Summary
Describimos aquí, el establecimiento y la aplicación de una línea de reportero de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominada αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación) para la evaluación de reprogramación cardíaca. Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) aislados de la cepa del ratón se convierten en cardiomiocitos inducidos (iCM), lo que permite una evaluación conveniente y eficiente de la eficiencia de reprogramación y la maduración funcional de los iCM a través del flujo de calcio (Ca2 +).
Abstract
La reprogramación cardíaca se ha convertido en una terapia potencialmente prometedora para reparar un corazón dañado. Al introducir múltiples factores de transcripción, incluidos Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), los fibroblastos se pueden reprogramar en cardiomiocitos inducidos (iCM). Estos iCM, cuando se generan in situ en un corazón infartado, se integran eléctrica y mecánicamente con el miocardio circundante, lo que lleva a una reducción en el tamaño de la cicatriz y una mejora en la función cardíaca. Debido a la eficiencia, pureza y calidad de reprogramación relativamente bajas de los iCM, la caracterización de los iCM sigue siendo un desafío. Los métodos utilizados actualmente en este campo, incluida la citometría de flujo, la inmunocitoquímica y la qPCR, se centran principalmente en la expresión de genes y proteínas específicas del corazón, pero no en la maduración funcional de los iCM. Desencadenada por potenciales de acción, la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje en los cardiomiocitos conduce a una rápida afluencia de calcio en la célula. Por lo tanto, cuantificar la tasa de afluencia de calcio es un método prometedor para evaluar la función de los cardiomiocitos. Aquí, el protocolo introduce un método para evaluar la función de iCM por flujo de calcio (Ca2+). Se estableció una cepa de ratón αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 cruzando ratones Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (denominado Myh6-Cre a continuación) con ratones Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominados Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación). Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) de ratones neonatales P0-P2 se aislaron y cultivaron in vitro, y se introdujo una construcción policistrónica de MGT en los NCF, lo que llevó a su reprogramación a iCM. Debido a que solo los iCM reprogramados con éxito expresarán el reportero GCaMP3, la maduración funcional de los iCM se puede evaluar visualmente mediante flujo de Ca2 + con microscopía de fluorescencia. En comparación con los NCF no reprogramados, los NCF-iCM mostraron un flujo transitorio significativo de calcio y una contracción espontánea, similar a los CM. Este protocolo describe en detalle el establecimiento de cepas de ratones, el aislamiento y la selección de corazones de ratones neonatales, el aislamiento de NCF, la producción de retrovirus para la reprogramación cardíaca, la inducción de iCM, la evaluación del flujo de Ca2 + de iCM utilizando nuestra línea reportera, y el análisis estadístico relacionado y la presentación de datos. Se espera que los métodos descritos aquí proporcionen una plataforma valiosa para evaluar la maduración funcional de los iCM para estudios de reprogramación cardíaca.
Introduction
El infarto de miocardio (IM) es una enfermedad grave en todo el mundo. Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en todo el mundo y representan aproximadamente 18,6 millones de muertes en 20191,2. La mortalidad total de las ECV ha disminuido durante el último medio siglo. Sin embargo, esta tendencia se ha ralentizado o incluso revertido en algunos países subdesarrollados1, lo que exige tratamientos más eficaces de las ECV. Como una de las manifestaciones fatales de las ECV, el IM representa aproximadamente la mitad de todas las muertes atribuidas a las ECV en los Estados Unidos2. Durante la isquemia, con el bloqueo de las arterias coronarias y el suministro limitado de nutrientes y oxígeno, el miocardio sufre cambios metabólicos severos, deteriora la función sistólica de los cardiomiocitos (CM) y conduce a la muerte de la CM3. Se han explorado numerosos enfoques en la investigación cardiovascular para reparar la lesión cardíaca y restaurar la función del corazón lesionado4. La reprogramación cardíaca directa se ha convertido en una estrategia prometedora para reparar el corazón dañado y restaurar su función5,6. Al introducir Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), los fibroblastos pueden reprogramarse a iCM in vitro e in vivo, y esos iCM pueden reducir el área de la cicatriz y mejorar la función cardíaca7,8.
Aunque la reprogramación cardíaca es una estrategia prometedora para el tratamiento del IM, sigue habiendo una serie de desafíos. En primer lugar, la eficiencia, la pureza y la calidad de la reprogramación no siempre son tan altas como se esperaba. La inducción de MGT solo puede alcanzar el 8,4% (cTnT+) o el 24,7% (αMHC-GFP+) del total de CF que se reprogramarán a iCM in vitro7, o hasta el 35% in vivo8, lo que limita su aplicación. Incluso con más factores inducidos en el sistema, como Hand29 o Akt1 / PKB10, la eficiencia de reprogramación sigue siendo apenas satisfactoria para ser utilizada en un entorno clínico. Por lo tanto, se necesitan más estudios centrados en mejorar la eficiencia de la reprogramación en este campo. En segundo lugar, la integridad eléctrica y las características de contracción de los iCM son importantes para la mejora eficiente de la función cardíaca, sin embargo, son difíciles de evaluar. Actualmente, los métodos de evaluación ampliamente utilizados en el campo, incluida la citometría de flujo, la inmunocitoquímica y la qPCR de la expresión de algunos genes clave de CM, se centran en la similitud de los MCi y los CM, pero no están directamente relacionados con las características funcionales de los MCI. Además, esos métodos tienen procedimientos relativamente complicados y requieren mucho tiempo. Mientras que los estudios de reprogramación generalmente implican una detección de posibles factores de reprogramación que promueven la maduración de los iCM11, la reprogramación cardíaca requiere un método rápido y conveniente basado en la función de los iCM.
Los CM abren los canales iónicos de calcio dependientes de voltaje en la citomembrana durante cada ciclo de contracción, lo que conduce a una afluencia transitoria de iones de calcio (Ca2 +) desde el líquido intercelular al citoplasma para participar en la contracción del miofilamento. Tal ciclo de afluencia y salida de Ca2+ es el rasgo fundamental de la contracción miocárdica y constituye la función normal de los CM12. Por lo tanto, un método que detecte la afluencia de Ca2 + podría ser una forma potencial de medir la función de los CM y las células similares a CM, incluidos los iCM. Además, para los iCM, este método proporciona otra forma de evaluar la eficiencia de la reprogramación.
Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) se han desarrollado y utilizado ampliamente para indicar las actividades celulares, especialmente los potenciales de acción. En general, los GECI consisten en un dominio de unión a Ca2 + como la calmodulina, y un dominio fluorescente como GFP, y GCaMP3 es uno con alta afinidad e intensidad de fluorescencia. El dominio de fluorescencia de GCaMP3 se activará cuando se cambie la concentración local de calcio13. En este artículo, se describe una cepa de ratón que expresa específicamente un reportero GCaMP3 en células Myh6+. Al introducir MGT en los NCF aislados de neonatos de esta cepa, la reprogramación puede ser monitoreada por fluorescencia, que exhibirá iCM reprogramados con éxito. Tal tensión y método de ratón proporcionará una plataforma valiosa para investigar la reprogramación cardíaca.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos y prácticas experimentales que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan. Todos los procedimientos y prácticas experimentales que impliquen cultivo celular deben realizarse en el Gabinete de Seguridad Biológica BSL2 en condiciones estériles. Para los procedimientos y prácticas que involucran virus, se siguió la directriz de la eliminación adecuada de las células transfectadas, las puntas de las pipetas y los tubos para evitar el riesgo de peligros ambientales y para la salud.
1. Establecimiento de una cepa de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (denominada Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) (Figura 1)
- Prepare la cepa de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (cepa de ratón Jackson lab stock 009074, denominada Myh6-Cre) y Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (cepa de ratón Jackson lab stock 014538, denominada Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), respectivamente.
- Críe cada cepa hasta las 8 semanas de edad para obtener ratones adultos Myh6-Cre y Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, respectivamente.
- Cruza los ratones adultos Myh6-Cre y Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
NOTA: Configure Myh6-Cre macho / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 hembra o viceversa. No hay diferencias significativas entre sus descendientes. Por lo general, los ratones hembra darán a luz a 8-10 cachorros 19-21 días después del cruce.
2. Aislamiento y selección de corazones de ratones neonatales Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
- Obtener cachorros P0-P2. Asegúrese de que 8-10 cachorros estén presentes para aislar a 10 millones de NCF con este protocolo.
- Anestesiaba profundamente a los cachorros por hipotermia. Coloque a los cachorros en un guante de látex y sumérjalos hasta el cuello en hielo picado y agua (2 ° C - 3 ° C).
- Desinfecte brevemente a los cachorros con etanol al 75%.
- Sacrifica a los cachorros por decapitación con tijeras estériles.
- Haga una incisión horizontal cerca del corazón, apriete el corazón y luego aíslelo separándolo en la raíz de la aorta con tijeras.
- Observe los latidos del corazón bajo un microscopio de fluorescencia. Asegúrese de que los corazones con el genotipo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muestren un flujo de Ca2+ indicado por GCaMP3 con latidos cardíacos. Los otros genotipos no muestran fluorescencia (Figura 2, Video 1 y Video 2).
3. Aislamiento de fibroblastos cardíacos neonatales (NCF)
NOTA: Para esta parte, se adoptó el protocolo Lab14 del Dr. Li Qian con optimizaciones menores cuando se aplica a este estudio.
- Después del aislamiento de los corazones αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, córtelos en cuatro pedazos que estén conectados libremente. Lávelos en DPBS helados en una placa de 6 cm a fondo varias veces para limitar la contaminación de las células sanguíneas en las células aisladas.
- Transfiera los corazones a un tubo cónico de 15 ml.
- Digiera los corazones con 8 ml de tripsina-EDTA caliente al 0,25% a 37 °C durante 10 min.
- Deseche el sobrenadante de tripsina y agregue 5 ml de colagenasa tipo II caliente (0,5 mg/ml) en HBSS.
- Vórtice bien la mezcla e incube a 37 °C durante 5 min.
- Después de la incubación, vórtice a fondo y deje que el tejido no digerido se asiente por gravedad.
- Recoger el sobrenadante en un tubo cónico de 15 ml con 5 ml de medio de fibroblastos fríos (FB) (IMDM con 20% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina).
- Repita los pasos 3.4-3.7 para el tejido no digerido 4-5 veces.
- Recoge todo el sobrenadante y filtra el sobrenadante con un colador de 40 μm.
- Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Resuspend las células en 10 mL de tampón de clasificación celular activado magnéticamente (tampón MACS; 1x PBS con 2 mM EDTA y 0.5% BSA).
- Determine el número de células viables mediante tinción azul tripano.
- Tome 10 μL de células de 10 ml de suspensión celular en el paso 3.11.
- Mezclar con 10 μL de solución de azul de tripano al 0,4% e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Agregue la mezcla a un hemocitómetro y determine el número de células viables. Las células muertas están teñidas de azul, mientras que las células viables no están teñidas.
- Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Resuspend las células con 10 μL de ti1.2 microperlas en 90 μL de tampón MACS refrigerado para menos de 10 millones de células viables. Agregue más cuentas proporcionalmente si hay más de 10 millones de células viables. Pipetear bien la mezcla e incubar a 4 °C durante 30-60 min.
- Agregue 10 ml de búfer MACS y mezcle bien.
- Centrifugar a 200 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante.
- Repita los pasos 3.15-3.16 una vez.
- Resuspend las celdas y cuentas con 2 ml de búfer MACS.
- Configure un separador MACS en la campana. Inserte una columna LS en el separador y equilibre la columna con 3 ml de búfer MACS.
- Cuando la columna LS esté equilibrada, pase las celdas a través de la columna.
- Lave la columna LS con 2 ml de búfer MACS tres veces.
- Retire la columna del separador, elútela con 2 ml de búfer MACS tres veces y luego recoja la elución en un tubo de 50 ml.
- Centrifugar a 200 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Resuspendir las células con 5 ml de medios FB.
- Determine el número de célula con un hemocitómetro.
- Diluya las células con medios FB y selle las células en platos o placas según lo desee. Asegúrese de que la densidad de siembra celular sea de alrededor de 2-2.5 x 104 células / cm2 (optimice la densidad en función de experimentos individuales). Asegúrese de que los fibroblastos unidos tengan una forma ovalada a redonda el segundo día después de la siembra (Figura 3).
4. Producción de retrovirus que codifica el vector MGT policistrónico para la reprogramación cardíaca
- Mantener Plat-E con medios de cultivo Plat-E (DMEM suplementado con 10% fbs, 1 μg/mL de puromicina y 10 μg/mL de blasticidina) a 37 °C con 5% de CO2.
- El día 1, divida Plat-E en una placa de 6 pocillos con una densidad de aproximadamente 4-5 x 105 células/pozo.
- En el día 2, Plat-E generalmente alcanza el 80% de confluencia. Transfectar las células con los siguientes procedimientos. Ajuste el volumen y la cantidad de cada elemento presente aquí en función de cada pozo en una placa de 6 pocillos.
- Diluir 2 μg de vector plásmido de expresión de retrovirus policistrónico pMX-puro-MGT (Addgene 111809) a 500 ng/μL con tampón TE.
- Preparar la mezcla de transfección mezclando 10 μL de Lipofectamina con 150 μL de medio sérico reducido. Pipetear cuidadosamente para mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Tenga cuidado de evitar las burbujas al pipetear.
- Mientras tanto, prepare una mezcla de plásmidos mezclando el plásmido con 150 μL de medio sérico reducido. Pipetear cuidadosamente para mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Tenga cuidado de evitar las burbujas al pipetear.
- Mezcle cuidadosamente las dos mezclas e incube a temperatura ambiente durante 5 min. La solución puede parecer turbia.
- Añadir la mezcla gota a gota a las células a transfectar.
- Incubar las células a 37 °C durante la noche.
- El día 3, cambie el medio a un medio de cultivo celular completo fresco que carezca de puromicina y blasticidina.
- El día 4, 48 h después de la transfección, recoger el sobrenadante que contiene retrovirus y almacenarlo a 4 °C.
- El día 5, 72 h después de la transfección, recoger el sobrenadante que contiene retrovirus.
- Filtre el sobrenadante de 48 h y 72 h con un filtro de 0,45 μm, precipite durante la noche a 4 °C agregando 1/5 de volumen de solución de poli (etilenglicol) (PEG) al 40% para hacer una concentración final de 8% de PEG.
- Centrifugar a 4.000 x g durante 30 min para precipitar el virus.
NOTA: PEG8000-virus forma una pequeña precipitación blanca. - Resuspend el virus con medio iCM que contenga 8 μg/mL de polibreno según se desee. Use el retrovirus inmediatamente.
5. Reprogramación de NCF a iCM con MGT que codifica la infección por retrovirus
- Cultivar o pasar NCF antes de la infección por virus.
NOTA: Por lo general, NCF se puede pasar dos veces. - En el día 0, sembrar NCF a la densidad alrededor de 1-2 x 104 células/cm2 en medio FB.
- El día 1, reemplace el medio de cultivo con un medio que contenga virus para cada pozo que desee. Use el virus de un pocillo Plat-E en una placa de 6 pocillos para infectar dos pocillos en una placa de 24 pocillos. Titule el virus para determinar la concentración óptima del virus.
NOTA: Los virus que contienen otros factores de reprogramación de interés podrían introducirse junto con el retrovirus MGT. - Incubar a 37 °C durante la noche.
- El día 2, 24 h después de la infección por el virus, reemplace el medio que contiene el virus por un medio iCM normal.
- Para monitorear la expresión de GCaMP3, colóquela bajo un microscopio de fluorescencia invertida. Bajo 10x en el canal GFP, observe la fluorescencia basal leve de GCaMP3 de una porción de células ya en el día 5.
- Reemplace el medio cada 2-3 días durante la reprogramación. Si es necesario, realice una selección positiva para las células infectadas por el retrovirus MGT agregando 2 μg/ ml de puromicina al medio de cultivo durante 3 días y manteniéndolo a 1 μg / ml.
NOTA: Introducir productos químicos de interés (por ejemplo, IGF-1, MM589, A83-01 y PTC-209, conocidos como IMAP como informamos anteriormente15) junto con el cambio de medio. - Después de 14 días de infección, reemplace el medio con medio B27 para inducir aún más la maduración de iCM.
6. Evaluación de la maduración funcional de iCM y eficiencia de reprogramación por flujo de Ca2+
NOTA: Agregue 1 μM de isoproterenol a las células que se evaluarán antes de la evaluación, si es necesario.
- Evalúe el flujo de Ca2+ con un microscopio de fluorescencia invertida a temperatura ambiente.
- En el canal GFP, observe las células GCaMP3+ bajo el objetivo 10x. Asegúrese de que muestre el latido espontáneo de la célula en el canal de campo brillante.
- Seleccione aleatoriamente tres campos por debajo de 20x y registre el flujo de Ca2+ de los iCM durante 3 minutos para cada campo.
NOTA: Aquí, el flujo de Ca2+ se sincronizó con el latido espontáneo de las células (Figura 4, Figura 5 y Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7, Video 8). - Cuantificar manualmente las células con flujo de Ca2 +.
7. Análisis estadístico y presentación de datos
- Analizar las diferencias entre los grupos de análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y realizar las pruebas de comparación múltiple de Student-Newman-Keuls.
NOTA: Los resultados son como media ± S.E con p < 0,05 considerados estadísticamente significativos. Cada experimento se realizó al menos tres veces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El flujo de trabajo experimental para generar la cepa de ratón Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 y la estructura genética de los ratones transgénicos se muestra en la Figura 1. Mientras se establece la cepa de ratón, los corazones de las crías fueron aislados y observados bajo un microscopio de fluorescencia inversa para confirmar el genotipo. Los corazones con el genotipo correcto muestran un flujo de Ca2+ sincronizado con los latidos, visualizado como fluorescencia GCaMP3, mientras que no se observó fluorescencia en los corazones de control (Figura 2, Video 1 y Video 2). Los NCF aislados se unirán al pozo dentro de las 2 h y mostrarán una forma ovalada a redonda 1 día después de la siembra (Figura 3). La madurez funcional y la eficiencia de reprogramación de los iCM se evaluaron mediante flujo de Ca2+ 14 días después de la introducción de MGT. Las células reprogramadas se pueden evaluar bajo un microscopio de fluorescencia para medir el flujo de Ca2 +. Las células GCaMP3+ se pueden encontrar en los grupos IMAP y MGT, mientras que el grupo IMAP muestra significativamente más células GCaMP3+ y células con patrones de oscilación Ca2+ más cercanos a los CM normales (Videos 3-8). Como se muestra en la Figura 4A, una celda representativa en el grupo IMAP con oscilación Ca2+ mostrará el cambio de fluorescencia GCaMP3 entre el máximo (panel medio) y el mínimo (panel derecho), y la oscilación Ca2+ de dichas células se cambia periódicamente (Figura 4B). Después de la introducción de IMAP, el número de grupos de latidos fue significativamente mayor que en el grupo de control, ya que el número de células GCaMP3+ con flujo de Ca2+ por campo de alta potencia (HPF, lente objetivo 20x) aumentó en el grupo IMAP-medio-tratado (Figura 5).
Figura 1: Generación de la tensión del ratón Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3. Ilustración de la generación de cepas de ratón Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 y la estructura genética de los ratones transgénicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo de Ca2+ del corazón que late. La fluorescencia GCaMP3 se sincronizó con los latidos del corazón en los corazones Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 (panel superior), mientras que no se observó fluorescencia en los corazones de control (panel inferior). Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: NCF aislados unidos a una placa de 6 pocillos. (A) NCF bajo campo de baja potencia (LPF, objetivo 10x, barra de escala = 100 μm). (B) NCF bajo campo de alta potencia (objetivo 20x, barra de escala = 50 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Flujo de Ca2+ de células reprogramadas. (A) NCF tratados con IMAP reprogramados a iCM bajo canal GFP en campo de alta potencia (objetivo 20x). El flujo de Ca2+ de los iCM se visualizó como fluorescencia GCaMP3, en la que las células con flujo de Ca2+ muestran un parpadeo repetido entre la fluorescencia básica (Ca2+ min, panel medio) y la fluorescencia brillante (Ca2+ max, panel derecho) sincronizada con el latido. (B) Curva de traza de Ca2+ de células de oscilación Ca2+ en el grupo IMAP. Barra de escala = 50 μm. F/F0: intensidad relativa de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 Figura 5: Evaluación del flujo de Ca2+ en medio IMAP. Número de células GCaMP3+ con flujo de Ca2+ por HPF 2, 3, 4 semanas después de la inducción de MGT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Un corazón latiendo aislado de cachorros con genotipo αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bajo lente objetivo de escaneo (objetivo 4x) en el canal GFP. El corazón es GCaMP3+ y parpadea entre la fluorescencia básica (Ca2+ min) y la fluorescencia brillante (Ca2+ max) sincronizada con los latidos. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 2: Un corazón latiendo aislado de cachorros con genotipo de control bajo lente de objetivo de escaneo en el canal GFP. El corazón es GCaMP3- y no muestra destellos de fluorescencia sincronizados con latidos. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 3: iCM en el grupo IMAP bajo LPF en el canal de campo brillante (BF). Se puede ver una celda con golpes significativos en el centro del campo. Tanto el Video 3 como el Video 4 se centran en el mismo campo. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 4: iCM en el grupo IMAP bajo LPF en el canal GFP. Se pueden observar múltiples células con fluorescencia intermitente, incluida la célula que late que se ve en el canal BF. Tanto el Video 3 como el Video 4 se centran en el mismo campo. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 5: iCM en el grupo IMAP bajo HPF en el canal BF. El centro del campo de Video 3 y Video 4 se observó bajo HPF. Se puede observar una célula con latidos significativos en el centro del campo. Tanto el video 5 como el video 6 se centran en el mismo campo. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 6: iCM en el grupo IMAP bajo HPF en el canal GFP. La parte central del campo de Video 3 y Video 4 se observó bajo HPF. Se pueden observar múltiples células con fluorescencia intermitente, incluida la célula que late que se ve en el canal BF. Tanto el video 5 como el video 6 se centran en el mismo campo. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 7: iCM en el grupo MGT bajo HPF en el canal BF. En contraste con las células batidoras significativas observadas en el grupo IMAP, hay algunas células que baten bajo el canal BF en el grupo MGT, que tiene una menor eficiencia de reprogramación. Tanto el video 7 como el video 8 se centran en el mismo campo. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 8: iCM en el grupo MGT bajo HPF en el canal GFP. Se pueden observar varias células con fluorescencia intermitente leve. Tanto el video 7 como el video 8 se centran en el mismo campo. Haga clic aquí para descargar este video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La evaluación de la función de los iCM es necesaria para el campo de la reprogramación cardíaca. En este manuscrito, el protocolo describe una cepa de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J cepa de ratón que se ha establecido, cómo utilizar los NCF aislados de los ratones neonatales en esta cepa para la reprogramación a iCM, y la evaluación de la función de iCM por flujo de Ca2+ . Este es un método de novo para evaluar la maduración funcional de los iCM.
Varios pasos críticos son importantes para reprogramar y evaluar con éxito con este método. En primer lugar, los NCF deben estar recién preparados y sanos después del aislamiento. Un procedimiento rápido de aislamiento cardíaco y corte es esencial. Lo más importante es que es crucial seguir el tiempo de incubación para evitar la sobredigestión y la reducción de la viabilidad y la condición celular. En segundo lugar, entre todos los procedimientos, la eficiencia de la infección por virus a menudo introduce una alta variación en los resultados. La eficiencia de la infección por virus está influenciada principalmente por dos factores. Por un lado, el título del virus debe ser constante entre los diferentes intentos, lo que requiere consistencia en la cantidad de plásmidos transfectados y una condición y densidad similar de las células Plat-E. Los investigadores que siguen este protocolo deben evaluar la densidad de siembra óptima y el tiempo antes de esos procedimientos. El virus debe usarse inmediatamente para evitar la atenuación del título debido a la sensibilidad del virus a los ciclos de congelación-descongelación. Además, es importante mantener los NCF en una condición saludable y una densidad adecuada en el momento de la infección. Los investigadores deben estar familiarizados con las características de crecimiento de los NCF. Si bien la variación de la eficiencia de reprogramación debería ser limitada, el monitoreo frecuente podría ser útil. Este protocolo se puede modificar fácilmente para coinfectar NCF con diferentes virus o tratarlos con productos químicos de interés. Por lo tanto, es aplicable como un método universal para la investigación de reprogramación cardíaca. Además de los puntos mencionados aquí, los problemas comunes con este método incluyen la baja fluorescencia observada después de la reprogramación. Esto puede deberse a varias razones. En primer lugar, la infección puede no ser tan efectiva como se desea, lo que conduce a una baja eficiencia de reprogramación y limita el número de iCM. En segundo lugar, es posible que sea necesario ajustar la condición de exposición de manera óptima para la observación de la fluorescencia GCaMP3 de los iCM. El uso de cardiomiocitos neonatales aislados de las mismas crías como control positivo ayudará a identificar la posible razón.
El flujo de Ca2+ ha sido ampliamente utilizado para evaluar las actividades celulares, incluso en células neuronales16, glándula mamaria17, tejidos grasos18, etc. En este estudio, se utilizó el flujo de Ca2+ para evaluar la maduración funcional de los iCM. Anteriormente, se ha informado que el flujo de Ca2+ puede medirse mediante sustancias químicas específicas denominadas colorantes sensibles al calcio de moléculas pequeñas que pueden utilizarse para evaluar la función de las células reprogramadas19. Sin embargo, tal método tiene varias limitaciones: el químico introducido en las células puede tener toxicidad potencial e influir en los procesos celulares, lo que hace que los resultados sean menos confiables que los obtenidos con el método presentado aquí. Además, el proceso de tinción es complicado y requiere mucho tiempo, al tiempo que impide nuevas evaluaciones de esas células. El método presentado aquí, por otro lado, supera esas limitaciones. GCaMP3 no es invasivo para las células, lo que minimiza las influencias en las actividades celulares y permite una evaluación adicional de las células. Dado que la fluorescencia de los iCM solo depende de su identidad, es decir, la expresión de Myh6 y el cambio local de concentración de Ca2 + , la fluorescencia del flujo de Ca2 + de las células se hace visible siempre que se reprogramen los NCF, lo que permite un monitoreo frecuente del proceso de reprogramación sin una estrategia que consuma mucho tiempo. Mientras que el flujo de Ca2+ puede ser monitoreado y registrado fácilmente bajo un microscopio de fluorescencia invertida, el latido repetido y la actividad electrónica relacionada a través de la membrana celular, es decir, el flujo de Ca2+ , pueden cuantificarse temporalmente20. Como se muestra en la Figura 4B, dicha cuantificación puede proporcionar más información sobre la madurez de los iCM e ilustrar estructuras más detalladas del cambio de flujo de Ca2+ durante la reprogramación cardíaca.
Este método tiene varias ventajas. En primer lugar, el flujo de Ca2+ se observa exclusivamente en los iCM. Debido a que Myh6 es muy específico para los CM, pero no para los CF, solo las células reprogramadas con éxito expresarán el informador GCaMP3 y se volverán fluorescentes. En segundo lugar, el flujo de Ca2 + proporciona una forma de evaluar la maduración funcional de los iCM además del método de monitoreo de la expresión de genes específicos de CM. Debido al procedimiento experimental relativamente largo y la variación relacionada con esto, la función de los iCM no siempre es aceptable para estudios posteriores y uso clínico potencial. Mientras que la expresión génica específica de CM solo revela una parte de las características de la célula reprogramada, el flujo de Ca2 + proporciona otro aspecto del campo de reprogramación cardíaca para evaluar la calidad y eficiencia de la célula reprogramada. Además, la maduración funcional está más relacionada con la función cardíaca, lo que puede ser un mejor indicador para evaluar la eficiencia. Los métodos ampliamente utilizados en este campo incluyen la citometría de flujo, una técnica que requiere la digestión de tripsina de todos los grupos celulares. Si bien la digestión puede influir en las funciones y características celulares, introduce variaciones en el sistema, disminuyendo el potencial para reproducir los resultados observados y evaluando aún más esas células. En comparación con esos métodos, la cepa de ratón transgénico que se muestra aquí ha limitado la influencia potencial de los productos químicos o los procedimientos experimentales necesarios para la evaluación. Con esas ventajas, esta cepa de ratón simplifica los procedimientos de evaluación necesarios para la reprogramación cardíaca y mejora la reproducibilidad de los resultados en este campo.
Sin embargo, hay algunas limitaciones en este estudio. En primer lugar, el establecimiento de la tensión del ratón lleva mucho tiempo. Las consultas de la cepa de ratón de colegas en este campo son bienvenidas para acortar el tiempo necesario para el establecimiento de la cepa. En segundo lugar, la reprogramación cardíaca a iCM con este protocolo implica múltiples factores y pasos, que introducen una variación relativamente alta en el sistema. La competencia en este campo ayudará a superar este problema. Finalmente, debido a que el GCaMP3 se vuelve fluorescente solo en condiciones de flujo de Ca2+, el método de evaluación actual no se puede utilizar directamente para FACS como reprogramación cardíaca con la cepa Myh6-GFP7. Sin embargo, si bien la cepa actual tiene más y diferentes aplicaciones en comparación con la cepa Myh6-GFP, tal inconveniente puede superarse.
En general, como el protocolo ha descrito anteriormente, la cepa de ratón Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 y la evaluación posterior de la maduración de los iCM proporcionan una estrategia para monitorear todo el proceso de reprogramación cardíaca. Esta estrategia de medición de flujo de Ca2+ mediada por GCaMP3 se puede realizar en células vivas sin dañar la viabilidad celular. Debido a que la fluorescencia GCaMP3 es impulsada por la expresión génica específica del miocardio, los datos fluorescentes GCaMP3 adquiridos se pueden cuantificar aún más para revelar la eficiencia de reprogramación y la actividad de los iCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos los esfuerzos de Leo Gnatovskiy en la edición del texto en inglés de este manuscrito. La figura 1 se creó con BioRender.com. Este estudio fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de los Estados Unidos (1R01HL109054) al Dr. Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
- Frangogiannis, N. G.
- Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
- Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036 (2016).
- Grant, A. O.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).
- Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).
- Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312 (2016).
