Summary
우리는 여기에 설명, Tg의 설립 및 응용 프로그램 (Myh6-cre)1Jmk / J /Gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)(CAG-GCaMP3)(αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 아래라고함) 심장 재프로그래밍 평가를 위한 마우스 리포터 라인. 마우스 균주로부터 분리된 신생아 심장 섬유아세포(NCFs)는 유도된 심근세포(iCM)로 변환되어 칼슘(Ca2+) 플럭스를 통해 iCM의 재프로그래밍 효율과 기능성 성숙을 편리하고 효율적으로 평가할 수 있습니다.
Abstract
심장 재프로그래밍은 손상된 심장을 복구하는 잠재적으로 유망한 치료법이되었습니다. Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT)를 포함하여 다중 전사 요인을 도입함으로써 섬유아세포는 유도된 심근세포(iCM)로 다시 프로그래밍될 수 있습니다. 이러한 iCM은 극한의 심장에서 시투에서 생성될 때 주변 심근과 전기및 기계적으로 통합되어 흉터 크기가 감소하고 심장 기능이 개선됩니다. IMC의 리프로그래밍 효율성, 순도 및 품질이 상대적으로 낮기 때문에 iMC의 특성화는 여전히 어려운 과제입니다. 현재 사용되는 방법은 유동 세포측정, 면역 세포화학 및 qPCR을 포함하여 주로 심장 특이적 유전자 및 단백질 발현에 초점을 맞추고 있지만 iCM의 기능성 성숙에는 초점을 맞추지 않습니다. 작용 잠재력에 의해 촉발, 심근 세포에 전압 게이트 칼슘 채널의 개방은 세포로 칼슘의 급속한 유입으로 이어질. 따라서 칼슘 유입 속도를 정량화하는 것은 심근세포 기능을 평가하는 유망한 방법입니다. 여기서, 프로토콜은 칼슘(Ca2+) 플럭스로 iCM 기능을 평가하는 방법을 소개한다. αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-GCaMP3 마우스 스트레인은 Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)의 Hze/J(Rosa26A-M-Stop-M3-M)와 Tg(Myh6-cre)1Jmk/J(아래 Myh6-Cre라고 함)를 교차하여 설립되었습니다. P0-P2 신생아 마우스의 신생아 심장 섬유아세포(NCFs)는 시험관 내에서 분리되고 배양되었고, MGT의 다각성 건설은 NCFs에 도입되어 ICM에 대한 리프로그래밍을 주도하였다. 성공적으로 다시 프로그래밍된 iMC만이 GCaMP3 리포터를 발현하기 때문에 iCM의 기능성숙은 형광 현미경 으로 Ca2+ 플럭스로 시각적으로 평가될 수 있습니다. NCF-iC는 비프로그래밍된 NCF와 비교하여 CM과 유사한 상당한 칼슘 과도 플럭스와 자발적인 수축을 보였습니다. 이 프로토콜은 마우스 변형 소작용 확립, 분리 및 신생아 마우스 심장의 선택, NCF 절연, 심장 재프로그래밍을 위한 레트로바이러스 생성, iCM 유도, 기자 라인을 이용한 iCM Ca2+ 플럭스의 평가, 관련 통계 분석 및 데이터 프레젠테이션을 자세히 설명합니다. 여기에 설명된 방법은 심장 재프로그래밍 연구를 위한 iCM의 기능성숙을 평가하는 귀중한 플랫폼을 제공할 것으로 기대된다.
Introduction
심근 경색 (MI)은 전 세계적으로 심각한 질병입니다. 심장 혈관 질병 (CVDs)는 전 세계적으로 사망의 주요 원인이며 20191,2에서 약 1,860 만 명의 사망자를 차지합니다. CVD의 총 사망률은 지난 반세기 동안 감소했습니다. 그러나, 이러한 경향은 CVDs의 더 효과적인 처리를 요구하는 몇몇 미개발 국가에서 둔화되거나 반전되었습니다1. CVD의 치명적인 표현의 한개, MI는 미국에 있는 CVDs에 기인한 모든 죽음의 대략 반을 차지합니다2. 허혈 동안 관상 동맥의 차단과 영양소와 산소의 공급이 제한되어 심근은 심한 대사 변화를 겪고 심근 세포 (CM)의 수축기 기능을 손상시키고 CM 사망3로 이어집니다. 심장 혈관 연구에 있는 수많은 접근은 심장 상해를 복구하고 부상당한 심장4의 기능을 복구하기 위하여 탐구되었습니다. 직접적인 심장 리프로그래밍은 손상된 심장을 복구하고 기능을 복원하는 하나의 유망한 전략으로 부상했습니다5,6. Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT)를 도입함으로써 섬유아세포는 체외 및 생체 내 iMC로 다시 프로그래밍할 수 있으며, 이러한 iCM은 흉터 부위를 줄이고 심장 기능을 향상시킬 수 있습니다7,8.
심장 재프로그래밍은 MI 처리를 위한 유망한 전략이지만, 많은 도전이 남아 있습니다. 첫째, 리프로그래밍 효율, 순도 및 품질이 항상 예상만큼 높지는 않습니다. MGT 유도는 시험관7에서 iCM으로 다시 프로그래밍될 총 CF의 8.4%(cTnT+) 또는 24.7%(αMHC-GFP+)만 달성할 수 있으며, 이는 해당 애플리케이션을 제한하는 생체 내에서 최대 35%까지 달성할 수 있다. Hand29 또는 Akt1/PKB10과 같은 시스템에 더 많은 요인이 유도되어 있더라도, 재프로그래밍 효율은 여전히 임상 환경에서 사용될 수 있는 거의 만족스럽지 않다. 따라서 이 분야에서는 리프로그래밍 효율성 향상에 초점을 맞춘 연구가 더 많이 필요합니다. 둘째, IMC의 전기 적 무결성 및 수축 특성은 심장 기능의 효율적인 개선을 위해 중요하지만, 이들은 평가하기 어렵다. 현재, 일부 주요 CM 유전자 발현의 유혈 세포측정, 면역세포화학 및 qPCR을 포함한 분야에서 널리 사용되는 평가 방법은 모두 iCM 및 CM의 유사성에 초점을 맞추고 있지만 iMC의 기능적 특성과 직접적인 관련이 없다. 또한 이러한 방법은 비교적 복잡한 절차를 가지며 시간이 많이 걸립니다. 재프로그래밍 연구는 일반적으로 iCM 성숙을 촉진하는 잠재적인 재프로그래밍 요인의 검사를 포함하지만, 심장 재프로그래밍은 iMC 기능에 따라 빠르고 편리한 방법을 요구합니다.
CM은 각 계약 주기 동안 사이토멤브레인에 전압 게이트 칼슘 이온 채널을 열어 세포간 유체에서 세포질로칼슘 이온(Ca2+)의 일시적인 유입으로 이어져 근막 수축에 참여합니다. 이러한 Ca2+ 유입 및 외동성 주기는 심근 수축의 기본 특성이며 CMs12의 정상적인 기능을 구성합니다. 따라서 Ca2+ 유입을 감지하는 방법은 IMC를 포함한 CM 및 CM과 같은 세포의 기능을 측정하는 잠재적인 방법이 될 수 있습니다. 또한 iMC의 경우 이러한 방법은 재프로그래밍 효율성을 평가하는 또 다른 방법을 제공합니다.
유전자 로 인코딩 된 칼슘 지표 (GECIs)는 세포 활동, 특히 행동 잠재력을 나타내는 데 널리 사용되었습니다. 일반적으로 GECI는 칼모둘린과 같은 Ca2+ 결합 도메인으로 구성되며, GFP와 같은 형광 도메인및 GCaMP3는 높은 친화력 및 형광 강도를 가진 도메인이다. GCaMP3의 형광 도메인은 국소 칼슘 농도가 변경될 때 활성화됩니다13. 본 논문에서, Myh6+ 세포에서 GCaMP3 리포터를 구체적으로 표현하는 마우스 변형이 설명된다. 이 균주의 신생아로부터 고립된 NCF에 MGT를 도입함으로써, 재프로그래밍은 형광에 의해 모니터링될 수 있으며, 이는 성공적으로 iMC를 다시 프로그래밍할 것이다. 이러한 마우스 변형 및 방법은 심장 재프로그래밍을 조사하는 귀중한 플랫폼을 제공합니다.
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Protocol
동물과 관련된 모든 실험 절차와 관행은 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다. 세포 배양과 관련된 모든 실험 절차 및 관행은 멸균 조건하에서 BSL2 생물학적 안전 캐비닛을 수행해야 합니다. 바이러스와 관련된 절차 및 관행에 대해, 환경 및 건강 위험의 위험을 피하기 위해 전염 된 세포, 파이펫 팁 및 튜브의 적절한 처분의 지침이 뒤따랐다.
1. Tg (Myh6-cre)1Jmk / J / Gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze /J (Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) 마우스 변형 (그림 1) 설립
- Tg(Myh6-cre)1Jmk/J 마우스 스트레인(잭슨 랩 스톡 009074, Myh6-Cre라고 함) 및 Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3) Hze/J 마우스 스트레인(잭슨 랩 재고 014538, Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3)을 준비한다.
- 각각 8주 까지 번식하여 성인 Myh6-Cre와 Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 마우스를 각각 얻습니다.
- 성인 Myh6-Cre와 Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 마우스를 교배합니다.
참고 : Myh6-Cre 남성 / Rosa26A - Flox-Stop-Flox-GCaMP3 여성 또는 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 그들의 후손 사이에는 큰 차이가 없습니다. 전형적으로, 암컷 마우스는 교배 후 19-21일 후에 8-10 새끼를 낳을 것이다.
2. 신생아 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 마우스 하트의 격리 및 선택.
- P0-P2 새끼를 가져옵니다. 이 프로토콜로 1,000만 개의 NCF를 격리하기 위해 8-10개의 새끼가 있는지 확인합니다.
- 저체온증에 의해 새끼를 심히 마취시켰습니다. 새끼를 라텍스 장갑에 놓고 분쇄 된 얼음과 물 (2 ° C - 3 ° C)에 목에 담급니다.
- 75%의 에탄올로 새끼를 간략하게 소독합니다.
- 멸균 가위로 참수하여 새끼를 희생하십시오.
- 심장 근처에 수평 절개를 하고, 심장을 짜낸 다음, 대마의 뿌리에서 가위로 분리하여 분리합니다.
- 형광 현미경으로 박동하는 심장을 관찰하십시오. Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 유전자형으로 심장 박동이 있는 GCaMP3로 표시된 Ca2+ 플럭스를 확인합니다. 다른 유전자형은 형광을 나타내지 않습니다(그림 2, 비디오 1 및 비디오 2).
3. 신생아 심장 섬유아세포 의 격리 (NCFs)
참고: 이 부분에 대해 Li Qian Dr.의 Lab14 의 프로토콜은 이 연구에 적용될 때 사소한 최적화로 채택되었습니다.
- αMHC-Cre/Rosa26A-플록스-플록스-GCaMP3 하트를 분리한 후 느슨하게 연결된 4개의 조각으로 자른다. 격리된 세포의 혈전 오염을 제한하기 위해 6cm 플레이트에서 얼음-차가운 DPBS로 여러 번 철저히 세척합니다.
- 하트를 15mL 원문 튜브로 옮기.
- 10 분 동안 37 °C에서 따뜻한 0.25 % 트립신 -EDTA의 8 mL로 마음을 소화.
- 트립신 상체를 버리고 HBSS에서 따뜻한 타입-II 콜라게나아제(0.5 mg/mL)를 5mL추가하십시오.
- 혼합물을 철저히 소용돌이시키고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 잠복 후, 소용돌이를 철저히 하고 소화되지 않은 조직이 중력에 의해 정착하게 하십시오.
- 5mL 냉간 섬유아세포(FB) 배지(IMDM 20% FBS 및 1% 페니실린/연쇄절제술)를 갖춘 15mL 원추형 튜브에서 상체를 수집합니다.
- 소화되지 않은 조직을 위해 3.4-3.7 단계를 4-5번 반복합니다.
- 모든 상체를 함께 수집하고 40 μm 스트레이너로 상체를 필터링합니다.
- 4°C에서 5분 동안 200 x g 의 원심분리기와 상류부를 폐기하십시오.
- 자기 활성화 셀 정렬 버퍼 (MACS 버퍼; 2 mM EDTA 및 0.5 % BSA와 1 x PBS)의 10 mL에서 세포를 다시 중단합니다.
- 트라이판 블루 염색에 의해 실행 가능한 셀 수를 결정합니다.
- 3.11 단계에서 10mL의 세포 현탁액에서 세포의 10 μL을 꺼내십시오.
- 10 μL의 0.4% 트라이판 블루 액액을 섞고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 혈종계에 혼합물을 추가하고 실행 가능한 세포 수를 결정합니다. 죽은 세포는 파란색으로 염색되고 실행 가능한 세포는 얼룩지지 않습니다.
- 4°C에서 5분 동안 200 x g 의 세포를 원심분리하고 상체부를 폐기합니다.
- 1000만 개 미만의 실행 가능한 세포를 위해 냉각 된 MACS 버퍼의 90 μL에서 Thy1.2 마이크로 비드의 10 μL로 세포를 다시 중단합니다. 1,000만 개 이상의 실행 가능한 세포가 있는 경우 비례적으로 더 많은 구슬을 추가합니다. 30-60 분 동안 4 °C에서 혼합물을 잘 피펫하고 배양합니다.
- MACS 버퍼 10mL를 추가하고 잘 섞습니다.
- 5 분 동안 200 x g 의 원심 분리기는 상신을 폐기하십시오.
- 한 번 3.15-3.16 단계를 반복합니다.
- MACS 버퍼2mL로 셀과 구슬을 다시 일시 중지합니다.
- 후드에 MACS 분리기 설정. 분리기에 LS 열을 삽입하고 MACS 버퍼3mL로 열을 위형화합니다.
- LS 열이 평형되면 열을 통해 셀을 전달합니다.
- LS 클럼을 2mL의 MACS 버퍼로 3번 세척합니다.
- 분리기에서 열을 꺼내 MACS 버퍼 2mL로 3번 엘테한 다음 용출을 50mL 튜브로 수집합니다.
- 원심 분리기 200 x g 에서 5 분 동안 및 상체를 폐기하십시오.
- FB 미디어의 5 mL로 세포를 다시 중단합니다.
- 혈종계를 사용하여 세포 수를 결정합니다.
- FB 매체로 세포를 희석시키고 원하는 대로 세포를 접시 나 접시에 시드하십시오. 세포 파종 밀도가 약 2-2.5 x 104 세포/cm2 인지 확인합니다(개별 실험에 따라 밀도를 최적화). 부착된 섬유아세포가 시드 후 둘째 날에 둥근 모양에 타원형이 있는지 확인합니다(그림 3).
4. 심장 재프로그래밍을 위한 폴리시스트로닉 MGT 벡터를 코딩하는 레트로바이러스 생산
- 37°C에서 Plat-E 배양 매체(DMEM은 10% FBS, 푸로마이신 1μg/mL, 블라스팅시딘 10μg/mL로 보충)를 5%CO2로 유지하십시오.
- 1일째에, Plat-E를 대략 4-5 x 105 세포/잘 조밀도로 6웰 플레이트로 분할합니다.
- 2일째에 Plat-E는 일반적으로 80%의 합류에 도달합니다. 다음 절차로 세포를 변형시. 6웰 플레이트의 각 웰을 기반으로 여기에 존재하는 각 요소의 부피와 양을 조정합니다.
- PMX-puro-MGT 폴리시스트로닉 레트로바이러스 발현 플라스미드 벡터(Addgene 111809)를 TE 버퍼로 500 ng/μL로 희석시 2 μg.
- 리포펙타민 10μL을 150μL의 감소된 혈청 배지와 혼합하여 트랜스펙션 혼합물을 준비한다. 조심스럽게 파이펫을 섞고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 파이펫팅 시 거품을 피하십시오.
- 한편, 플라스미드를 150μL의 감소된 혈청 배지와 혼합하여 플라스미드 혼합물을 준비한다. 조심스럽게 파이펫을 섞고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 파이펫팅 시 거품을 피하십시오.
- 두 혼합물을 조심스럽게 섞고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 용액이 흐릿해 보일 수 있습니다.
- 혼합물을 세포에 드롭하여 첨가하여 감염됩니다.
- 하룻밤 사이에 37°C에서 세포를 배양한다.
- 3일째에는 푸오마이신과 블라시딘이 부족한 신선한 완전한 세포 배양 배지로 배지를 변경한다.
- 4일째, 48h의 트랜스펙트 후, 레트로바이러스가 포함된 상퍼를 수집하고 4°C로 저장한다.
- 5일째, 72h에 트랜스펙트 후 레트로바이러스가 포함된 상퍼를 수집합니다.
- 0.45 μm 필터로 48h 및 72 h 의 상퍼를 모두 필터링하고, 40% 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 용액의 1/5 부피를 추가하여 4°C에서 하룻밤침전을 침전시켜 8%의 PEG의 최종 농도를 만듭니다.
- 바이러스를 침전시키기 위해 30 분 동안 4,000 x g 에서 원심 분리기.
참고 : PEG8000 바이러스는 작은 흰색 강수량을 형성한다. - 원하는대로 8 μg/mL 폴리브레인을 포함하는 iCM 배지로 바이러스를 다시 중단합니다. 즉시 레트로바이러스를 사용하십시오.
5. MGT 인코딩 레트로 바이러스 감염을 가진 IC에 NCF를 다시 프로그래밍
- 바이러스 감염 전에 NCF를 성장하거나 통과시.
참고: 일반적으로 NCF는 두 번 통과될 수 있습니다. - 0일째에, 종자 NCF는 FB 배지에서 약 1-2 x 104 세포/cm2 주위밀도로 종자 NCF.
- 1일째에는 배양 배지를 원하는 대로 각각 바이러스 함유 배지로 교체한다. 24 웰 플레이트에 두 개의 우물을 감염시키기 위해 6 웰 플레이트에 하나의 잘 Plat-E에서 바이러스를 사용합니다. 최적의 바이러스 농도를 결정하기 위해 바이러스를 티터.
참고: 관심의 다른 재프로그래밍 요인을 포함 하는 바이러스 MGT 레트로 바이러스와 함께 도입 될 수 있습니다. - 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.
- 2일째, 24h 바이러스 감염 후, 바이러스 함유 배지를 일반 iCM 배지로 대체한다.
- GCaMP3 발현을 모니터링하려면 반전된 형광 현미경으로 플레이트합니다. GFP 채널에서 10배 미만, 5일째부터 세포의 일부의 온화한 기저 GCaMP3 형광을 관찰한다.
- 재프로그래밍 하는 동안 매 2-3 일 마다 매체를 교체 합니다. 필요한 경우, 3일 동안 배양 배지에 2μg/mL의 퓨리신/mL을 추가하고 1 μg/mL로 유지함으로써 MGT 레트로바이러스 감염 세포에 대한 양성 선택을 수행한다.
참고: 관심 있는 화학 물질(예: IGF-1, MM589, A83-01 및 PTC-209, 이전에 보고된 IMAP이라고 함 15)을 중간 변화와 함께 소개합니다. - 감염 후, 배지를 B27 배지로 교체하여 iCM 성숙을 더욱 유도한다.
6. Ca2+ 플럭스로 iCM 기능 성숙 및 재프로그래밍 효율 평가
참고: 필요한 경우 평가 전에 평가할 수 있는 셀에 1μM 이소프로테레놀을 추가합니다.
- 실온에서 반전형 형광 현미경으로 Ca2+ 플럭스를 평가합니다.
- GFP 채널에서 10배 목표 미만의 GCaMP3+ 셀을 관찰한다. 밝은 필드 채널에서 자발적인 세포가 뛰는 것을 보여 주는지 확인합니다.
- 20배 미만의 세 필드를 임의로 선택하고 각 필드에 대해 3분 동안 iCM의 Ca2+ 플럭스를 기록합니다.
참고 : 여기, Ca2 + 플럭스 자발적인 셀 박동과 동기화되었다 (그림 4, 그림 5, 비디오 3, 비디오 4, 비디오 5, 비디오 6, 비디오 7, 비디오 8). - Ca2+ 플럭스로 세포를 수동으로 정량화합니다.
7. 통계 분석 및 데이터 프레젠테이션
- 그룹 간의 차이(ANOVA) 분산 분석(ANOVA)을 분석하고 학생-뉴먼-쿨스 다중 비교 테스트를 수행합니다.
참고: 결과는 통계적으로 유의한 것으로 간주되는 p < 0.05를 가진 ± S.E를 의미합니다. 각 실험은 적어도 세 번 수행하였다.
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Representative Results
Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-GCaMP3 마우스 균주와 형질형 마우스의 유전자 구조를 생성하는 실험 워크플로우가 도 1에 도시된다. 마우스 균주가 확립되는 동안, 새끼의 심장은 유전자형을 확인하기 위해 역형 형광 현미경으로 분리되고 관찰되었다. 올바른 유전자형을 가진 하트는 GCaMP3 형광으로 시각화된 구타와 동기화된 Ca2+ 플럭스를 보여주며, 대조군 하트에서는 형광이 관찰되지 않았습니다(그림 2, 비디오 1 및 비디오 2). 격리된 NCF는 2시간 이내에 우물에 부착하고 시드 후 1일 동안 둥근 모양에 타원형을 표시합니다(그림 3). ICM의 기능 성숙도 및 리프로그래밍 효율은 MGT 도입 후 14일 후에 Ca2+ 플럭스로 평가하였다. 재프로그래밍된 세포는 Ca2+ 플럭스를 측정하기 위해 형광 현미경으로 평가될 수 있다. GCaMP3+ 세포는 IMAP과 MGT 그룹 모두에서 찾을 수 있으며, IMAP 그룹은 일반 CM에 가까운 Ca2+ 진동 패턴을 가진 GCaMP3+ 세포 및 세포를 훨씬 더 많이 보여줍니다(동영상 3-8). 도 4A에 도시된 바와 같이, Ca2+ 진동을 가진 IMAP 그룹의 대표적인 셀은 최대(중간 패널)와 최소(오른쪽 패널) 사이의 GCaMP3 형광 변화를 나타내며, 이러한 세포의 Ca2+ 진동은 주기적으로 변경됩니다(그림 4B). IMAP의 도입 후, 고출력 장당 Ca2+ 플럭스를 가진 GCaMP3+ 세포의 수가 IMAP-중간 처리 군에서 증가했기 때문에, 대조군에서 그보다 구타 클러스터의 수가 훨씬 높았다(그림 5).
그림 1: 마이6-크레/Rosa26A-플록스-스톱-플록스-GCaMP3 마우스 스트레인 생성. Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 마우스 균주 생성 및 형질전환 마우스의 유전자 구조의 삽화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 박동하는 심장의 Ca2+ 플럭스. GCaMP3 형광은 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 하트(상부 패널)에서 심장 박동과 동기화되었으며, 대조군 하트(하부 패널)에서는 형광이 관찰되지 않았습니다. 스케일 바 = 200 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 3: 6웰 플레이트에 부착된 분리된 NCF . (A) 저전력 장하에서 NCF(LPF, 10배 목표, 스케일 바 = 100 μm). (B) 고전력장 하에서 NCF(20배 목표, 스케일 바 = 50 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 재프로그래밍된 셀의 Ca2+ 플럭스. (A) IMAP 처리 NCF는 고전력 필드(20배 목표)에서 GFP 채널하에서 iCM으로 재프로그래밍되었습니다. ICM의 Ca2+ 플럭스는 GCaMP3 형광으로 시각화되었으며, Ca2+ 플럭스를 가진 세포는 기본 형광(Ca2+ 분, 중간 패널) 및 밝은 형광(Ca2+ 최대, 오른쪽 패널) 사이에 반복적으로 깜박이는 것을 보여줍니다. (B) IMAP 그룹에서 Ca2+ 진동+ 셀의 추적 곡선. 스케일 바 = 50 μm. F/F0: 상대형 광등 강도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 그림 5: IMAP 매체에서 Ca2+ 플럭스의 평가. HPF 당 Ca2 + 플럭스를 가진 GCaMP3+ 세포의 수는 2, 3, 4 MGT 유도 후 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: GFP 채널에서 스캐닝 객관적 렌즈(4배 목표)에서 αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 유전자형으로 새끼로부터 분리된 박동심장. 심장은 GCaMP3+이며 기본 형광 (Ca2+ 분)과 밝은 형광 (Ca2 + 최대) 사이에 깜박입니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: GFP 채널에서 스캐닝 객관적인 렌즈 아래 제어 유전자형을 가진 새끼로부터 분리된 박동심장. 심장은 GCaMP3- 그리고 박동과 동기화 형광 깜박임을 표시하지 않습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 3: 밝은 필드(BF) 채널의 LPF 아래 IMAP 그룹의 iCM. 필드의 중앙에 상당한 구타를 가진 세포를 볼 수 있습니다. 비디오 3과 비디오 4 모두 동일한 필드에 중점을 둡니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 4: GFP 채널의 LPF 아래 IMAP 그룹의 iCM. BF 채널에서 볼 수 있는 구타 세포를 포함하여 깜박이는 형광을 가진 다중 세포가 관찰될 수 있다. 비디오 3과 비디오 4 모두 동일한 필드에 중점을 둡니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 5: BF 채널의 HPF 아래 IMAP 그룹의 iCM. 비디오 3 및 비디오 4 의 필드의 중심은 HPF에서 관찰되었다. 필드의 중앙에 상당한 구타를 가진 세포를 관찰할 수 있습니다. 비디오 5와 비디오 6 모두 동일한 필드에 중점을 둡니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 6: GFP 채널의 HPF 아래 IMAP 그룹의 iCM. 비디오 3 및 비디오 4 의 필드의 중심 부분은 HPF에서 관찰되었다. BF 채널에서 볼 수 있는 구타 세포를 포함하여 깜박이는 형광을 가진 다중 세포가 관찰될 수 있다. 비디오 5와 비디오 6 모두 동일한 필드에 중점을 둡니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 7: BF 채널에서 HPF에서 MGT 그룹의 iCM. IMAP 그룹에서 관찰되는 중요한 구타 세포의 대조적으로, MGT 군의 BF 채널 의 밑에 몇몇 구타 세포가 있습니다, 이는 더 낮은 재프로그래밍 효율이 있습니다. 비디오 7과 비디오 8 모두 동일한 필드에 중점을 둡니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 8: GFP 채널의 HPF 아래 MGT 그룹의 iCM. 온화한 깜박이는 형광을 가진 몇몇 세포는 관찰될 수 있습니다. 비디오 7과 비디오 8 모두 동일한 필드에 중점을 둡니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
심장 리프로그래밍 필드에iC 함수를 평가하는 것이 필요합니다. 이 원고에서, 프로토콜은 Tg (Myh6-cre)1Jmk / J / Gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Ze / J 마우스 변형을 설명하고, iCM에 대한 재프로그래밍을 위한 이 균주에서 신생아 마우스로부터 분리된 NCF를 사용하는 방법, 그리고 iC의 iC 함수에 의한 iC의 평가를 설명한다. 이것은 iCM 기능 성숙을 평가하는 de novo 방법입니다.
이 방법을 사용하여 성공적으로 다시 프로그래밍하고 평가하는 데 몇 가지 중요한 단계가 중요합니다. 첫째, NCF는 고립 후 신선하게 준비하고 건강해야합니다. 심장 고립과 절단의 빠른 절차는 필수적입니다. 가장 중요한 것은, 세포 생존력과 상태의 과잉 소화 및 감소를 피하기 위해 인큐베이션 시간을 따르는 것이 중요합니다. 둘째, 모든 절차 중, 바이러스 감염 효율은 종종 결과에 높은 변화를 소개합니다. 바이러스 감염 효율은 주로 두 가지 요인에 의해 영향을 받습니다. 한편으로는, 바이러스 titer는 전염된 플라스미드 수량 및 유사한 Plat-E 세포 상태 및 밀도에 있는 일관성을 요구하는 다른 시도 중 상수이어야 합니다. 이 프로토콜을 따르는 연구원은 그 절차 의 앞에 최적 종자 조밀도 및 시간을 평가해야 합니다. 바이러스는 동결 해동 주기에 바이러스 감도 때문에 titer 감쇠를 피하기 위하여 즉시 이용되어야 합니다. 추가적으로, 감염시 건강한 상태 및 적당한 조밀도에 NCFs를 유지하는 것이 중요합니다. 연구원은 NCFs의 성장 특성에 익숙해야 합니다. 리프로그래밍 효율성 변화는 제한적이어야 하지만 빈번한 모니터링이 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 바이러스와 NCF를 공동 감염하거나 관심있는 화학 물질로 치료하기 위해 쉽게 수정 할 수 있습니다. 따라서, 심장 재프로그래밍 연구를 위한 보편적인 방법으로 적용가능하다. 여기에 언급 된 점 외에,이 방법의 일반적인 문제는 재프로그래밍 후 관찰 낮은 형광을 포함한다. 이것은 몇 가지 이유로 인해 발생할 수 있습니다. 첫째, 감염은 낮은 리프로그래밍 효율로 이끌어 내고 iMC의 수를 제한하는 원하는만큼 효과적이지 않을 수 있습니다. 둘째, 노출 조건은 iMC의 GCaMP3 형광의 관측을 위해 최적으로 조정될 필요가 있을 수 있습니다. 긍정적인 대조군으로 같은 새끼에서 분리된 신생아 심근세포를 사용하면 잠재적인 이유를 식별하는 데 도움이 됩니다.
Ca2+ 플럭스는 뉴런 셀16, 유방 선17, 지방 조직18 등을 포함한 세포 활동을 평가하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이 연구에서Ca2+ 플럭스는 iMC의 기능성 성숙을 평가하는 데 사용되었습니다. 이전에는 Ca2+ 플럭스가 재프로그래밍된 세포의 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 작은 분자 칼슘 에민감한 염료라는 특정 화학 물질에 의해 측정될 수 있다고 보고되었습니다19. 그러나, 이러한 방법은 몇 가지 한계가 있다: 세포에 도입 된 화학 물질잠재적인 독성을 가질 수 있고 세포 과정에 영향을 미칠 수 있습니다., 여기에 제시 된 방법으로 얻은 것 들 보다 덜 신뢰할 수 있는 결과 만들기. 게다가, 염색 과정은 또한 그 세포의 추가 평가를 방지하는 동안 복잡하고 시간이 많이 걸립니다. 반면에 여기에 제시된 메서드는 이러한 한계를 극복합니다. GCaMP3는 세포 활동에 미치는 영향을 최소화하고 세포의 추가 평가를 가능하게 하는 세포에 대한 비침습적이다. iCM의 형광은 자신의 정체성, 즉 Myh6 발현 및 로컬 Ca2+ 농도 변화에 따라 달라지기 때문에 NCF가 다시 프로그래밍되는 한 세포의 Ca2+ 플럭스 형광이 표시되어 시간이 많이 소요되는 전략 없이 리프로그래밍 프로세스를 자주 모니터링할 수 있습니다. Ca2+ 플럭스는 반전형 형광 현미경하에서 쉽게 모니터링및 기록할 수 있지만, 세포막, 즉 Ca2+ 플럭스를 가로지르는 반복된 구타 및 관련 전자 활동은 더욱 일시적으로 정량화될 수 있다20. 도 4B에 도시된 바와 같이, 이러한 정량화는 iCM의 성숙도에 대한 자세한 정보를 제공하고 심장 재프로그래밍 중에 Ca2+ 플럭스 변화의 보다 상세한 구조를 설명할 수 있다.
이 방법에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, Ca2+ 플럭스는 iMC에서만 관찰됩니다. Myh6는 CM에 매우 국한적이지만 CF는 아니기 때문에 성공적으로 재프로그래밍된 세포만 GCaMP3 리포터를 발현하고 형광이 됩니다. 둘째, Ca2+ 플럭스는 CM 특이적 유전자의 발현을 모니터링하는 방법 외에 iCM의 기능성 성숙을 평가하는 방법을 제공한다. 이것에 연결된 상대적으로 긴 실험 절차 및 변이 때문에, iCM의 기능은 추가 연구 및 잠재적인 임상 사용을 위해 항상 허용되지 않습니다. CM 특이적 유전자 발현은 재프로그래밍된 세포의 특성의 일부만 을 드러내지만, Ca2+ 플럭스(Ca2+ flux)는 재평가된 세포 품질 및 효율성을 평가하기 위해 심장 재프로그래밍 필드의 또 다른 측면을 제공한다. 또한 기능성 성숙은 심장 기능과 더 관련이 있으며 효율성을 평가하는 더 나은 지표가 될 수 있습니다. 이 분야에서 널리 사용되는 방법은 모든 세포 그룹의 트립신 소화를 필요로 하는 기술인 유동 세포측정법을 포함한다. 소화는 세포 기능 및 특성에 영향을 미칠 수 있지만, 그것은 시스템에 변화를 도입, 관찰 된 결과를 재현 하는 잠재력을 감소 하 고 더 그 세포를 평가. 이러한 방법에 비해, 여기에 표시된 형질 전환 마우스 균주는 평가에 필요한 화학 물질 또는 실험 절차로부터 잠재적 인 영향을 제한했다. 이러한 장점으로, 이 마우스 변형은 심장 재프로그래밍에 필요한 평가 절차를 단순화하고이 분야에서 결과의 재현성을 향상시킵니다.
그러나 이 연구에는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 마우스 변형 소점은 시간이 많이 걸립니다. 이 분야에서 동료에서 마우스 변형의 문의는 변형 설립에 필요한 시간을 단축하는 것이 환영된다. 둘째, 이 프로토콜을 사용하여 IC에 대한 심장 재프로그래밍에는 여러 가지 요인과 단계가 포함되며, 이는 시스템에 상대적으로 높은 변형을 도입합니다. 이 분야의 숙련도는 이 문제를 극복하는 데 도움이 될 것입니다. 마지막으로, GCaMP3는 Ca2+ 플럭스 상태에서만 형광이 되기 때문에 현재 평가 방법은 Myh6-GFP strain7을 이용한 심장 재프로그래밍으로 FACS에 직접 사용될 수 없습니다. 그러나, 현재의 균주는 Myh6-GFP 균주에 비해 점점 더 다른 응용 프로그램을 가지고 있지만, 이러한 불편을 극복 할 수있다.
전반적으로, 프로토콜이 위에서 설명한 바와 같이, Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 마우스 변형 및 iCM 성숙평가에 따른 후 심장 재프로그래밍의 전체 과정을 모니터링하는 전략을 제공한다. 이 GCaMP3 매개 Ca2+ 플럭스 측정 전략은 세포 생존가능성을 해치지 않고 살아있는 세포에서 수행될 수 있다. GCaMP3 형광은 심근 특이적 유전자 발현에 의해 구동되기 때문에, 획득한 GCaMP3 형광 데이터는 재프로그래밍 효율 및 iCM 활성을 드러내기 위해 더욱 정량화될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는이 원고의 영어 텍스트를 편집레오 Gnatovskiy의 노력을 주셔서 감사합니다. 그림 1은 BioRender.com 함께 만들어졌습니다. 이 연구는 미국의 국립 보건 원 (NIH)에 의해 지원되었다 (1R01HL109054) 왕 박사에 보조금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
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