Summary
Descriviamo qui, l'istituzione e l'applicazione di una linea di reporter del mouse Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J (indicata come αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito) per la valutazione della riprogrammazione cardiaca. I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) isolati dal ceppo murino vengono convertiti in cardiomiociti indotti (iCM), consentendo una valutazione comoda ed efficiente dell'efficienza di riprogrammazione e della maturazione funzionale degli iCM tramite il flusso di calcio (Ca2+).
Abstract
La riprogrammazione cardiaca è diventata una terapia potenzialmente promettente per riparare un cuore danneggiato. Introducendo più fattori di trascrizione, tra cui Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), i fibroblasti possono essere riprogrammati in cardiomiociti indotti (iCM). Questi iCM, quando generati in situ in un cuore infartuato, si integrano elettricamente e meccanicamente con il miocardio circostante, portando ad una riduzione delle dimensioni della cicatrice e ad un miglioramento della funzione cardiaca. A causa dell'efficienza, della purezza e della qualità relativamente basse della riprogrammazione degli iCM, la caratterizzazione degli iCM rimane una sfida. I metodi attualmente utilizzati in questo campo, tra cui la citometria a flusso, l'immunocitochimica e la qPCR, si concentrano principalmente sull'espressione di geni e proteine cardiaco-specifici, ma non sulla maturazione funzionale degli iCM. Innescata dai potenziali d'azione, l'apertura dei canali del calcio voltaggio-dipendenti nei cardiomiociti porta ad un rapido afflusso di calcio nella cellula. Pertanto, quantificare il tasso di afflusso di calcio è un metodo promettente per valutare la funzione dei cardiomiociti. Qui, il protocollo introduce un metodo per valutare la funzione iCM in base al flusso di calcio (Ca2+). Un ceppo di topo αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 è stato stabilito incrociando Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (indicato come Myh6-Cre di seguito) con topi Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (indicato come Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito). I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) di topi neonatali P0-P2 sono stati isolati e coltivati in vitro e una costruzione policistronica di MGT è stata introdotta negli NCF, che ha portato alla loro riprogrammazione in iCM. Poiché solo gli iCM riprogrammati con successo esprimeranno il reporter GCaMP3, la maturazione funzionale degli iCM può essere valutata visivamente dal flusso Di Ca2+ con microscopia a fluorescenza. Rispetto agli NCF non riprogrammati, gli NCF-iCM hanno mostrato un flusso transitorio di calcio significativo e una contrazione spontanea, simili ai CM. Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione del ceppo murino, l'isolamento e la selezione dei cuori dei topi neonatali, l'isolamento NCF, la produzione di retrovirus per la riprogrammazione cardiaca, l'induzione iCM, la valutazione del flusso di iCM Ca2 + utilizzando la nostra linea reporter e la relativa analisi statistica e presentazione dei dati. Si prevede che i metodi qui descritti forniranno una preziosa piattaforma per valutare la maturazione funzionale degli iCM per gli studi di riprogrammazione cardiaca.
Introduction
L'infarto miocardico (MI) è una malattia grave in tutto il mondo. Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte in tutto il mondo e rappresentano circa 18,6 milioni di decessi nel 20191,2. La mortalità totale delle CVD è diminuita nell'ultimo mezzo secolo. Tuttavia, questa tendenza è stata rallentata o addirittura invertita in alcuni paesi non sviluppati1, il che richiede trattamenti più efficaci delle CVD. Come una delle manifestazioni fatali di CVD, MI rappresenta circa la metà di tutti i decessi attribuiti a CVD negli Stati Uniti2. Durante l'ischemia, con il blocco delle arterie coronarie e l'apporto limitato di nutrienti e ossigeno, il miocardio subisce gravi cambiamenti metabolici, compromette la funzione sistolica dei cardiomiociti (CM) e porta alla morte del CM3. Numerosi approcci nella ricerca cardiovascolare sono stati esplorati per riparare le lesioni cardiache e ripristinare la funzione del cuore ferito4. La riprogrammazione cardiaca diretta è emersa come una strategia promettente per riparare il cuore danneggiato e ripristinarne la funzione5,6. Con l'introduzione di Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), i fibroblasti possono essere riprogrammati in iCM in vitro e in vivo, e questi iCM possono ridurre l'area cicatriziale e migliorare la funzione cardiaca7,8.
Sebbene la riprogrammazione cardiaca sia una strategia promettente per il trattamento dell'infarto miocardico, rimangono una serie di sfide. In primo luogo, l'efficienza, la purezza e la qualità della riprogrammazione non sono sempre così alte come previsto. L'incentivo MGT può raggiungere solo l'8,4% (cTnT+) o il 24,7% (αMHC-GFP+) del totale dei CF da riprogrammare in iCM in vitro7, o fino al 35% in vivo8, il che ne limita l'applicazione. Anche con più fattori indotti nel sistema, come Hand29 o Akt1 / PKB10, l'efficienza di riprogrammazione è ancora appena soddisfacente per essere utilizzata in un ambiente clinico. Pertanto, sono necessari ulteriori studi incentrati sul miglioramento dell'efficienza di riprogrammazione in questo campo. In secondo luogo, l'integrità elettrica e le caratteristiche di contrazione degli iCM sono importanti per il miglioramento efficiente della funzione cardiaca, ma sono difficili da valutare. Attualmente, i metodi di valutazione ampiamente utilizzati nel campo, tra cui la citometria a flusso, l'immunocitochimica e la qPCR di alcuni importanti cv di espressione dei geni, sono tutti focalizzati sulla somiglianza di iCM e CM, ma non direttamente correlati alle caratteristiche funzionali degli iCM. Inoltre, tali metodi hanno procedure relativamente complicate e richiedono molto tempo. Mentre gli studi di riprogrammazione di solito comportano uno screening dei potenziali fattori di riprogrammazione che promuovono la maturazione degli iCM11, la riprogrammazione cardiaca richiede un metodo rapido e conveniente basato sulla funzione degli iCM.
I CM aprono i canali ionici del calcio voltaggio-dipendenti sulla citomembrana durante ogni ciclo di contrazione, il che porta ad un afflusso transitorio di ioni calcio (Ca2+) dal fluido intercellulare al citoplasma per partecipare alla contrazione del miofilamento. Tale ciclo di afflusso e deflusso di Ca2+ è il tratto fondamentale della contrazione miocardica e costituisce la normale funzione delle CM12. Pertanto, un metodo che rileva l'afflusso di Ca2+ potrebbe essere un modo potenziale per misurare la funzione delle CM e delle celle simili a CM, compresi gli iCM. Inoltre, per gli iCM, tale metodo fornisce un altro modo per valutare l'efficienza della riprogrammazione.
Indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) sono stati sviluppati e ampiamente utilizzati per indicare le attività cellulari, in particolare i potenziali d'azione. Generalmente, i GECI sono costituiti da un dominio di legame Ca2+ come la calmodulina e da un dominio fluorescente come GFP, e GCaMP3 è uno con alta intensità di affinità e fluorescenza. Il dominio di fluorescenza di GCaMP3 verrà attivato quando la concentrazione locale di calcio viene modificata13. In questo articolo, viene descritto un ceppo di topo che esprime specificamente un reporter GCaMP3 in cellule Myh6+. Introducendo MGT nei NCF isolati dai neonati di questo ceppo, la riprogrammazione può essere monitorata mediante fluorescenza, che esporrà con successo iCM riprogrammati. Un tale ceppo e metodo di topo fornirà una preziosa piattaforma per studiare la riprogrammazione cardiaca.
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Protocol
Tutte le procedure e le pratiche sperimentali che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care & Use Committee dell'Università del Michigan. Tutte le procedure e le pratiche sperimentali che coinvolgono la coltura cellulare devono essere eseguite BSL2 Biological Safety Cabinet in condizioni sterili. Per le procedure e le pratiche che coinvolgono i virus, è stata seguita la linea guida del corretto smaltimento delle cellule trasfettate, delle punte delle pipette e dei tubi per evitare il rischio di rischi per l'ambiente e la salute.
1. Istituzione di un ceppo di mouse Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (denominato Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) (Figura 1)
- Preparare il ceppo di topo Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (Jackson lab stock 009074, denominato Myh6-Cre) e Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J ceppo di topo (Jackson lab stock 014538, denominato Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), rispettivamente.
- Allevare ogni ceppo fino a 8 settimane per ottenere topi adulti Myh6-Cre e Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, rispettivamente.
- Incrociamo i topi adulti Myh6-Cre e Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
NOTA: Impostare Myh6-Cre maschio / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 femmina o viceversa. Non vi è alcuna differenza significativa tra i loro discendenti. Tipicamente, i topi femmina daranno alla luce 8-10 cuccioli 19-21 giorni dopo l'incrocio.
2. Isolamento e selezione dei cuori neonatali dei topi Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
- Ottieni cuccioli P0-P2. Assicurarsi che siano presenti 8-10 cuccioli per isolare 10 milioni di NCF con questo protocollo.
- Anestetizzò profondamente i cuccioli per ipotermia. Mettere i cuccioli in un guanto di lattice e immergerli fino al collo in ghiaccio tritato e acqua (2° C - 3 °C).
- Disinfettare brevemente i cuccioli con il 75% di etanolo.
- Sacrifica i cuccioli per decapitazione con forbici sterili.
- Fai un'incisione orizzontale vicino al cuore, stringi il cuore e poi isolalo separandolo alla radice dell'aorta con le forbici.
- Osservare il cuore che batte sotto un microscopio a fluorescenza. Assicurarsi che i cuori con il genotipo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mostrino il flusso Di Ca2+ indicato da GCaMP3 con battito cardiaco. Gli altri genotipi non mostrano fluorescenza (Figura 2, Video 1 e Video 2).
3. Isolamento dei fibroblasti cardiaci neonatali (NCF)
NOTA: Per questa parte, il protocollo del Lab14 del Dr. Li Qian è stato adottato con ottimizzazioni minori quando applicabile a questo studio.
- Dopo l'isolamento dei cuori αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, tagliarli in quattro pezzi che sono liberamente collegati. Lavarli in DPBS ghiacciato in una piastra da 6 cm accuratamente più volte per limitare l'inquinamento delle cellule del sangue nelle cellule isolate.
- Trasferire i cuori in un tubo conico da 15 ml.
- Digerire i cuori con 8 ml di tripsina-EDTA calda allo 0,25% a 37 °C per 10 min.
- Scartare la tripsina surnatante e aggiungere 5 mL di collagenasi calda di tipo II (0,5 mg/mL) in HBSS.
- Vorticare accuratamente la miscela e incubare a 37 °C per 5 minuti.
- Dopo l'incubazione, vortice accuratamente e lasciare che il tessuto non digerito si stabilizzi per gravità.
- Raccogliere il surnatante in un tubo conico da 15 ml con 5 mL di fibroblasti freddi (FB) medio (IMDM con 20% FBS e 1% penicillina/streptomicina).
- Ripetere i passaggi 3.4-3.7 per il tessuto non digerito 4-5 volte.
- Raccogliere tutto il surnatante insieme e filtrare il surnatante con un filtro da 40 μm.
- Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Risospese le celle in 10 mL di buffer di smistamento cellulare attivato magneticamente (buffer MACS; 1x PBS con 2 mM EDTA e 0,5% BSA).
- Determinare il numero di cellule vitali mediante colorazione blu tripano.
- Prelevare 10 μL di cellule da 10 mL di sospensione cellulare nel passaggio 3.11.
- Mescolare con 10 μL di soluzione blu di tripano allo 0,4% e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere la miscela a un emocitometro e determinare il numero di cellule vitali. Le cellule morte sono macchiate di blu, mentre le cellule vitali sono non macchiate.
- Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Risospesso le cellule con 10 μL di microsfere Thy1.2 in 90 μL di tampone MACS refrigerato per meno di 10 milioni di cellule vitali. Aggiungi più perline proporzionalmente se ci sono più di 10 milioni di cellule vitali. Pipettare bene la miscela e incubare a 4 °C per 30-60 min.
- Aggiungere 10 ml di buffer MACS e mescolare bene.
- Centrifugare a 200 x g per 5 min, scartare il surnatante.
- Ripetere una volta i passaggi 3.15-3.16.
- Sospendere le celle e le perline con 2 ml di buffer MACS.
- Impostare un separatore MACS nella cappa. Inserire una colonna LS nel separatore ed equilibrare la colonna con 3 mL di buffer MACS.
- Quando la colonna LS è bilanciata, passare le celle attraverso la colonna.
- Lavare la colonna LS con 2 mL di buffer MACS tre volte.
- Togliere la colonna dal separatore, eluirla con 2 mL di buffer MACS tre volte, quindi raccogliere l'eluizione in un tubo da 50 ml.
- Centrifugare a 200 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
- Risospendare le celle con 5 ml di media FB.
- Determinare il numero di cellule con un emocitometro.
- Diluire le cellule con mezzi FB e seminare le cellule in piatti o piatti come desiderato. Assicurarsi che la densità di semina cellulare sia di circa 2-2,5 x 104 celle/cm2 (ottimizzare la densità in base ai singoli esperimenti). Assicurarsi che i fibroblasti attaccati abbiano una forma da ovale a rotonda il secondo giorno dopo la semina (Figura 3).
4. Produzione di retrovirus che codifica per il vettore MGT policistronico per la riprogrammazione cardiaca
- Mantenere Plat-E con terreni di coltura Plat-E (DMEM integrato con 10% FBS, 1 μg/mL di puromicina e 10 μg/mL di blasticidina) a 37 °C con il 5% di CO2.
- Il giorno 1, dividere Plat-E in una piastra a 6 pozzetti a circa 4-5 x 105 celle / densità del pozzo.
- Il giorno 2, Plat-E raggiunge in genere l'80% di confluenza. Trasfettare le cellule con le seguenti procedure. Regola il volume e la quantità di ogni elemento qui presente in base a ciascun pozzetto in una piastra a 6 pozzetti.
- Diluire 2 μg di vettore plasmide di espressione del retrovirus policistronico pMX-puro-MGT (Addgene 111809) a 500 ng/μL con tampone TE.
- Preparare la miscela di trasfezione mescolando 10 μL di lipofectamine con 150 μL di mezzo sierico ridotto. Pipettare con cura per mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Fare attenzione a evitare le bolle durante il pipettaggio.
- Nel frattempo, preparare una miscela di plasmidi mescolando il plasmide con 150 μL di mezzo sierico ridotto. Pipettare con cura per mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Fare attenzione a evitare le bolle durante il pipettaggio.
- Mescolare con cura le due miscele e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. La soluzione potrebbe apparire torbida.
- Aggiungere la miscela goccia a goccia alle cellule da trasfettare.
- Incubare le cellule a 37 °C durante la notte.
- Il giorno 3, cambiare il mezzo in un terreno di coltura cellulare completo fresco privo di puromicina e blasticidina.
- Il giorno 4, 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere il surnatante che contiene retrovirus e conservarlo a 4 °C.
- Il giorno 5, 72 ore dopo la trasfezione, raccogliere il surnatante che contiene retrovirus.
- Filtrare sia il surnatante da 48 h che da 72 h con un filtro da 0,45 μm, precipitare durante la notte a 4 °C aggiungendo 1/5 di volume di soluzione al 40% di Poli (glicole etilenico) (PEG) per ottenere una concentrazione finale di PEG all'8%.
- Centrifugare a 4.000 x g per 30 minuti per far precipitare il virus.
NOTA: il virus PEG8000 forma piccole precipitazioni bianche. - Risospesare il virus con un mezzo iCM contenente 8 μg/mL di polibrene come desiderato. Utilizzare immediatamente il retrovirus.
5. Riprogrammazione di NCF in iCM con infezione da retrovirus codificante MGT
- Crescere o passare NCF prima dell'infezione da virus.
NOTA: Di solito, NCF può essere passato due volte. - Il giorno 0, seme NCF alla densità di circa 1-2 x 104 cellule / cm2 in mezzo FB.
- Il giorno 1, sostituire il terreno di coltura con un mezzo contenente virus per ogni bene desiderato. Utilizzare il virus da un pozzo Plat-E in una piastra a 6 pozzetti per infettare due pozzetti in una piastra a 24 pozzetti. Legare il virus per determinare la concentrazione ottimale del virus.
NOTA: Virus contenenti altri fattori di riprogrammazione di interesse potrebbero essere introdotti insieme al retrovirus MGT. - Incubare a 37 °C durante la notte.
- Il giorno 2, 24 ore dopo l'infezione da virus, sostituire il mezzo contenente virus con un normale mezzo iCM.
- Per monitorare l'espressione di GCaMP3, placcarla al microscopio a fluorescenza invertita. Sotto 10x al canale GFP, osserva la lieve fluorescenza basale GCaMP3 di una porzione di cellule già al giorno 5.
- Sostituire il mezzo ogni 2-3 giorni durante la riprogrammazione. Se necessario, eseguire una selezione positiva per le cellule infette da retrovirus MGT aggiungendo 2 μg/mL di puromicina al terreno di coltura per 3 giorni e mantenendolo a 1 μg/mL.
NOTA: introdurre sostanze chimiche di interesse (ad esempio, IGF-1, MM589, A83-01 e PTC-209, denominate IMAP come riportato in precedenza15) insieme al cambiamento medio. - Dopo 14 giorni di infezione, sostituire il mezzo con il mezzo B27 per indurre ulteriormente la maturazione iCM.
6. Valutazione della maturazione funzionale iCM e dell'efficienza di riprogrammazione mediante flusso Di Ca2+
NOTA: Aggiungere 1 μM di isoproterenolo alle cellule da valutare prima della valutazione, se necessario.
- Valutare il flusso di Ca2+ con un microscopio a fluorescenza invertita a temperatura ambiente.
- Nel canale GFP, osservare le celle GCaMP3+ sotto l'obiettivo 10x. Assicurati che mostri il battito cellulare spontaneo nel canale del campo luminoso.
- Selezionare casualmente tre campi sotto 20x e registrare il flusso Ca2+ degli iCM per 3 min per ogni campo.
NOTA: Qui, il flusso di Ca2 + è stato sincronizzato con il battito cellulare spontaneo (Figura 4, Figura 5 e Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7, Video 8). - Quantificare manualmente le cellule con flusso di Ca2 +.
7. Analisi statistica e presentazione dei dati
- Analizza le differenze tra i gruppi analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) ed esegui i test di confronto multipli Student-Newman-Keuls.
NOTA: I risultati sono nella media ± S.E con p < 0,05 considerato statisticamente significativo. Ogni esperimento è stato eseguito almeno tre volte.
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Representative Results
Il flusso di lavoro sperimentale per generare il ceppo di topo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 e la struttura genica dei topi transgenici sono mostrati nella Figura 1. Mentre il ceppo di topo è stabilito, i cuori dei cuccioli sono stati isolati e osservati al microscopio a fluorescenza inversa per confermare il genotipo. I cuori con genotipo corretto mostrano il flusso di Ca2+ sincronizzato con il battito, visualizzato come fluorescenza GCaMP3, mentre non è stata osservata alcuna fluorescenza nei cuori di controllo (Figura 2, Video 1 e Video 2). Gli NCF isolati si attaccheranno al pozzo entro 2 ore e mostreranno una forma da ovale a rotonda 1 giorno dopo la semina (Figura 3). La maturità funzionale e l'efficienza di riprogrammazione degli iCM sono state valutate dal flusso Di Ca2+ 14 giorni dopo l'introduzione di MGT. Le cellule riprogrammate possono essere valutate al microscopio a fluorescenza per misurare il flusso di Ca2+. Le celle GCaMP3+ possono essere trovate in entrambi i gruppi IMAP e MGT, mentre il gruppo IMAP mostra significativamente più celle GCaMP3+ e celle con modelli di oscillazione Ca2+ più vicini ai normali CM (Video 3-8). Come mostrato nella Figura 4A, una cella rappresentativa nel gruppo IMAP con oscillazione Ca2+ mostrerà la variazione di fluorescenza GCaMP3 tra il massimo (pannello centrale) e il minimo (pannello destro) e l'oscillazione Ca2+ di tali celle viene periodicamente modificata (Figura 4B). Dopo l'introduzione di IMAP, il numero di cluster di battitura era significativamente superiore a quello del gruppo di controllo, poiché il numero di cellule GCaMP3+ con flusso di Ca2+ per campo ad alta potenza (HPF, obiettivo 20x) era aumentato nel gruppo IMAP-medium-trattato (Figura 5).
Figura 1: Generazione del ceppo di mouse Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3. Illustrazione della generazione del ceppo di topo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 e della struttura genica dei topi transgenici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Flusso di Ca2+ del cuore pulsante. La fluorescenza GCaMP3 è stata sincronizzata con il battito cardiaco nei cuori Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 (pannello superiore), mentre non è stata osservata alcuna fluorescenza nei cuori di controllo (pannello inferiore). Barra della scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: NCF isolati attaccati a una piastra a 6 pozzetti. (A) NCF in campo a bassa potenza (LPF, obiettivo 10x, barra di scala = 100 μm). (B) NCF in campo ad alta potenza (obiettivo 20x, barra di scala = 50 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Flusso Di Ca2+ di celle riprogrammate. (A) NCF trattati con IMAP riprogrammati in iCM sotto canale GFP ad alta potenza (obiettivo 20x). Il flusso Ca2+ di iCM è stato visualizzato come fluorescenza GCaMP3, in cui le cellule con flusso Ca2+ mostrano lampeggiamenti ripetuti tra fluorescenza di base (Ca2+ min, pannello centrale) e fluorescenza luminosa (Ca2+ max, pannello destro) sincronizzata con il battito. (B) Curva traccia Ca2+ di celle oscillanti+ Ca2 + nel gruppo IMAP. Barra di scala = 50 μm. F/F0: intensità di fluorescenza relativa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
https://www.jove.com/files/ftp_upload/62643/Zhaokai_Li_-_Video_1_GCaMP3+_heart.mp4 Figura 5: Valutazione del flusso di Ca2+ su supporto IMAP. Numero di cellule GCaMP3+ con flusso di Ca2+ per HPF 2, 3, 4 settimane dopo l'induzione di MGT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Un cuore pulsante isolato dai cuccioli con genotipo αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 sotto obiettivo a scansione (obiettivo 4x) nel canale GFP. Il cuore è GCaMP3+ e lampeggia tra fluorescenza di base (Ca2+ min) e fluorescenza luminosa (Ca2+ max) sincronizzata con il battito. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Un cuore pulsante isolato dai cuccioli con genotipo di controllo sotto la lente dell'obiettivo di scansione nel canale GFP. Il cuore è GCaMP3- e non mostra fluorescenza lampeggiante sincronizzata con il battito. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 3: iCM nel gruppo IMAP in LPF nel canale a campo luminoso (BF). Si può vedere una cella con un battito significativo al centro del campo. Sia il Video 3 che il Video 4 si concentrano sullo stesso campo. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 4: iCM nel gruppo IMAP in LPF nel canale GFP. Si possono osservare più cellule con fluorescenza lampeggiante, inclusa la cellula battente osservata nel canale BF. Sia il Video 3 che il Video 4 si concentrano sullo stesso campo. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 5: iCM nel gruppo IMAP in HPF nel canale BF. Il centro del campo di Video 3 e Video 4 è stato osservato sotto HPF. Si può osservare una cellula con un battito significativo al centro del campo. Sia il Video 5 che il Video 6 si concentrano sullo stesso campo. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 6: iCM nel gruppo IMAP in HPF nel canale GFP. La parte centrale del campo di Video 3 e Video 4 è stata osservata sotto HPF. Si possono osservare più cellule con fluorescenza lampeggiante, inclusa la cellula battente osservata nel canale BF. Sia il Video 5 che il Video 6 si concentrano sullo stesso campo. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 7: iCM nel gruppo MGT sotto HPF nel canale BF. In contrasto con le cellule battenti significative osservate nel gruppo IMAP, ci sono alcune cellule che battono sotto il canale BF nel gruppo MGT, che ha un'efficienza di riprogrammazione inferiore. Sia il Video 7 che il Video 8 si concentrano sullo stesso campo. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 8: iCM nel gruppo MGT sotto HPF nel canale GFP. Si possono osservare diverse cellule con lieve fluorescenza lampeggiante. Sia il Video 7 che il Video 8 si concentrano sullo stesso campo. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
La valutazione della funzione degli iCM è necessaria per il campo della riprogrammazione cardiaca. In questo manoscritto, il protocollo descrive un ceppo di topo Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J che è stato stabilito, come utilizzare gli NCF isolati dai topi neonatali in questo ceppo per la riprogrammazione in iCM e la valutazione della funzione degli iCM mediante flusso di Ca2 +. Questo è un metodo de novo per valutare la maturazione funzionale degli iCM.
Diversi passaggi critici sono importanti per riprogrammare e valutare con successo con questo metodo. In primo luogo, i NCF dovrebbero essere preparati al momento e sani dopo l'isolamento. Una rapida procedura di isolamento cardiaco e taglio è essenziale. Ancora più importante, è fondamentale seguire il tempo di incubazione per evitare la digestione eccessiva e la riduzione della vitalità e delle condizioni cellulari. In secondo luogo, tra tutte le procedure, l'efficienza dell'infezione da virus spesso introduce un'elevata variazione nei risultati. L'efficienza dell'infezione da virus è influenzata principalmente da due fattori. Da un lato, il titolo del virus dovrebbe essere costante tra i diversi tentativi, il che richiede coerenza nella quantità di plasmidi trasfettati e condizioni e densità simili delle cellule Plat-E. I ricercatori che seguono questo protocollo dovrebbero valutare la densità di semina ottimale e il tempo prima di tali procedure. Il virus deve essere usato immediatamente per evitare l'attenuazione del titolo a causa della sensibilità del virus ai cicli di congelamento-disgelo. Inoltre, è importante mantenere gli NCF in condizioni sane e densità adeguata al momento dell'infezione. I ricercatori dovrebbero avere familiarità con le caratteristiche di crescita dei NCF. Mentre la variazione dell'efficienza di riprogrammazione dovrebbe essere limitata, un monitoraggio frequente potrebbe essere utile. Questo protocollo può essere facilmente modificato per co-infettare I NCF con diversi virus o trattarli con sostanze chimiche di interesse. Pertanto, è applicabile come metodo universale per la ricerca sulla riprogrammazione cardiaca. Oltre ai punti qui menzionati, i problemi comuni con questo metodo includono la bassa fluorescenza osservata dopo la riprogrammazione. Ciò può essere dovuto a diversi motivi. In primo luogo, l'infezione potrebbe non essere efficace come desiderato, il che porta a una bassa efficienza di riprogrammazione e limita il numero di iCM. In secondo luogo, potrebbe essere necessario regolare in modo ottimale la condizione di esposizione per l'osservazione della fluorescenza GCaMP3 degli iCM. L'uso di cardiomiociti neonatali isolati dagli stessi cuccioli come controllo positivo aiuterà a identificare la potenziale ragione.
Il flusso di Ca2+ è stato ampiamente utilizzato per valutare le attività cellulari, anche nelle cellule neuronali16, nella ghiandola mammaria17, nei tessuti adiposi18, ecc. In questo studio, il flusso di Ca2+ è stato utilizzato per valutare la maturazione funzionale degli iCM. In precedenza, è stato riportato che il flusso di Ca2+ può essere misurato da sostanze chimiche specifiche denominate coloranti sensibili al calcio a piccola molecola che possono essere utilizzate per valutare la funzione delle cellule riprogrammate19. Tuttavia, un tale metodo ha diversi limiti: la sostanza chimica introdotta nelle cellule può avere una potenziale tossicità e influenzare i processi cellulari, rendendo i risultati meno affidabili di quelli ottenuti con il metodo qui presentato. Inoltre, il processo di colorazione è complicato e richiede tempo, impedendo anche ulteriori valutazioni di quelle cellule. Il metodo qui presentato, d'altra parte, supera tali limitazioni. GCaMP3 non è invasivo per le cellule, il che riduce al minimo le influenze sulle attività cellulari e consente un'ulteriore valutazione delle cellule. Poiché la fluorescenza degli iCM dipende solo dalla loro identità, cioè dall'espressione di Myh6 e dalla variazione della concentrazione locale di Ca2+, la fluorescenza del flusso di Ca2+ delle cellule diventa visibile finché i NCF vengono riprogrammati, il che consente un monitoraggio frequente del processo di riprogrammazione senza una strategia dispendiosa in termini di tempo. Mentre il flusso di Ca2+ può essere monitorato e registrato facilmente al microscopio a fluorescenza invertita, il battito ripetuto e la relativa attività elettronica attraverso la membrana cellulare, cioè il flusso di Ca2+, possono essere ulteriormente quantificati temporalmente20. Come mostrato nella Figura 4B, tale quantificazione può fornire maggiori informazioni sulla maturità degli iCM e illustrare strutture più dettagliate del cambiamento del flusso di Ca2+ durante la riprogrammazione cardiaca.
Questo metodo ha diversi vantaggi. In primo luogo, il flusso di Ca2+ è osservato esclusivamente negli iCM. Poiché Myh6 è molto specifico per i CM ma non per i CF, solo le celle riprogrammate con successo esprimeranno il reporter GCaMP3 e diventeranno fluorescenti. In secondo luogo, il flusso di Ca2+ fornisce un modo per valutare la maturazione funzionale degli iCM oltre al metodo di monitoraggio dell'espressione di geni specifici del CM. A causa della procedura sperimentale relativamente lunga e della variazione ad essa collegata, la funzione degli iCM non è sempre accettabile per ulteriori studi e potenziale utilizzo clinico. Mentre l'espressione genica specifica del CM rivela solo una parte delle caratteristiche della cellula riprogrammata, il flusso di Ca2+ fornisce un altro aspetto del campo di riprogrammazione cardiaca per valutare la qualità e l'efficienza cellulare riprogrammata. Inoltre, la maturazione funzionale è più correlata alla funzione cardiaca, che può essere un indicatore migliore per valutare l'efficienza. I metodi ampiamente utilizzati in questo campo includono la citometria a flusso, una tecnica che richiede la digestione della tripsina di tutti i gruppi cellulari. Mentre la digestione può influenzare le funzioni e le caratteristiche delle cellule, introduce variazioni nel sistema, diminuendo il potenziale di riproduzione dei risultati osservati e valutando ulteriormente quelle cellule. Rispetto a questi metodi, il ceppo di topo transgenico mostrato qui ha limitato la potenziale influenza delle sostanze chimiche o delle procedure sperimentali necessarie per la valutazione. Con questi vantaggi, questo ceppo di topo semplifica le procedure di valutazione necessarie per la riprogrammazione cardiaca e migliora la riproducibilità dei risultati in questo campo.
Tuttavia, ci sono alcune limitazioni a questo studio. In primo luogo, l'istituzione del ceppo di topo richiede molto tempo. Le richieste del ceppo di topo da parte di colleghi in questo campo sono benvenute per abbreviare il tempo necessario per l'istituzione del ceppo. In secondo luogo, la riprogrammazione cardiaca in iCM con questo protocollo comporta molteplici fattori e passaggi, che introducono variazioni relativamente elevate al sistema. La competenza in questo campo aiuterà a superare questo problema. Infine, poiché il GCaMP3 diventa fluorescente solo in condizioni di flusso Di Ca2+, l'attuale metodo di valutazione non può essere utilizzato direttamente per FACS come riprogrammazione cardiaca con ceppo Myh6-GFP7. Tuttavia, mentre la deformazione attuale ha più e diverse applicazioni rispetto alla deformazione Myh6-GFP, un tale inconveniente può essere superato.
Nel complesso, come il protocollo ha descritto sopra, il ceppo di topo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 e la successiva valutazione della maturazione degli iCM forniscono una strategia per monitorare l'intero processo di riprogrammazione cardiaca. Questa strategia di misurazione del flusso di Ca2+ mediata da GCaMP3 può essere eseguita in cellule vive senza danneggiare la vitalità cellulare. Poiché la fluorescenza GCaMP3 è guidata dall'espressione genica miocardica specifica, i dati fluorescenti GCaMP3 acquisiti possono essere ulteriormente quantificati per rivelare l'efficienza di riprogrammazione e l'attività degli iCM.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Apprezziamo gli sforzi di Leo Gnatovskiy nella redazione del testo inglese di questo manoscritto. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti (1R01HL109054) sovvenzione al Dr. Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
References
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