Summary
Burada, kardiyak yeniden programlama değerlendirmesi için bir Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıdaki αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare muhabir hattının kurulmasını ve uygulanmasını açıklıyoruz. Fare zorlanmasından izole edilen yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) dönüştürülerek, kalsiyum (Ca2+) akı yoluyla iCM'lerin yeniden programlama verimliliğinin ve fonksiyonel olgunlaşmasının rahat ve verimli bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Abstract
Kardiyak yeniden programlama, hasarlı bir kalbi onarmak için potansiyel olarak umut verici bir tedavi haline geldi. Fibroblastlar, Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) dahil olmak üzere birden fazla transkripsiyon faktörü sunarak indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) yeniden programlanabilir. Bu iCM'ler, enfarktüslü bir kalpte yerinde üretildiğinde, elektriksel ve mekanik olarak çevredeki miyokardla bütünleşir ve yara izi boyutunda bir azalmaya ve kalp fonksiyonunda iyileşmeye yol ederim. iCM'lerin nispeten düşük yeniden programlama verimliliği, saflığı ve kalitesi nedeniyle, iCM'lerin karakterizasyonu bir zorluk olmaya devam etmektedir. Akış sitometrisi, immünositokimya ve qPCR dahil olmak üzere bu alanda şu anda kullanılan yöntemler, esas olarak kardiyak gen ve protein ekspresyonine odaklanır, ancak iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasına odaklanmaz. Eylem potansiyelleri tarafından tetiklenen kardiyomiyositlerde voltaj kapılı kalsiyum kanallarının açılması hücreye hızlı bir kalsiyum akınına yol açar. Bu nedenle, kalsiyum akını oranını ölçmek kardiyomiyosit fonksiyonunu değerlendirmek için umut verici bir yöntemdir. Burada, protokol iCM işlevini kalsiyum (Ca2+) akı ile değerlendirmek için bir yöntem sunar. Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (Myh6-olarak adlandırılır) geçilerek bir αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare suşu kuruldu Aşağıdaki cre) gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıda Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fareler ile. P0-P2 yenidoğan farelerinden yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) izole edildi ve in vitro olarak kültürlendi ve NCF'lere MGT'nin polistronik bir yapısı tanıtıldı ve bu da iCM'lere yeniden programlanmalarına yol açtı. Sadece başarıyla yeniden programlanan iCM'ler GCaMP3 muhabirini ifade edeceğinden, iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşması floresan mikroskopi ile Ca2+ akı tarafından görsel olarak değerlendirilebilir. Yeniden programlanmamış NCF'lerle karşılaştırıldığında, NCF-iCM'ler CD'lere benzer şekilde önemli kalsiyum geçici akı ve spontan kasılma gösterdi. Bu protokol, fare zorlanması kuruluşu, yenidoğan fare kalplerinin izolasyonu ve seçimi, NCF izolasyonu, kardiyak yeniden programlama için retrovirüs üretimi, iCM indüksiyonu, muhabir hattımız kullanılarak iCM Ca2+ akısının değerlendirilmesi ve ilgili istatistiksel analiz ve veri sunumunu ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Burada açıklanan yöntemlerin kardiyak yeniden programlama çalışmaları için iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için değerli bir platform sağlaması beklanmaktadır.
Introduction
Miyokard enfarktüsü (MI) dünya çapında ağır bir hastalıktır. Kardiyovasküler hastalıklar (CVD' ler) dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve 20191,2'de yaklaşık 18,6 milyon ölüme neden olmaktadır. CvD'lerin toplam mortalitesi son yarım yüzyıl içinde azaldı. Bununla birlikte, bu eğilim bazı gelişmemiş ülkelerde yavaşlatıldı ve hatta tersine çevrildi1, bu da CVD'lerin daha etkili tedavilerini gerektiriyor. CVD'nin ölümcül tezahürlerinden biri olarak MI, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki CVD'lere atfedilen tüm ölümlerin yaklaşık yarısını oluşturmaktadır2. İskemi sırasında, koroner arterlerin bloke edilmesi ve hem besin hem de oksijenin sınırlı tedariki ile miyokard ciddi metabolik değişikliklere uğrar, kardiyomiyositlerin (CM' ler) sistolik işlevini bozar ve CM ölümüne yol açar3. Kalp yaralanmasını onarmak ve yaralı kalbin işlevini geri kazandırmak için kardiyovasküler araştırmalarda çok sayıda yaklaşım araştırıldı4. Doğrudan kardiyak yeniden programlama, hasarlı kalbi onarmak ve işlevini geri kazandırmak için umut verici bir strateji olarak ortaya çıkmıştır5,6. Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) tanıtılarak fibroblastlar iCM'lere in vitro ve in vivo olarak yeniden programlanabilir ve bu iCM'ler yara bölgesini azaltabilir ve kalp fonksiyonunu iyileştirebilir7,8.
Kardiyak yeniden programlama MI tedavisi için umut verici bir strateji olsa da, bir dizi zorluk devam etmektedir. İlk olarak, yeniden programlama verimliliği, saflığı ve kalitesi her zaman beklendiği kadar yüksek değildir. MGT indüksiyonu, in vitro7'deki iCM'lere yeniden programlanacak toplam CF'lerin sadece% 8.4'ünü (cTnT+) veya% 24.7'sini (αMHC-GFP +) veya uygulamasını sınırlayan% 35'e kadar in vivo8 elde edebilir. Hand29 veya Akt1/PKB10 gibi sistemde daha fazla faktör indüklenmiş olsa bile, yeniden programlama verimliliği klinik bir ortamda kullanılmak üzere hala tatmin edici değildir. Bu nedenle, bu alanda yeniden programlama verimliliğini artırmaya odaklanan daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. İkincisi, iCM'lerin elektrik bütünlüğü ve kasılma özellikleri kalp fonksiyonunun verimli bir şekilde iyileştirilmesi için önemlidir, ancak bunların değerlendirilmesi zordur. Şu anda, bazı önemli CD genlerinin ekspresyonunun akış sitometrisi, immünositokimya ve qPCR dahil olmak üzere alanda yaygın olarak kullanılan değerlendirme yöntemleri, iCM'lerin ve CD'lerin benzerliğine odaklanmıştır, ancak iCM'lerin fonksiyonel özellikleriyle doğrudan ilişkili değildir. Ayrıca, bu yöntemler nispeten karmaşık prosedürlere sahiptir ve zaman alıcıdır. Yeniden programlama çalışmaları genellikle iCM'lerin olgunlaşmasını teşvik eden potansiyel yeniden programlama faktörlerinin taranması içerir11, kardiyak yeniden programlama iCMs işlevine dayalı hızlı ve kullanışlı bir yöntem gerektirir.
CD'ler, her büzülme döngüsü sırasında sitomembran üzerindeki voltaj kapılı kalsiyum iyon kanallarını açar ve bu da miyofilament kasılmasına katılmak için hücreler arası sıvıdan sitoplazmaya geçici bir kalsiyum iyonu (Ca2+) akınına yol açar. Böyle bir Ca2+ akını ve dış döngü miyokard kasılmasının temel özelliğidir ve CMs12'nin normal işlevini oluşturur. Bu nedenle, Ca2+ akınını algılayan bir yöntem, iCM'ler de dahil olmak üzere CD'lerin ve CM benzeri hücrelerin işlevini ölçmenin potansiyel bir yolu olabilir. Ayrıca, iCM'ler için, böyle bir yöntem yeniden programlama verimliliğini değerlendirmek için başka bir yol sağlar.
Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) geliştirilmiş ve başta eylem potansiyelleri olmak üzere hücre aktivitelerini belirtmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Genellikle, GECI'ler calmodulin gibi bir Ca2+ bağlama etki alanından ve GFP gibi floresan bir etki alanından oluşur ve GCaMP3 yüksek benzeşim ve floresan yoğunluğuna sahip bir etki alanıdır. GCaMP3'ün floresan etki alanı, lokal kalsiyum konsantrasyonu değiştiğinde etkinleştirilecektir13. Bu makalede, Myh6+ hücrelerinde özellikle bir GCaMP3 muhabirini ifade eden bir fare suşu açıklanmıştır. MGT'yi bu türün yenidoğanlarından izole edilmiş NCF'lere tanıtarak, yeniden programlama, başarılı bir şekilde yeniden programlanan iCM'lerin sergileyeceği floresan ile izlenebilir. Böyle bir fare zorlanması ve yöntemi, kardiyak yeniden programlamayı araştırmak için değerli bir platform sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürler ve uygulamalar Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Hücre kültürünü içeren tüm deneysel prosedürler ve uygulamalar steril koşullarda BSL2 Biyolojik Güvenlik Kabini yapılmalıdır. Virüslerle ilgili prosedürler ve uygulamalar için, çevresel ve sağlık açısından tehlike riskini önlemek için transfected hücrelerin, pipet uçlarının ve tüplerin uygun şekilde bertaraf edilmesi kılavuzuna uyulur.
1. Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare suşu (Şekil 1)
- Sırasıyla Tg(Myh6-cre)1Jmk/J fare suşu (Myh6-Cre olarak adlandırılan Jackson laboratuvar stok 009074) ve Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J fare suşu (Jackson laboratuvar stok 014538, Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) hazırlayın.
- Sırasıyla yetişkin Myh6-Cre ve Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fareleri elde etmek için her bir suş 8 haftalık kadar yetiştirin.
- Yetişkin Myh6-Cre ve Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 farelerini melezledi.
NOT: Myh6-Cre erkek / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 kadın veya tam tersi ayarlayın. Torunları arasında önemli bir fark yoktur. Tipik olarak, dişi fareler melezlemeden 19-21 gün sonra 8-10 yavru doğurur.
2. Yenidoğan Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare kalplerinin izolasyonu ve seçimi.
- P0-P2 yavruları alın. Bu protokolle 10 milyon NCF'yi izole etmek için 8-10 yavrunun bulunduğundan emin olun.
- Yavruları hipotermi ile derinden uyuşturdum. Yavruları lateks eldivene yerleştirin ve boynuna kadar ezilmiş buz ve suya (2°C - 3°C) daldırin.
- Yavruları kısaca% 75 etanol ile sterilize edin.
- Kısır makasla kafalarını keserek yavruları kurban edin.
- Kalbin yakınında yatay bir kesi yapın, kalbi sıkın ve ardından aortu kökünden makasla ayırarak izole edin.
- Floresan mikroskop altında kalbin atışını gözlemleyin. Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotipi ile kalplerin GCaMP3 tarafından kalp atışlarıyla gösterilen Ca2+ akısını gösterdiğine emin olun. Diğer genotipler floresan göstermez (Şekil 2, Video 1 ve Video 2).
3. Yenidoğan kardiyak fibroblastların (NCF'ler) izolasyonu
NOT: Bu bölüm için, Dr. Li Qian's Lab14 protokolü, bu çalışmaya uygun olduğunda küçük optimizasyonlarla benimsenmiştir.
- αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 kalplerinin izolasyonundan sonra, gevşek bir şekilde bağlı olan dört parçaya bölün. İzole hücrelerdeki kan hücresi kirliliğini sınırlamak için onları buz gibi DPBS'de 6 cm'lik bir plakada birkaç kez iyice yıkayın.
- Kalpleri 15 mL konik bir tüpe aktarın.
- 10 dakika boyunca 37 °C'de 8 mL sıcak % 0.25 Trypsin-EDTA ile kalpleri sindirin.
- Tripsin süpernatantı atın ve HBSS'ye 5 mL sıcak tip-II kollajenaz (0,5 mg/mL) ekleyin.
- Karışımı iyice girdaplayın ve 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, iyice girdap ve sindirilmemiş dokunun yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
- Süpernatantı 5 mL soğuk fibroblast (FB) orta (%20 FBS ve %1 penisilin/streptomisin içeren IMDM) ile 15 mL konik tüpte toplayın.
- Sindirilmemiş doku için 3.4-3.7 adımlarını 4-5 kez tekrarlayın.
- Tüm süpernatantı bir araya toplayın ve süpernatantı 40 μm süzgeçle filtreleyin.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj ve süpernatantı atın.
- Hücreleri 10 mL Manyetik aktive hücre sıralama tamponunda (MACS arabelleği; 2 mM EDTA ve% 0,5 BSA ile 1x PBS) yeniden biriktirin.
- Trypan mavi boyama ile uygun hücre numarasını belirleyin.
- Adım 3.11'de 10 mL hücre süspansiyonundan 10 μL hücre alın.
- 10 μL%0,4 trypan mavi çözelti ile karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Karışımı bir hemositometreye ekleyin ve uygun hücre numarasını belirleyin. Ölü hücreler maviye boyanırken, canlı hücreler lekesizdir.
- Hücreleri 200 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın.
- 10 milyondan az canlı hücre için 90 μL soğutulmuş MACS tamponunda 10 μL Thy1.2 mikrobead ile hücreleri yeniden biriktirin. 10 milyondan fazla canlı hücre varsa orantılı olarak daha fazla boncuk ekleyin. Karışımı iyice pipetleyin ve 30-60 dakika boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- 10 mL MACS tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.
- 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj, süpernatantı atın.
- 3.15-3.16 arası adımları bir kez yineleyin.
- Hücreleri ve boncukları 2 mL MACS arabelleği ile yeniden biriktirin.
- Kaputa bir MACS ayırıcısı kurun. Ayırıcıya bir LS sütunu yerleştirin ve sütunu 3 mL MACS arabelleği ile dengelayın.
- LS sütunu dengelendiğinde, hücreleri sütundan geçirin.
- LS sütununu 2 mL MACS arabelleği ile üç kez yıkayın.
- Sütunu ayırıcıdan alın, üç kez 2 mL MACS tamponu ile elüte edin ve ardından elution'ı 50 mL'lik bir tüpe toplayın.
- 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj ve süpernatantı atın.
- Hücreleri 5 mL FB ortamla yeniden biriktirin.
- Hemositometre ile hücre numarasını belirleyin.
- Hücreleri FB ortamı ile seyreltin ve hücreleri istediğiniz gibi tabaklara veya tabaklara tohumlayın. Hücre tohumlama yoğunluğunun 2-2,5 x 104 hücre/cm2 civarında olduğundan emin olun (yoğunluğu bireysel deneylere göre optimize edin). Ekli fibroblastların tohumlamadan sonraki ikinci günde ovalden yuvarlak şekle sahip olduğundan emin olun (Şekil 3).
4. Kardiyak yeniden programlama için retrovirüs kodlama polisistronik MGT vektör üretimi
- Plat-E'yi 37 °C'de %5 CO2 ile Plat-E kültür ortamı (%10 FBS, 1 μg/mL puromycin ve 10 μg/mL blasticidin ile desteklenmiş DMEM) ile koruyun.
- 1. günde, Plat-E'yi yaklaşık 4-5 x 105 hücre / kuyu yoğunluğunda 6 kuyulu bir tabağa bölün.
- 2. günde, Plat-E genellikle% 80 izdiah eder. Hücreleri aşağıdaki yordamlarla transfect. Burada bulunan her elemanın hacmini ve miktarını 6 kuyulu bir plakadaki her kuyuya göre ayarlayın.
- 2 μg pMX-puro-MGT polisistronik retrovirüs ekspresyon plazmid vektörünü (Addgene 111809) TE tamponu ile 500 ng/μL'ye seyreltin.
- 10 μL Lipofectamin'i 150 μL azaltılmış serum ortamı ile karıştırarak transfeksiyon karışımını hazırlayın. İyice karıştırmak ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatmak için dikkatlice pipet. Pipetleme yaparken kabarcıklardan kaçınmaya dikkat edin.
- Bu arada, plazmidi 150 μL azaltılmış serum ortamı ile karıştırarak bir plazmid karışımı hazırlayın. İyice karıştırmak ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatmak için dikkatlice pipet. Pipetleme yaparken kabarcıklardan kaçınmaya dikkat edin.
- İki karışımı dikkatlice karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çözüm bulutlu görünebilir.
- Karışımı transfected olacak hücrelere damla damla ekleyin.
- Hücreleri bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- 3. günde, ortamı puromycin ve blasticidin eksikliği olan taze bir tam hücre kültürü ortamına değiştirin.
- Transfectiondan 4, 48 saat sonra, retrovirüs içeren süpernatant toplayın ve 4 ° C'de saklayın.
- Transfectiondan 5, 72 saat sonra, retrovirüs içeren süpernatant toplayın.
- 48 h ve 72 h süpernatantı 0,45 μm filtre ile filtreleyin, %8 PEG'lik son konsantrasyonu yapmak için %40 Poli (etilen glikol) (PEG) çözeltisinin 1/5 hacmini ekleyerek 4 °C'de bir gecede çökelin.
- Virüsü çökeltmek için 30 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüj.
NOT: PEG8000-virüs küçük beyaz yağış oluşturur. - İstenildiği gibi 8 μg/mL polibren içeren iCM ortamı ile virüsü yeniden dirildirin. Retrovirüsü hemen kullanın.
5. MGT kodlama retrovirüs enfeksiyonu ile NCF'leri iCM'lere yeniden programlama
- Virüs bulaşmadan önce NCF'leri büyütün veya geçiştirin.
NOT: Genellikle NCF iki kez geçiş yapılabilir. - 0. günde, FB ortamında 1-2 x 104 hücre/cm2 civarındaki yoğunluğa tohum NCF.
- 1. günde, kültür ortamını her biri için istenen kadar virüs içeren bir ortamla değiştirin. 24 kuyulu bir tabakta iki kuyuya bulaştırmak için virüsü bir kuyu Plat-E'den 6 kuyulu bir tabakta kullanın. En uygun virüs konsantrasyonu belirlemek için virüsü titret.
NOT: MGT retrovirüs ile birlikte ilgi çekici diğer yeniden programlama faktörlerini içeren virüsler de tanıtılabilir. - Gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır.
- 2. günde, virüs enfeksiyonundan 24 saat sonra, virüs içeren ortamı normal bir iCM ortamına değiştirin.
- GCaMP3 ifadesini izlemek için ters floresan mikroskobu altında plakalayın. GFP kanalında 10x'in altında, hücrelerin bir kısmının hafif bazal GCaMP3 floresanını 5.
- Yeniden programlama sırasında ortamı her 2-3 günde bir değiştirin. Gerekirse, 3 gün boyunca kültür ortamına 2 μg/mL puromisisin ekleyerek ve 1 μg/mL'de tutarak MGT retrovirüs enfekte hücreleri için pozitif bir seçim gerçekleştirin.
NOT: Orta değişimle birlikte ilgi çekici kimyasalları (örneğin, IGF-1, MM589, A83-01 ve daha önce bildirdiğimiz gibi IMAP olarak adlandırılan PTC-209) tanıtın. - 14 günlük enfeksiyondan sonra, iCM olgunlaşmasını daha da teşvik etmek için ortamı B27 ortamı ile değiştirin.
6. iCM fonksiyonel olgunlaşma ve yeniden programlama verimliliğinin Ca2+ akı ile değerlendirilmesi
NOT: Gerekirse değerlendirmeden önce değerlendirilecek hücrelere 1 μM izoproterenol ekleyin.
- Ca2+ akısını oda sıcaklığında ters floresan mikroskopla değerlendirin.
- GFP kanalında, GCaMP3+ hücrelerini 10x hedefi altında gözlemleyin. Parlak alan kanalında spontan hücre çırpma gösterdiğine emin olun.
- 20x'in altındaki üç alanı rastgele seçin ve iCM'lerin Ca2+ akısını her alan için 3 dakika boyunca kaydedin.
NOT: Burada, Ca2+ akısı spontan hücre çırpığı ile senkronize edildi (Şekil 4, Şekil 5 ve Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7, Video 8). - Hücreleri Ca2+ akı ile manuel olarak ölçün.
7. İstatistiksel analiz ve veri sunumu
- Gruplar arasındaki farklılıkları tek yönlü varyans analizi (ANOVA) analiz etmek ve Student-Newman-Keuls çoklu karşılaştırma testlerini gerçekleştirmek.
NOT: Sonuçlar, istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edilen p < 0.05 ile S.E ± ortalamadır. Her deney en az üç kez gerçekleştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare zorlanması ve transgenik farelerin gen yapısını oluşturmak için deneysel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Fare zorlanması kurulurken, yavruların kalpleri izole edildi ve genotipi doğrulamak için ters floresan mikroskop altında gözlemlendi. Doğru genotipli kalpler Ca2+ akıyı atmakla senkronize eder, GCaMP3 floresan olarak görselleştirilirken, kontrol kalplerinde floresan gözlenmedi (Şekil 2, Video 1 ve Video 2). İzole NCF'ler kuyuya 2 saat içinde yapır ve tohumlamadan 1 gün sonra ovalden yuvarlak şekle kadar gösterir (Şekil 3). mgt girişten 14 gün sonra fonksiyonel olgunluk ve iCM'lerin yeniden programlama verimliliği Ca2+ akı tarafından değerlendirildi. Yeniden programlanan hücreler, Ca2+ akısını ölçmek için floresan mikroskop altında değerlendirilebilir. GCaMP3+ hücreleri hem IMAP hem de MGT gruplarında bulunabilirken, IMAP grubu normal CD'lere daha yakın Ca2+ salınım desenlerine sahip önemli ölçüde daha fazla GCaMP3+ hücresi ve hücresi gösterir (Videolar 3-8). Şekil 4A'da gösterildiği gibi, IMAP grubunda Ca2+ salınımlı temsili bir hücre, maksimum (orta panel) ve minimum (sağ panel) arasında GCaMP3 floresan değişimini gösterecektir ve bu hücrelerin Ca2+ salınımı periyodik olarak değiştirilir (Şekil 4B). IMAP'in piyasaya sürülmesinden sonra, yüksek güç alanı başına Ca2+ akı (HPF, 20x objektif lens) olan GCaMP3+ hücrelerinin sayısı IMAP-orta işlem grubunda artırıldığinden, yenici küme sayısı kontrol grubundakinden önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 5).
Şekil 1: Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare zorlanması oluşturma. Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare gerinimi üretimi ve transgenik farelerin gen yapısının illüstrasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Atan kalbin Ca2+ akısı. GCaMP3 floresan Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 kalplerinde (üst panel) kalp atışları ile senkronize edilirken, kontrol kalplerinde (alt panel) floresan gözlenmedi. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 6 kuyulu bir plakaya bağlı yalıtılmış NCF'ler. (A) Düşük güç alanı altında NCF'ler (LPF, 10x amaç, ölçek çubuğu = 100 μm). (B) Yüksek güç alanı altındaki NCF'ler (20x amaç, ölçek çubuğu = 50 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yeniden programlanmış hücrelerin Ca2+ akı. (A) IMAP ile işlenmiş NCF'ler, yüksek güç alanında (20x hedefi) GFP kanalı altındaki iCM'lere yeniden programlandı. Ca2+ akı iCM'ler GCaMP3 floresan olarak görselleştirildi, ca2 + akılı hücreler temel floresan (Ca2 + dk, orta panel) ve parlak floresan (Ca2 + max, sağ panel) arasında tekrarlanan yanıp sönmeyi gösteriyor. (B) IMAP grubundaki Ca2+ salınım+ hücrelerinin Ca2+ izleme eğrisi. Ölçek çubuğu = 50 μm. F/F0: göreli floresan yoğunluğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 Şekil 5: CA2+ akısının IMAP ortamı altında değerlendirilmesi. MGT indüksiyonu sonrası 2, 3, 4 hafta sonra HPF başına Ca2+ akı ile GCaMP3+ hücrelerinin sayısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: GFP kanalında objektif lens (4x amaç) tarama altında αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotipli yavrulardan izole edilmiş atan bir kalp. Kalp GCaMP3+ ve temel floresan (Ca2+ dk) ve parlak floresan (Ca2 + max) arasında yanıp söner. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 2: GFP kanalında objektif lensi tarama altında kontrol genotipi olan yavrulardan izole edilmiş atan bir kalp. Kalp GCaMP3' dür ve floresan yanıp sönmesini atarak senkronize etmez. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 3: Parlak alan (BF) kanalında LPF altında IMAP grubundaki iCM'ler. Sahanın merkezinde önemli darp olan bir hücre görülebilir. Hem Video 3 hem de Video 4 aynı alana odaklanır. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 4: GFP kanalında LPF altında IMAP grubundaki iCM'ler. BF kanalında görülen dayaktan hücre de dahil olmak üzere yanıp sönen floresanlı birden fazla hücre gözlemlenebilir. Hem Video 3 hem de Video 4 aynı alana odaklanır. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 5: BF kanalında HPF altında IMAP grubundaki iCM'ler. HpF kapsamında Video 3 ve Video 4 alanının merkezi gözlemlendi. Alanın merkezinde önemli darp olan bir hücre gözlemlenebilir. Hem Video 5 hem de Video 6 aynı alana odaklanır. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 6: GFP kanalında HPF altında IMAP grubundaki iCM'ler. Video 3 ve Video 4 alanının orta kısmı HPF altında gözlendi. BF kanalında görülen dayaktan hücre de dahil olmak üzere yanıp sönen floresanlı birden fazla hücre gözlemlenebilir. Hem Video 5 hem de Video 6 aynı alana odaklanır. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 7: BF kanalında HPF altında MGT grubundaki iCM'ler. IMAP grubunda gözlenen önemli dayak hücrelerinin aksine, MGT grubunda BF kanalının altında birkaç çırpma hücresi vardır ve bu da yeniden programlama verimliliği daha düşüktür. Hem Video 7 hem de Video 8 aynı alana odaklanır. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 8: GFP kanalında HPF altında MGT grubundaki iCM'ler. Hafif yanıp sönen floresanlı birkaç hücre gözlenebilir. Hem Video 7 hem de Video 8 aynı alana odaklanır. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kardiyak yeniden programlama alanı için iCM'lerin değerlendirilmesi gereklidir. Bu yazıda, protokolde bir Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J fare suşu, iCM'lere yeniden programlama için yenidoğan farelerden izole edilen NCF'lerin bu suşta nasıl kullanılacağı ve iCM işlevinin Ca2+ fluks tarafından değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Bu, iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için bir de novo yöntemidir.
Bu yöntemle başarıyla yeniden programlamak ve değerlendirmek için birkaç kritik adım önemlidir. İlk olarak, NCF'ler izolasyondan sonra taze ve sağlıklı olmalıdır. Hızlı bir kalp izolasyonu ve kesimi prosedürü esastır. En önemlisi, aşırı sindirimi ve hücre canlılığı ve durumunda azalmayı önlemek için kuluçka süresini takip etmek çok önemlidir. İkincisi, tüm prosedürler arasında, virüs enfeksiyonu verimliliği genellikle sonuçlarda yüksek varyasyona neden olur. Virüs enfeksiyonu verimliliği büyük ölçüde iki faktörden etkilenir. Bir yandan, virüs titresi transfected plazmid miktarı ve benzeri Plat-E hücre durumu ve yoğunluğunda tutarlılık gerektiren farklı girişimler arasında sabit olmalıdır. Bu protokolü izleyen araştırmacılar, bu prosedürlerden önce en uygun tohumlama yoğunluğunu ve süresini değerlendirmelidir. Virüs, donma-çözülme döngülerine karşı virüs hassasiyeti nedeniyle titer zayıflamasını önlemek için derhal kullanılmalıdır. Ek olarak, NCF'leri enfeksiyon sırasında sağlıklı bir durumda ve uygun yoğunlukta tutmak önemlidir. Araştırmacılar NCF'lerin büyüme özelliklerine aşina olmalıdır. Yeniden programlama verimliliği varyasyonu sınırlı olması gerekirken, sık izleme yardımcı olabilir. Bu protokol, NCF'leri farklı virüslerle birlikte enfekte etmek veya ilgi çekici kimyasallarla tedavi etmek için kolayca değiştirilebilir. Bu nedenle, kardiyak yeniden programlama araştırmaları için evrensel bir yöntem olarak uygulanabilir. Burada belirtilen noktaların yanı sıra, bu yöntemle ilgili yaygın sorunlar arasında yeniden programlamadan sonra gözlenen düşük floresan sayılıyor. Bunun nedeni çeşitli olabilir. İlk olarak, enfeksiyon iseildiği kadar etkili olmayabilir, bu da düşük bir yeniden programlama verimliliğine yol açar ve iCM sayısını sınırlar. İkinci olarak, iCM'lerin GCaMP3 floresanının gözlemlenmesi için maruz kalma durumunun en uygun şekilde ayarlanması gerekebilir. Pozitif kontrol ile aynı yavrulardan izole edilmiş yenidoğan kardiyomiyositlerin kullanılması potansiyel nedeni belirlemeye yardımcı olacaktır.
Ca2+ akı, nöron hücreleri16, meme bezi17, yağ dokuları18, vb. Bu çalışmada iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için Ca2+ akı kullanılmıştır. Daha önce, Ca2 + akısının, yeniden programlanmış hücrelerin işlevini değerlendirmek için kullanılabilecek küçük molekül kalsiyuma duyarlı boyalar adlı spesifik kimyasallarla ölçülebileceği bildirilmiştir19. Bununla birlikte, böyle bir yöntemin birkaç sınırlaması vardır: hücrelere tanıtılan kimyasal potansiyel toksisiteye sahip olabilir ve hücresel süreçleri etkileyebilir, bu da sonuçları burada sunulan yöntemle elde edilenlerden daha az güvenilir hale getirir. Ayrıca, boyama işlemi karmaşık ve zaman alıcıdır, aynı zamanda bu hücrelerin daha fazla değerlendirilmesini önler. Öte yandan burada sunulan yöntem bu sınırlamaların üstesinden geliyor. GCaMP3, hücre aktiviteleri üzerindeki etkileri en aza indiren ve hücrelerin daha fazla değerlendirilmesini sağlayan hücreler için invaziv değildir. iCM'lerin floresanları yalnızca kimliklerine, yani Myh6 ifadesine ve yerel Ca2+ konsantrasyon değişikliğine bağlı olduğundan, NCF'ler yeniden programlandıkça hücrelerin Ca2+ akı floresan görünür hale gelir ve bu da zaman alıcı bir strateji olmadan yeniden programlama sürecinin sık izlenmesini sağlar. Ca2+ akı ters floresan mikroskop altında kolayca izlenebilir ve kaydedilebilirken, hücre zarı boyunca tekrarlanan dayak ve ilgili elektronik aktivite, yani Ca2+ akı, daha da zamansal olarak ölçülebilir20. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, bu tür niceleme iCM'lerin olgunluğu hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir ve kardiyak yeniden programlama sırasında Ca2 + akı değişiminin daha ayrıntılı yapılarını gösterebilir.
Bu yöntemin çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, Ca2+ akısı sadece iCM'lerde görülür. Myh6 CD'lere çok özgü olduğundan, ancak CD'lere özgü olmadığından, yalnızca başarıyla yeniden programlanan hücreler GCaMP3 muhabirini ifade eder ve floresan olur. İkinci olarak, Ca2+ akı, CM'ye özgü genlerin ekspresyonunu izleme yönteminin yanı sıra iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmenin bir yolunu sağlar. Buna bağlı nispeten uzun deneysel prosedür ve varyasyon nedeniyle, iCM'lerin işlevi daha fazla çalışma ve potansiyel klinik kullanım için her zaman kabul edilemez. CM'ye özgü gen ekspresyumu, yeniden programlanan hücrenin özelliklerinin sadece bir kısmını ortaya koymakta iken, Ca2+ akı, yeniden programlanan hücre kalitesini ve verimliliğini değerlendirmek için kardiyak yeniden programlama alanının başka bir yönünü sağlar. Ayrıca, fonksiyonel olgunlaşma daha çok kalp fonksiyonu ile ilgilidir, bu da verimliliği değerlendirmek için daha iyi bir gösterge olabilir. Bu alanda yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında tüm hücre gruplarının tripsin sindirimini gerektiren bir teknik olan akış sitometrisi yer almaktadır. Sindirim hücre fonksiyonlarını ve özelliklerini etkileyebilirken, sisteme varyasyon getirerek gözlemlenen sonuçları yeniden üretme potansiyelini azaltır ve bu hücreleri daha fazla değerlendirir. Bu yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada gösterilen transgenik fare suşu, değerlendirme için gerekli kimyasalların veya deneysel prosedürlerin potansiyel etkisini sınırlamıştır. Bu avantajlarla, bu fare zorlanması kardiyak yeniden programlama için gereken değerlendirme prosedürlerini basitleştirir ve bu alandaki sonuçların tekrarlanabilirliğini artırır.
Ancak, bu çalışmada bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, fare zorlanması kuruluşu zaman alıcıdır. Bu alandaki meslektaşlarından gelen fare gerginliğinin sorgulanması, gerinim kuruluşu için gereken süreyi kısaltmak için memnuniyetle karşılanmaktadır. İkincisi, bu protokolle iCM'lere kardiyak yeniden programlama, sisteme nispeten yüksek varyasyon getiren birden fazla faktör ve adım içerir. Bu alandaki yeterlilik bu konunun üstesinden gelmeye yardımcı olacaktır. Son olarak, GCaMP3 sadece Ca2+ akı durumunda floresan hale geldiğinden, mevcut değerlendirme yöntemi doğrudan MYH6-GFP suşu ile kardiyak yeniden programlama olarak FACS için kullanılamaz7. Bununla birlikte, mevcut suş Myh6-GFP suşu ile karşılaştırıldığında daha fazla ve farklı uygulamalara sahip olsa da, böyle bir rahatsızlık aşılabilir.
Genel olarak, protokolün yukarıda açıkladığı gibi, Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare zorlanması ve iCM'lerin olgunlaşmasının değerlendirilmesini takiben, tüm kardiyak yeniden programlama sürecini izlemek için bir strateji sağlar. Bu GCaMP3 aracılı Ca2+ akı ölçüm stratejisi canlı hücrelerde hücre canlılığı zarar vermeden gerçekleştirilebilir. GCaMP3 floresan miyokard spesifik gen ekspresyonu tarafından yönlendirilebildiğinden, elde edilen GCaMP3 floresan verileri yeniden programlama verimliliğini ve iCMs aktivitesini ortaya çıkarmak için daha da ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Leo Gnatovskiy'nin bu makalenin İngilizce metnini düzenleme çabalarını takdir ediyoruz. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından Dr. Wang'a verilen hibe (1R01HL109054) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
- Frangogiannis, N. G.
- Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
- Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036 (2016).
- Grant, A. O.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).
- Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).
- Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312 (2016).
