Summary
Vi beskriver här etablering och tillämpning av en Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (kallas αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedan) mus reporter linje för hjärt omprogrammering bedömning. Neonatal hjärtfibblaster (NCFs) isolerade från musstammen omvandlas till inducerade kardiomyocyter (iCMs), vilket möjliggör bekväm och effektiv utvärdering av omprogrammering effektivitet och funktionell mognad av iCMs via kalcium (Ca2 +) flöde.
Abstract
Hjärt omprogrammering har blivit en potentiellt lovande terapi för att reparera ett skadat hjärta. Genom att införa flera transkriptionsfaktorer, inklusive Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), kan fibroblaster omprogrammeras till inducerade kardiomyocyter (iCMs). Dessa iCMs, när de genereras in situ i ett infarcted hjärta, integreras elektriskt och mekaniskt med det omgivande hjärtmuskel, vilket leder till en minskning av ärrstorlek och en förbättring av hjärtfunktionen. På grund av den relativt låga omprogrammeringseffektiviteten, renheten och kvaliteten på iCMs är karakterisering av iCMs fortfarande en utmaning. De metoder som för närvarande används inom detta område, inklusive flödescytometri, immunocytokemi och qPCR, fokuserar främst på hjärtspecifik gen- och proteinuttryck men inte på funktionell mognad av iCMs. Utlöst av åtgärdspotentialer leder öppningen av spänningsdrivna kalciumkanaler i kardiomyocyter till en snabb tillströmning av kalcium till cellen. Därför är kvantifiering av kalciumtillströmningen en lovande metod för att utvärdera kardiomyocytfunktionen. Här introducerar protokollet en metod för att utvärdera iCM-funktion med kalcium (Ca2 +) flöde. En musstam av αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fastställdes genom att korsa Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (kallad Myh6-Cre nedan) med Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (kallad Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) möss nedan. Neonatal hjärt fibroblasts (NCFs) från P0-P2 neonatal möss isolerades och odlade in vitro, och en polycistronisk konstruktion av MGT introducerades till NCFs, vilket ledde till deras omprogrammering till iCMs. Eftersom endast framgångsrikt omprogrammerade iCMs kommer att uttrycka GCaMP3 reporter, kan funktionell mognad av iCMs visuellt bedömas av Ca2 + flöde med fluorescensmikroskopi. Jämfört med oprogrammerade NCFs visade NCF-iCMs betydande kalcium transienta flöde och spontan sammandragning, liknande CMs. Detta protokoll beskriver i detalj mus stam etablering, isolering och urval av neonatal möss hjärtan, NCF isolering, produktion av retrovirus för hjärt omprogrammering, iCM induktion, utvärdering av iCM Ca2 + flöde med hjälp av vår reporter linje och relaterade statistisk analys och data presentation. Det förväntas att de metoder som beskrivs här kommer att ge en värdefull plattform för att bedöma funktionell mognad av iCMs för hjärtomprogrammering studier.
Introduction
Hjärtinfarkt (MI) är en allvarlig sjukdom över hela världen. Hjärt- och kärlsjukdomar är den främsta dödsorsaken i världen och står för cirka 18,6 miljoner dödsfall 20191,2. Den totala dödligheten i cvds har minskat under det senaste halvseklet. Denna trend har dock bromsats eller till och med vänts i vissa outvecklade länder1, vilket kräver effektivare behandlingar av cvds. Som en av de dödliga manifestationerna av CVD står MI för ungefär hälften av alla dödsfall som tillskrivs CVDs i USA2. Under ischemin, med blockering av kranskärlen och begränsad tillgång på både näringsämnen och syre, lider myokardiet allvarliga metaboliska förändringar, försämrar den systoliska funktionen hos kardiomyocyter (CMs) och leder till CM-död3. Många metoder i kardiovaskulär forskning har undersökts för att reparera hjärtskada och återställa funktionen hos det skadade hjärtat4. Direkt hjärt omprogrammering har dykt upp som en lovande strategi för att reparera det skadade hjärtat och återställa dess funktion5,6. Genom att introducera Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) kan fibroblaster omprogrammeras till iCMs in vitro och in vivo, och dessa iCMs kan minska ärrområdet och förbättra hjärtfunktionen7,8.
Även om hjärt omprogrammering är en lovande strategi för MI behandling, det finns fortfarande ett antal utmaningar. För det första är omprogrammeringseffektiviteten, renheten och kvaliteten inte alltid så hög som förväntat. MGT-incitament kan endast uppnå 8,4% (cTnT+) eller 24,7% (αMHC-GFP+) av de totala CFs som ska omprogrammeras till iCMs in vitro7, eller upp till 35% in vivo8, vilket begränsar dess tillämpning. Även med fler faktorer som induceras i systemet, såsom Hand29 eller Akt1/PKB10, är omprogrammeringseffektiviteten fortfarande knappt tillfredsställande att använda i en klinisk miljö. Det behövs därför fler studier som är inriktade på att förbättra omprogrammeringseffektiviteten på detta område. För det andra är iCMs elektriska integritet och sammandragningsegenskaper viktiga för en effektiv förbättring av hjärtfunktionen, men dessa är utmanande att utvärdera. För närvarande är allmänt använda utvärderingsmetoder inom området, inklusive flödescytometri, immunocytokemi och qPCR av vissa viktiga CMs gener uttryck, alla fokuserade på likheten mellan iCMs och CMs, men inte direkt relaterade till funktionella egenskaper hos iCMs. Dessutom har dessa metoder relativt komplicerade förfaranden och är tidskrävande. Medan omprogrammeringsstudier vanligtvis innebär en screening av potentiella omprogrammeringsfaktorer som främjar iCMs mognad11, kräver hjärtomprogrammering en snabb och bekväm metod baserad på iCMs-funktionen.
CMs öppnar de spänningshägnade kalciumjonkanalerna på cytomembranen under varje kontrakteringscykel, vilket leder till en övergående tillströmning av kalciumjon (Ca2+) från den intercellulära vätskan till cytoplasman för att delta i myofilamentkontraktionen. En sådan Ca2 + tillströmning och utflödescykel är det grundläggande draget för hjärtinfarkt och utgör den normala funktionen hos CMs12. Således kan en metod som upptäcker Ca2 + tillströmning vara ett potentiellt sätt att mäta funktionen hos CMs och CM-liknande celler, inklusive iCMs. För iCMs ger en sådan metod dessutom ett annat sätt att utvärdera omprogrammeringseffektiviteten.
Genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECIs) har utvecklats och använts i stor utsträckning för att indikera cellaktiviteter, särskilt åtgärdspotentialer. I allmänhet består GECIs av en Ca2 + bindningsdomän som calmodulin, och en fluorescerande domän som GFP, och GCaMP3 är en med hög affinitet och fluorescensintensitet. Fluorescensområdet för GCaMP3 aktiveras när den lokala kalciumkoncentrationen ändras13. I detta dokument beskrivs en musstam som specifikt uttrycker en GCaMP3-reporter i Myh6 + celler. Genom att införa MGT till de isolerade NCF från nyfödda av denna stam kan omprogrammeringar övervakas av fluorescens, som framgångsrikt omprogrammerade iCMs kommer att ställa ut. En sådan musstam och metod kommer att ge en värdefull plattform för att undersöka hjärt omprogrammering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök och metoder som involverar djur godkändes av Institutional Animal Care & Use Committee vid University of Michigan. Alla experimentella förfaranden och metoder som involverar cellodling måste utföras BSL2 Biologiskt säkerhetsskåp under sterila förhållanden. För förfaranden och metoder som involverar virus följdes riktlinjen om korrekt bortskaffande av transfekterade celler, pipettspetsar och rör för att undvika risken för miljö- och hälsorisker.
1. Upprättande av en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (kallad Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) musstam (figur 1)
- Förbered Tg(Myh6-cre)1Jmk/J musstam (Jackson lab stock 009074, kallad Myh6-Cre) och Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J musstam (Jackson lab stock 014538, kallad Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), respektive.
- Avla varje stam upp till 8 veckor gammal för att få vuxna Myh6-Cre och Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 möss, respektive.
- Korsade de vuxna Myh6-Cre och Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mössen.
OBS: Ställ in Myh6-Cre hane/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 kvinna eller vice versa. Det finns ingen signifikant skillnad mellan deras ättlingar. Vanligtvis kommer honmössen att föda 8-10 valpar 19-21 dagar efter korsningen.
2. Isolering och urval av neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 möss hjärtan.
- Få P0-P2-valpar. Se till att 8-10 valpar finns för att isolera 10 miljoner NCFs med detta protokoll.
- Bedövade valparna djupt av hypotermi. Placera valparna i en latexhandske och doppa ner upp till halsen i krossad is och vatten (2°C - 3°C).
- Sanera valparna kort med 75% etanol.
- Offra valparna genom halshuggning med steril sax.
- Gör ett horisontellt snitt nära hjärtat, pressa hjärtat och isolera det sedan genom att separera vid aortan med sax.
- Observera hjärtat slå under ett fluorescensmikroskop. Se till att hjärtana med Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotyp visar Ca2 + flöde som indikeras av GCaMP3 med hjärtslag. De andra genotyperna visar inte fluorescens (figur 2, video 1 och video 2).
3. Isolering av neonatala hjärtfibblaster (NCFs)
OBS: För denna del antogs protokoll från Dr. Li Qians Lab14 med mindre optimeringar när det är tillämpligt på denna studie.
- Efter isolering av αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 hjärtan, skär dem i fyra bitar som är löst anslutna. Tvätta dem i iskall DPBS i en 6 cm tallrik noggrant flera gånger för att begränsa blodcellsföroreningen i de isolerade cellerna.
- Överför hjärtan till ett 15 ml koniskt rör.
- Smält hjärtan med 8 ml varmt 0,25% Trypsin-EDTA vid 37 °C i 10 min.
- Kassera trypsin supernatanten och tillsätt 5 ml varmt typ II kollagenas (0,5 mg/ml) i HBSS.
- Virvla blandningen noggrant och inkubera vid 37 °C i 5 min.
- Efter inkubationen virvlar du noggrant och låter den osmälta vävnaden slå sig ner genom gravitationen.
- Samla supernatanten i ett koniskt rör på 15 mL med 5 ml kallfibblastmedium (FB) (IMDM med 20% FBS och 1% penicillin/streptomycin).
- Upprepa steg 3,4-3,7 för den osmälta vävnaden 4-5 gånger.
- Samla ihop all supernatant och filtrera supernatanten med en sil på 40 μm.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Återanvänd cellerna i 10 ml magnetisk aktiverad cellsorteringsbuffert (MACS-buffert; 1x PBS med 2 mM EDTA och 0,5% BSA).
- Bestäm det livskraftiga cellnumret genom trypan blå färgning.
- Ta ut 10 μL celler från 10 ml cellfjädring i steg 3.11.
- Blanda med 10 μL 0,4% trypanblå lösning och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt blandningen till en hemocytometer och bestäm det livskraftiga cellnumret. De döda cellerna är färgade i blått, medan de livskraftiga cellerna är olåst.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Återanvänd cellerna med 10 μL Thy1,2 mikrober i 90 μL kyld MACS-buffert för mindre än 10 miljoner livskraftiga celler. Tillsätt fler pärlor proportionellt om det finns mer än 10 miljoner livskraftiga celler. Pipettera blandningen väl och inkubera vid 4 °C i 30-60 min.
- Tillsätt 10 ml MACS-buffert och blanda väl.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 minuter, kassera supernatanten.
- Upprepa steg 3.15-3.16 en gång.
- Återanvänd cellerna och pärlorna med 2 ml MACS-buffert.
- Sätt upp en MACS-separator i huven. Infoga en LS-kolumn i avgränsaren och balansera kolumnen med 3 ml MACS-buffert.
- När LS-kolumnen är ekvilibrerad skickar du cellerna genom kolumnen.
- Tvätta LS-kolonnen med 2 ml MACS-buffert tre gånger.
- Ta kolonnen från separatorn, elute den med 2 ml MACS-buffert tre gånger och samla sedan elutionen till ett 50 ml-rör.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min och kassera supernatanten.
- Återanvänd cellerna med 5 ml FB-media.
- Bestäm cellnumret med en hemocytometer.
- Späd cellerna med FB-media och så cellerna till disk eller tallrikar efter önskemål. Se till att cellsåddstätheten är cirka 2-2,5 x 104 celler/cm2 (optimera densiteten baserat på enskilda experiment). Se till att de bifogade fibroblasterna har en oval till rund form den andra dagen efter sådd (figur 3).
4. Produktion av retroviruskodning polycistronisk MGT vektor för hjärt omprogrammering
- Underhåll Plat-E med Plat-E-odlingsmedier (DMEM kompletterat med 10% FBS, 1 μg/ml puromycin och 10 μg/ml blasticidin) vid 37 °C med 5% CO2.
- På dag 1 delar du Plat-E till en 6-brunnsplatta vid cirka 4-5 x 105 celler / brunnstäthet.
- Dag 2 når Plat-E vanligtvis 80% sammanflöde. Transfect cellerna med följande procedurer. Justera volymen och kvantiteten för varje element som finns här baserat på varje brunn i en 6-brunnsplatta.
- Späd ut 2 μg pMX-puro-MGT polycistroniskt retrovirusuttrycksplasmidvektor (Addgene 111809) till 500 ng/μL med TE-buffert.
- Förbered transfektblandningen genom att blanda 10 μL lipofectamin med 150 μL reducerat serummedium. Rör försiktigt för att blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Var noga med att undvika bubblor vid pipettering.
- Under tiden bered en plasmidblandning genom att blanda plasmiden med 150 μL reducerat serummedium. Rör försiktigt för att blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Var noga med att undvika bubblor vid pipettering.
- Blanda försiktigt de två blandningarna och inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Lösningen kan verka grumlig.
- Tillsätt blandningen droppe för droppe till cellerna som ska transfected.
- Inkubera cellerna vid 37 °C över natten.
- På dag 3, ändra mediet till ett nytt komplett cellodlingsmedium som saknar puromycin och blasticidin.
- På dag 4, 48 h efter transfektionen, samla supernatanten som innehåller retrovirus och lagra det i 4 °C.
- På dag 5, 72 h efter transfektionen, samla supernatanten som innehåller retrovirus.
- Filtrera både 48 h och 72 h supernatant med ett 0,45 μm filter, fäll ut över natten vid 4 °C genom att tillsätta 1/5 volym 40% Poly (etylenglykol) (PEG) lösning för att göra en slutlig koncentration på 8% PEG.
- Centrifugera vid 4 000 x g i 30 minuter för att fälla ut viruset.
OBS: PEG8000-virus bildar liten vit nederbörd. - Återanvänd viruset med iCM-medium som innehåller 8 μg/mL polybrene efter önskemål. Använd retroviruset omedelbart.
5. Omprogrammera NCFs till iCMs med MGT-kodning retrovirusinfektion
- Odla eller passera NCFs före virusinfektion.
OBS: Vanligtvis kan NCF passeras två gånger. - På dag 0, frö NCF till densiteten runt 1-2 x 104 celler/cm2 i FB medium.
- På dag 1, ersätt odlingsmediet med ett virusinnehållande medium för varje såväl som önskat. Använd viruset från en brunn Plat-E i en 6-väl tallrik för att infektera två brunnar i en 24-brunnsplatta. Titer viruset för att bestämma den optimala viruskoncentrationen.
OBS: Virus som innehåller andra omprogrammeringsfaktorer av intresse kan introduceras tillsammans med MGT retrovirus. - Inkubera vid 37 °C över natten.
- På dag 2, 24 h efter virusinfektionen, ersätt det virusinnehållande mediet till ett vanligt iCM-medium.
- För att övervaka GCaMP3-uttrycket, plätera det under ett inverterat fluorescensmikroskop. Under 10x vid GFP-kanalen, observera den milda basala GCaMP3 fluorescensen av en del av cellerna så tidigt som dag 5.
- Byt ut mediet var 2-3 dag under omprogrammningen. Vid behov, utför ett positivt urval för MGT retrovirusinfekterade celler genom att tillsätta 2 μg/ml puromycin till odlingsmediet i 3 dagar och bibehålla det vid 1 μg/ml.
OBS: Introducera kemikalier av intresse (t.ex. IGF-1, MM589, A83-01 och PTC-209, kallad IMAP som vi tidigare rapporterat15) tillsammans med medelförändring. - Efter 14 dagars infektion, ersätt mediet med B27 medium för att ytterligare inducera iCM mognad.
6. Utvärdering av iCM funktionell mognad och omprogrammeringseffektivitet med Ca2 + flöde
OBS: Tillsätt 1 μM isoproterenol till de celler som ska utvärderas före bedömning, om det behövs.
- Utvärdera Ca2+ flusset med ett inverterat fluorescensmikroskop vid rumstemperatur.
- Observera GCaMP3+-cellerna under 10x-målet i GFP-kanalen. Se till att den visar spontan cellslagning i den ljusa fältkanalen.
- Välj slumpmässigt tre fält under 20x och registrera Ca2+ flödet för iCMs i 3 minuter för varje fält.
OBS: Här synkroniserades Ca2 + -flödet med spontan cellslagning (figur 4, figur 5 och video 3, video 4, video 5, video 6, video 7, video 8). - Kvantifiera cellerna manuellt med Ca2+ flöde.
7. Statistisk analys och uppgiftspresentation
- Analysera skillnaderna mellan grupper envägsanalys av varians (ANOVA) och utför Student-Newman-Keuls flera jämförelsetester.
OBS: Resultaten är som medelvärde ± S.E med p < 0,05 betraktas som statistiskt signifikanta. Varje experiment utfördes minst tre gånger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det experimentella arbetsflödet för att generera Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musstam och genstrukturen hos de transgena mössen visas i figur 1. Medan musstammen är etablerad isolerades valparnas hjärtan och observerades under ett omvänt fluorescensmikroskop för att bekräfta genotypen. Hjärtan med korrekt genotyp visar Ca2 + flux synkroniserat med stryk, visualiserat som GCaMP3 fluorescens, medan ingen fluorescens observerades i kontrollhjärtan (figur 2, video 1 och video 2). Isolerade nationella kontaktpunkter fästs på brunnen inom 2 h och visar en oval till rund form 1 dag efter sådden (figur 3). Den funktionella mognaden och omprogrammeringseffektiviteten hos iCMs utvärderades av Ca2 + flöde 14 dagar efter MGT introduktion. De omprogrammerade cellerna kan bedömas under ett fluorescensmikroskop för att mäta Ca2+ flusset. GCaMP3+ celler kunde hittas i både IMAP- och MGT-grupper, medan IMAP-gruppen visar betydligt fler GCaMP3+ celler och celler med Ca2 + svängningsmönster närmare normala CMs (Videos 3-8). Som visas i figur 4A visar en representativ cell i IMAP-gruppen med Ca2+ svängning GCaMP3 fluorescensförändring mellan den maximala (mittpanelen) och minsta (högra panelen), och Ca2+ svängningen av sådana celler ändras regelbundet (figur 4B). Efter införandet av IMAP var antalet slagkluster betydligt högre än i kontrollgruppen, eftersom antalet GCaMP3+ celler med Ca2 + flöde per högeffektfält (HPF, 20x objektiv) ökade i den IMAP-mediumbehandlade gruppen (figur 5).
Figur 1: Generera Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musstam. Illustration av Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mus stam generation och genstrukturen hos de transgena mössen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Ca2+ flöde av det bultande hjärtat. GCaMP3 fluorescens synkroniserades med hjärtslag i Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 hjärtan (övre panelen), medan ingen fluorescens observerades i kontrollhjärtan (nedre panelen). Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Isolerade nationella centralbanker som är fästa vid en 6-brunnsplatta. B) Nationella kontaktpunkter under högeffektsfält (20x mål, skalstreck = 50 μm). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Ca2+ flöde av omprogrammerade celler. (A) IMAP-behandlade NCFs omprogrammerade till iCMs under GFP-kanal vid hög effektfält (20x mål). Ca2 + flöde av iCMs visualiserades som GCaMP3 fluorescens, där celler med Ca2 + flöde visar upprepade blinkningar mellan grundläggande fluorescens (Ca2 + min, mittpanel) och ljus fluorescens (Ca2 + max, höger panel) synkroniseras med stryk. (B) Ca2+ spårningskurva för Ca2+ svängning+-celler i IMAP-gruppen. Skalstång = 50 μm. F/F0: relativ fluorescensintensitet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 figur 5: Utvärdering av Ca2+- flöde under IMAP-medium. Antal GCaMP3+ celler med Ca2+ flöde per HPF 2, 3, 4 veckor efter MGT-induktion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Video 1: Ett bultande hjärta isolerat från valpar med αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotyp under skanning objektiv (4x mål) i GFP-kanalen. Hjärtat är GCaMP3+ och blinkar mellan grundläggande fluorescens (Ca2+ min) och ljus fluorescens (Ca2+ max) synkroniserad med slag. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Ett bultande hjärta isolerat från valpar med kontrollgenotyp under skanning objektiv i GFP-kanalen. Hjärtat är GCaMP3- och visar inte fluorescens blinkande synkroniserat med misshandel. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: ICMs i IMAP-gruppen under LPF i kanalen för ljust fält (BF). En cell med betydande slag i mitten av fältet kan ses. Både Video 3 och Video 4 fokuserar på samma fält. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 4: iCMs i IMAP-gruppen under LPF i GFP-kanalen. Flera celler med blinkande fluorescens, inklusive den slå cellen som ses i BF-kanalen kan observeras. Både Video 3 och Video 4 fokuserar på samma fält. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 5: ICMs i IMAP-gruppen under HPF i BF-kanalen. Centrum för fältet video 3 och video 4 observerades under HPF. En cell med betydande slag i mitten av fältet kan observeras. Både Video 5 och Video 6 fokuserar på samma fält. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 6: ICMs i IMAP-gruppen under HPF i GFP-kanalen. Centrumdelen av fältet video 3 och video 4 observerades under HPF. Flera celler med blinkande fluorescens, inklusive den slå cellen som ses i BF-kanalen kan observeras. Både Video 5 och Video 6 fokuserar på samma fält. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 7: iCMs i MGT-gruppen under HPF i BF-kanalen. Till skillnad från signifikanta slagceller som observerats i IMAP-gruppen finns det några slående celler under BF-kanalen i MGT-gruppen, som har lägre omprogrammeringseffektivitet. Både Video 7 och Video 8 fokuserar på samma fält. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 8: ICMs i MGT-gruppen under HPF i GFP-kanalen. Flera celler med mild blinkande fluorescens kan observeras. Både Video 7 och Video 8 fokuserar på samma fält. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvärdering av iCMs-funktionen är nödvändig för omprogrammeringsfältet för hjärt. I detta manuskript beskriver protokollet en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J musstam som har fastställts, hur man använder ncf isolerat från neonatal möss i denna stam för omprogrammering till iCMs och utvärderingen av iCMs funktion av Ca2 + flöde. Detta är en de novo-metod för att utvärdera iCMs funktionella mognad.
Flera kritiska steg är viktiga för att framgångsrikt omprogrammera och utvärdera med den här metoden. För det första bör de nationella kontaktpunkterna vara nyberedda och friska efter isolering. Ett snabbt förfarande för hjärtisolering och skärning är viktigt. Viktigast av allt är det viktigt att följa inkubationstiden för att undvika överrötning och minskning av cellens livskraft och tillstånd. För det andra, bland alla förfaranden, virus infektion effektivitet ofta införa hög variation i resultaten. Virusinfektionens effektivitet påverkas i hög grad av två faktorer. Å ena sidan bör viruset titer vara konstant bland olika försök, vilket kräver konsistens i transfected plasmids mängd och liknande Plat-E cell tillstånd och densitet. Forskare som följer detta protokoll bör utvärdera den optimala såddtätheten och tiden före dessa förfaranden. Viruset bör användas omedelbart för att undvika titerdämpning på grund av viruskänslighet för frys-tina cykler. Dessutom är det viktigt att hålla NCFs i ett hälsosamt tillstånd och lämplig densitet vid infektionstillfället. Forskare bör känna till de nationella kontaktpunkternas tillväxtegenskaper. Även om omprogrammeringseffektivitetsvariationen bör begränsas, kan frekvent övervakning vara till hjälp. Detta protokoll kan enkelt ändras för att saminfektera NCFs med olika virus eller behandla dem med kemikalier av intresse. Således är det tillämpligt som en universell metod för hjärt omprogrammering av forskning. Förutom punkter som nämns här, inkluderar vanliga problem med denna metod låg fluorescens observerad efter omprogrammering. Detta kan bero på flera skäl. För det första kanske infektionen inte är så effektiv som önskat, vilket leder till en låg omprogrammeringseffektivitet och begränsar antalet iCMs. För det andra kan exponeringsförhållandet behöva justeras optimalt för observation av GCaMP3 fluorescens av iCMs. Att använda neonatal kardiomyocyter isolerade från samma valpar som positiv kontroll hjälper till att identifiera den potentiella orsaken.
Ca2 + flux har använts i stor utsträckning för att bedöma cellaktiviteter, inklusive i neuronceller16, bröstkörtel17, fettvävnader18, etc. I denna studie användes Ca2+ fluss för att bedöma funktionell mognad av iCMs. Tidigare har det rapporterats att Ca2 + flux kan mätas med specifika kemikalier som heter små molekyl kalciumkänsliga färgämnen som kan användas för att utvärdera funktionen hos omprogrammerade celler19. En sådan metod har dock flera begränsningar: kemikalien som introduceras till cellerna kan ha potentiell toxicitet och påverka cellprocesserna, vilket gör resultaten mindre tillförlitliga än de som erhålls med den metod som presenteras här. Dessutom är färgningsprocessen komplicerad och tidskrävande samtidigt som den förhindrar ytterligare utvärderingar av dessa celler. Den metod som presenteras här övervinner å andra sidan dessa begränsningar. GCaMP3 är icke-invasivt för cellerna, vilket minimerar påverkan på cellaktiviteter och möjliggör ytterligare utvärdering av cellerna. Eftersom fluorescensen hos iCMs endast beror på deras identitet, dvs. Myh6-uttryck och lokal Ca2 + koncentrationsförändring, blir Ca2 + fluxfluorescens av celler synlig så länge NCFs omprogrammeras, vilket möjliggör frekvent övervakning av omprogrammeringsprocessen utan en tidskrävande strategi. Medan Ca2+ flusse kan övervakas och registreras enkelt under ett inverterat fluorescensmikroskop, kan upprepad misshandel och relaterad elektronisk aktivitet över cellmembranet, dvs Ca2+ flöde, kvantifieras ytterligare tidsmässigt20. Som visas i figur 4B kan sådan kvantifiering ge mer information om mognaden hos iCMs och illustrera mer detaljerade strukturer av Ca2 + flödesförändring under hjärtomprogrammering.
Denna metod har flera fördelar. För det första observeras Ca2 + -flödet uteslutande i ICMs. Eftersom Myh6 är mycket specifikt för CMs men inte CFs, kommer endast de framgångsrikt omprogrammerade cellerna att uttrycka GCaMP3-reportern och bli fluorescerande. För det andra ger Ca2 + flux ett sätt att utvärdera funktionell mognad av iCMs förutom metoden att övervaka uttrycket av CM-specifika gener. På grund av det relativt långa experimentella förfarandet och variationen kopplad till detta är funktionen hos iCMs inte alltid acceptabel för ytterligare studier och potentiell klinisk användning. Medan cm-specifika genuttrycket bara avslöjar en del av egenskaperna hos den omprogrammerade cellen, ger Ca2 + flöde en annan aspekt av hjärt omprogrammeringsfältet för att utvärdera den omprogrammerade cellkvaliteten och effektiviteten. Dessutom är funktionell mognad mer relaterad till hjärtfunktion, vilket kan vara en bättre indikator för att utvärdera effektiviteten. Allmänt använda metoder inom detta område inkluderar flödescytometri, en teknik som kräver trypsin matsmältning av alla cellgrupper. Medan matsmältningen kan påverka cellfunktioner och egenskaper, introducerar det variation i systemet, vilket minskar potentialen att reproducera de observerade resultaten och ytterligare utvärdera dessa celler. Jämfört med dessa metoder har den transgena musstammen som visas här begränsat det potentiella inflytandet från kemikalier eller experimentella förfaranden som behövs för utvärderingen. Med dessa fördelar förenklar denna mus stam de utvärderingsförfaranden som behövs för hjärt omprogrammering och förbättrar reproducerbarheten av resultat inom detta område.
Det finns dock vissa begränsningar i denna studie. För det första är musstammens anläggning tidskrävande. Förfrågningar om musstammen från kollegor inom detta område välkomnas för att förkorta den tid som behövs för stamanläggningen. För det andra innebär hjärt omprogrammering till iCMs med detta protokoll flera faktorer och steg, vilket introducerar relativt hög variation i systemet. Kunskaper på detta område kommer att bidra till att övervinna denna fråga. Slutligen, eftersom GCaMP3 blir fluorescerande endast under Ca2 + flödesförhållande, kan den nuvarande utvärderingsmetoden inte direkt användas för FACS som hjärt omprogrammering med Myh6-GFP stam7. Men medan den nuvarande stammen har fler och olika tillämpningar jämfört med Myh6-GFP-stammen, kan en sådan olägenhet övervinnas.
Sammantaget, som protokollet har beskrivit ovan, myh6-cre/rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mus stam och efter utvärdering av iCMs mognad ger en strategi för att övervaka hela processen med hjärt omprogrammering. Denna GCaMP3-medierade Ca2 + flödesmätningsstrategi kan utföras i levande celler utan att skada cellens livskraft. Eftersom GCaMP3 fluorescens drivs av myokard-specifika genuttryck, kan de förvärvade GCaMP3 fluorescerande data kvantifieras ytterligare för att avslöja omprogrammering effektivitet och iCMs verksamhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi uppskattar Leo Gnatovskiys ansträngningar att redigera den engelska texten i detta manuskript. Figur 1 skapades med BioRender.com. Denna studie stöddes av National Institutes of Health (NIH) i USA (1R01HL109054) bidrag till Dr. Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
- Frangogiannis, N. G.
- Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
- Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036 (2016).
- Grant, A. O.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).
- Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).
- Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312 (2016).
