Summary
我们在这里描述了Tg（Myh6-cre）1Jmk/J /Gt（ROSA）26Sortm38（CAG-GCaMP3）Hze/J（下面称为αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）小鼠报告线用于心脏重编程评估的建立和应用。从小鼠菌株中分离出的新生儿心脏成纤维细胞（NCF）转化为诱导心肌细胞（iCM），从而可以方便有效地评估通过钙（Ca2 +）通量对iCM的重编程效率和功能成熟。
Abstract
心脏重编程已成为修复受损心脏的潜在有希望的疗法。通过引入多种转录因子，包括Mef2c，Gata4，Tbx5（MGT），成纤维细胞可以重新编程为诱导心肌细胞（iCM）。这些iCM在梗死的心脏 中原位 产生时，与周围的心肌在电和机械上集成，导致疤痕大小的减小和心脏功能的改善。由于iCM的重编程效率、纯度和质量相对较低，iCM的表征仍然是一个挑战。该领域目前使用的方法包括流式细胞术、免疫细胞化学和qPCR，主要集中在心脏特异性基因和蛋白表达上，而不是iCM的功能成熟。由动作电位触发，心肌细胞中电压门控钙通道的打开导致钙快速流入细胞。因此，量化钙流入速率是评估心肌细胞功能的有希望的方法。在这里，该协议介绍了一种通过钙（Ca2 +）通量评估iCM功能的方法。通过将Tg（Myh6-cre）1Jmk/J（下面称为Myh6-Cre）与Gt（ROSA）26Sortm38（CAG-GCaMP3）Hze/J（下面称为Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）小鼠杂交，建立了αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠品系。分离来自P0-P2新生小鼠的新生儿心脏成纤维细胞（NCF） 并在体外培养，并将MGT的多顺式构建引入NCF，这导致它们重新编程为iCM。由于只有成功重编程的iCM才能表达GCaMP3报告基因，因此可以通过Ca2 + 通量和荧光显微镜直观地评估iCM的功能成熟。与未重编程的NCF相比，NCF-iCM显示出显着的钙瞬时通量和自发收缩，类似于CM。该协议详细描述了小鼠品系的建立，新生小鼠心脏的分离和选择，NCF分离，用于心脏重编程的逆转录病毒的产生，iCM诱导，使用我们的报告线评估iCM Ca2 + 通量，以及相关的统计分析和数据呈现。预计这里描述的方法将为评估iCM的功能成熟度提供一个有价值的平台，用于心脏重编程研究。
Introduction
心肌梗死 （MI） 是世界范围内的一种严重疾病。心血管疾病 （CVD） 是全球主要死因，2019 年造成约 1860 万人死亡1，2。在过去半个世纪中，心血管疾病的总死亡率有所下降。然而，在一些不发达国家，这一趋势已经放缓甚至逆转1，这需要对心血管疾病进行更有效的治疗。作为心血管疾病的致命表现之一，在美国，心肌梗死约占 CVD 死亡总数的一半2。在缺血期间，随着冠状动脉阻塞以及营养和氧气供应有限，心肌发生严重的代谢变化，损害心肌细胞（CM）的收缩功能，并导致CM死亡3。心血管研究中已经探索了许多方法来修复心脏损伤并恢复受伤心脏的功能4。直接心脏重编程已成为修复受损心脏并恢复其功能的一种有希望的策略5，6。通过引入Mef2c，Gata4，Tbx5（MGT），成纤维细胞可以在 体外 和 体内重新编程为iCM，这些iCM可以减少疤痕面积并改善心脏功能7，8。
虽然心脏重编程是心肌梗死治疗的一种有前途的策略，但仍存在许多挑战。首先，重编程效率、纯度和质量并不总是像预期的那样高。MGT诱导只能达到总CF的8.4%（cTnT+）或24.7%（αMHC-GFP +），以在体外7重新编程为iCM7，或在体内高达35%8，这限制了其应用。即使系统中诱导了更多的因素，例如Hand29或Akt1 / PKB10，重编程效率仍然勉强令人满意，无法在临床环境中使用。因此，该领域需要更多的研究来提高重编程效率。其次，iCM的电完整性和收缩特性对于有效改善心脏功能非常重要，但评估这些特性具有挑战性。目前，该领域广泛使用的评价方法，包括流式细胞术、免疫细胞化学、qPCR等一些关键CM基因表达，都集中在iCM和CM的相似性上，但与iCM的功能特征没有直接关系。此外，这些方法具有相对复杂的程序，并且非常耗时。虽然重编程研究通常涉及筛选促进iCM成熟的潜在重编程因子11，但心脏重编程需要一种基于iCM功能的快速便捷的方法。
在每个收缩周期中，CM打开细胞膜上的电压门控钙离子通道，这导致钙离子（Ca2 +）从细胞间液短暂流入细胞质以参与肌原收缩。这样的Ca2+ 流入和流出循环是心肌收缩的基本特征，构成了CMs12的正常功能。因此，检测Ca2 + 流入的方法可能是测量CM和CM样细胞（包括iCM）功能的潜在方法。此外，对于iCM，这种方法提供了另一种评估重编程效率的方法。
遗传编码钙指示剂（GECI）已被开发并广泛用于指示细胞活性，特别是动作电位。通常，GECI由Ca2 + 结合结构域（例如钙调蛋白）和荧光结构域（例如GFP）组成，而GCaMP3是具有高亲和力和荧光强度的结合结构域。当局部钙浓度改变时，GCaMP3的荧光结构域将被激活13。在本文中，描述了一种在Myh6 +细胞中特异性表达GCaMP3报告基因的小鼠品系。通过将MGT引入该菌株新生儿的分离NCF中，可以通过荧光监测重编程，成功重编程的iCM将表现出来。这种小鼠菌株和方法将为研究心脏重编程提供有价值的平台。
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Protocol
所有涉及动物的实验程序和实践都得到了密歇根大学动物护理和使用委员会的批准。所有涉及细胞培养的实验程序和实践必须在无菌条件下进行BSL2生物安全柜。对于涉及病毒的程序和做法，遵循了正确处理转染细胞，移液器吸头和管子以避免环境和健康危害风险的指南。
1. 建立Tg（Myh6-cre）1Jmk/J /Gt（ROSA）26Sortm38（CAG-GCaMP3）Hze /J（称为Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）小鼠品系（图1）
- 分别制备Tg（Myh6-cre）1Jmk/J小鼠品系（杰克逊实验室储备009074，称为Myh6-Cre）和Gt（ROSA）26Sortm38（CAG-GCaMP3）Hze/J小鼠品系（杰克逊实验室库存014538，称为Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）。
- 培育每个菌株至8周大，分别获得成年Myh6-Cre和Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠。
- 杂交了成年Myh6-Cre和Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠。
注意：设置Myh6-Cre公头/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3母头，反之亦然。它们的后代之间没有显着差异。通常，雌性小鼠将在杂交后19-21天生下8-10只幼崽。
2.新生儿Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠心脏的分离和选择。
- 获得P0-P2幼崽。确保存在8-10只幼崽，以使用此方案隔离1000万个NCF。
- 通过体温过低深度麻醉幼崽。将幼崽戴上乳胶手套，将幼崽浸入碎冰和水（2°C - 3°C）中，直到脖子。
- 用75%乙醇对幼崽进行短暂消毒。
- 用无菌剪刀斩首幼崽。
- 在心脏附近做一个水平切口，挤压心脏，然后用剪刀在主动脉根部分离它。
- 在荧光显微镜下观察心脏跳动。确保使用 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 基因型的心脏显示 GCaMP3 指示的 Ca2+ 通量，伴有心脏跳动。其他基因型不显示荧光（图2， 视频1和 视频2）。
3. 新生儿心脏成纤维细胞（NCF）的分离
注：本部分，李谦博士的Lab14 实验方案在适用于本研究时进行了小幅优化。
- 在分离出αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3心脏后，将它们切成四块松散连接的碎片。在冰冷的DPBS中将它们在6厘米的板中彻底洗涤几次，以限制分离细胞中的血细胞污染。
- 将心脏转移到15 mL锥形管中。
- 用8毫升温热的0.25%胰蛋白酶-EDTA在37°C下消化心脏10分钟。
- 丢弃胰蛋白酶上清液，在HBSS中加入5mL温热的II型胶原酶（0.5mg / mL）。
- 彻底涡旋混合物，并在37°C孵育5分钟。
- 孵育后，彻底涡旋，让未消化的组织在重力作用下沉降下来。
- 将上清液收集在15 mL锥形管中，其中含有5 mL冷成纤维细胞（FB）培养基（IMDM与20%FBS和1%青霉素/链霉素）。
- 对未消化的组织重复步骤3.4-3.74-5次。
- 将所有上清液收集在一起，并用40μm过滤器过滤上清液。
- 在4°C下以200× g 离心5分钟，弃去上清液。
- 将细胞重悬于10mL磁性活化细胞分选缓冲液（MACS缓冲液;1x PBS，2mM EDTA和0.5%BSA）中。
- 通过台盼蓝染色确定活细胞数。
- 在步骤3.11中从10mL细胞悬浮液中取出10μL细胞。
- 与10μL0.4%台盼蓝溶液混合，在室温下孵育5分钟。
- 将混合物加入血细胞计数器并确定活细胞数。死细胞被染成蓝色，而活细胞没有被染色。
- 在4°C下以200× g 离心细胞5分钟并弃去上清液。
- 将10μLThy1.2微珠重悬于90μL冷冻MACS缓冲液中，以重悬细胞，以处理少于1000万个活细胞。如果活细胞超过1000万个，则按比例添加更多磁珠。将混合物移液充分并在4°C下孵育30-60分钟。
- 加入 10 mL MACS 缓冲液并充分混合。
- 以200× g 离心5分钟，弃去上清液。
- 重复步骤 3.15-3.16 一次。
- 用2 mL MACS缓冲液重悬细胞和磁珠。
- 在抽油烟机中设置 MACS 分离器。将LS色谱柱插入分离器，并用3 mL MACS缓冲液平衡色谱柱。
- 当 LS 色谱柱达到平衡时，将细胞传递到色谱柱中。
- 用2 mL MACS缓冲液洗涤LS色谱柱三次。
- 将色谱柱从分离器中取出，用2 mL MACS缓冲液洗脱三次，然后将洗脱收集到50 mL管中。
- 以200× g 离心5分钟并弃去上清液。
- 用5mLFB培养基重悬细胞。
- 用血细胞计数器确定细胞数。
- 用FB培养基稀释细胞，并根据需要将细胞接种到培养皿或平板上。确保细胞接种密度约为2-2.5×104 个细胞/cm2 （根据单个实验优化密度）。确保附着的成纤维细胞在接种后的第二天具有椭圆形至圆形（图3）。
4. 用于心脏重编程的逆转录病毒编码多顺电子MGT载体的生产
- 在37°C和5%CO 2下，用Plat-E培养基（DMEM补充10%FBS，1μg/ mL嘌呤霉素和10μg/mL杀胚素）维持Plat-E。
- 在第1天，将Plat-E以大约4-5×105 个细胞/孔密度分裂到6孔板中。
- 在第2天，Plat-E通常达到80%的汇合度。使用以下程序转染细胞。根据6孔板中的每个孔调整此处存在的每个元素的体积和数量。
- 用TE缓冲液将2μgpMX-puro-MGT多顺电子病毒表达质粒载体（Addgene 111809）稀释至500ng / μL。
- 通过将10μL脂质酰胺与150μL还原血清培养基混合来制备转染混合物。小心地移液以充分混合，并在室温下孵育5分钟。移液时要小心避免气泡。
- 同时，通过将质粒与150μL还原血清培养基混合来制备质粒混合物。小心地移液以充分混合，并在室温下孵育5分钟。移液时要小心避免气泡。
- 小心地混合两种混合物，并在室温下孵育5分钟。解决方案可能显示为阴天。
- 将混合物一滴一滴地添加到要转染的细胞中。
- 将细胞在37°C孵育过夜。
- 第3天，将培养基更换为不含嘌呤霉素和杀菌素的新鲜完整细胞培养基。
- 在转染后第4天，48小时，收集含有逆转录病毒的上清液并将其储存在4°C中。
- 在转染后第5天，72小时，收集含有逆转录病毒的上清液。
- 用0.45μm过滤器过滤48小时和72小时的上清液，通过加入1/5体积的40%聚（乙二醇）（PEG）溶液在4°C沉淀过夜，使最终浓度为8%的PEG。
- 以4，000× g 离心30分钟以沉淀病毒。
注意：PEG8000病毒形成小的白色沉淀。 - 根据需要用含有8μg/ mL聚苯乙烯的iCM培养基重悬病毒。立即使用逆转录病毒。
5. 将NCF重新编程为具有MGT编码逆转录病毒感染的iCM
- 在病毒感染之前生长或传代NCF。
注意：通常，NCF可以传行两次。 - 在第0天，在FB培养基中将NCF播种至密度约为1-2 x 10 4 个细胞/ cm 2 。
- 在第1天，根据需要将培养基替换为每个孔的含病毒培养基。使用来自6孔板中一个孔Plat-E的病毒感染24孔板中的两个孔。滴定病毒以确定最佳病毒浓度。
注意：包含其他感兴趣重编程因子的病毒可能与MGT逆转录病毒一起引入。 - 在37°C孵育过夜。
- 在病毒感染后第2天，24小时，将含病毒培养基更换为常规iCM培养基。
- 为了监测GCaMP3表达，将其置于倒置荧光显微镜下。在GFP通道下10倍，早在第5天就观察到一部分细胞的轻度基础GCaMP3荧光。
- 在重编程期间每2-3天更换一次培养基。如有必要，通过向培养基中加入2μg/ mL嘌呤霉素3天并将其维持在1μg/ mL，对MGT逆转录病毒感染细胞进行阳性选择。
注：介绍感兴趣的化学品（例如，IGF-1、MM589、A83-01 和 PTC-209，正如我们之前报道的 IMAP15）以及介质变化。 - 感染14天后，用B27培养基替换培养基以进一步诱导iCM成熟。
6. 通过Ca2+ 助焊剂评估iCM功能成熟度和重编程效率
注意：如有必要，在评估前向待评估的细胞中加入1μM异丙肾上腺素。
- 在室温下使用倒置荧光显微镜评估Ca2 + 通量。
- 在GFP通道中，观察10倍物镜下的GCaMP3 +细胞。确保它在明场通道中显示自发的细胞跳动。
- 随机选择 20x 以下的三个场，并记录每个场的 iCM 的 Ca2+ 通量 3 分钟。
注：此处，Ca2+ 通量与自发细胞跳动同步（图4， 图5和 视频3，视频4，视频5，视频6，视频7，视频8）。 - 用Ca2 + 通量手动定量细胞。
7. 统计分析和数据呈现
- 分析组之间的差异 单向方差分析 （ANOVA） 并执行 Student-Newman-Keuls 多重比较检验。
注：结果与 S.E ±均值相同，p < 0.05 被认为具有统计学意义。每个实验至少进行三次。
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Representative Results
生成Myh6-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠品系的实验工作流程和转基因小鼠的基因结构如图1所示。在建立小鼠品系的同时，分离幼崽的心脏并在反向荧光显微镜下观察以确认基因型。具有正确基因型的心脏显示Ca2 +通量与跳动同步，可视化为GCaMP3荧光，而在对照心脏中未观察到荧光（图2，视频1和视频2）。分离的NCF将在2小时内附着在孔上，并在播种后1天显示椭圆形至圆形（图3）。在MGT引入后14 d采用Ca2+通量对iCM的功能成熟度和重编程效率进行了评价。可以在荧光显微镜下评估重编程的细胞，以测量Ca2 +通量。GCaMP3 +细胞可以在IMAP和MGT组中找到，而IMAP组显示显着更多的GCaMP3 +细胞和具有更接近正常CM的Ca2 +振荡模式的细胞（视频3-8）。如图4A所示，具有Ca2+振荡的IMAP组中具有代表性的细胞将显示GCaMP3荧光在最大（中间图）和最小值（右图）之间的变化，并且这些细胞的Ca2 +振荡周期性变化（图4B）。引入IMAP后，跳动簇的数量明显高于对照组，因为IMAP中等处理组每个高功率场（HPF，20倍物镜）具有Ca2 +通量的GCaMP3 +细胞数量增加（图5）。
图 1：生成 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 小鼠菌株。 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠品系生成和转基因小鼠基因结构的插图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：跳动心脏的Ca2 + 通量。 GCaMP3荧光与Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3心脏（上图）的心跳同步，而对照组（下图）未观察到荧光。比例尺 = 200 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图 3：连接到 6 孔板的隔离 NCF。 （A） 低功率场（LPF，10 倍物镜，比例尺 = 100 μm）下的 NCF。（B） 高功率场下的 NCF（20 倍物镜，比例尺 = 50 μm）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：重编程细胞的Ca2 +通量。（A）IMAP处理的NCF在高功率场（20倍物镜）下在GFP通道下重新编程为iCM。iCM的Ca2 +通量可视化为GCaMP3荧光，其中具有Ca2 +通量的细胞在基本荧光（Ca2 + min，中间图）和明亮荧光（Ca2 + max，右图）之间显示重复闪烁与跳动同步。（B） IMAP组中Ca2+振荡+细胞的Ca2+迹线曲线。比例尺 = 50 μm. F/F0：相对荧光强度。请点击此处查看此图的放大版本。
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 图5：IMAP介质下Ca2+ 通量的评价。 MGT诱导后每HPF 2，3，4周具有Ca2 +通量的GCaMP3 + 细胞的数量。 请点击此处查看此图的放大版本。
视频1：在GFP通道的扫描物镜（4个物镜）下，用αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3基因型从幼崽中分离出的跳动的心脏。 心脏是GCaMP3 +，在基本荧光（Ca2 + min）和明亮荧光（Ca2 + max）之间闪烁，与跳动同步。 请点击此处下载此视频。
视频 2：在 GFP 通道的扫描物镜下，与具有对照基因型的幼崽分离出的跳动的心脏。 心脏是GCaMP3-，不显示与跳动同步的荧光闪烁。 请点击此处下载此视频。
视频 3：明场 （BF） 通道 LPF 下 IMAP 组中的 iCM。 可以看到在场中央有明显跳动的细胞。视频 3 和视频 4 都专注于同一领域。 请点击此处下载此视频。
视频 4：GFP 通道中 LPF 下 IMAP 组中的 iCM。 可以观察到具有闪烁荧光的多个细胞，包括在BF通道中看到的跳动细胞。视频 3 和视频 4 都专注于同一领域。 请点击此处下载此视频。
视频 5：BF 通道中 HPF 下 IMAP 组中的 iCM。 在HPF下观察视频3和视频4场的中心。可以观察到在场中心有显着跳动的细胞。视频 5 和视频 6 都专注于同一领域。 请点击此处下载此视频。
视频 6：GFP 频道中 HPF 下 IMAP 组中的 iCM。 在HPF下观察视频3和视频4场的中心部分。可以观察到具有闪烁荧光的多个细胞，包括在BF通道中看到的跳动细胞。视频 5 和视频 6 都专注于同一领域。 请点击此处下载此视频。
视频7：高炉频道HPF下MGT组的iCM。 与IMAP组观察到的显著跳动细胞相反，MGT组BF通道下有少数跳动细胞，其重编程效率较低。视频 7 和视频 8 都专注于同一领域。 请点击此处下载此视频。
视频8：GFP频道HPF下MGT组的iCM。 可以观察到几个具有轻度闪烁荧光的细胞。视频 7 和视频 8 都专注于同一领域。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
评估iCM功能对于心脏重编程领域是必要的。在这份手稿中，该协议描述了已经建立的Tg（Myh6-cre）1Jmk / J / Gt（ROSA）26Sortm38（CAG-GCaMP3）Hze / J小鼠品系，如何使用从该菌株中新生小鼠分离的NCF进行重编程为iCM，以及通过Ca2 + 通量评估iCM功能。这是一种评估iCM功能成熟的 从头开始 的方法。
几个关键步骤对于使用此方法成功重新编程和评估非常重要。首先，NCF在隔离后应新鲜准备和健康。快速的心脏隔离和切割手术至关重要。最重要的是，遵循孵育时间以避免过度消化和细胞活力和状况下降至关重要。其次，在所有程序中，病毒感染效率往往会在结果中引入很大的变化。病毒感染效率主要受两个因素影响。一方面，不同尝试的病毒滴度应恒定，这需要转染质粒数量和相似的Plat-E细胞状况和密度的一致性。遵循该协议的研究人员应该在这些程序之前评估最佳播种密度和时间。应立即使用病毒，以避免由于病毒对冻融循环的敏感性而导致滴度衰减。此外，在感染时保持NCF处于健康状态和合适的密度也很重要。研究人员应该熟悉NCF的生长特征。虽然重编程效率变化应该受到限制，但频繁的监测可能会有所帮助。该协议可以很容易地修改，以用不同的病毒共同感染NCF或用感兴趣的化学物质处理它们。因此，它适用于心脏重编程研究的通用方法。除了这里提到的要点外，该方法的常见问题还包括在重编程后观察到的低荧光。这可能是由于几个原因。首先，感染可能不如预期有效，这导致重编程效率低并限制了iCM的数量。其次，暴露条件可能需要为观察iCM的GCaMP3荧光而进行最佳调整。使用从同一幼崽中分离出的新生儿心肌细胞作为阳性对照将有助于确定潜在原因。
Ca2+通量已被广泛用于评估细胞活性，包括神经元细胞16、乳腺17、脂肪组织18等。本研究采用Ca2+通量评估iCM的功能成熟度。此前，据报道，Ca2 +通量可以通过称为小分子钙敏感染料的特定化学物质进行测量，这些化学物质可用于评估重编程细胞的功能19。然而，这种方法有几个局限性：引入细胞的化学物质可能具有潜在的毒性并影响细胞过程，使得结果不如这里介绍的方法获得的结果可靠。此外，染色过程复杂且耗时，同时也阻止了对这些细胞的进一步评估。另一方面，这里介绍的方法克服了这些限制。GCaMP3对细胞是非侵入性的，它最大限度地减少了对细胞活性的影响，并能够进一步评估细胞。由于iCM的荧光仅取决于它们的身份，即Myh6表达和局部Ca2 +浓度的变化，因此只要对NCF进行重新编程，细胞的Ca2 +通量荧光就会变得可见，这使得无需耗时的策略即可频繁监测重编程过程。虽然可以在倒置荧光显微镜下轻松监测和记录Ca2 +通量，但可以进一步时间量化细胞膜上的重复跳动和相关电子活动，即Ca2 +通量20。如图4B所示，这种定量可以提供更多关于iCM成熟度的信息，并说明心脏重编程过程中Ca2 +通量变化的更详细结构。
这种方法有几个优点。首先，Ca2+ 通量仅在iCM中观察到。由于Myh6对CM非常特异，而不是CF，因此只有成功重编程的细胞才会表达GCaMP3报告基因并变得荧光。其次，除了监测CM特异性基因表达的方法外，Ca2+ 通量还提供了一种评估iCM功能成熟的方法。由于相对较长的实验过程和与此相关的变异，iCM的功能并不总是可以接受进一步的研究和潜在的临床使用。虽然CM特异性基因表达仅揭示了重编程细胞的一部分特征，但Ca2 + 通量提供了心脏重编程场的另一个方面来评估重编程细胞的质量和效率。此外，功能成熟与心脏功能更相关，这可能是评估效率的更好指标。该领域广泛使用的方法包括流式细胞术，这是一种需要对所有细胞群进行胰蛋白酶消化的技术。虽然消化可以影响细胞功能和特征，但它会给系统引入变异，降低重现观察到的结果并进一步评估这些细胞的潜力。与这些方法相比，这里显示的转基因小鼠品系限制了评估所需的化学品或实验程序的潜在影响。凭借这些优点，这种小鼠品系简化了心脏重编程所需的评估程序，并增强了该领域结果的可重复性。
但是，本研究存在一些局限性。首先，小鼠品系的建立非常耗时。欢迎该领域的同事对小鼠品系进行咨询，以缩短菌株建立所需的时间。其次，使用该协议将心脏重编程为iCM涉及多个因素和步骤，这给系统带来了相对较高的变化。精通这一领域将有助于克服这个问题。最后，由于GCaMP3仅在Ca2+ 通量条件下变为荧光，因此目前的评估方法不能直接用于FACS作为Myh6-GFP菌株7的心脏重编程。然而，虽然与Myh6-GFP菌株相比，目前的菌株具有更多不同的应用，但这种不便是可以克服的。
总体而言，如上述方案所述，Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠品系和随后对iCM成熟度的评估提供了一种监测心脏重编程全过程的策略。这种GCaMP3介导的Ca2 + 通量测量策略可以在活细胞中进行，而不会损害细胞活力。由于GCaMP3荧光是由心肌特异性基因表达驱动的，因此可以进一步量化获得的GCaMP3荧光数据，以揭示重编程效率和iCM活性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Leo Gnatovskiy在编辑本手稿英文文本方面所做的努力。图 1 是使用 BioRender.com 创建的。这项研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）（1R01HL109054）对王博士的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
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