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Developmental Biology

पुनर्योजी क्षमता के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए ज़ेबराफिश और मेडाका का उपयोग करके वयस्क ऑप्टिक टेक्टम का स्टैब घाव चोट मॉडल

Published: February 10, 2022 doi: 10.3791/63166
Automatic Translation
1,2, 1
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2DBT-AIST International Laboratory for Advanced Biomedicine, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology

Summary

वयस्क ज़ेबराफिश में एक यांत्रिक मस्तिष्क की चोट मॉडल को उनकी उच्च पुनर्योजी क्षमता को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र की जांच करने के लिए वर्णित किया गया है। फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करके पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए विधि छोटी मछलियों की कई प्रजातियों के ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोट बनाने के लिए बताती है।

Abstract

जबकि ज़ेबराफिश में अपने केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को पुनर्जीवित करने की बेहतर क्षमता होती है, मेडाका में कम सीएनएस पुनर्योजी क्षमता होती है। ज़ेब्राफिश और मेडाका के वयस्क ऑप्टिक टेक्टम में एक मस्तिष्क की चोट मॉडल विकसित किया गया था और इन मछली प्रजातियों में इस ऊतक की उच्च पुनर्योजी क्षमता को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए तुलनात्मक हिस्टोलॉजिकल और आणविक विश्लेषण किए गए थे। यहां तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) के प्रसार और भेदभाव के लिए सुई और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण का उपयोग करके वयस्क ऑप्टिक टेक्टम के लिए एक चाकू घाव की चोट मॉडल प्रस्तुत किया गया है। ऑप्टिक टेक्टम के मध्य क्षेत्र में मैन्युअल रूप से एक सुई डाली गई थी, और फिर मछली को इंट्राकार्डियल रूप से संक्रमित किया गया था, और उनके दिमाग को विच्छेदित किया गया था। इन ऊतकों को तब क्रायोसेक्शन किया गया और उचित एनएससी प्रसार और भेदभाव मार्करों के खिलाफ इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया। यह टेक्टम चोट मॉडल ज़ेबराफिश और मेडाका दोनों में मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है, जिससे चोट के बाद एनएससी प्रतिक्रियाओं की तुलना करने की अनुमति मिलती है। यह विधि छोटे टेलोस्ट के लिए उपलब्ध है, जिसमें ज़ेबराफ़िश, मेडाका और अफ्रीकी किलीफ़िश शामिल हैं, और हमें उनकी पुनर्योजी क्षमता की तुलना करने और अद्वितीय आणविक तंत्र की जांच करने में सक्षम बनाता है।

Introduction

ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो) में अन्य स्तनधारियों 1,2,3 की तुलना में अपने केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को पुनर्जीवित करने की क्षमता में वृद्धि हुई है। हाल ही में, इस बढ़ी हुई पुनर्योजी क्षमता को अंतर्निहित आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीक का उपयोग करके ऊतक पुनर्जनन का तुलनात्मक विश्लेषण 4,5,6 किया गया है। ज़ेबराफिश और टेट्रापोड्स में मस्तिष्क संरचनाएंकाफी अलग हैं 7,8,9। इसका मतलब यह है कि समान मस्तिष्क संरचनाओं और जैविक विशेषताओं के साथ छोटी मछलियों का उपयोग करके कई मस्तिष्क की चोट मॉडल विकसित किए गए हैं ताकि इस बढ़ी हुई पुनर्योजी क्षमता में योगदान देने वाले अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच की सुविधा मिल सके।

इसके अलावा, मेडाका (ओरिज़ियास लैटिप्स) जेब्राफिश की तुलना में हृदय और न्यूरोनल पुनर्जनन10,11,12,13 के लिए कम क्षमता वाला एक लोकप्रिय प्रयोगशाला जानवर है। ज़ेबराफिश और मेडाका में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) 14,15,16,17 के लिए समान मस्तिष्क संरचनाएं और niches हैं। ज़ेबराफ़िश और मेडाका में, ऑप्टिक टेक्टम में दो प्रकार के एनएससी शामिल हैं, न्यूरोएपिथेलियल जैसी स्टेम सेल और रेडियल ग्लियल सेल (आरजीसी) 15,18। वयस्क ज़ेबराफिश के ऑप्टिक टेक्टम के लिए एक चाकू घाव की चोट पहले विकसित की गई थी, और इस मॉडल का उपयोग इन जानवरों में मस्तिष्क पुनर्जनन को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र की जांच करने के लिए किया गया था 19,20,21,22,23। इस युवा वयस्क ज़ेबराफिश घाव की चोट मॉडल ने आरजीसी 19,24,25 से पुनर्योजी न्यूरोजेनेसिस को प्रेरित किया। ऑप्टिक टेक्टम में यह चाकू घाव की चोट एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि है 13,19,20,21,22,23,24,25। जब वयस्क मेडाका पर एक ही चोट मॉडल लागू किया गया था, तो चोट13 के बाद आरजीसी प्रसार और भेदभाव के तुलनात्मक विश्लेषण के माध्यम से मेडका ऑप्टिक टेक्टम में आरजीसी की कम न्यूरोजेनिक क्षमता का पता चला था।

ऑप्टिक टेक्टम में स्टैब घाव की चोट के मॉडल भी मम्मिचोग मॉडल26 में विकसित किए गए हैं, लेकिन टेलेसेफेलिक चोट27 की तुलना में टेक्टम चोट का विवरण अच्छी तरह से प्रलेखित नहीं किया गया है। जेब्राफिश और मेडाका का उपयोग करके ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोट अंतर पुनर्योजी क्षमता वाली प्रजातियों के बीच अंतर सेलुलर प्रतिक्रियाओं और जीन अभिव्यक्ति की जांच की अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि इंजेक्शन सुई का उपयोग करके ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोट कैसे की जाए। इस विधि को जेब्राफिश और मेडाका जैसी छोटी मछलियों पर लागू किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और क्रायोसेक्शन का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण और सेलुलर प्रसार और भेदभाव विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी की प्रक्रियाओं को यहां समझाया गया है।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को राष्ट्रीय उन्नत औद्योगिक विज्ञान और प्रौद्योगिकी संस्थान में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। ज़ेबराफिश और मेडाका को मानक प्रक्रियाओं28 के अनुसार बनाए रखा गया था।

1. वयस्क ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोट

  1. संज्ञाहरण के लिए 0.4% (डब्ल्यू / वी) ट्राइकेन स्टॉक समाधान तैयार करें। 100 एमएल स्टॉक समाधान के लिए, 90 एमएल आसुत जल में 400 मिलीग्राम ट्राइकेन मीथेनसल्फोनेट ( सामग्री की तालिका देखें) को घोलें और 1 एम ट्रिस एचसीएल बफर (पीएच 9.0) का उपयोग करके पीएच को 7.0 में समायोजित करें। एक बार पीएच समायोजित हो जाने के बाद, 100 एमएल तक पानी जोड़ें, फिर उपयुक्त एलिकोट बनाएं और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. वयस्क ज़ेबराफ़िश या मेडाका को एनेस्थेटाइज करने के लिए, मछली सुविधा के पानी के साथ 0.4% ट्राइकेन स्टॉक समाधान को पतला करके 0.02% (डब्ल्यू / वी) ट्राइकेन समाधान तैयार करें।
  3. 0.02% ट्राइकेन समाधान के साथ मछली को एनेस्थेटाइज करें; जब वे हिलते या स्पर्श का जवाब नहीं देते हैं तो वे एनेस्थेटाइज्ड हो जाते हैं (1-2 मिनट)।
  4. एनेस्थेटाइज्ड मछली को स्टायरोफोम ट्रे पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और स्टायरोफोम में लंबवत रूप से डाली गई दो 30 जी सुइयों के बीच मछली को सीधा करें।
  5. मछली के सिर को हिलने से रोकने के लिए मछली के शरीर को पकड़ें और लंबवत रूप से खोपड़ी के माध्यम से ऑप्टिक टेक्टम गोलार्धों में से एक के मध्यवर्ती क्षेत्र में 30 ग्राम सुई डालें (चित्रा 1 ए, बी)। सम्मिलन गहराई ~ 0.75 मिमी है, जो 30 जी बेवेल की लंबाई के लगभग आधे के बराबर है। यह सम्मिलन गहराई इन मछलियों के समान शरीर के आकार के कारण ज़ेबराफिश और मेडाका पर मस्तिष्क की चोट को प्रेरित करती है।
    नोट: मेडाका की खोपड़ी पर तराजू है। चाकू के घाव की चोट को कुशलतापूर्वक और सटीक रूप से प्रेरित करने के लिए 30 जी सुई का उपयोग करके तराजू को खरोंचें और हटा दें (चित्रा 1 सी)।
  6. घायल मछली को ताजा मछली सुविधा वाले पानी के साथ एक मछली टैंक में स्थानांतरित करें और एनेस्थीसिया से पूरी तरह से ठीक होने के बाद टैंक को मछली प्रजनन प्रणाली में ले जाएं।
    नोट: मछली ठीक हो जाएगी और कुछ ही मिनटों के भीतर स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ना शुरू कर देगी।
  7. चोट के बाद वंश विश्लेषण के लिए, 5 एमएम ब्रोमोडॉक्स्यूरिडाइन (बीआरडीयू) युक्त ताजा मछली सुविधा पानी तैयार करें (सामग्री की तालिका देखें) और फिर13,19 (जैसा कि एक प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा निर्धारित) समय की पूर्व निर्धारित मात्रा के लिए इस 5 एमएम बीआरडीयू समाधान के साथ मछली को इनक्यूबेट करें। फिर चरण 2 के अनुसार इन मछलियों को विच्छेदित करें और बीआरडीयू निगमन और सेल वंश पहचान का मूल्यांकन करें।
    नोट: यह चरण सेल वंश विश्लेषण के लिए एक वैकल्पिक कदम है। बीआरडीयू संकेतों का पता लगाने के लिए, चरण 4.3 में दिखाए गए अनुसार एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें।

2. मस्तिष्क विच्छेदन

  1. इंट्राकार्डियल छिड़काव के लिए 0.02% ट्राइकेन समाधान, विच्छेदन के लिए एक स्टायरोफोम ट्रे, और एक विस्तार ट्यूब के साथ फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (1x PBS) युक्त 10 एमएल सिरिंज और इंट्राकार्डियल छिड़काव के लिए 30 ग्राम सुइयों ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें।
  2. चयनित समय बिंदुओं पर घायल मछली को एनेस्थेटाइज करें।
  3. स्टायरोफोम ट्रे पर पेपर तौलिए रखें और पेपर तौलिए पर एनेस्थेटाइज्ड मछली रखें।
  4. गुदा पंख के दोनों ओर लंबवत रूप से दो 30 जी सुइयों को डालकर मछली के शरीर को पकड़ें (चित्रा 2 ए)।
  5. गुदा से हृदय तक एक उदर चीरा लगाएं (चित्र 2बी) और इस अंग के प्रत्येक तरफ दो 30 जी सुइयों को डालकर दिल को दृश्यमान रखें (चित्रा 2 सी)।
    नोट: दिल जेब्राफिश और मेडाका दोनों में हाइपोडर्मिस की चांदी की उपकला परत में कवर किया गया है (चित्रा 2 सी)।
  6. धीरे से चांदी के उपकला परत को बल की नोक के साथ हटा दें (चित्रा 2 डी)।
  7. 30 ग्राम सुई को वेंट्रिकल में डालें, बेवेल को ऊपर रखें, और फोर्सप्स का उपयोग करके एट्रियम में चीरा लगाएं (चित्रा 2 ई)। 1x PBS को धक्का देने के लिए सिरिंज पर सावधानीपूर्वक दबाएं और पुष्टि करें कि आलिंद ने रक्त को फ्लश किया है।
    नोट: सुई को वेंट्रिकल को भेदने से रोकने के लिए, सुई को सावधानीपूर्वक आधे बेवेल की गहराई में डालें और फिर सम्मिलन की गहराई को समायोजित करें। यदि छिड़काव अच्छी तरह से किया जाता है, तो गलफड़े सफेद हो जाते हैं (चित्रा 2 एफ, जी)।
  8. रक्त निकलने और गलफड़े सफेद होने के बाद छिड़काव बंद कर दें।
  9. मछली के शरीर को ठीक करने वाली सुइयों को हटा दें और मछली के उदर पक्ष को नीचे ठीक करें (चित्रा 2 एच)। रीढ़ की हड्डी को काटें और खोपड़ी को ऑप्टिक टेक्टम और टेलेन्सेफ्लोन से हटा दें (चित्रा 2 आई)। फिर, ऑप्टिक नसों को काटें और मस्तिष्क को सावधानी से विच्छेदित करें।
    नोट: विच्छेदन के दौरान ऑप्टिक नसों के लिए ध्यान दें क्योंकि तंत्रिकाएं टेक्टम से जुड़ी होती हैं। जब ऑप्टिक तंत्रिका को खींचा जाता है, तो ऑप्टिक टेक्टम को मस्तिष्क से अलग किया जा सकता है। यदि रक्त हटाने का काम पूरा नहीं होता है, तो मस्तिष्क हल्का गुलाबी दिखता है ( चित्रा 2 जे में सही मस्तिष्क)।
  10. दिमाग को 1x PBS में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 1 एमएल के साथ 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।

3. जमे हुए अनुभागों की तैयारी

  1. फिक्स्ड दिमाग को 5 मिनट के लिए 1x PBS में तीन बार धोएं।
  2. मस्तिष्क को क्रायोप्रोटेक्ट करने के लिए, उन्हें 1x PBS में 30% (w / v) सुक्रोज के 1 एमएल के साथ 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 30 एमएल ओसीटी और 15 एमएल 30% सुक्रोज के संयोजन से एम्बेडिंग यौगिक (ओसीटी यौगिक और 30% सुक्रोज का 2: 1 मिश्रण, सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: मिश्रित यौगिक से बुलबुले को हटाने के लिए, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 10,000 x g पर 50 एमएल ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें या ट्यूबों को रात भर सीधा रखें।
  3. क्रायोमोल्ड को ठंडा करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एल्यूमीनियम ब्लॉक को इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें) विच्छेदित मस्तिष्क को एम्बेडिंग यौगिक के साथ क्रायोमोल्ड में एम्बेडेड करने के तुरंत बाद।
    नोट: एल्यूमीनियम ब्लॉक को ठंडा करने के लिए तरल नाइट्रोजन का भी उपयोग किया जा सकता है। उस स्थिति में, एल्यूमीनियम ब्लॉक को एम्बेड करने से ठीक पहले एल्यूमीनियम ब्लॉक को कवर करने के लिए पर्याप्त तरल नाइट्रोजन से भरे स्टायरोफोम बॉक्स में रखा जाना चाहिए। तरल नाइट्रोजन उर्ध्वपातन की पुष्टि करने के बाद, क्रायोमोल्ड को प्रीकूल्ड एल्यूमीनियम ब्लॉक पर रखें। यह पुष्टि करना बेहतर है कि एल्यूमीनियम ब्लॉक पर एक बार में कितने क्रायोमोल्ड्स रखे जा सकते हैं। सभी नमूनों को जल्दी से ठंडा करने के लिए पर्याप्त स्थान सुनिश्चित करने के लिए तरल नाइट्रोजन या एक अतिरिक्त प्रीकूल्ड ब्लॉक का उपयोग करने की सलाह दी जाती है।
  4. प्रीकूल्ड एल्यूमीनियम ब्लॉक को स्टायरोफोम बॉक्स में रखें। एल्यूमीनियम ब्लॉक को गर्म होने से रोकने के लिए ढक्कन के साथ एक स्टायरोफोम बॉक्स का उपयोग करें।
  5. कोरोनल वर्गों के लिए, मस्तिष्क को क्रायोमोल्ड में एम्बेड करें और माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 ए) के तहत बल का उपयोग करके अभिविन्यास को समायोजित करें।
  6. स्टायरोफोम बॉक्स में प्रीकूल्ड एल्यूमीनियम ब्लॉक पर क्रायोमोल्ड रखें और ओसीटी यौगिक को फ्रीज करने की अनुमति दें (चित्रा 3 बी)। जब ओसीटी यौगिक जमने लगता है, तो यह सफेद हो जाता है।
  7. नमूना डिस्क पर ओसीटी यौगिक का एक छोटा सर्कल लागू करें, और नमूना डिस्क से क्रायोब्लॉक को संलग्न करने के लिए क्रायोब्लॉक को माउंट करें।
  8. क्रायोस्टेट में नमूना डिस्क रखें और ओसीटी यौगिक को पूरी तरह से फ्रीज करें।
  9. क्रायोस्टेट में नमूना सिर पर नमूना डिस्क रखें।
  10. क्रायोब्लॉक का अभिविन्यास सेट करें और किसी भी अतिरिक्त क्षेत्रों को हटाने के लिए ओसीटी को ट्रिम करें।
    नोट: टेलेन्सेफ्लोन को काटते समय काटने वाले विमान के अभिविन्यास को समायोजित करें। ब्लेड क्रायोस्टेट से लैस है। नमूना सिर के कोण को बदलकर काटने वाले विमान के अभिविन्यास को समायोजित करना संभव है।
  11. क्रायोस्टेट का उपयोग करके पूरे ऑप्टिक टेक्टम के माध्यम से 14 μm मोटी सीरियल सेक्शन काटें। स्लाइड्स को -25 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: दीर्घकालिक भंडारण -80 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए।

4. फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग

  1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए स्लाइड रैक में सूखे ग्लास स्लाइड। आरटी पर 30 मिनट के लिए 1x PBS में स्लाइड धोएं। यदि एंटी-पीसीएनए या बीआरडीयू एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग किया जाना है, तो चरण 4.2 या चरण 4.3 पर आगे बढ़ें।
  2. 500 एमएल बीकर में 10 एमएम सोडियम साइट्रेट का 500 एमएल तैयार करें और एक गर्म प्लेट चुंबकीय स्टिरर पर साइट्रेट बफर को 85 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, फिर स्लाइड को स्लाइड स्टेनिंग रैक में रखें और रैक को 30 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर साइट्रेट बफर में इनक्यूबेट करें। उबलने से बचने के लिए, तापमान 85 डिग्री सेल्सियस के आसपास रखें। एंटीजन पुनर्प्राप्ति के बाद, स्लाइड को 1x PBS (PBSTr) में 0.1% ट्राइटन में तीन बार धोएं, प्रत्येक धोने में RT पर 5 मिनट लगते हैं।
    नोट: यह कदम सेल परमाणु एंटीजन (पीसीएनए) पुनर्प्राप्ति के प्रसार के लिए एक वैकल्पिक कदम है।
  3. आसुत जल में 12 एन एचसीएल को पतला करके 2 एन एचसीएल समाधान तैयार करें। तरल अवरोधक का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें), अनुभागों के चारों ओर 2 एन एचसीएल समाधान रखने के लिए हाइड्रोफोबिक बाधा के रूप में एक रेखा खींचें।
    1. इम्यूनोस्टेनिंग ट्रे पर स्लाइड रखें और 2 एन एचसीएल समाधान के 200-300 μL लागू करें। ट्रे को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एंटीजन पुनर्प्राप्ति के बाद, आरटी पर 5 मिनट लेने वाले प्रत्येक धोने के साथ 0.1% पीबीएसटीआर में तीन बार धोएं।
      नोट: यह चरण बीआरडीयू एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए एक वैकल्पिक कदम है।
  4. पेपर तौलिए का उपयोग करके शेष घोल को अवशोषित करें और हटा दें। फिर, आवश्यक रूप से अनुभागों के आसपास एंटीबॉडी समाधान रखने के लिए हाइड्रोफोबिक बाधा खींचने के लिए एक तरल अवरोधक का उपयोग करें।
  5. स्लाइड्स को ट्रे पर रखें और प्रत्येक स्लाइड पर ब्लॉकिंग समाधान के 200-300 μL, PBSTR में 3% (v / v) घोड़े का सीरम लागू करें, और RT पर 1 घंटे के लिए स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
  6. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएसटीआर के साथ अनुभागों को धोएं और तीन बार दोहराएं।
  7. ब्लॉकिंग समाधान (प्रत्येक स्लाइड के लिए एंटीबॉडी समाधान के 200-300 μL) का उपयोग करके प्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। पेपर तौलिए के साथ शेष पीबीएसटीआर को हटा दें और इम्यूनोस्टेनिंग ट्रे पर स्लाइड रखें। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हर स्लाइड पर लागू करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ट्रे को इनक्यूबेट करें।
  8. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएसटीआर के साथ अनुभागों को धोएं और तीन बार दोहराएं।
  9. ब्लॉकिंग बफर (1: 500) का उपयोग करके फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। पेपर तौलिए के साथ शेष पीबीएसटीआर को हटा दें और इम्यूनोस्टेनिंग ट्रे पर स्लाइड रखें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ हर स्लाइड और शेड ट्रे पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान लागू करें। आरटी पर 1-2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. पीबीएसटीआर के साथ अनुभागों को प्रकाश में उजागर किए बिना आरटी पर 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  11. परमाणु धुंधलापन के लिए होचस्ट समाधान (1x PBS में 1:500 कमजोर पड़ने, सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। पेपर तौलिए के साथ शेष पीबीएसटीआर को हटा दें और इम्यूनोस्टेनिंग ट्रे पर स्लाइड रखें। हर स्लाइड पर होचस्ट समाधान लागू करें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्रे को कवर करें। आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. आरटी में 10 मिनट के लिए 1x PBS के साथ अनुभागों को धोएं, उन्हें प्रकाश में उजागर किए बिना।
  13. पेपर तौलिए का उपयोग करके शेष 1x PBS को अवशोषित करें और हटा दें और फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग के लिए पानी में घुलनशील माउंटिंग माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके स्लाइड पर अनुभागों को माउंट करें। धीरे-धीरे अनुभागों पर 24 x 45 मिमी कवरस्लिप सेट करें। स्लाइड्स को प्रकाश में उजागर किए बिना, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  14. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत अनुभागों का निरीक्षण और छवि।

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Representative Results

दाहिने गोलार्ध (चित्रा 1, चित्रा 4 ए, और चित्रा 5 ए) में सुई सम्मिलन का उपयोग करके ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोट रेडियल ग्लियल सेल (आरजीसी) प्रसार और नवजात न्यूरॉन्स की पीढ़ी सहित विभिन्न सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करती है। इसी तरह, जेब्राफिश और मेडाका की वृद्ध आबादी का उपयोग पुनर्योजी प्रतिक्रिया में किसी भी उम्र बढ़ने के प्रभाव का मुकाबला करने के लिए किया गया था। फिर जमे हुए वर्गों पर फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया था, और जेब्राफिश और मेडाका (चित्रा 4-5)13) में टेक्टम चोट के बाद आरजीसी प्रसार और भेदभाव का विश्लेषण किया गया था।

इनऊतकों में आरजीसी प्रसार का मूल्यांकन करने के लिए जेब्राफिश और मेडाका में उपलब्ध एक प्रोलिफ़ेरेटिंग सेल मार्कर, प्रोलिफ़ेरिंग सेल एंटीजन (पीसीएनए), और एक आरजीसी मार्कर, ब्रेन लिपिड-बाइंडिंग प्रोटीन (बीएलबीपी) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। जैसा कि पहले वर्णित है, अधिकांश आरजीसी विपरीत अघायल गोलार्ध (चित्रा 4 बी) 13 में क्विसेंट (पीसीएनए नकारात्मक) थे। फिर भी, आरजीसी प्रसार को मेडाका टेक्टम (चित्रा 4 सी, डी) 13 में चोट के 2 दिनों के बाद (डीपीआई) पर प्रेरित किया गया था। चोट के बाद आरजीसी प्रसार का प्रेरण ज़ेबराफिश और मेडाका पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं13,19 दोनों की एक सामान्य विशेषता है।

बीआरडीयू लेबलिंग एक सरल विधि है जिसका उपयोग सेल वंश का मूल्यांकन करने और मस्तिष्क की चोट के बाद आरजीसी भेदभाव का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है (चित्रा 5 ए)13)। पैन-न्यूरोनल मार्कर, एचयूसी और बीआरडीयू के लिए एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग पहले जेब्राफिश और मेडाका (चित्रा 5 बी, सी) 13 के घायल टेक्टम में आरजीसी भेदभाव की तुलना करने के लिए किया गया था। यदि ये एंटीबॉडी लक्षित प्रजातियों में उपलब्ध हैं, तो तुलनात्मक विश्लेषण किया जा सकता है।

यदि चोट उचित रूप से प्रेरित है, तो चोट स्थल ऑप्टिक टेक्टम (चित्रा 4 सी) में केंद्रीय-पृष्ठीय क्षेत्र में स्थित है। परमाणु धुंधलापन और हेमटोक्सिलिन और ईओसिन धुंधलापन का उपयोग तब चोट स्थल13,19,20,21,22,23,24,25 की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। चोट के बाद, परमाणु धुंधलापन के साथ एक परेशान पेरिवेंट्रिकुलर ग्रे ज़ोन देखा जा सकता है (चित्रा 4 सी)। यदि चोट औसत दर्जे के पृष्ठीय क्षेत्र में स्थित है, तो आरजीसी प्रसार में काफीवृद्धि नहीं हुई है।

Figure 1
चित्र 1: सुई का उपयोग करके वयस्क ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोट। (ए) वयस्क ज़ेबराफिश का पृष्ठीय दृश्य। ज़ेबराफिश को स्टायरोफोम में लंबवत रूप से डाली गई दो मुड़ी हुई सुइयों के बीच सीधा रखा जाता है। (A') (ए) में बॉक्स किए गए क्षेत्र की बढ़ी हुई छवि। 30 ग्राम सुई को ऑप्टिक टेक्टम पर दो खोपड़ियों के बीच सीमा के मध्यवर्ती क्षेत्र में डाला जाता है जिसे ओएस फ्रंटल और ओएस पेराइटल कहा जाता है। पीला वृत्त चोट स्थल को इंगित करता है, और सफेद डैश्ड लाइनें ऑप्टिक टेक्टम पर दो खोपड़ियों को इंगित करती हैं। (बी) वयस्क मेडाका का पृष्ठीय दृश्य। (B') (बी) में बॉक्स किए गए क्षेत्र की एक आवर्धित छवि। ऑप्टिक टेक्टम पर सीमा में 30 ग्राम सुई डाली जाती है। पीला वृत्त चोट स्थल को इंगित करता है, और सफेद डैश्ड लाइनें ऑप्टिक टेक्टम पर दो खोपड़ियों का संकेत देती हैं। (C) मेडाका की खोपड़ी पर तराजू होता है। चाकू के घाव की चोट से पहले खोपड़ी के तराजू को हटाया जाना चाहिए। डैश्ड लाइन ऑप्टिक टेक्टम पर पैमाने को इंगित करती है। स्केल बार: ए-बी में 2 मिमी, ए', बी' और सी में 1 मिमी। टेलेन्सेफ्लोन (टेल), ऑप्टिक टेक्टम (ओटी), ओएस फ्रंटल (एफ), और ओएस पेराइटल (पी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: छोटी वयस्क मछलियों में इंट्राकार्डियक छिड़काव। (ए) इंट्राकार्डियक छिड़काव और मस्तिष्क विच्छेदन के लिए तैयार मुड़ी हुई सुइयों का उपयोग करके स्टायरोफोम पर तय किए गए ज़ेबराफिश का वेंट्रल दृश्य। (बी) गुदा पंख की उत्पत्ति से छाती तक एक उदर चीरा लगाया जाता है। (सी) दिल एक चांदी की उपकला परत के पीछे होता है जिसे जेब्राफिश और मेडाका दोनों में हाइपोडर्मिस कहा जाता है। चांदी के उपकला परत के बगल में एक मुड़ी हुई सुई का उपयोग करके एक और निर्धारण आसान पहुंच की अनुमति देता है। ठोस सफेद रेखा वेंट्रिकल (वी) को इंगित करती है, और बिंदीदार रेखा हाइपोडर्मिस को इंगित करती है। (डी) चांदी के उपकला परत को 1x PBS के इंट्राकार्डियल छिड़काव से पहले हटा दिया जाता है। (ई-जी) इंट्राकार्डियक छिड़काव के लिए कैनुला को वेंट्रिकल में डाला जाता है। (एफ) से पहले और बाद में (जी) इंट्राकार्डियक छिड़काव। यदि रक्त निकालने का काम पूरा नहीं होता है, तो गलफड़े लाल रहते हैं। (एच-जे) ऊतकों से रक्त को हटाने के लिए पीबीएस छिड़काव के बाद मस्तिष्क विच्छेदन। ऑप्टिक टेक्टम और टेलेन्सेफ्लोन पर खोपड़ी को हटा दें जैसा कि (आई) में दिखाया गया है। यदि रक्त हटाने का काम पूरा नहीं होता है, तो मस्तिष्क हल्का गुलाबी दिखता है ((जे) में सही मस्तिष्क)। स्केल बार: ए-सी और एच में 2 मिमी, डी-जी और आई-जे में 1 मिमी। घ्राण बल्ब (ओबी), टेलेन्सेफ्लोन (टेल), ऑप्टिक टेक्टम (ओटी), बल्बस आर्टेरियोसस (बीए), वेंट्रिकल (वी), और एट्रियम (एटी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: जमे हुए वर्गों के लिए मस्तिष्क एम्बेडिंग। (A) मस्तिष्क एक एम्बेडिंग यौगिक के साथ क्रायोमोल्ड में एम्बेडेड है। पूर्वकाल नीचे है। (बी) क्रायोमोल्ड्स को प्रीकूल्ड एल्यूमीनियम ब्लॉक पर ठंडा किया जाता है। टेलेन्सेफ्लोन (टेल), ऑप्टिक टेक्टम (ओटी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: वयस्क मेडाका में टेक्टम चोट के बाद आरजीसी प्रसार के खिलाफ फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) ऑप्टिक टेक्टम और कोरोनल सेक्शन के दाहिने गोलार्ध में चाकू के घाव की चोट का योजनाबद्ध दृश्य। (बी-सी) चोट लगने के 2 दिनों बाद विपरीत चोट (बी) और घायल (सी) पक्ष में प्रोलिफेरेटिव आरजीसी (पीसीएनए + बीएलबीपी + कोशिकाओं) के प्रतिनिधि परिणाम। 'सी' में सफेद तीर का निशान चाकू के घाव की चोट से एक परेशान पेरिवेंट्रिकुलर ग्रे जोन को इंगित करता है। (डी) (सी) में बॉक्स किए गए क्षेत्र की आवर्धित छवियां। (डी) में सफेद तीर के निशान पीसीएनए + बीएलबीपी + कोशिकाओं को इंगित करते हैं। स्केल बार: बी-डी में 50 μm. संदर्भ13 से अनुमति के साथ अनुकूलित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: टेक्टम चोट के बाद नवजात न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) ब्रोमोडॉक्स्यूरिडिन (बीआरडीयू) उपचार का योजनाबद्ध दृश्य और ऑप्टिक टेक्टम और कोरोनल सेक्शन में चाकू घाव की चोट। (बी-सी) घायल ज़ेब्राफिश (बी) और मेडाका (सी) में चोट के 7 दिनों बाद नवजात न्यूरॉन्स (बीआरडीयू + एचयूसी + कोशिकाओं) के प्रतिनिधि परिणाम। स्केल बार: बी-सी में 50 μm. संदर्भ13 से अनुमति के साथ अनुकूलित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां विधियों का एक सेट वर्णित किया गया है जिसका उपयोग मस्तिष्क की चोट के बाद आरजीसी प्रसार और भेदभाव के मूल्यांकन की सुविधा के लिए सुई का उपयोग करके ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोटों को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। सुई-मध्यस्थता चाकू घाव एक सरल, कुशलता से कार्यान्वित विधि है जिसे उपकरणों के मानक सेट का उपयोग करके कई प्रयोगात्मक नमूनों पर लागू किया जा सकता है। ज़ेब्राफिश मस्तिष्क के कई क्षेत्रों के लिए चाकू घाव की चोट मॉडल 3,19,29 विकसित किए गए हैं। ऑप्टिक टेक्टम मस्तिष्क के सबसे बड़े हिस्सों में से एक है और हेरफेर करना आसान है। इसके अलावा, ऑप्टिक टेक्टम में अधिकांश आरजीसी टेलेसेफेलॉन की तुलना में शारीरिक परिस्थितियों में क्विसेंट होते हैं, जिससे चोट 3,19 के आधार पर आरजीसी प्रसार और भेदभाव का निरीक्षण करना आसान हो जाता है।

चाकू के घाव की चोटों में महत्वपूर्ण चरणों और सीमाओं में से एक मैनुअल सुई सम्मिलन है; प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम बनाने और तुलनात्मक विश्लेषण की सुविधा के लिए एक सुसंगत चोट आवश्यक है। सम्मिलन का सटीक स्थान और गहराई महत्वपूर्ण है और प्रयोगों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोटों को बनाने में मदद करता है। यह पेपर हर बार समान चोटों को बनाने के लिए स्पष्ट दिशानिर्देश प्रदान करता है। इसके अलावा, चोट के बाद आरजीसी का प्रसार घायल टेक्टम के न्यूरोजेनेसिस के लिए आवश्यक है। घायल ज़ेबराफिश और मेडाका में, आरजीसी प्रसार 1 डीपीआई पर बढ़ता है और बेसल स्तरों पर लौटता है, जैसा कि 7 डीपीआई13,19 पर विपरीत घायल गोलार्ध में होता है।

चाकू घाव की चोट यांत्रिक चोट विधियों में से एक है जो गैर-विशिष्ट सेल एब्लेशन को प्रेरित करती है। इसके विपरीत, सेल-विशिष्ट पृथक्करण के लिए ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण जैसे नाइट्रोरिडक्टेस / मेट्रोनिडाज़ोल प्रणाली भी 30,31,32 विकसित की गई है। इन एब्लेशन मॉडल को प्रयोगात्मक उद्देश्य के आधार पर चुना जाना चाहिए। गैर-विशिष्ट पृथक्करण मस्तिष्क की चोटों जैसे कि चाकू के घाव और इस्केमिक स्ट्रोक के लिए उपयुक्त है। इसके विपरीत, पार्किंसंस रोग जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जुड़े विशिष्ट कोशिकाओं के अध: पतन का मूल्यांकन करने के लिए सेल-विशिष्ट पृथक्करण अधिक उपयुक्त हो सकता है।

हाल ही में, ज़ेबराफिश का उपयोग करके इस्केमिक चोट मॉडल विकसित किए गए हैं, लेकिन इन मॉडलों को रक्त प्रवाह की निगरानी के लिए ट्रांसजेनिक लाइनों और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता होती है। इसलिए, ये मॉडल खराब आनुवंशिक दृष्टिकोण वाली प्रजातियों पर लागू करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं, और उनका थ्रूपुट चाकू घाव की चोट मॉडल से कम है।

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, ऑप्टिक टेक्टम में चाकू के घाव की चोट सरल है और आसानी से अन्य छोटे मछली मॉडल जैसे कि अफ्रीकी किलीफिश और मम्मिचोग में सामान्य उपकरण 26 के साथ लागूहोती है। इसके अलावा, अनुक्रमण तकनीक का उपयोग करके प्रजातियों के बीच तुलनात्मक विश्लेषण की अच्छी तरह से जांच की गई है। इसलिए, सेलुलर प्रतिक्रियाओं और जीन अभिव्यक्ति के तुलनात्मक विश्लेषण का उपयोग करके ज़ेबराफिश में एनएससी की पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करते समय यह सरल विधि आवश्यक रहती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को JSPS KAKENHI अनुदान संख्या 18K14824 और 21K15195 और AIST, जापान के आंतरिक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringe TERUMO SS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0) NIPPON GENE 314-90381
30 G needle Dentronics HS-2739A
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution Wako 163-20145
Aluminum block 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds
Anti-BLBP Millipore ABN14 1:500
Anti-BrdU Abcam ab1893 1:500
Anti-HuC Invitrogen A21271 1:100
Anti-PCNA Santa Cruz Biotechnology sc-56 1:200
Brmodeoxyuridine Wako 023-15563
Confocal microscope C1 plus Nikon
Cryomold Sakura Finetek Japan 4565 10 x 10 x 5 mm (W x D x H)
Cryostat Leica CM1960
Danio rerio WT strains RW
Extension tube TERUMO SF-ET3520
Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues SIGMA-ALDRICH F4680-25ML
Forceps DUMONT 11252-20
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32723
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035
Hoechst 33342 solution Dojindo 23491-52-3
Hydrochloric Acid Wako 080-01066
Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange COSMO BIO CO., LTD. 10DO
MAS coat sliding glass Matsunami glass MAS-01
Micro cover glass Matsunami glass C024451
Microscopy Nikon SMZ745T
Normal horse serum blocking solution VECTOR LABRATORIES S-2000-20
O.C.T Compound Sakura Finetek Japan 83-1824
Oryzias latipes WT strains Cab
PAP Pen Super-Liquid Blocker DAIDO SANGYO PAP-S
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 TaKaRa T9181
Styrofoam tray 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray
Sucrose Wako 196-00015 30 % (w/v) Sucrose in PBS
Tricaine (MS-222) nacarai tesque 14805-24
Trisodium Citrate Dihydrate Wako 191-01785
Triton X-100 Wako 04605-250

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References

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पुनर्योजी क्षमता के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए ज़ेबराफिश और मेडाका का उपयोग करके वयस्क ऑप्टिक टेक्टम का स्टैब घाव चोट मॉडल
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Shimizu, Y., Kawasaki, T. Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity. J. Vis. Exp. (180), e63166, doi:10.3791/63166 (2022).

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