Summary
Wir beschreiben hier die Einrichtung und Anwendung einer Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Maus-Reporterlinie zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs), die aus dem Mausstamm isoliert wurden, werden in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umgewandelt, was eine bequeme und effiziente Bewertung der Reprogrammierungseffizienz und der funktionellen Reifung von iCMs über den Calcium(Ca2+)-Fluss ermöglicht.
Abstract
Die kardiale Reprogrammierung ist zu einer potenziell vielversprechenden Therapie zur Reparatur eines beschädigten Herzens geworden. Durch die Einführung mehrerer Transkriptionsfaktoren, einschließlich Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), können Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umprogrammiert werden. Diese iCMs, wenn sie in situ in einem infarktierten Herzen erzeugt werden, integrieren sich elektrisch und mechanisch in das umgebende Myokard, was zu einer Verringerung der Narbengröße und einer Verbesserung der Herzfunktion führt. Aufgrund der relativ geringen Reprogrammierungseffizienz, Reinheit und Qualität der iCMs bleibt die Charakterisierung von iCMs eine Herausforderung. Die derzeit in diesem Bereich verwendeten Methoden, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunzytochemie und qPCR, konzentrieren sich hauptsächlich auf die kardialspezifische Gen- und Proteinexpression, nicht aber auf die funktionelle Reifung von iCMs. Ausgelöst durch Aktionspotentiale führt das Öffnen spannungsgesteuerter Calciumkanäle in Kardiomyozyten zu einem schnellen Zustrom von Calcium in die Zelle. Daher ist die Quantifizierung der Rate des Kalziumeinstroms eine vielversprechende Methode zur Bewertung der Kardiomyozytenfunktion. Hier stellt das Protokoll eine Methode zur Bewertung der iCM-Funktion durch Calcium (Ca2 +) -Fluss vor. Ein αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-Mausstamm wurde durch Kreuzung von Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (unten als Myh6-Cre bezeichnet) mit Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Mäuse etabliert. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs) von P0-P2-Neugeborenenmäusen wurden isoliert und in vitro kultiviert, und eine polycistronische Konstruktion von MGT wurde in NCFs eingeführt, was zu ihrer Reprogrammierung auf iCMs führte. Da nur erfolgreich reprogrammierte iCMs GCaMP3-Reporter exprimieren, kann die funktionelle Reifung von iCMs durch Ca2+- Fluss mit Fluoreszenzmikroskopie visuell beurteilt werden. Im Vergleich zu nicht reprogrammierten NCFs zeigten NCF-iCMs einen signifikanten transienten Kalziumfluss und eine spontane Kontraktion, ähnlich wie CMs. Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Etablierung von Mausstämmen, die Isolierung und Selektion neonataler Mäuseherzen, die NCF-Isolierung, die Produktion von Retroviren zur kardialen Reprogrammierung, die iCM-Induktion, die Auswertung des iCM Ca2+- Flusses unter Verwendung unserer Reporterlinie sowie die damit verbundene statistische Analyse und Datenpräsentation. Es wird erwartet, dass die hier beschriebenen Methoden eine wertvolle Plattform bieten werden, um die funktionelle Reifung von iCMs für kardiale Reprogrammierungsstudien zu bewerten.
Introduction
Myokardinfarkt (MI) ist weltweit eine schwere Erkrankung. Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) sind weltweit die häufigste Todesursache und für rund 18,6 Millionen Todesfälle im Jahr 20191 verantwortlich,2. Die Gesamtmortalität von CVDs ist im letzten halben Jahrhundert zurückgegangen. Dieser Trend wurde jedoch in einigen unterentwickelten Ländern verlangsamt oder sogar umgekehrt1, was eine wirksamere Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen erfordert. Als eine der tödlichen Manifestationen von CVD macht MI etwa die Hälfte aller Todesfälle aus, die auf CVDs in den Vereinigten Staaten zurückzuführen sind2. Während der Ischämie, mit der Blockierung der Koronararterien und der begrenzten Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff, erleidet das Myokard schwere metabolische Veränderungen, beeinträchtigt die systolische Funktion von Kardiomyozyten (CMs) und führt zum CM-Tod3. Zahlreiche Ansätze in der Herz-Kreislauf-Forschung wurden erforscht, um Herzverletzungen zu reparieren und die Funktion des verletzten Herzens wiederherzustellen4. Die direkte kardiale Reprogrammierung hat sich als eine vielversprechende Strategie zur Reparatur des geschädigten Herzens und zur Wiederherstellung seiner Funktion herausgestellt5,6. Durch die Einführung von Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) können Fibroblasten in vitro und in vivo auf iCMs umprogrammiert werden, und diese iCMs können den Narbenbereich reduzieren und die Herzfunktion verbessern7,8.
Obwohl die kardiale Reprogrammierung eine vielversprechende Strategie für die MI-Behandlung ist, gibt es noch eine Reihe von Herausforderungen. Erstens sind die Reprogrammierungseffizienz, Reinheit und Qualität nicht immer so hoch wie erwartet. Die MGT-Aufforderung kann nur 8,4% (cTnT+) oder 24,7% (αMHC-GFP+) der gesamten CFs erreichen, die in vitro7 auf iCMs umprogrammiert werden sollen7, oder bis zu 35% in vivo8, was ihre Anwendung einschränkt. Selbst mit mehr im System induzierten Faktoren wie Hand29 oder Akt1/PKB10 ist die Reprogrammierungseffizienz immer noch kaum zufriedenstellend, um in einem klinischen Umfeld eingesetzt zu werden. Daher sind in diesem Bereich weitere Studien erforderlich, die sich auf die Verbesserung der Reprogrammierungseffizienz konzentrieren. Zweitens sind die elektrische Integrität und die Kontraktionseigenschaften von iCMs wichtig für die effiziente Verbesserung der Herzfunktion, aber diese sind schwierig zu bewerten. Derzeit konzentrieren sich weit verbreitete Bewertungsmethoden auf diesem Gebiet, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunzytochemie und qPCR der Expression einiger wichtiger CMs-Gene, alle auf die Ähnlichkeit von iCMs und CMs, aber nicht direkt mit den funktionellen Eigenschaften von iCMs. Darüber hinaus haben diese Methoden relativ komplizierte Verfahren und sind zeitaufwendig. Während Reprogrammierungsstudien in der Regel ein Screening potenzieller Reprogrammierungsfaktoren beinhalten, die die Reifung von iCMs fördern11, erfordert die kardiale Reprogrammierung eine schnelle und bequeme Methode, die auf der iCMs-Funktion basiert.
CMs öffnen die spannungsgesteuerten Calciumionenkanäle auf der Zytomembran während jedes Kontraktionszyklus, was zu einem vorübergehenden Zustrom von Calciumionen (Ca2+) aus der interzellulären Flüssigkeit in das Zytoplasma führt, um an der Myofilamentkontraktion teilzunehmen. Ein solcher Ca2+-Ein- und Abflusszyklus ist das grundlegende Merkmal der Myokardkontraktion und bildet die normale Funktion von CMs12. Daher könnte eine Methode, die den Ca2+-Zustrom erkennt, eine mögliche Möglichkeit sein, die Funktion von CMs und CM-ähnlichen Zellen, einschließlich iCMs, zu messen. Darüber hinaus bietet eine solche Methode für iCMs eine weitere Möglichkeit, die Reprogrammierungseffizienz zu bewerten.
Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) wurden entwickelt und weit verbreitet verwendet, um Zellaktivitäten, insbesondere Aktionspotenziale, anzuzeigen. Im Allgemeinen bestehen GECIs aus einer Ca2 +- Bindungsdomäne wie Calmodulin und einer Fluoreszenzdomäne wie GFP, und GCaMP3 ist eine mit hoher Affinität und Fluoreszenzintensität. Die Fluoreszenzdomäne von GCaMP3 wird aktiviert, wenn die lokale Calciumkonzentration geändert wird13. In diesem Artikel wird ein Mausstamm beschrieben, der speziell einen GCaMP3-Reporter in Myh6+-Zellen exprimiert. Durch die Einführung von MGT in die isolierten NCFs von Neugeborenen dieses Stammes kann die Reprogrammierung durch Fluoreszenz überwacht werden, die erfolgreich reprogrammierte iCMs aufweisen werden. Ein solcher Mausstamm und eine solche Methode wird eine wertvolle Plattform bieten, um die kardiale Reprogrammierung zu untersuchen.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren und Praktiken mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care & Use Committee der University of Michigan genehmigt. Alle experimentellen Verfahren und Praktiken mit Zellkultur müssen BSL2 Biological Safety Cabinet unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Für die Verfahren und Praktiken im Zusammenhang mit Viren wurde die Richtlinie zur ordnungsgemäßen Entsorgung von transfizierten Zellen, Pipettenspitzen und Röhrchen befolgt, um das Risiko von Umwelt- und Gesundheitsgefahren zu vermeiden.
1. Etablierung eines Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (bezeichnet als Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) Mausstamms (Abbildung 1)
- Präparieren Sie Tg(Myh6-cre)1Jmk/J Mausstamm (Jackson Lab Stock 009074, bezeichnet als Myh6-Cre) bzw. Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J Mausstamm (Jackson Lab Stock 014538, bezeichnet als Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3).
- Züchten Sie jeden Stamm bis zu einem Alter von 8 Wochen, um erwachsene Myh6-Cre- bzw. Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-Mäuse zu erhalten.
- Kreuzung der erwachsenen Myh6-Cre und der Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mäuse.
HINWEIS: Richten Sie Myh6-Cre männlich / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 weiblich oder umgekehrt ein. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen ihren Nachkommen. Typischerweise bringen die weiblichen Mäuse 19-21 Tage nach der Kreuzung 8-10 Welpen zur Welt.
2. Isolierung und Auswahl von neonatalen Myh6-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mäuseherzen.
- Erhalten Sie P0-P2 Welpen. Stellen Sie sicher, dass 8-10 Welpen vorhanden sind, um 10 Millionen NCFs mit diesem Protokoll zu isolieren.
- Tief betäubt die Welpen durch Unterkühlung. Legen Sie die Welpen in einen Latexhandschuh und tauchen Sie bis zum Hals in zerstoßenes Eis und Wasser (2°C - 3°C) ein.
- Desinfizieren Sie die Welpen kurz mit 75% Ethanol.
- Opfere die Welpen durch Enthauptung mit einer sterilen Schere.
- Machen Sie einen horizontalen Schnitt in der Nähe des Herzens, drücken Sie das Herz zusammen und isolieren Sie es dann, indem Sie es an der Wurzel der Aorta mit einer Schere trennen.
- Beobachten Sie das Herz schlagen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Herzen mit Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Genotyp ca2+ flux zeigt, der durch GCaMP3 mit Herzschlag angezeigt wird. Die anderen Genotypen zeigen keine Fluoreszenz (Abbildung 2, Video 1 und Video 2).
3. Isolierung von neonatalen kardialen Fibroblasten (NCFs)
HINWEIS: Für diesen Teil wurde das Protokoll aus Dr. Li Qians Labor14 mit geringfügigen Optimierungen übernommen, sofern dies für diese Studie anwendbar ist.
- Nach der Isolierung der αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Herzen werden sie in vier Lose miteinander verbundene Teile geschnitten. Waschen Sie sie in eiskaltem DPBS in einer 6 cm großen Platte mehrmals gründlich, um die Blutzellverschmutzung in den isolierten Zellen zu begrenzen.
- Übertragen Sie die Herzen in ein 15 ml konisches Rohr.
- Verdauen Sie die Herzen mit 8 ml warmem 0,25% Trypsin-EDTA bei 37 °C für 10 min.
- Verwerfen Sie den Trypsinüberstand und geben Sie 5 ml warme Typ-II-Kollagenase (0,5 mg/ml) in HBSS.
- Die Mischung gründlich vorrühren und bei 37 °C für 5 min inkubieren.
- Nach der Inkubation gründlich wirbeln und das unverdaute Gewebe durch schwerkraft absetzen lassen.
- Sammeln Sie den Überstand in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml kaltem Fibroblastenmedium (FB) (IMDM mit 20% FBS und 1% Penicillin/ Streptomycin).
- Wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.7 für das unverdaute Gewebe 4-5 Mal.
- Sammeln Sie alle Überstände zusammen und filtern Sie den Überstand mit einem 40 μm Sieb.
- Zentrifugiere bei 200 x g für 5 min bei 4 °C und entsorge den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL Magnetaktivierten Zellsortierpuffer (MACS-Puffer; 1x PBS mit 2 mM EDTA und 0,5% BSA).
- Bestimmen Sie die lebensfähige Zellzahl durch Trypanblaufärbung.
- Nehmen Sie 10 μL Zellen aus 10 ml Zellsuspension in Schritt 3.11.
- Mischen Sie mit 10 μL 0,4% iger trypanblauer Lösung und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie die Mischung zu einem Hämozytometer hinzu und bestimmen Sie die lebensfähige Zellzahl. Die toten Zellen sind blau gefärbt, während die lebensfähigen Zellen nicht angefärbt sind.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C und verwerfen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 10 μL Thy1,2-Mikrokügelchen in 90 μL gekühltem MACS-Puffer für weniger als 10 Millionen lebensfähige Zellen. Fügen Sie proportional mehr Perlen hinzu, wenn es mehr als 10 Millionen lebensfähige Zellen gibt. Die Mischung gut pipettieren und bei 4 °C für 30-60 min inkubieren.
- Fügen Sie 10 ml MACS-Puffer hinzu und mischen Sie gut.
- Zentrifugiere bei 200 x g für 5 min, verwerfe den Überstand.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.15-3.16 einmal.
- Resuspendieren Sie die Zellen und Kügelchen mit 2 ml MACS-Puffer.
- Richten Sie einen MACS-Separator in der Haube ein. Fügen Sie eine LS-Spalte in das Trennzeichen ein und gleichen Sie die Spalte mit 3 ml MACS-Puffer aus.
- Wenn die LS-Spalte ausgeglichen ist, führen Sie die Zellen durch die Spalte.
- Waschen Sie die LS-Säule dreimal mit 2 ml MACS-Puffer.
- Nehmen Sie die Säule vom Separator, eluieren Sie sie dreimal mit 2 ml MACS-Puffer und sammeln Sie dann die Elution in einem 50 ml Rohr.
- Zentrifugiere bei 200 x g für 5 min und entsorge den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 5 ml FB-Medien.
- Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
- Verdünnen Sie die Zellen mit FB-Medien und säen Sie die Zellen nach Belieben auf Schalen oder Teller. Stellen Sie sicher, dass die Zellaussaatdichte etwa 2-2,5 x 104 Zellen/cm2 beträgt (optimieren Sie die Dichte basierend auf einzelnen Experimenten). Stellen Sie sicher, dass die anhaftenden Fibroblasten am zweiten Tag nach der Aussaat eine ovale bis runde Form haben (Abbildung 3).
4. Herstellung eines Retrovirus-kodierenden polycistronischen MGT-Vektors zur kardialen Reprogrammierung
- Halten Sie Plat-E mit Plat-E-Kulturmedien (DMEM ergänzt mit 10% FBS, 1 μg/ml Puromycin und 10 μg/ml Blasticidin) bei 37 °C mit 5% CO2.
- Teilen Sie an Tag 1 Plat-E in eine 6-Well-Platte mit einer Dichte von ca. 4-5 x 105 Zellen / Well.
- An Tag 2 erreicht Plat-E typischerweise 80% Konfluenz. Transfizieren Sie die Zellen mit den folgenden Verfahren. Passen Sie das Volumen und die Menge jedes hier vorhandenen Elements basierend auf jeder Vertiefung in einer 6-Well-Platte an.
- Verdünnen Sie 2 μg pMX-puro-MGT polycistronischen Retrovirus-Expressionsplasmidvektor (Addgen 111809) auf 500 ng/μL mit TE-Puffer.
- Bereiten Sie die Transfektionsmischung vor, indem Sie 10 μL Lipofektamin mit 150 μL reduziertem Serummedium mischen. Vorsichtig pipettieren, gut mischen und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren. Achten Sie darauf, Blasen beim Pipettieren zu vermeiden.
- In der Zwischenzeit eine Plasmidmischung herstellen, indem Sie das Plasmid mit 150 μL reduziertem Serummedium mischen. Vorsichtig pipettieren, gut mischen und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren. Achten Sie darauf, Blasen beim Pipettieren zu vermeiden.
- Die beiden Mischungen vorsichtig vermischen und bei Raumtemperatur 5 min inkubieren. Die Lösung kann wolkig erscheinen.
- Fügen Sie die Mischung Tropfen für Tropfen zu den zu transfizierenden Zellen hinzu.
- Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C.
- Wechseln Sie am Tag 3 das Medium in ein frisches vollständiges Zellkulturmedium ohne Puromycin und Blasticidin.
- Am Tag 4, 48 h nach der Transfektion, sammeln Sie den Überstand, der Retroviren enthält, und lagern Sie ihn in 4 ° C.
- Sammeln Sie am Tag 5, 72 h nach der Transfektion, den Überstand, der Retroviren enthält.
- Sowohl den 48 h als auch den 72 h Überstand mit einem 0,45 μm Filter filtrieren, über Nacht bei 4 °C durch Zugabe von 1/5 Volumen 40% Poly (Ethylenglykol) (PEG) Lösung zu einer Endkonzentration von 8% PEG ausfallen.
- Zentrifugieren Sie bei 4.000 x g für 30 min, um das Virus auszufällen.
HINWEIS: Das PEG8000-Virus bildet einen kleinen weißen Niederschlag. - Resuspendieren Sie das Virus mit einem iCM-Medium, das 8 μg/ml Polybrenn enthält, wie gewünscht. Verwenden Sie das Retrovirus sofort.
5. Umprogrammierung von NCFs auf iCMs mit MGT-kodierender Retrovirus-Infektion
- Züchten oder passieren Sie NCFs vor der Virusinfektion.
HINWEIS: Normalerweise kann NCF zweimal durchlaufen werden. - Am Tag 0 ncf auf die Dichte von etwa 1-2 x 104 Zellen/cm2 in FB-Medium ausrichten.
- Ersetzen Sie an Tag 1 das Kulturmedium durch ein virushaltiges Medium für jede Vertiefung nach Belieben. Verwenden Sie das Virus aus einem Brunnen Plat-E in einer 6-Well-Platte, um zwei Vertiefungen in einer 24-Well-Platte zu infizieren. Titeren Sie das Virus, um die optimale Viruskonzentration zu bestimmen.
HINWEIS: Viren, die andere Reprogrammierungsfaktoren von Interesse enthalten, könnten zusammen mit dem MGT-Retrovirus eingeführt werden. - Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Ersetzen Sie am Tag 2, 24 h nach der Virusinfektion, das virushaltige Medium durch ein normales iCM-Medium.
- Um die GCaMP3-Expression zu überwachen, platten Sie sie unter ein inverses Fluoreszenzmikroskop. Beobachten Sie unter 10x am GFP-Kanal die milde basale GCaMP3-Fluoreszenz eines Teils der Zellen bereits am Tag 5.
- Tauschen Sie das Medium während der Neuprogrammierung alle 2-3 Tage aus. Falls erforderlich, führen Sie eine positive Selektion für MGT-Retrovirus-infizierte Zellen durch, indem Sie 3 Tage lang 2 μg/ml Puromycin in das Kulturmedium geben und bei 1 μg/ml halten.
HINWEIS: Einführung von Chemikalien von Interesse (z. B. IGF-1, MM589, A83-01 und PTC-209, die als IMAP bezeichnet werden, wie wir bereits berichtet haben15), zusammen mit der Mitteländerung. - Ersetzen Sie das Medium nach 14 Tagen Infektion durch B27-Medium, um die iCM-Reifung weiter zu induzieren.
6. Bewertung der iCM-Funktionsreifung und Reprogrammierungseffizienz durch Ca2+ Fluss
HINWEIS: Geben Sie den zu bewertenden Zellen vor der Beurteilung erforderlichenfalls 1 μM Isoproterenol hinzu.
- Beurteilen Sie den Ca2+ -Fluss mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei Raumtemperatur.
- Beobachten Sie im GFP-Kanal die GCaMP3+-Zellen unter dem 10-fachen Objektiv. Stellen Sie sicher, dass es spontane Zellschläge im Hellfeldkanal zeigt.
- Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Felder unter 20x aus und zeichnen Sie den Ca2+ -Fluss der iCMs für 3 Minuten für jedes Feld auf.
HINWEIS: Hier wurde der Ca2+- Fluss mit spontanem Zellschlag synchronisiert (Abbildung 4, Abbildung 5 und Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7, Video 8). - Quantifizieren Sie die Zellen manuell mit ca2+ Fluss.
7. Statistische Auswertung und Datendarstellung
- Analysieren Sie die Unterschiede zwischen den Gruppen, einseitige Varianzanalyse (ANOVA) und führen Sie die Multiple-Vergleichstests Student-Newman-Keuls durch.
ANMERKUNG: Die Ergebnisse entsprechen dem Mittelwert ± S.E. mit p < 0,05, die als statistisch signifikant angesehen werden. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal durchgeführt.
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Representative Results
Der experimentelle Workflow zur Erzeugung des Mausstamms Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 und die Genstruktur der transgenen Mäuse ist in Abbildung 1 dargestellt. Während der Mausstamm etabliert ist, wurden die Herzen der Welpen isoliert und unter einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um den Genotyp zu bestätigen. Herzen mit korrektem Genotyp zeigen ca2+-Fluss synchronisiert mit schlagen, visualisiert als GCaMP3-Fluoreszenz, während in Kontrollherzen keine Fluoreszenz beobachtet wurde (Abbildung 2, Video 1 und Video 2). Isolierte NCFs heften sich innerhalb von 2 h an die Vertiefung und zeigen 1 Tag nach der Aussaat eine ovale bis runde Form (Abbildung 3). Die funktionelle Reife und die Reprogrammierungseffizienz von iCMs wurden 14 Tage nach Einführung der MGT mit Ca2+ Flux bewertet. Die reprogrammierten Zellen können unter einem Fluoreszenzmikroskop beurteilt werden, um den Ca2+-Fluss zu messen. GCaMP3+-Zellen konnten sowohl in IMAP- als auch in MGT-Gruppen gefunden werden, während die IMAP-Gruppe signifikant mehr GCaMP3+-Zellen und Zellen mit Ca2+-Oszillationsmustern zeigt, die näher an normalen CMs liegen (Videos 3-8). Wie in Abbildung 4A gezeigt, zeigt eine repräsentative Zelle in der IMAP-Gruppe mit Ca2+-Oszillation eine GCaMP3-Fluoreszenzänderung zwischen dem Maximum (mittleres Bild) und dem Minimum (rechtes Feld), und die Ca2+-Oszillation solcher Zellen wird periodisch geändert (Abbildung 4B). Nach der Einführung von IMAP war die Anzahl der Schlagcluster signifikant höher als in der Kontrollgruppe, da die Anzahl der GCaMP3+-Zellen mit Ca2+-Fluss pro Hochleistungsfeld (HPF, 20-fache Objektivlinse) in der IMAP-mittelbehandelten Gruppe erhöht war (Abbildung 5).
Abbildung 1: Erzeugen des Mausstamms Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3. Illustration der Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mausstammbildung und der Genstruktur der transgenen Mäuse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ca2+ Fluss des schlagenden Herzens. Die GCaMP3-Fluoreszenz wurde mit dem Herzschlag in Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-Herzen (oberes Bild) synchronisiert, während bei Kontrollherzen (unteres Bild) keine Fluoreszenz beobachtet wurde. Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Isolierte NCFs, die an einer 6-Well-Platte befestigt sind. (A) NCFs unter niedrigem Leistungsfeld (LPF, 10-faches Objektiv, Skalenbalken = 100 μm). (B) NCFs unter hohem Leistungsfeld (20x Objektiv, Maßstabsleiste = 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Ca2+ -Fluss reprogrammierter Zellen. (A) IMAP-behandelte NCFs, die auf iCMs unter GFP-Kanal bei hohem Leistungsfeld (20-faches Objektiv) umprogrammiert wurden. Der Ca2+ -Fluss von iCMs wurde als GCaMP3-Fluoreszenz visualisiert, bei dem Zellen mit Ca2+- Fluss ein wiederholtes Blinken zwischen Basisfluoreszenz (Ca2+ min, mittleres Panel) und heller Fluoreszenz (Ca2+ max, rechtes Panel) zeigen, das mit dem Schlagen synchronisiert ist. (B) Ca2+ -Spurenkurve von Ca2+- Oszillationszellen in der IMAP-Gruppe. Maßstabsleiste = 50 μm. F/F0: relative Fluoreszenzintensität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 Abbildung 5: Bewertung des Ca2+- Flusses unter IMAP-Medium. Anzahl der GCaMP3+-Zellen mit Ca2+- Fluss pro HPF 2, 3, 4 Wochen nach MGT-Induktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Ein schlagendes Herz isoliert von Welpen mit αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Genotyp unter Scanning-Objektiv (4x Objektiv) im GFP-Kanal. Das Herz ist GCaMP3+ und blinkt zwischen Basisfluoreszenz (Ca2+ min) und heller Fluoreszenz (Ca2+ max) synchronisiert mit Schlagen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Ein schlagendes Herz, isoliert von Welpen mit Kontrollgennotyp unter Scanning-Objektiv im GFP-Kanal. Das Herz ist GCaMP3- und zeigt kein Fluoreszenzblitz synchronisiert mit schlagen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 3: iCMs in der IMAP-Gruppe unter LPF im Hellfeldkanal (BF). Eine Zelle mit signifikanten Schlägen in der Mitte des Feldes ist zu sehen. Sowohl Video 3 als auch Video 4 konzentrieren sich auf dasselbe Feld. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 4: iCMs in der IMAP-Gruppe unter LPF im GFP-Kanal. Mehrere Zellen mit blinkender Fluoreszenz, einschließlich der schlagenden Zelle, die im BF-Kanal zu sehen ist, können beobachtet werden. Sowohl Video 3 als auch Video 4 konzentrieren sich auf dasselbe Feld. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 5: iCMs in der IMAP-Gruppe unter HPF im BF-Kanal. Das Zentrum des Feldes von Video 3 und Video 4 wurde unter HPF beobachtet. Eine Zelle mit signifikantem Schlag in der Mitte des Feldes kann beobachtet werden. Sowohl Video 5 als auch Video 6 konzentrieren sich auf das gleiche Feld. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 6: iCMs in der IMAP-Gruppe unter HPF im GFP-Kanal. Der mittlere Teil des Feldes von Video 3 und Video 4 wurde unter HPF beobachtet. Mehrere Zellen mit blinkender Fluoreszenz, einschließlich der schlagenden Zelle, die im BF-Kanal zu sehen ist, können beobachtet werden. Sowohl Video 5 als auch Video 6 konzentrieren sich auf das gleiche Feld. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 7: iCMs in der MGT-Gruppe unter HPF im BF-Kanal. Im Gegensatz zu signifikanten Schlagzellen, die in der IMAP-Gruppe beobachtet wurden, gibt es in der MGT-Gruppe einige Schlagzellen unter dem BF-Kanal, der eine geringere Reprogrammierungseffizienz aufweist. Sowohl Video 7 als auch Video 8 konzentrieren sich auf das gleiche Feld. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 8: iCMs in der MGT-Gruppe unter HPF im GFP-Kanal. Mehrere Zellen mit leichter blinkender Fluoreszenz können beobachtet werden. Sowohl Video 7 als auch Video 8 konzentrieren sich auf das gleiche Feld. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Die Bewertung der iCMs-Funktion ist für das Kardiale Reprogrammierungsfeld notwendig. In diesem Manuskript beschreibt das Protokoll einen Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J Mausstamm, der etabliert wurde, wie die ncFs, die von den neonatalen Mäusen in diesem Stamm isoliert wurden, für die Reprogrammierung auf iCMs und die Bewertung der iCMs-Funktion durch Ca2+- Fluss verwendet werden. Dies ist eine De-novo-Methode zur Bewertung der funktionellen Reifung von iCMs.
Mehrere kritische Schritte sind wichtig, um mit dieser Methode erfolgreich umprogrammiert und evaluiert zu werden. Erstens sollten NCFs frisch zubereitet und nach der Isolierung gesund sein. Ein schnelles Verfahren der Herzisolierung und des Schneidens ist unerlässlich. Am wichtigsten ist, dass es wichtig ist, die Inkubationszeit einzuhalten, um eine Überverdauung und eine Verringerung der Lebensfähigkeit und des Zustands der Zellen zu vermeiden. Zweitens führt die Effizienz der Virusinfektion unter allen Verfahren oft zu einer hohen Variation der Ergebnisse. Die Effizienz der Virusinfektion wird hauptsächlich von zwei Faktoren beeinflusst. Auf der einen Seite sollte der Virustiter zwischen verschiedenen Versuchen konstant sein, was Konsistenz in der Menge der transfizierten Plasmide und einer ähnlichen Plat-E-Zellbedingung und -dichte erfordert. Forscher, die dieses Protokoll befolgen, sollten die optimale Seeding-Dichte und -Zeit vor diesen Verfahren bewerten. Das Virus sollte sofort verwendet werden, um eine Titerdämpfung aufgrund der Virusempfindlichkeit gegenüber Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Darüber hinaus ist es wichtig, NCFs zum Zeitpunkt der Infektion in einem gesunden Zustand und einer geeigneten Dichte zu halten. Forscher sollten mit den Wachstumsmerkmalen von NCFs vertraut sein. Während die Variation der Reprogrammierungseffizienz begrenzt sein sollte, könnte eine häufige Überwachung hilfreich sein. Dieses Protokoll kann leicht modifiziert werden, um NCFs mit verschiedenen Viren zu infizieren oder sie mit Chemikalien von Interesse zu behandeln. Somit ist es als universelle Methode für die kardiale Reprogrammierungsforschung anwendbar. Neben den hier genannten Punkten gehören zu den häufigen Problemen bei dieser Methode eine niedrige Fluoreszenz, die nach der Reprogrammierung beobachtet wurde. Dies kann mehrere Gründe haben. Erstens ist die Infektion möglicherweise nicht so effektiv wie gewünscht, was zu einer geringen Reprogrammierungseffizienz führt und die Anzahl der iCMs begrenzt. Zweitens muss die Expositionsbedingung möglicherweise optimal für die Beobachtung der GCaMP3-Fluoreszenz von iCMs eingestellt werden. Die Verwendung von neonatalen Kardiomyozyten, die aus denselben Welpen als Positivkontrolle isoliert wurden, hilft, den möglichen Grund zu identifizieren.
Ca2+ Flussmittel wurde häufig verwendet, um Zellaktivitäten zu bewerten, einschließlich in Neuronenzellen16, Brustdrüse17, Fettgewebe18 usw. In dieser Studie wurde der Ca2+-Fluss verwendet, um die funktionelle Reifung von iCMs zu beurteilen. Zuvor wurde berichtet, dass der Ca2+-Fluss durch spezifische Chemikalien gemessen werden kann, die als niedermolekulare calciumempfindliche Farbstoffe bezeichnet werden und zur Bewertung der Funktion reprogrammierter Zellen verwendet werden können19. Eine solche Methode hat jedoch mehrere Einschränkungen: Die in die Zellen eingebrachte Chemikalie kann eine potenzielle Toxizität aufweisen und die zellulären Prozesse beeinflussen, wodurch die Ergebnisse weniger zuverlässig sind als die mit der hier vorgestellten Methode erhaltenen Ergebnisse. Außerdem ist der Färbeprozess kompliziert und zeitaufwendig und verhindert gleichzeitig weitere Auswertungen dieser Zellen. Die hier vorgestellte Methode hingegen überwindet diese Einschränkungen. GCaMP3 ist nicht-invasiv für die Zellen, was die Einflüsse auf die Zellaktivitäten minimiert und eine weitere Auswertung der Zellen ermöglicht. Da die Fluoreszenz von iCMs nur von ihrer Identität abhängt, d.h. der Myh6-Expression und der lokalen Ca2+-Konzentrationsänderung, wird die Ca2+-Flussfluoreszenz von Zellen sichtbar, solange NCFs neu programmiert werden, was eine häufige Überwachung des Reprogrammierungsprozesses ohne zeitaufwändige Strategie ermöglicht. Während der Ca2+-Fluss unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop leicht überwacht und aufgezeichnet werden kann, können das wiederholte Schlagen und die damit verbundene elektronische Aktivität über die Zellmembran, d.h. der Ca2+-Fluss, weiter zeitlich quantifiziert werden20. Wie in Abbildung 4B gezeigt, kann eine solche Quantifizierung mehr Informationen über die Reife von iCMs liefern und detailliertere Strukturen der Ca2+-Flussänderung während der kardialen Reprogrammierung veranschaulichen.
Diese Methode hat mehrere Vorteile. Erstens wird der Ca2+- Fluss ausschließlich in iCMs beobachtet. Da Myh6 sehr spezifisch für CMs, aber nicht für CFs ist, exprimieren nur die erfolgreich reprogrammierten Zellen den GCaMP3-Reporter und werden fluoreszierend. Zweitens bietet Ca2+ Flux eine Möglichkeit, die funktionelle Reifung von iCMs neben der Methode zur Überwachung der Expression von CM-spezifischen Genen zu bewerten. Aufgrund des relativ langen experimentellen Verfahrens und der damit verbundenen Variation ist die Funktion von iCMs für weitere Studien und den potenziellen klinischen Einsatz nicht immer akzeptabel. Während die CM-spezifische Genexpression nur einen Teil der Eigenschaften der reprogrammierten Zelle offenbart, liefert der Ca2+ -Fluss einen weiteren Aspekt des kardialen Reprogrammierungsfeldes, um die Qualität und Effizienz der reprogrammierten Zelle zu bewerten. Darüber hinaus hängt die funktionelle Reifung mehr mit der Herzfunktion zusammen, was ein besserer Indikator für die Bewertung der Effizienz sein kann. Zu den weit verbreiteten Methoden auf diesem Gebiet gehört die Durchflusszytometrie, eine Technik, die einen Trypsin-Aufschluss aller Zellgruppen erfordert. Während die Verdauung die Zellfunktionen und -eigenschaften beeinflussen kann, führt sie zu Variationen im System, wodurch das Potenzial verringert wird, die beobachteten Ergebnisse zu reproduzieren und diese Zellen weiter zu bewerten. Im Vergleich zu diesen Methoden hat der hier gezeigte transgene Mausstamm den potenziellen Einfluss von Chemikalien oder experimentellen Verfahren, die für die Bewertung erforderlich sind, begrenzt. Mit diesen Vorteilen vereinfacht dieser Mausstamm die für die kardiale Reprogrammierung erforderlichen Bewertungsverfahren und verbessert die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse in diesem Bereich.
Es gibt jedoch einige Einschränkungen für diese Studie. Erstens ist die Etablierung von Mausstämmen zeitaufwendig. Anfragen der Maussorte von Kollegen auf diesem Gebiet sind willkommen, um die für die Stammetablierung benötigte Zeit zu verkürzen. Zweitens umfasst die kardiale Reprogrammierung auf iCMs mit diesem Protokoll mehrere Faktoren und Schritte, die relativ hohe Variationen in das System einbringen. Kenntnisse auf diesem Gebiet werden dazu beitragen, dieses Problem zu überwinden. Da das GCaMP3 nur unter Ca2+-Flussbedingungen fluoreszierend wird, kann die aktuelle Auswertungsmethode nicht direkt für FACS als kardiale Reprogrammierung mit Myh6-GFP-Stamm7 verwendet werden. Während der aktuelle Stamm jedoch im Vergleich zum Myh6-GFP-Stamm mehr und andere Anwendungen hat, kann eine solche Unannehmlichkeit überwunden werden.
Wie das Protokoll oben beschrieben hat, bieten der Mausstamm Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 und die anschließende Auswertung der Reifung von iCMs insgesamt eine Strategie zur Überwachung des gesamten Prozesses der kardialen Reprogrammierung. Diese GCaMP3-vermittelte Ca2+ -Flussmessstrategie kann in lebenden Zellen durchgeführt werden, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Da die GCaMP3-Fluoreszenz durch die myokardspezifische Genexpression angetrieben wird, können die erfassten GCaMP3-Fluoreszenzdaten weiter quantifiziert werden, um die Reprogrammierungseffizienz und die iCMs-Aktivität zu zeigen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir schätzen die Bemühungen von Leo Gnatovskiy bei der Bearbeitung des englischen Textes dieses Manuskripts. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt. Diese Studie wurde durch das Stipendium der National Institutes of Health (NIH) der Vereinigten Staaten (1R01HL109054) an Dr. Wang unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
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