Summary
Здесь мы описываем создание и применение линии репортеров Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (называемой αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) для оценки перепрограммирования сердца. Неонатальные сердечные фибробласты (NCF), выделенные из штамма мыши, превращаются в индуцированные кардиомиоциты (iCM), что позволяет удобно и эффективно оценивать эффективность перепрограммирования и функциональное созревание iCM через поток кальция (Ca2+).
Abstract
Перепрограммирование сердца стало потенциально перспективной терапией для восстановления поврежденного сердца. Путем введения нескольких факторов транскрипции, включая Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), фибробласты могут быть перепрограммированы в индуцированные кардиомиоциты (iCM). Эти iCM, генерируемые in situ в инфарктном сердце, электрически и механически интегрируются с окружающим миокардом, что приводит к уменьшению размера рубца и улучшению функции сердца. Из-за относительно низкой эффективности перепрограммирования, чистоты и качества iCM характеристика iCM остается проблемой. Используемые в настоящее время методы в этой области, включая проточную цитометрию, иммуноцитохимию и qPCR, в основном сосредоточены на сердечно-специфической экспрессии генов и белков, но не на функциональном созревании iCM. Запускаемое потенциалами действия, открытие кальциевых каналов в кардиомиоцитах приводит к быстрому притоку кальция в клетку. Поэтому количественная оценка скорости притока кальция является перспективным методом оценки функции кардиомиоцитов. Здесь протокол вводит метод оценки функции iCM по потоку кальция (Ca2+). Штамм мыши αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 был установлен путем скрещивания Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (далее именуемого Myh6-Cre) с Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (далее именуемым Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3). Неонатальные сердечные фибробласты (NCF) у неонатальных мышей P0-P2 были выделены и культивированы in vitro, а полицистронная конструкция MGT была введена в NCF, что привело к их перепрограммированию в iCM. Поскольку только успешно перепрограммированные iCM будут выражать репортер GCaMP3, функциональное созревание iCM может быть визуально оценено с помощью потока Ca2+ с помощью флуоресцентной микроскопии. По сравнению с неперепрограммированными NCF, NCF-iCM показали значительный переходный поток кальция и спонтанное сокращение, аналогичное КМ. Этот протокол подробно описывает создание штамма мыши, изоляцию и отбор сердца неонатальных мышей, изоляцию NCF, производство ретровируса для перепрограммирования сердца, индукцию iCM, оценку потока iCM Ca2 + с использованием нашей репортерной линии и соответствующий статистический анализ и представление данных. Ожидается, что методы, описанные здесь, обеспечат ценную платформу для оценки функционального созревания iCM для исследований сердечного перепрограммирования.
Introduction
Инфаркт миокарда (ИМ) является тяжелым заболеванием во всем мире. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всем мире и составляют около 18,6 миллиона смертей в 20191 году2. Общая смертность от ССЗ снизилась за последние полвека. Однако эта тенденция замедлилась или даже обратилась вспять в некоторых неразвитых странах1, что требует более эффективного лечения ССЗ. Как одно из смертельных проявлений ССЗ, им приходится около половины всех смертей, приписываемых ССЗ в Соединенных Штатах2. Во время ишемии, при блокировке коронарных артерий и ограниченном поступлении как питательных веществ, так и кислорода, миокард страдает от тяжелых метаболических изменений, ухудшает систолическую функцию кардиомиоцитов (КМ) и приводит к смерти ОТ СМ3. Были изучены многочисленные подходы в сердечно-сосудистых исследованиях для восстановления повреждения сердца и восстановления функции поврежденного сердца4. Прямое перепрограммирование сердца стало одной из многообещающих стратегий восстановления поврежденного сердца и восстановления его функции5,6. Вводя Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), фибробласты могут быть перепрограммированы на iCM in vitro и in vivo, и эти iCM могут уменьшить область рубца и улучшить работу сердца7,8.
Хотя перепрограммирование сердца является многообещающей стратегией для лечения ИМ, остается ряд проблем. Во-первых, эффективность перепрограммирования, чистота и качество не всегда так высоки, как ожидалось. Индуцирование MGT может достигать только 8,4% (cTnT+) или 24,7% (αMHC-GFP+) от общего количества CF, подлежащих перепрограммированию в iCM in vitro7, или до 35% in vivo8, что ограничивает его применение. Даже с большим количеством факторов, индуцированных в системе, таких как Hand29 или Akt1 / PKB10, эффективность перепрограммирования все еще едва ли удовлетворительна для использования в клинических условиях. Таким образом, в этой области необходимы дополнительные исследования, направленные на повышение эффективности перепрограммирования. Во-вторых, электрические характеристики целостности и сокращения iCM важны для эффективного улучшения функции сердца, но их сложно оценить. В настоящее время широко используемые методы оценки в этой области, включая проточную цитометрию, иммуноцитохимию и qPCR экспрессии некоторых ключевых генов CMs, сосредоточены на сходстве iCM и CM, но не связаны напрямую с функциональными характеристиками iCM. Кроме того, эти методы имеют относительно сложные процедуры и отнимают много времени. В то время как исследования перепрограммирования обычно включают скрининг потенциальных факторов перепрограммирования, которые способствуют созреванию iCM11, перепрограммирование сердца требует быстрого и удобного метода, основанного на функции iCM.
CMs открывают напряженные ионные каналы кальция на цитомембране во время каждого цикла сокращения, что приводит к переходному притоку иона кальция (Ca2+) из межклеточной жидкости в цитоплазму для участия в сокращении миофиламента. Такой цикл притока и оттока Ca2+ является фундаментальной чертой сокращения миокарда и составляет нормальную функцию CMs12. Таким образом, метод, который обнаруживает приток Ca2+ , может быть потенциальным способом измерения функции CM и CM-подобных клеток, включая iCM. Кроме того, для iCM такой метод обеспечивает еще один способ оценки эффективности перепрограммирования.
Генетически закодированные показатели кальция (GECI) были разработаны и широко используются для указания активности клеток, особенно потенциалов действия. Как правило, GECI состоят из домена связывания Ca2+ , такого как кальмодулин, и флуоресцентного домена, такого как GFP, а GCaMP3 является доменом с высокой аффинностью и интенсивностью флуоресценции. Флуоресцентный домен GCaMP3 будет активирован при изменении местной концентрации кальция13. В этой статье описан штамм мыши, который специфически экспрессирует репортер GCaMP3 в клетках Myh6+. Вводя MGT в изолированные NCF от новорожденных этого штамма, перепрограммирование можно контролировать флуоресценцией, которая будет проявляться успешно перепрограммированным iCM. Такой штамм и метод мыши обеспечат ценную платформу для исследования сердечного перепрограммирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры и практики с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных в Мичиганском университете. Все экспериментальные процедуры и практики, связанные с клеточной культурой, должны выполняться BSL2 Biological Safety Cabinet в стерильных условиях. В отношении процедур и практик, связанных с вирусами, соблюдалось руководство по надлежащему удалению трансфектированных клеток, наконечников пипеток и трубок, чтобы избежать риска опасности для окружающей среды и здоровья.
1. Создание штамма мыши Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (называемого Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) (рисунок 1)
- Приготовьте штамм мыши Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (jackson lab stock 009074, называемый Myh6-Cre) и Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J mouse strain (Jackson lab stock 014538, называемый Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) соответственно.
- Разводите каждый штамм в возрасте до 8 недель, чтобы получить взрослых мышей Myh6-Cre и Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 соответственно.
- Скрещивание взрослых мышей Myh6-Cre и Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите Myh6-Cre мужской / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 женский или наоборот. Существенной разницы между их потомками нет. Как правило, самки мышей рожают 8-10 детенышей через 19-21 день после скрещивания.
2. Выделение и отбор неонатальных мышей Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
- Получить P0-P2 щенков. Убедитесь, что присутствуют 8-10 детенышей, чтобы изолировать 10 миллионов NCF с помощью этого протокола.
- Глубоко обезболивает детенышей путем переохлаждения. Поместите щенков в латексную перчатку и погрузите до шеи в измельченный лед и воду (2°C - 3°C).
- Кратковременно продезинфицируйте детенышей 75% этанолом.
- Приносят в жертву детенышей путем обезглавливания стерильными ножницами.
- Сделайте горизонтальный разрез возле сердца, сожмите сердце, а затем изолируйте его, отделив ножницами корень аорты.
- Наблюдайте за сердцебиением под флуоресцентным микроскопом. Убедитесь, что генотип сердца Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 показывает поток Ca2+ , обозначенный GCaMP3 с сердцебиением. Другие генотипы не показывают флуоресценции (рисунок 2, видео 1 и видео 2).
3. Выделение неонатальных сердечных фибробластов (НКО)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой части был принят протокол из Лаборатории 14 доктора Ли Цяня с незначительными оптимизациями, когда это применимо к этому исследованию.
- После выделения сердец αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 разрежьте их на четыре части, которые слабо соединены. Промыть их в ледяном DPBS в 6 см пластине тщательно несколько раз, чтобы ограничить загрязнение клеток крови в изолированных клетках.
- Переведите сердца в коническую трубку объемом 15 мл.
- Переваривайте сердца с 8 мл теплого 0,25% трипсина-ЭДТА при 37 °C в течение 10 мин.
- Откажитесь от супернатанта трипсина и добавьте 5 мл теплой коллагеназы II типа (0,5 мг/мл) в HBSS.
- Тщательно вихрьте смесь и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин.
- После инкубации тщательно вихрьте и дайте непереваренной ткани остепениться под действием силы тяжести.
- Соберите супернатант в коническую трубку объемом 15 мл со средой холодного фибробласта (FB) 5 мл (IMDM с 20% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина).
- Повторите шаги 3,4-3,7 для непереваренной ткани 4-5 раз.
- Соберите все супернатанты вместе и отфильтруйте супернатант с помощью ситечка 40 мкм.
- Центрифугу при 200 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант.
- Повторное суспендирование ячеек в 10 мл магнитно-активированного буфера сортировки ячеек (буфер MACS; 1x PBS с 2 мМ ЭДТА и 0,5% BSA).
- Определите жизнеспособный номер ячейки с помощью окрашивания в синий цвет трипана.
- Возьмите 10 мкл клеток из 10 мл клеточной суспензии на стадии 3.11.
- Смешать с 10 мкл 0,4% раствора трипан синего цвета и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавьте смесь в гемоцитометр и определите жизнеспособное количество клеток. Мертвые клетки окрашены в синий цвет, в то время как жизнеспособные клетки не загрязнены.
- Центрифугируют ячейки при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбрасывают супернатант.
- Повторное суспендирование клеток с 10 мкл микрошариков Thy1.2 в 90 мкл охлажденного буфера MACS для менее чем 10 миллионов жизнеспособных клеток. Добавляйте больше бусин пропорционально, если есть более 10 миллионов жизнеспособных клеток. Пипетку смесь хорошо инкубируют при 4 °С в течение 30-60 мин.
- Добавьте 10 мл буфера MACS и хорошо перемешайте.
- Центрифугу при 200 х г в течение 5 мин, выбросьте надосадочный материал.
- Повторите шаги 3.15-3.16 один раз.
- Повторное суспендирование клеток и шариков с помощью 2 мл буфера MACS.
- Установите сепаратор MACS в вытяжке. Вставьте столбец LS в разделитель и уравновесьте столбец 3 мл буфера MACS.
- Когда столбец LS уравновешен, пропустите ячейки через столбец.
- Трижды промыть колонку LS 2 мл буфера MACS.
- Снимите колонку с сепаратора, трижды элюируйте ее 2 мл буфера MACS, а затем соберите элюирование в трубку объемом 50 мл.
- Центрифугу при 200 х г в течение 5 мин и выбросьте супернатант.
- Повторное суспендирование клеток 5 мл среды FB.
- Определите номер ячейки с помощью гемоцитометра.
- Разбавьте клетки средой FB и посейте клетки в тарелки или тарелки по желанию. Убедитесь, что плотность посева клеток составляет около 2-2,5 x 104 клеток/см2 (оптимизируйте плотность на основе отдельных экспериментов). Убедитесь, что прикрепленные фибробласты имеют овальную или круглую форму на второй день после посева (рисунок 3).
4. Получение ретровируса, кодирующего полицистронный вектор MGT для сердечного перепрограммирования
- Поддерживать Plat-E с питательными средами Plat-E (DMEM, дополненным 10% FBS, 1 мкг/мл пуромицина и 10 мкг/мл бластицидина) при 37 °C с 5% CO2.
- На 1-й день разделите Plat-E на 6-луночную пластину примерно 4-5 x 105 ячеек/плотность скважины.
- На 2-й день Plat-E обычно достигает 80% слияния. Трансфектируйте клетки с помощью следующих процедур. Отрегулируйте объем и количество каждого элемента, присутствующего здесь, на основе каждой скважины в 6-луночной пластине.
- Разбавить 2 мкг pMX-puro-MGT полицистронного вектора экспрессии ретровируса плазмиды (Addgene 111809) до 500 нг/мкл с помощью буфера TE.
- Готовят трансфекционную смесь, смешивая 10 мкл липофектамина со 150 мкл восстановленной сывороточной среды. Аккуратно пипетку хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Будьте осторожны, чтобы избежать пузырьков при пипетке.
- Тем временем готовят плазмидную смесь, смешивая плазмиду со 150 мкл восстановленной сывороточной среды. Аккуратно пипетку хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Будьте осторожны, чтобы избежать пузырьков при пипетке.
- Тщательно перемешайте две смеси и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин. Решение может выглядеть облачным.
- Добавляйте смесь по каплям в клетки, подлежащие трансфекции.
- Инкубируют клетки при 37 °C в течение ночи.
- На 3-й день замените среду на свежую полную культуральную среду, в которой отсутствуют пуромицин и бластицидин.
- На 4 день, через 48 ч после трансфекции, соберите супернатант, содержащий ретровирус, и храните его при 4 °C.
- На 5-й день, через 72 ч после трансфекции, соберите супернатант, содержащий ретровирус.
- Фильтруйте как 48-часовой, так и 72-часовой супернатант фильтром 0,45 мкм, выпадайте в осадок в течение ночи при 4 °C, добавляя 1/5 объема 40% раствора поли (этиленгликоля) (ПЭГ) для получения конечной концентрации 8% ПЭГ.
- Центрифуга при 4000 х г в течение 30 мин для осаждения вируса.
ПРИМЕЧАНИЕ: PEG8000-вирус образует небольшие белые осадки. - Повторно суспендировать вирус средой iCM, содержащей 8 мкг/мл полибрена по желанию. Немедленно используйте ретровирус.
5. Перепрограммирование НПФ в iCM с ретровирусной инфекцией, кодирующей MGT
- Выращивать или проходить НПФ до заражения вирусом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно NCF может быть пройден дважды. - На 0-й день высевают NCF до плотности около 1-2 х 104 клеток/см2 в среде FB.
- На 1 день замените культуральную среду вируссодержащей средой для каждой скважины по желанию. Используйте вирус из одной скважины Plat-E в 6-луночной пластине, чтобы заразить две скважины в 24-луночной пластине. Титр вируса для определения оптимальной концентрации вируса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусы, содержащие другие интересующие факторы перепрограммирования, могут быть введены вместе с ретровирусом MGT. - Инкубировать при 37 °C в течение ночи.
- На 2-й день, через 24 ч после заражения вирусом, замените вируссодержащую среду на обычную среду iCM.
- Чтобы контролировать экспрессию GCaMP3, поместите ее под перевернутый флуоресцентный микроскоп. Под 10x на канале GFP наблюдайте мягкую базальную флуоресценцию GCaMP3 части клеток уже на 5-й день.
- Заменяйте среду каждые 2-3 дня во время перепрограммирования. При необходимости проводят положительный отбор для клеток, инфицированных ретровирусом MGT, добавляя 2 мкг/мл пуромицина в культуральную среду в течение 3 дней и поддерживая ее на уровне 1 мкг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ввести химические вещества, представляющие интерес (например, IGF-1, MM589, A83-01 и PTC-209, называемые IMAP, как мы сообщали ранее15), наряду с изменением среды. - После 14 дней инфекции замените среду средой B27, чтобы еще больше индуцировать созревание iCM.
6. Оценка эффективности функционального созревания и перепрограммирования iCM по потоку Ca2+
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости добавить 1 мкМ изопротеренола в клетки, подлежащие оценке перед оценкой.
- Оцените поток Ca2+ с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа при комнатной температуре.
- В канале GFP наблюдайте за ячейками GCaMP3+ под 10-кратным объективом. Убедитесь, что он показывает спонтанное биение клеток в ярком полевом канале.
- Случайным образом выберите три поля под 20x и запишите поток Ca2+ iCM в течение 3 минут для каждого поля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь поток Ca2+ был синхронизирован со спонтанным биением клеток (рисунок 4, рисунок 5, и видео 3, видео 4, видео 5, видео 6, видео 7, видео 8). - Вручную количественно оцените ячейки с помощью потока Ca2+ .
7. Статистический анализ и представление данных
- Проанализируйте различия между группами односторонним дисперсионным анализом (ANOVA) и выполните множественные сравнительные тесты Student-Newman-Keuls.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты являются средними ± S.E с p < 0,05 считаются статистически значимыми. Каждый эксперимент проводился не менее трех раз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экспериментальный рабочий процесс для генерации штамма мыши Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 и генной структуры трансгенных мышей показан на рисунке 1. В то время как штамм мыши установлен, сердца детенышей были изолированы и наблюдались под обратным флуоресцентным микроскопом для подтверждения генотипа. Сердца с правильным генотипом показывают поток Ca2+, синхронизированный с биением, визуализированный как флуоресценция GCaMP3, в то время как флуоресценция не наблюдалась в контрольных сердцах (рисунок 2, видео 1 и видео 2). Изолированные NCF прикрепляются к скважине в течение 2 ч и показывают овальную или круглую форму через 1 день после посева (рисунок 3). Функциональную зрелость и эффективность перепрограммирования iCM оценивали по потоку Ca2+ через 14 дней после введения MGT. Перепрограммированные клетки могут быть оценены под флуоресцентным микроскопом для измерения потока Ca2+. Клетки GCaMP3+ можно найти как в группах IMAP, так и в группах MGT, в то время как группа IMAP показывает значительно больше клеток GCaMP3+ и клеток с паттернами колебаний Ca2+ ближе к нормальным СМ (видео 3-8). Как показано на рисунке 4A, репрезентативная ячейка в группе IMAP с колебаниями Ca2+ покажет изменение флуоресценции GCaMP3 между максимумом (средняя панель) и минимумом (правая панель), и колебание Ca2+ таких ячеек периодически изменяется (рисунок 4B). После введения IMAP количество бьющихся кластеров было значительно выше, чем в контрольной группе, так как количество клеток GCaMP3+ с потоком Ca2+ на поле высокой мощности (HPF, объектив 20x) было увеличено в группе со средней обработкой IMAP (рисунок 5).
Рисунок 1: Генерация штамма мыши Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3. Иллюстрация генерации штамма мыши Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 и генной структуры трансгенных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Ca2+ поток бьющегося сердца. Флуоресценция GCaMP3 была синхронизирована с сердцебиением в сердцах Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 (верхняя панель), в то время как флуоресценция не наблюдалась в контрольных сердцах (нижняя панель). Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Изолированные НКЭ, прикрепленные к 6-луночной пластине. (А) НКЭ под действием поля малой мощности (LPF, объектив 10x, шкала бар = 100 мкм). (B) NCF в поле высокой мощности (объектив 20x, шкала бар = 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Ca2+ поток перепрограммированных ячеек. (A) IMAP-обработанные NCF перепрограммированы на iCM по каналу GFP в поле высокой мощности (объектив 20x). Поток Ca2+ iCM был визуализирован как флуоресценция GCaMP3, в которой ячейки с потоком Ca2+ показывают повторяющееся мигание между основной флуоресценцией (Ca2+ min, средняя панель) и яркой флуоресценцией (Ca2+ max, правая панель), синхронизированной с биением. (B) Кривая трассировки Ca2+ ячеек ca2+ колебаний+ в группе IMAP. Шкала бар = 50 мкм. F/F0: относительная интенсивность флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 Рисунок 5: Оценка потока Ca2+ в среде IMAP. Количество Ячеек GCaMP3+ с потоком Ca2+ на HPF 2, 3, 4 недели после индукции MGT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Бьющееся сердце, выделенное у детенышей с генотипом αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 под сканирующим объективом (объектив 4x) в канале GFP. Сердце GCaMP3+ и мигает между базовой флуоресценцией (Ca2+ min) и яркой флуоресценцией (Ca2+ max), синхронизированной с биением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Бьющееся сердце, изолированное от детенышей с контрольным генотипом под сканирующим объективом в канале GFP. Сердце GCaMP3- и не показывает флуоресценцию, мигающую синхронизированную с биением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 3: iCM в группе IMAP под LPF в канале яркого поля (BF). Можно увидеть ячейку со значительным биением в центре поля. И Video 3, и Video 4 фокусируются на одном и том же поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 4: iCM в группе IMAP под LPF в канале GFP. Можно наблюдать несколько клеток с мигающей флуоресценцией, включая бьющуюся клетку, наблюдаемую в канале BF. И Video 3, и Video 4 фокусируются на одном и том же поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 5: iCM в группе IMAP под HPF в канале BF. Центр поля Video 3 и Video 4 наблюдался под HPF. Можно наблюдать клетку со значительным биением в центре поля. И Video 5, и Video 6 фокусируются на одном и том же поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 6: iCM в группе IMAP в HPF в канале GFP. Центральная часть поля Video 3 и Video 4 наблюдалась под HPF. Можно наблюдать несколько клеток с мигающей флуоресценцией, включая бьющуюся клетку, наблюдаемую в канале BF. И Video 5, и Video 6 фокусируются на одном и том же поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 7: iCM в группе MGT под HPF в канале BF. В отличие от значительных бьющихся клеток, наблюдаемых в группе IMAP, в группе MGT есть несколько биющихся клеток под каналом BF, что имеет более низкую эффективность перепрограммирования. И Video 7, и Video 8 фокусируются на одном и том же поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 8: iCM в группе MGT под HPF в канале GFP. Можно наблюдать несколько клеток с легкой мигающей флуоресценцией. И Video 7, и Video 8 фокусируются на одном и том же поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оценка функции iCM необходима для поля перепрограммирования сердца. В этой рукописи протокол описывает установленный штамм мыши Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J, как использовать NCF, выделенные от неонатальных мышей в этом штамме, для перепрограммирования на iCM и оценки функции iCM по потоку Ca2+ . Это метод de novo для оценки функционального созревания iCM.
Несколько критических шагов важны для успешного перепрограммирования и оценки с помощью этого метода. Во-первых, НПФ должны быть свежеприготовленными и здоровыми после изоляции. Необходима быстрая процедура изоляции и разрезания сердца. Самое главное, важно следить за временем инкубации, чтобы избежать переваривания и снижения жизнеспособности и состояния клеток. Во-вторых, среди всех процедур эффективность вирусной инфекции часто приводит к большим различиям в результатах. На эффективность вирусной инфекции в основном влияют два фактора. С одной стороны, титр вируса должен быть постоянным при различных попытках, что требует согласованности в количестве трансфектированных плазмид и сходном состоянии и плотности клеток Plat-E. Исследователи, следующие этому протоколу, должны оценить оптимальную плотность посева и время до этих процедур. Вирус следует использовать немедленно, чтобы избежать ослабления титра из-за чувствительности вируса к циклам замораживания-оттаивания. Кроме того, важно поддерживать NCF в здоровом состоянии и подходящей плотности во время заражения. Исследователи должны быть знакомы с характеристиками роста НПФ. Хотя различия в эффективности перепрограммирования должны быть ограничены, частый мониторинг может быть полезным. Этот протокол может быть легко модифицирован для совместного заражения NCF различными вирусами или лечения их химическими веществами, представляющими интерес. Таким образом, он применим как универсальный метод исследования сердечного перепрограммирования. Помимо моментов, упомянутых здесь, общие проблемы с этим методом включают низкую флуоресценцию, наблюдаемую после перепрограммирования. Это может быть связано с несколькими причинами. Во-первых, инфекция может быть не такой эффективной, как хотелось бы, что приводит к низкой эффективности перепрограммирования и ограничивает количество iCM. Во-вторых, состояние воздействия, возможно, потребуется оптимально скорректировать для наблюдения флуоресценции GCaMP3 iCM. Использование неонатальных кардиомиоцитов, выделенных у тех же детенышей, в качестве положительного контроля поможет выявить потенциальную причину.
Флюс Ca2+ широко используется для оценки активности клеток, в том числе в нейронных клетках16, молочной железе17, жировых тканях18 и др. В этом исследовании флюс Ca2+ использовался для оценки функционального созревания iCM. Ранее сообщалось, что поток Ca2+ может быть измерен специфическими химическими веществами, называемыми низкомолекулярными кальций-чувствительными красителями, которые могут быть использованы для оценки функции перепрограммированных клеток19. Однако такой способ имеет несколько ограничений: химическое вещество, вводимое в клетки, может иметь потенциальную токсичность и влиять на клеточные процессы, что делает результаты менее надежными, чем те, которые получены с помощью способа, представленного здесь. Кроме того, процесс окрашивания является сложным и трудоемким, а также предотвращает дальнейшую оценку этих клеток. Метод, представленный здесь, с другой стороны, преодолевает эти ограничения. GCaMP3 является неинвазивным для клеток, что сводит к минимуму влияние на активность клеток и позволяет проводить дальнейшую оценку клеток. Поскольку флуоресценция iCM зависит только от их идентичности, то есть экспрессии Myh6 и локального изменения концентрации Ca2+ , флуоресценция потока Ca2+ клеток становится видимой до тех пор, пока NCF перепрограммируются, что позволяет часто контролировать процесс перепрограммирования без трудоемкой стратегии. В то время как поток Ca2+ можно легко контролировать и регистрировать под инвертированным флуоресцентным микроскопом, повторное биение и связанная с ним электронная активность через клеточную мембрану, т.е. поток Ca2+ , могут быть дополнительно количественно определены во времени20. Как показано на рисунке 4B, такая количественная оценка может предоставить больше информации о зрелости iCM и проиллюстрировать более подробные структуры изменения потока Ca2+ во время перепрограммирования сердца.
Этот метод имеет ряд преимуществ. Во-первых, поток Ca2+ наблюдается исключительно в iCM. Поскольку Myh6 очень специфичен для CM, но не для CF, только успешно перепрограммированные клетки будут экспрессировать репортер GCaMP3 и станут флуоресцентными. Во-вторых, поток Ca2+ обеспечивает способ оценки функционального созревания iCM помимо метода мониторинга экспрессии CM-специфических генов. Из-за относительно длительной экспериментальной процедуры и вариаций, связанных с этим, функция iCM не всегда приемлема для дальнейшего изучения и потенциального клинического использования. В то время как экспрессия гена, специфичная для CM, раскрывает только часть характеристик перепрограммированной клетки, поток Ca2 + обеспечивает еще один аспект поля перепрограммирования сердца для оценки качества и эффективности перепрограммированных клеток. Кроме того, функциональное созревание больше связано с функцией сердца, что может быть лучшим показателем для оценки эффективности. Широко используемые методы в этой области включают проточную цитометрию, технику, которая требует переваривания трипсина всеми группами клеток. Хотя пищеварение может влиять на функции и характеристики клеток, оно вносит изменения в систему, уменьшая потенциал для воспроизведения наблюдаемых результатов и дальнейшей оценки этих клеток. По сравнению с этими методами трансгенный штамм мыши, показанный здесь, ограничил потенциальное влияние химических веществ или экспериментальных процедур, необходимых для оценки. Обладая этими преимуществами, этот штамм мыши упрощает процедуры оценки, необходимые для перепрограммирования сердца, и повышает воспроизводимость результатов в этой области.
Тем не менее, есть некоторые ограничения для этого исследования. Во-первых, создание штамма мыши занимает много времени. Приветствуются запросы о штамме мыши от коллег в этой области, чтобы сократить время, необходимое для создания штамма. Во-вторых, перепрограммирование сердца на iCM с помощью этого протокола включает в себя множество факторов и шагов, которые вносят относительно высокие вариации в систему. Мастерство в этой области поможет преодолеть этот вопрос. Наконец, поскольку GCaMP3 становится флуоресцентным только при условии потока Ca2+ , текущий метод оценки не может быть непосредственно использован для FACS в качестве сердечного перепрограммирования с Myh6-GFP strain7. Однако, хотя текущий штамм имеет больше и другие применения по сравнению с штаммом Myh6-GFP, такое неудобство можно преодолеть.
В целом, как описано в протоколе выше, штамм мыши Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 и последующая оценка созревания iCM обеспечивают стратегию мониторинга всего процесса сердечного перепрограммирования. Эта GCaMP3-опосредованная стратегия измерения потока Ca2+ может быть выполнена в живых клетках без ущерба для жизнеспособности клеток. Поскольку флуоресценция GCaMP3 обусловлена экспрессией генов, специфичной для миокарда, полученные флуоресцентные данные GCaMP3 могут быть дополнительно количественно определены для выявления эффективности перепрограммирования и активности iCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы высоко ценим усилия Льва Гнатовского в редактировании английского текста этой рукописи. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com. Это исследование было поддержано грантом Национального института здравоохранения (NIH) США (1R01HL109054) доктору Вану.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
- Frangogiannis, N. G.
- Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
- Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036 (2016).
- Grant, A. O.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).
- Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).
- Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312 (2016).
