Summary
نحن نصف هنا، إنشاء وتطبيق TG (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (يشار إليه باسم αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 أدناه) خط مراسل الماوس لتقييم إعادة برمجة القلب. يتم تحويل الخلايا الليفية القلبية الوليدية (NCFs) المعزولة عن سلالة الماوس إلى خلايا قلبية مستحثة (iCMs) ، مما يسمح بتقييم مناسب وفعال لكفاءة إعادة البرمجة والنضج الوظيفي ل iCMs عن طريق تدفق الكالسيوم (Ca2+).
Abstract
أصبحت إعادة برمجة القلب علاجا واعدا لإصلاح القلب التالف. من خلال إدخال عوامل نسخ متعددة ، بما في ذلك Mef2c ، Gata4 ، Tbx5 (MGT) ، يمكن إعادة برمجة الخلايا الليفية في خلايا القلب المستحثة (iCMs). هذه iCMs، عندما ولدت في الموقع في قلب متشح، ودمج كهربائيا وميكانيا مع عضلة القلب المحيطة بها، مما يؤدي إلى انخفاض في حجم ندبة وتحسين في وظيفة القلب. ونظرا للانخفاض النسبي في كفاءة إعادة البرمجة ونقاوتها وجودتها، فإن توصيف الأجهزة iCMs يظل تحديا. تركز الأساليب المستخدمة حاليا في هذا المجال، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي والكيمياء المناعية وqPCR، بشكل رئيسي على التعبير الجيني والبروتيني الخاص بالقلب ولكن ليس على النضج الوظيفي ل iCMs. يؤدي فتح قنوات الكالسيوم ذات بوابات الجهد في خلايا القلب إلى تدفق سريع للكالسيوم إلى الخلية بسبب إمكانات العمل. لذلك ، فإن تحديد معدل تدفق الكالسيوم هو طريقة واعدة لتقييم وظيفة القلب. هنا، يقدم البروتوكول طريقة لتقييم وظيفة iCM عن طريق تدفق الكالسيوم (Ca2+). تم تأسيس سلالة ماوس αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 من خلال عبور Tg (Myh6-cre)1Jmk/J (يشار إليه باسم Myh6-Cre أدناه) مع Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (يشار إليها باسم Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 أدناه) الفئران. تم عزل الخلايا الليفية القلبية الوليدية (NCFs) من فئران حديثي الولادة P0-P2 واستزراعها في المختبر ، وتم إدخال بناء متعدد الحسابات ل MGT إلى NCFs ، مما أدى إلى إعادة برمجتها إلى iCMs. لأن فقط إعادة برمجة iCMs بنجاح سوف تعبر عن مراسل GCaMP3، يمكن تقييم النضج الوظيفي لل iCMs بصريا من خلال تدفق Ca2+ مع المجهر الفلوري. وبالمقارنة مع الصناديق غير المبرمجة، أظهرت NCF-iCMs تدفقا عابرا كبيرا للكالسيوم وانكماشا عفويا، على غرار CMs. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل إنشاء سلالة الماوس وعزل واختيار قلوب الفئران الوليدية وعزلة NCF وإنتاج الفيروس الرجعية لإعادة برمجة القلب ، وحث iCM ، وتقييم تدفق iCM Ca2 + باستخدام خط المراسل الخاص بنا ، والتحليل الإحصائي ذي الصلة وعرض البيانات. ومن المتوقع أن توفر الأساليب الموصوفة هنا منصة قيمة لتقييم النضج الوظيفي ل iCMs لدراسات إعادة برمجة القلب.
Introduction
احتشاء عضلة القلب (MI) هو مرض شديد في جميع أنحاء العالم. أمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs) هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم وتسبب ما يقرب من 18.6 مليون حالة وفاة في عام 20191،2. وقد انخفض مجموع الوفيات الناجمة عن الأمراض القلبية الوعائية خلال نصف القرن الماضي. ومع ذلك، تباطأ هذا الاتجاه أو حتى انعكس في بعض البلدان غير المتطورة1، مما يدعو إلى علاجات أكثر فعالية للأمراض القلبية الوعائية. باعتبارها واحدة من المظاهر القاتلة للأمراض القلبية الوعائية، يمثل MI حوالي نصف جميع الوفيات المنسوبة إلى الأمراض القلبية الوعائية في الولايات المتحدة2. خلال نقص التروية ، مع انسداد الشرايين التاجية والعرض المحدود لكل من العناصر الغذائية والأوكسجين ، يعاني عضلة القلب من تغيرات استقلابية حادة ، ويضعف الوظيفة الانقباضية لخلايا القلب (CMs) ، ويؤدي إلى موت CM3. وقد تم استكشاف العديد من النهج في أبحاث القلب والأوعية الدموية لإصلاح إصابة القلب واستعادة وظيفة القلب المصاب4. ظهرت إعادة برمجة القلب المباشرة كاستراتيجية واعدة لإصلاح القلب التالف واستعادة وظيفته5،6. من خلال إدخال Mef2c، Gata4، Tbx5 (MGT)، يمكن إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى iCMs في المختبر وفي الجسم الحي، ويمكن لتلك iCMs تقليل منطقة ندبة وتحسين وظيفة القلب7،8.
على الرغم من أن إعادة برمجة القلب هي استراتيجية واعدة لعلاج MI ، لا يزال هناك عدد من التحديات. أولا، كفاءة إعادة البرمجة، والنقاء، والجودة ليست دائما عالية كما هو متوقع. يمكن أن يحقق إغراء MGT 8.4٪ فقط (cTnT+) أو 24.7٪ (αMHC-GFP+) من إجمالي CFs التي سيتم إعادة برمجتها على iCMs في المختبر7 ، أو ما يصل إلى 35٪ في vivo8 ، مما يحد من تطبيقها. حتى مع وجود المزيد من العوامل المستحثة في النظام ، مثل Hand29 أو Akt1 /PKB10 ، فإن كفاءة إعادة البرمجة لا تزال مرضية بالكاد لاستخدامها في بيئة سريرية. ومن ثم، يلزم إجراء المزيد من الدراسات التي تركز على تحسين كفاءة إعادة البرمجة في هذا المجال. ثانيا، تعتبر خصائص السلامة الكهربائية والانكماش لأجهزة iCMs مهمة لتحسين كفاءة وظائف القلب، ومع ذلك فإن تقييمها صعب. وفي الوقت الراهن، تركز أساليب التقييم المستخدمة على نطاق واسع في هذا المجال، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، والكيمياء المناعية، وqPCR لبعض التعبيرات الرئيسية لجينات CMs، على تشابه ال iCMs و CMs، ولكنها لا ترتبط مباشرة بالخصائص الوظيفية ل iCMs. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب لها إجراءات معقدة نسبيا وتستغرق وقتا طويلا. في حين أن دراسات إعادة البرمجة عادة ما تنطوي على فحص لعوامل إعادة البرمجة المحتملة التي تعزز نضوج iCMs11 ، تتطلب إعادة برمجة القلب طريقة سريعة ومريحة استنادا إلى وظيفة iCMs.
CMs فتح قنوات أيونات الكالسيوم ذات بوابات الجهد على السيتوميمبران خلال كل دورة التعاقد، مما يؤدي إلى تدفق عابر من أيون الكالسيوم (Ca2+) من السائل بين الخلايا إلى السيتوبلازم للمشاركة في انكماش myofilament. مثل هذا التدفق Ca2 + ودورة اللوكس هو السمة الأساسية للانكماش عضلة القلب ويشكل وظيفة طبيعية من CMs12. وبالتالي، فإن الطريقة التي تكتشف تدفق Ca2+ يمكن أن تكون طريقة محتملة لقياس وظيفة CMs والخلايا الشبيهة ب CM، بما في ذلك iCMs. وعلاوة على ذلك، بالنسبة لأجهزة iCMs، توفر هذه الطريقة طريقة أخرى لتقييم كفاءة إعادة البرمجة.
تم تطوير مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) واستخدامها على نطاق واسع للإشارة إلى أنشطة الخلية، وخاصة إمكانات العمل. عموما، GECIs تتكون من مجال ربط Ca2 + مثل كالمودولين، ومجال الفلورسنت مثل GFP، وGCaMP3 هو واحد مع تقارب عالية وكثافة مضان. سيتم تنشيط مجال الفلورسينس GCaMP3 عند تغيير تركيز الكالسيوم المحلي13. في هذه الورقة، يتم وصف سلالة الماوس التي تعبر على وجه التحديد مراسل GCaMP3 في خلايا Myh6+. من خلال إدخال MGT إلى NCFs المعزولة من حديثي الولادة من هذه السلالة ، يمكن مراقبة إعادة البرمجة عن طريق الفلور ، والتي سيتم عرضها بنجاح iCMs المبرمجة. مثل هذه السلالة الماوس وطريقة سوف توفر منصة قيمة للتحقيق في إعادة برمجة القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات والممارسات التجريبية التي تنطوي على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ميشيغان. يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات والممارسات التجريبية التي تنطوي على زراعة الخلايا BSL2 خزانة السلامة البيولوجية في ظل ظروف معقمة. وفيما يتعلق بالإجراءات والممارسات التي تنطوي على الفيروسات، اتبع المبدأ التوجيهي للتخلص السليم من الخلايا المتحولة جنسيا، ونصائح المصصة، والأنابيب لتجنب خطر المخاطر البيئية والصحية.
1. إنشاء TG (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze /J (يشار إليه باسم Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) سلالة الماوس (الشكل 1)
- إعداد Tg (Myh6-cre)1Jmk/J سلالة الماوس (جاكسون مختبر الأسهم 009074، ويشار إليها باسم Myh6-Cre) وGt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J سلالة الماوس (جاكسون مختبر الأسهم 014538، ويشار إليها باسم Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3)، على التوالي.
- تولد كل سلالة تصل إلى 8 أسابيع من العمر للحصول على الكبار Myh6-Cre و Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 الفئران، على التوالي.
- Crossbreed الكبار Myh6 - كري و Rosa26A - Flox - وقف - Flox - GCaMP3 الفئران.
ملاحظة: إعداد Myh6-Cre الذكور / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 أنثى أو العكس بالعكس. لا يوجد فرق كبير بين أحفادهم. عادة ، فإن الفئران الإناث تلد 8-10 الجراء 19-21 يوما بعد التهجين.
2. عزل واختيار المولودين Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 قلوب الفئران.
- الحصول على الجراء P0-P2. تأكد من وجود 8-10 جراء لعزل 10 ملايين NCFs بهذا البروتوكول.
- تخدير عميق الجراء عن طريق انخفاض حرارة الجسم. ضع الجراء في قفاز اللاتكس وانغمس حتى الرقبة في الثلج والماء المسحوق (2 درجة مئوية - 3 درجات مئوية).
- تعقيم الجراء لفترة وجيزة مع الإيثانول 75٪.
- التضحية الجراء بقطع الرأس مع مقص معقم.
- إجراء شق أفقي بالقرب من القلب، والضغط على القلب، ومن ثم عزله عن طريق فصل في جذور الشريان الأورطي مع مقص.
- مراقبة ضربات القلب تحت المجهر الفلوري. ضمان قلوب مع Myh6- Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 النمط الجيني يظهر Ca2 + تدفق المشار إليها من قبل GCaMP3 مع ضربات القلب. لا تظهر الأنماط الجينية الأخرى الفلورسينس (الشكل 2، الفيديو 1، والفيديو 2).
3. عزل الخلايا الليفية القلبية الوليدية (NCFs)
ملاحظة: لهذا الجزء، تم اعتماد بروتوكول من Lab14 الدكتور لي تشيان مع تحسينات طفيفة عند الاقتضاء لهذه الدراسة.
- بعد عزل قلوب αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3، قطعها إلى أربع قطع متصلة بشكل فضفاض. غسلها في الجليد الباردة DPBS في لوحة 6 سم جيدا عدة مرات للحد من تلوث خلايا الدم في الخلايا المعزولة.
- نقل القلوب إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- هضم قلوب مع 8 مل من الحارة 0.25٪ تريبسين-EDTA في 37 °C لمدة 10 دقيقة.
- تجاهل التريبسين الفائق وإضافة 5 مل من الكولاجينز الدافئ من النوع الثاني (0.5 ملغم / مل) في HBSS.
- دوامة الخليط جيدا، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- بعد الحضانة ، دوامة تماما والسماح للأنسجة غير المهضومة يستقر عن طريق الجاذبية.
- جمع supernatant في أنبوب مخروطي 15 مل مع 5 مل ليفية باردة (FB) المتوسطة (IMDM مع 20٪ FBS و 1٪ البنسلين / العقدية).
- كرر الخطوات 3.4-3.7 للأنسجة غير المهضومة 4-5 مرات.
- جمع كل supernatant معا وتصفية supernatant مع مصفاة 40 ميكرومتر.
- جهاز الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant.
- إعادة إنفاق الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS المؤقت؛ 1x PBS مع EDTA 2 mM و 0.5٪ BSA).
- تحديد عدد الخلايا قابلة للحياة عن طريق تلطيخ الأزرق تريبان.
- خذ 10 ميكرولتر من الخلايا من 10 مل من تعليق الخلية في الخطوة 3.11.
- مزيج مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ حل أزرق تريبان واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة الخليط إلى مقياس الدم وتحديد عدد الخلايا قابلة للحياة. الخلايا الميتة ملطخة باللون الأزرق، في حين أن الخلايا القابلة للحياة غير ملطخة.
- طرد مركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant.
- إعادة إنفاق الخلايا مع 10 ميكروغرام من الميكروبات Thy1.2 في 90 ميكرولتر من العازلة MACS المبردة لأقل من 10 مليون خلية قابلة للحياة. إضافة المزيد من الخرز نسبيا إذا كان هناك أكثر من 10 مليون خلية قابلة للحياة. ماصة الخليط جيدا واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
- إضافة 10 مل من المخزن المؤقت MACS وتخلط جيدا.
- الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق، والتخلص من supernatant.
- كرر الخطوات 3.15-3.16 مرة واحدة.
- Resuspend الخلايا والخرز مع 2 مل من MACS العازلة.
- إعداد فاصل MACS في غطاء محرك السيارة. إدراج عمود LS إلى الفاصل وتوازن العمود مع 3 مل من المخزن المؤقت MACS.
- عندما يكون العمود LS متساويا، مرر الخلايا عبر العمود.
- اغسل عمود LS مع 2 مل من المخزن المؤقت MACS ثلاث مرات.
- قم بخلع العمود عن الفاصل، ثم قم بتهيئة 2 مل من المخزن المؤقت MACS ثلاث مرات، ثم اجمع elution إلى أنبوب 50 مل.
- الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق والتخلص من supernatant.
- إعادة إنفاق الخلايا مع 5 مل من وسائل الإعلام FB.
- تحديد رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
- تمييع الخلايا مع وسائل الإعلام FB والبذور الخلايا إلى أطباق أو لوحات على النحو المطلوب. تأكد من أن كثافة بذر الخلايا حوالي 2-2.5 × 104 خلايا / سم2 (تحسين الكثافة استنادا إلى التجارب الفردية). تأكد من أن الخلايا الليفية المرفقة لها شكل بيضاوي إلى مستدير في اليوم الثاني بعد البذر (الشكل 3).
4. إنتاج الفيروسات الرجعية ترميز ناقلات MGT متعددة الأجهزة لإعادة برمجة القلب
- الحفاظ على بلات-E مع وسائط الثقافة بلات-E (تكمل DMEM مع 10٪ FBS، 1 ميكروغرام / مل من بوروميسين و 10 ميكروغرام / مل من blasticidin) في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- في اليوم الأول، تقسيم بلات-E إلى لوحة 6-جيدا في حوالي 4-5 × 105 خلايا / كثافة البئر.
- في اليوم الثاني، يصل Plat-E عادة إلى التقاء بنسبة 80٪. تحويل الخلايا مع الإجراءات التالية. ضبط حجم وكمية كل عنصر موجود هنا على أساس كل بئر في لوحة 6-جيدا.
- تمييع 2 ميكروغرام من pMX-puro-MGT متعدد الأجهزة الرجعية التعبير plasmid ناقلات (أدجين 111809) إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر مع العازلة TE.
- إعداد خليط العدوى عن طريق خلط 10 ميكرولتر من ليبولاثامين مع 150 ميكرولتر من انخفاض متوسط المصل. ماصة بعناية لخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كن حذرا لتجنب الفقاعات عند pipetting.
- وفي الوقت نفسه، وإعداد خليط البلازميد عن طريق خلط البلازميد مع 150 ميكرولتر من انخفاض متوسط المصل. ماصة بعناية لخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كن حذرا لتجنب الفقاعات عند pipetting.
- تخلط بعناية الخلائط اثنين واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قد يبدو الحل غائما.
- إضافة الخليط قطرة قطرة إلى الخلايا ليتم تحويلها.
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم الثالث، قم بتغيير الوسط إلى وسيط جديد لثقافة الخلايا الكاملة يفتقر إلى البوروميسين والبوميسيدين.
- في اليوم 4، 48 ساعة بعد العدوى، وجمع supernatant التي تحتوي على الفيروسات الرجعية وتخزينها في 4 درجة مئوية.
- في اليوم 5، 72 ساعة بعد العدوى، وجمع supernatant التي تحتوي على الفيروس الرجعية.
- تصفية كل من 48 ساعة و 72 ساعة فائقة مع مرشح 0.45 ميكرومتر، تترسب بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية عن طريق إضافة حجم 1/5 من 40٪ بولي (جلايكول الإيثيلين) (PEG) حل لجعل تركيز النهائي من 8٪ PEG.
- جهاز طرد مركزي عند 4000 x g لمدة 30 دقيقة لتسريع الفيروس.
ملاحظة: PEG8000-virus يشكل هطول الأمطار البيضاء الصغيرة. - Resuspend الفيروس مع وسيطة iCM تحتوي على 8 ميكروغرام / مل البوليبرين على النحو المطلوب. استخدام الفيروس الرجعية على الفور.
5. إعادة برمجة NCFs إلى iCMs مع MGT ترميز عدوى الفيروس الرجعية
- تنمو أو مرور NCFs قبل عدوى الفيروس.
ملاحظة: عادة، يمكن تمرير NCF مرتين. - في اليوم 0، NCF البذور إلى الكثافة حول 1-2 × 104 خلايا/ سم2 في المتوسط FB.
- في اليوم الأول، استبدل وسيطة الثقافة بوسط يحتوي على فيروس لكل بئر كما هو مرغوب فيه. استخدام الفيروس من بئر واحدة Plat-E في لوحة 6-جيدا لتصيب بئرين في لوحة 24 جيدا. تيتر الفيروس لتحديد تركيز الفيروس الأمثل.
ملاحظة: يمكن إدخال الفيروسات التي تحتوي على عوامل إعادة برمجة أخرى ذات أهمية مع الفيروسات الرجعية MGT. - حضانة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم الثاني، بعد 24 ساعة من الإصابة بالفيروس، استبدل الوسط المحتوي على الفيروس إلى وسيط iCM منتظم.
- لمراقبة تعبير GCaMP3، قم بتصفيحه تحت مجهر مضان مقلوب. تحت 10x في قناة GFP، ومراقبة خفيفة GCaMP3 القاعدية الفلورية لجزء من الخلايا في وقت مبكر من اليوم 5.
- استبدل الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام أثناء إعادة البرمجة. إذا لزم الأمر، إجراء اختيار إيجابي للخلايا المصابة بالفيروس الرجعية MGT بإضافة 2 ميكروغرام / مل من البوريميسين إلى وسط الثقافة لمدة 3 أيام والحفاظ عليه في 1 ميكروغرام / مل.
ملاحظة: إدخال المواد الكيميائية ذات الأهمية (على سبيل المثال، IGF-1، MM589، A83-01، و PTC-209، يشار إليها باسم IMAP كما أبلغنا سابقا15) جنبا إلى جنب مع تغيير متوسط. - بعد 14 يوما من العدوى، استبدل الوسط ب B27 المتوسط للحث على نضوج iCM.
6. تقييم iCM النضج الوظيفي وإعادة برمجة الكفاءة من قبل Ca2 + تدفق
ملاحظة: إضافة 1 ميكرومتر إيزوبروتيرينول إلى الخلايا التي سيتم تقييمها قبل التقييم، إذا لزم الأمر.
- تقييم تدفق Ca2 + مع مجهر مضان مقلوب في درجة حرارة الغرفة.
- في قناة GFP، لاحظ خلايا GCaMP3+ تحت هدف 10x. تأكد من أنه يظهر ضرب الخلية التلقائي في قناة حقل مشرق.
- حدد عشوائيا ثلاثة حقول تحت 20x وتسجيل تدفق Ca2 + من iCMs لمدة 3 دقائق لكل حقل.
ملاحظة: هنا، تزامن تدفق Ca2+ مع ضرب الخلايا التلقائي (الشكل 4، الشكل 5، والفيديو 3، فيديو 4، فيديو 5، فيديو 6، فيديو 7، فيديو 8). - قياس الخلايا يدويا مع تدفق Ca2 + .
7. التحليل الإحصائي وعرض البيانات
- تحليل الاختلافات بين المجموعات تحليل اتجاه واحد من التباين (ANOVA) وإجراء اختبارات المقارنة متعددة الطالب نيومان-Keuls.
ملاحظة: النتائج هي كما متوسط ± S.E مع p < 0.05 تعتبر ذات دلالة إحصائية. تم إجراء كل تجربة ثلاث مرات على الأقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويظهر في الشكل 1 سير العمل التجريبي لتوليد Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 سلالة الفئران والبنية الجينية للفئران المعدلة وراثيا. في حين يتم تأسيس سلالة الماوس ، تم عزل قلوب الجراء ومراقبتها تحت مجهر مضان عكسي لتأكيد النمط الجيني. قلوب مع النمط الجيني الصحيح تظهر Ca2 + تدفق متزامنة مع الضرب، تصور كما GCaMP3 مضان، في حين لوحظ عدم وجود مضان في قلوب السيطرة (الشكل 2، فيديو 1، والفيديو 2). سوف تعلق NCFs معزولة إلى البئر في غضون 2 ساعة وتظهر شكل بيضاوي إلى جولة 1 بعد يوم من البذر (الشكل 3). تم تقييم النضج الوظيفي وكفاءة إعادة برمجة iCMs بواسطة تدفق Ca2 + بعد 14 يوما من إدخال MGT. يمكن تقييم الخلايا المبرمجة تحت مجهر مضان لقياس تدفق Ca2+ . يمكن العثور على خلايا GCaMP3+ في كل من مجموعات IMAP و MGT ، في حين تظهر مجموعة IMAP خلايا وخلايا GCaMP3 + أكثر بكثير مع أنماط تذبذب Ca2 + أقرب إلى CMs العادية (فيديو 3-8). كما هو موضح في الشكل 4A، خلية تمثيلية في مجموعة IMAP مع Ca2+ التذبذب سوف تظهر GCaMP3 تغيير الفلورسينس بين الحد الأقصى (لوحة الوسطى) والحد الأدنى (لوحة الحق)، ويتم تغيير التذبذب Ca2 + من هذه الخلايا دوريا (الشكل 4B). بعد إدخال IMAP ، كان عدد مجموعات الضرب أعلى بكثير من ذلك في مجموعة التحكم ، حيث تم زيادة عدد خلايا GCaMP3 + مع تدفق Ca2 + لكل حقل عالي الطاقة (HPF ، عدسة الهدف 20x) في مجموعة IMAP المتوسطة المعالجة (الشكل 5).
الشكل 1: توليد Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 سلالة الماوس. رسم توضيحي لجيل سلالة الفئران Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 والهيكل الجيني للفئران المعدلة وراثيا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: Ca2 + تدفق القلب النابض. تزامنت فلورة GCaMP3 مع خفقان القلب في قلوب Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 (اللوحة العليا)، في حين لم يلاحظ أي تفلور في قلوب التحكم (اللوحة السفلية). مقياس الشريط = 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أطر NCFs المعزولة المرفقة بلوحة من 6 آبار. (أ) NCFs تحت حقل الطاقة المنخفض (LPF، هدف 10x، شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (ب) أطر العمل الوطنية في إطار مجال الطاقة العالية (هدف 20x، شريط المقياس = 50 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تدفق Ca2+ للخلايا المبرمجة. (أ) NCFs المعالجة من IMAP تمت إعادة برمجتها على iCMs تحت قناة GFP في حقل الطاقة العالية (هدف 20x). تم تصور تدفق Ca2 + من iCMs على أنه مضان GCaMP3 ، حيث تظهر الخلايا ذات تدفق Ca2 + الوميض المتكرر بين التألق الأساسي (Ca2 + min ، اللوحة الوسطى) والفلورسينس الساطع (Ca2 + max ، اللوحة اليمنى) متزامنة مع الضرب. (ب) منحنى تتبع Ca2 + من خلايا Ca2 + التذبذب + في مجموعة IMAP. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 الشكل 5: تقييم تدفق Ca2+ تحت وسيط IMAP. عدد خلايا GCaMP3+ مع تدفق Ca2+ لكل HPF 2 أو 3 أو 4 أسابيع بعد تحريض MGT. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: قلب نابض معزول عن الجراء مع النمط الجيني αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 تحت عدسة هدف المسح الضوئي (هدف 4x) في قناة GFP. القلب هو GCaMP3 + وامض بين الفلورسينس الأساسية (Ca2 + دقيقة) وفلورسينس مشرق (Ca2 + ماكس) متزامنة مع الضرب. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 2: قلب ينبض معزول عن الجراء مع النمط الجيني للسيطرة تحت عدسة الهدف المسح الضوئي في قناة GFP. القلب هو GCaMP3 - ولا يظهر مضان وامض متزامنة مع الضرب. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 3: iCMs في مجموعة IMAP تحت LPF في قناة المجال الساطع (BF). ويمكن رؤية زنزانة مع الضرب كبيرة في وسط الميدان. يركز كل من الفيديو 3 وفيديو 4 على نفس الحقل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 4: iCMs في مجموعة IMAP تحت LPF في قناة GFP. يمكن ملاحظة خلايا متعددة ذات مضان وامض ، بما في ذلك الخلية النابضة التي شوهدت في قناة BF. يركز كل من الفيديو 3 وفيديو 4 على نفس الحقل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 5: iCMs في مجموعة IMAP تحت HPF في قناة BF. وقد لوحظ مركز مجال الفيديو 3 والفيديو 4 تحت HPF. ويمكن ملاحظة خلية مع الضرب كبيرة في وسط الميدان. يركز كل من الفيديو 5 وفيديو 6 على نفس الحقل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
الفيديو 6: iCMs في مجموعة IMAP تحت HPF في قناة GFP. وقد لوحظ جزء من مركز مجال الفيديو 3 والفيديو 4 تحت HPF. يمكن ملاحظة خلايا متعددة ذات مضان وامض ، بما في ذلك الخلية النابضة التي شوهدت في قناة BF. يركز كل من الفيديو 5 وفيديو 6 على نفس الحقل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 7: iCMs في مجموعة MGT تحت HPF في قناة BF. على النقيض من خلايا الضرب الهامة التي لوحظت في مجموعة IMAP ، هناك عدد قليل من خلايا الضرب تحت قناة BF في مجموعة MGT ، والتي لديها كفاءة أقل في إعادة البرمجة. يركز كل من الفيديو 7 وفيديو 8 على نفس الحقل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 8: iCMs في مجموعة MGT تحت HPF في قناة GFP. ويمكن ملاحظة العديد من الخلايا مع التألق وامض خفيفة. يركز كل من الفيديو 7 وفيديو 8 على نفس الحقل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقييم وظيفة iCMs ضروري لحقل إعادة برمجة القلب. في هذه المخطوطة، يصف البروتوكول سلالة TG (Myh6-cre)1Jmk/J/Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J Mouse التي تم إنشاؤها، وكيفية استخدام NCFs المعزولة عن الفئران الوليدية في هذه السلالة لإعادة برمجتها على iCMs، وتقييم وظيفة iCMs بواسطة تدفق Ca2+ . هذه طريقة de novo لتقييم النضج الوظيفي ل iCMs.
العديد من الخطوات الهامة مهمة لإعادة برمجة بنجاح وتقييم باستخدام هذا الأسلوب. أولا، يجب أن تكون صناديق NCFs معدة حديثا وصحية بعد العزلة. إجراء سريع لعزل القلب وقطع أمر ضروري. والأهم من ذلك، من المهم متابعة وقت الحضانة لتجنب الإفراط في الهضم والحد من صلاحية الخلايا وحالتها. ثانيا، من بين جميع الإجراءات، غالبا ما تؤدي كفاءة العدوى بالفيروسات إلى اختلاف كبير في النتائج. تتأثر كفاءة العدوى بالفيروس بشكل رئيسي بعاملين. فمن ناحية، ينبغي أن يكون تتر الفيروس ثابتا بين المحاولات المختلفة، الأمر الذي يتطلب اتساقا في كمية البلازميدات المصابة وحالة الخلية البلاط-E المماثلة وكثافتها. يجب على الباحثين الذين يتبعون هذا البروتوكول تقييم كثافة البذر المثلى والوقت قبل تلك الإجراءات. وينبغي استخدام الفيروس على الفور لتجنب توهين التيتر بسبب حساسية الفيروس لدورات التجميد والذوبان. بالإضافة إلى ذلك، من المهم الحفاظ على NCFs في حالة صحية وكثافة مناسبة في وقت العدوى. يجب أن يكون الباحثون على دراية بخصائص نمو صناديق الاستثمار الوطنية. وفي حين ينبغي أن يكون التباين في الكفاءة في إعادة البرمجة محدودا، فإن الرصد المتكرر يمكن أن يكون مفيدا. يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة ليصيب NCFs بفيروسات مختلفة أو يعالجها بالمواد الكيميائية ذات الاهتمام. وبالتالي، فإنه ينطبق كطريقة عالمية لأبحاث إعادة برمجة القلب. وإلى جانب النقاط المذكورة هنا، تشمل القضايا الشائعة مع هذه الطريقة انخفاض الفلورسينس لوحظ بعد إعادة البرمجة. قد يكون هذا بسبب عدة أسباب. أولا، قد لا تكون العدوى فعالة كما هو مطلوب، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة إعادة البرمجة ويحد من عدد أجهزة iCMs. ثانيا، قد تحتاج حالة التعرض إلى تعديل أمثل لمراقبة مضان GCaMP3 من أجهزة iCMs. استخدام خلايا القلب الوليدية المعزولة عن نفس الجراء مثل السيطرة الإيجابية سيساعد على تحديد السبب المحتمل.
وقد تم استخدام تدفق Ca2 + على نطاق واسع لتقييم أنشطة الخلية، بما في ذلك في خلايا الخلايا العصبية16، الغدة الثديية17، الأنسجة الدهنية18، الخ. في هذه الدراسة، تم استخدام تدفق Ca2+ لتقييم النضج الوظيفي ل iCMs. في السابق ، تم الإبلاغ عن أن تدفق Ca2 + يمكن قياسه بواسطة مواد كيميائية محددة تسمى الأصباغ الحساسة للكالسيوم جزيء صغير التي يمكن استخدامها لتقييم وظيفة الخلايا المبرمجة19. ومع ذلك ، فإن مثل هذه الطريقة لها عدة قيود: قد يكون للمواد الكيميائية التي تم إدخالها إلى الخلايا سمية محتملة وتؤثر على العمليات الخلوية ، مما يجعل النتائج أقل موثوقية من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقة المعروضة هنا. إلى جانب ذلك ، فإن عملية التلطيخ معقدة وتستغرق وقتا طويلا مع منع إجراء المزيد من التقييمات لتلك الخلايا. ومن ناحية أخرى، فإن الطريقة المعروضة هنا تتغلب على تلك القيود. GCaMP3 غير الغازية للخلايا، مما يقلل من التأثيرات على أنشطة الخلية ويمكن من إجراء مزيد من التقييم للخلايا. وبما أن فلورة ال iCMs تعتمد فقط على هويتها، أي تعبير Myh6 وتغيير تركيز Ca2+ المحلي، فإن مضان تدفق Ca2+ للخلايا يصبح مرئيا طالما تتم إعادة برمجة NCFs، مما يتيح المراقبة المتكررة لعملية إعادة البرمجة دون استراتيجية تستغرق وقتا طويلا. في حين يمكن رصد تدفق Ca2 + وتسجيلها بسهولة تحت مجهر مضان مقلوب ، يمكن قياس الضرب المتكرر والنشاط الإلكتروني ذي الصلة عبر غشاء الخلية ، أي تدفق Ca2 + ، بشكل زمني إضافي20. وكما هو مبين في الشكل 4B، يمكن أن يوفر هذا القياس الكمي المزيد من المعلومات حول نضج أجهزة iCMs ويوضح هياكل أكثر تفصيلا لتغير تدفق Ca2+ أثناء إعادة برمجة القلب.
هذا الأسلوب له العديد من المزايا. أولا، يتم مراقبة تدفق Ca2+ حصريا في iCMs. لأن Myh6 محددة جدا ل CMs ولكن ليس CFs ، فإن الخلايا التي أعيد برمجتها بنجاح فقط ستعبر عن مراسل GCaMP3 وتصبح فلورية. ثانيا، يوفر تدفق Ca2+ طريقة لتقييم النضج الوظيفي ل iCMs إلى جانب طريقة مراقبة التعبير عن الجينات الخاصة ب CM. نظرا للإجراء التجريبي الطويل نسبيا والاختلاف المرتبط بذلك ، فإن وظيفة iCMs ليست مقبولة دائما لمزيد من الدراسة والاستخدام السريري المحتمل. في حين أن التعبير الجيني الخاص ب CM يكشف فقط عن جزء من خصائص الخلية المبرمجة ، يوفر تدفق Ca2 + جانبا آخر من مجال إعادة برمجة القلب لتقييم جودة الخلايا المبرمجة وكفاءتها. وعلاوة على ذلك، فإن النضج الوظيفي يرتبط أكثر بوظيفة القلب، والتي يمكن أن تكون مؤشرا أفضل لتقييم الكفاءة. وتشمل الأساليب المستخدمة على نطاق واسع في هذا المجال قياس التدفق الخلوي، وهي تقنية تتطلب هضم التريبسين لجميع مجموعات الخلايا. في حين أن الهضم يمكن أن يؤثر على وظائف الخلايا وخصائصها ، فإنه يدخل الاختلاف في النظام ، مما يقلل من إمكانية إعادة إنتاج النتائج الملاحظة وزيادة تقييم تلك الخلايا. وبالمقارنة مع تلك الأساليب، فإن سلالة الفئران المعدلة وراثيا المبينة هنا قد حدت من التأثير المحتمل للمواد الكيميائية أو الإجراءات التجريبية اللازمة للتقييم. مع هذه المزايا، هذه السلالة الماوس يبسط إجراءات التقييم اللازمة لإعادة برمجة القلب ويعزز استنساخ النتائج في هذا المجال.
ومع ذلك، هناك بعض القيود على هذه الدراسة. أولا ، فإن إنشاء سلالة الماوس يستغرق وقتا طويلا. ورحب الاستفسارات من سلالة الماوس من الزملاء في هذا المجال لتقصير الوقت اللازم لإنشاء سلالة. ثانيا، تتضمن إعادة برمجة القلب ل iCMs مع هذا البروتوكول عوامل وخطوات متعددة، والتي تقدم تباينا كبيرا نسبيا للنظام. إن الكفاءة في هذا المجال ستساعد على التغلب على هذه المشكلة. وأخيرا ، لأن GCaMP3 يصبح الفلورسنت فقط تحت حالة تدفق Ca2 + ، لا يمكن استخدام طريقة التقييم الحالية مباشرة لFACS كإعادة برمجة القلب مع Myh6 - GFP strain7. ومع ذلك ، في حين أن السلالة الحالية لديها تطبيقات أكثر ومختلفة مقارنة بسلالة Myh6-GFP ، يمكن التغلب على مثل هذا الإزعاج.
عموما، كما وصف البروتوكول أعلاه، وM myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 سلالة الماوس وبعد تقييم نضوج iCMs توفير استراتيجية لرصد عملية كاملة من إعادة برمجة القلب. يمكن تنفيذ استراتيجية قياس التدفق Ca2+ بوساطة GCaMP3 في الخلايا الحية دون الإضرار بقابلية الخلية للحياة. ولأن الفلورسينس GCaMP3 مدفوع بالتعبير الجيني الخاص ب عضلة القلب، يمكن قياس بيانات GCaMP3 الفلورية المكتسبة كميا للكشف عن كفاءة إعادة البرمجة ونشاط iCMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نقدر جهود ليو جناتوفسكي في تحرير النص الإنجليزي لهذه المخطوطة. تم إنشاء الشكل 1 مع BioRender.com. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) في الولايات المتحدة (1R01HL109054) منحة للدكتور وانغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
- Frangogiannis, N. G.
- Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
- Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036 (2016).
- Grant, A. O.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).
- Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).
- Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312 (2016).
