Summary
Описана модель механической черепно-мозговой травмы у взрослых рыбок данио-рерио для исследования молекулярных механизмов, регулирующих их высокую регенеративную способность. Метод объясняет создание ножевого ранения в тектуме зрительного нерва нескольких видов мелких рыб для оценки регенеративных реакций с использованием флуоресцентного иммуноокрашивания.
Abstract
В то время как рыбки данио-рерио обладают превосходной способностью к регенерации своей центральной нервной системы (ЦНС), медака имеет более низкую регенеративную способность ЦНС. Модель черепно-мозговой травмы была разработана в тектуме зрительного нерва взрослых рыбок данио-рерио и медаки, и были проведены сравнительные гистологические и молекулярные анализы для выяснения молекулярных механизмов, регулирующих высокую регенеративную способность этой ткани у этих видов рыб. Здесь представлена модель ножевого ранения для тектума зрительного нерва взрослого человека с использованием иглы и гистологических анализов на пролиферацию и дифференцировку нейральных стволовых клеток (НСК). Иглу вручную вводили в центральную область тектума зрительного нерва, а затем рыб интракардиально перфузировали, а их мозг рассекали. Затем эти ткани были криосекций и оценены с использованием иммуноокрашивания по соответствующим маркерам пролиферации и дифференцировки НСК. Эта модель тектумной травмы обеспечивает надежные и воспроизводимые результаты как у рыбок данио, так и у медаки, что позволяет сравнивать реакции NSC после травмы. Этот метод доступен для небольших телеостов, включая рыбок данио, медаку и африканских рыб-убийц, и позволяет нам сравнивать их регенеративную способность и исследовать уникальные молекулярные механизмы.
Introduction
Рыбки данио-рерио (Danio rerio) обладают повышенной способностью к регенерации центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с другими млекопитающими 1,2,3. Недавно, чтобы лучше понять молекулярные механизмы, лежащие в основе этой повышенной регенеративной способности, был проведен сравнительный анализ регенерации тканей с использованием технологии секвенирования следующего поколения 4,5,6. Структуры мозга у рыбок данио-рерио и четвероногих совершенно разные 7,8,9. Это означает, что было разработано несколько моделей черепно-мозговых травм с использованием мелких рыб со схожими структурами мозга и биологическими особенностями, чтобы облегчить исследование основных молекулярных механизмов, способствующих увеличению регенеративной способности.
Кроме того, медака (Oryzias latipes) является популярным лабораторным животным с низкой способностью к регенерации сердца и нейронов10,11,12,13 по сравнению с рыбками данио. Рыбки данио-рерио и медака имеют сходные структуры мозга и ниши для взрослых нейральных стволовых клеток (НСК)14,15,16,17. У рыбок данио-рерио и медаки тектум зрительного нерва включает два типа НСК: нейроэпителиоподобные стволовые клетки и радиальные глиальные клетки (RGCs)15,18. Ранее была разработана ножевая рана для тектума зрительного нерва взрослых рыбок данио, и эта модель была использована для исследования молекулярных механизмов, регулирующих регенерацию мозга у этих животных 19,20,21,22,23. Эта молодая взрослая модель ножевых ранений рыбок данио-рерио индуцировала регенеративный нейрогенез из RGC 19,24,25. Это ножевое ранение в тектуме зрительного нерва является надежным и воспроизводимым методом 13,19,20,21,22,23,24,25. Когда та же модель травмы была применена к взрослой медаке, низкая нейрогенная способность RGC в тектуме зрительного нерва medaka была выявлена с помощью сравнительного анализа пролиферации и дифференцировки RGC после травмы13.
Модели ножевых ранений в тектуме зрительного нерва также были разработаны в моделяхмумихога 26, но детали повреждения тектума не были хорошо задокументированы по сравнению с повреждением теленцефала27. Ножевое ранение в тектуме зрительного нерва с использованием рыбок данио-рерио и медаки позволяет исследовать дифференциальные клеточные реакции и экспрессию генов между видами с дифференциальной регенеративной способностью. В этом протоколе описывается, как выполнить ножевое ранение в тектуме зрительного нерва с помощью инъекционной иглы. Этот метод может быть применен к мелким рыбам, таким как рыбки данио-рерио и медака. Здесь объясняются процессы подготовки образцов для гистологического анализа и анализа клеточной пролиферации и дифференцировки с использованием флуоресцентной иммуногистохимии и криосекций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные протоколы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Национальном институте передовых промышленных наук и технологий. Рыбки данио-рерио и медака содержались в соответствии со стандартными процедурами28.
1. Ножевая травма тектума зрительного нерва взрослого человека
- Приготовьте 0,4% (мас./об.) раствор трикаина для анестезии. Для исходного раствора объемом 100 мл растворите 400 мг трикаина метансульфоната (см. Таблицу материалов) в 90 мл дистиллированной воды и отрегулируйте рН до 7,0, используя 1 М трис HCl буфер (рН 9,0). После того, как рН будет отрегулирован, добавьте воды до 100 мл, затем сделайте соответствующие аликвоты и храните их при -20 ° C.
- Чтобы обезболить взрослых рыбок данио-рерио или медаку, приготовьте 0,02 % (мас. / об.) раствор трикаина, разбавив 0,4% раствор трикаина водой для рыбы.
- обезболить рыбу 0,02% раствором трикаина; Они обезболиваются, когда не двигаются или не реагируют на прикосновения (1-2 минуты).
- Поместите анестезированную рыбу на поддон из пенополистирола (см. Таблицу материалов) и закрепите рыбу вертикально между двумя иглами весом 30 г, вставленными вертикально в пенополистирол.
- Держите тело рыбы, чтобы предотвратить движение головы рыбы, и вертикально вставьте иглу 30 G через череп в медиальную область одного из полушарий оптического тектума (рис. 1A, B). Глубина вставки составляет ~0,75 мм, что почти равно половине длины скоса 30 G. Такая глубина введения вызывает черепно-мозговую травму у рыбок данио-рерио и медаки из-за одинакового размера тела этих рыб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Медака имеет чешуйки на черепе. Поцарапайте и удалите чешуйки с помощью иглы 30 G, чтобы эффективно и точно вызвать ножевую рану (рис. 1C). - Перенесите раненую рыбу в аквариум со свежей водой для рыбы и переместите аквариум в систему разведения рыбы, как только они полностью оправятся от анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба выздоравливает и начинает свободно двигаться в течение нескольких минут. - Для анализа происхождения после травмы приготовьте свежую воду для рыбы, содержащую 5 мМ бромдезоксиуридина (BrdU) (см. Таблицу материалов), а затем инкубируйте рыбу с этим раствором BrdU 5 мМ в течение заданного периода времени13,19 (как определено экспериментальным планом). Затем препарируйте этих рыб в соответствии с шагом 2 и оцените инкорпорацию BrdU и идентичность клеточной линии по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным этапом для анализа клеточного происхождения. Чтобы обнаружить сигналы BrdU, выполните извлечение антигена, как показано на шаге 4.3.
2. Рассечение мозга
- Приготовьте 0,02% раствор трикаина, лоток из пенополистирола для вскрытия и шприц объемом 10 мл, содержащий фосфатно-буферный физиологический раствор (1x PBS) с удлинительной трубкой и иглами 30 г (см. Таблицу материалов) для внутрисердечной перфузии.
- Обезболивайте раненую рыбу в выбранные моменты времени.
- Положите бумажные полотенца на поднос из пенополистирола, а анестезированную рыбу положите на бумажные полотенца.
- Удерживайте тело рыбы на месте, вертикально вставив две иглы по 30 G по обе стороны от анального плавника (рис. 2A).
- Сделайте вентральный разрез от ануса до сердца (рис. 2B) и держите сердце видимым, вставив еще две иглы по 30 G с каждой стороны этого органа (рис. 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сердце покрыто серебристым эпителиальным слоем гиподермы как у рыбок данио, так и у медаки (рис. 2C). - Аккуратно удалите слой серебристого эпителия кончиком щипцов (рис. 2D).
- Введите иглу 30 G в желудочек, сохраняя скос вверх, и сделайте разрез в предсердии с помощью щипцов (рис. 2E). Осторожно надавите на шприц, чтобы нажать на 1x PBS, и убедитесь, что предсердие вымыло кровь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы игла не проникла в желудочек, осторожно вставьте иглу на глубину половины скоса, а затем отрегулируйте глубину введения. Если перфузия выполнена правильно, жабры становятся белыми (рис. 2F, G). - Остановите перфузию после того, как кровь стечет и жабры побелеют.
- Удалите иглы, фиксирующие тело рыбы на месте, и зафиксируйте рыбу брюшной стороной вниз (рис. 2H). Перережьте спинной мозг и извлеките череп из тектума зрительного нерва и головного мозга (рис. 2I). Затем перережьте зрительные нервы и тщательно рассеките мозг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за зрительными нервами во время рассечения, потому что нервы связаны с тектумом. Когда зрительный нерв растягивается, зрительный тектум может быть отделен от мозга. Если забор крови не завершен, мозг выглядит светло-розовым (правое полушарие на рисунке 2J). - Перенесите мозг в пробирки объемом 1,5 мл с 1 мл 4% параформальдегида в 1x PBS и зафиксируйте их на ночь при 4 ° C.
3. Подготовка замороженных участков
- Промойте неподвижные мозги три раза в 1x PBS по 5 минут каждый.
- Чтобы криозащитить мозг, перенесите его в пробирки объемом 1,5 мл с 1 мл 30% (мас./об.) сахарозы в 1x PBS и инкубируйте их в течение ночи при 4 ° C. Приготовьте заделочный состав (смесь соединения ОКТ и 30% сахарозы в соотношении 2:1, см. Таблицу материалов), соединив 30 мл ОКТ и 15 мл 30% сахарозы. Хранить при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удалить пузырьки из смешанного соединения, центрифугируйте пробирки объемом 50 мл при 10 000 x g в течение 2 минут при комнатной температуре или поместите пробирки в вертикальное положение на ночь. - Инкубируйте алюминиевый блок в течение ночи при -80 ° C, чтобы охладить криомолд (см. Таблицу материалов) сразу после того, как препарированный мозг будет встроен в криомолд с закладным составом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкий азот также можно использовать для охлаждения алюминиевого блока. В этом случае алюминиевый блок следует поместить в коробку из пенополистирола, заполненную достаточным количеством жидкого азота, чтобы покрыть алюминиевый блок непосредственно перед закладкой. После подтверждения сублимации жидкого азота поместите криомолд на предварительно охлажденный алюминиевый блок. Лучше подтвердить, сколько криоформ можно разместить на алюминиевом блоке сразу. Рекомендуется использовать жидкий азот или дополнительный блок с предварительным охлаждением, чтобы обеспечить достаточно места для быстрого охлаждения всех образцов. - Поместите предварительно охлажденный алюминиевый блок в коробку из пенополистирола. Используйте коробку из пенополистирола с крышкой, чтобы алюминиевый блок не нагревался.
- Для корональных срезов вставьте мозг в криомолд и отрегулируйте ориентацию с помощью щипцов под микроскопом (рис. 3А).
- Поместите криомолд на предварительно охлажденный алюминиевый блок в коробке из пенополистирола и дайте составу OCT застыть (рис. 3B). Когда соединение ОКТ начинает замерзать, оно становится белым.
- Нанесите небольшой круг соединения ОКТ на диск образца и установите криоблок, чтобы прикрепить криоблок к диску образца.
- Поместите диск с образцом в криостат и полностью заморозьте соединение ОКТ.
- Поместите диск с образцом на головку образца в криостате.
- Установите ориентацию криоблока и обрежьте ОКТ, чтобы удалить лишние области.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте ориентацию режущей плоскости во время разрезания головного мозга. Лезвие оснащено криостатом. Можно регулировать ориентацию плоскости резания, изменяя угол наклона головки образца. - Вырежьте серийные срезы толщиной 14 мкм по всему оптическому тектуму с помощью криостата. Хранить предметные стекла при температуре -25 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное хранение должно быть при -80 °C.
4. Флуоресцентное иммуноокрашивание
- Сухое стекло помещают в подставку для слайдов в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Мойте предметные стекла в 1x PBS в течение 30 минут при RT. Если необходимо выполнить иммуноокрашивание антителами против PCNA или BrdU, перейдите к шагу 4.2 или шагу 4.3.
- Приготовьте 500 мл цитрата натрия 10 мМ в стакане объемом 500 мл и нагрейте цитратный буфер до 85 °C на магнитной мешалке с подогревом, затем поместите предметные стекла в решетку для окрашивания предметного стекла и инкубируйте решетку в цитратном буфере при 85 ° C в течение 30 минут. Во избежание кипения поддерживайте температуру около 85 °C. После извлечения антигена промойте предметные стекла три раза в 0,1 % Triton в 1x PBS (PBSTr), при этом каждая промывка занимает 5 минут при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным этапом для извлечения пролиферирующего клеточного ядерного антигена (PCNA). - Приготовьте раствор HCl 2 N, разбавив 12 N HCl в дистиллированной воде. Используя блокиратор жидкости (см. Таблицу материалов), проведите линию в качестве гидрофобного барьера, чтобы удерживать раствор 2 N HCl вокруг срезов.
- Поместите предметные стекла на лотки для иммуноокрашивания и нанесите 200-300 мкл раствора 2N HCl. Инкубируйте лотки при температуре 37 °C в течение 30 минут. После извлечения антигена промыть три раза в 0,1 % PBSTr, при этом каждая стирка занимает 5 минут при ЛТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным этапом для извлечения антигена BrdU.
- Поместите предметные стекла на лотки для иммуноокрашивания и нанесите 200-300 мкл раствора 2N HCl. Инкубируйте лотки при температуре 37 °C в течение 30 минут. После извлечения антигена промыть три раза в 0,1 % PBSTr, при этом каждая стирка занимает 5 минут при ЛТ.
- Впитайте и удалите остатки раствора с помощью бумажных полотенец. Затем используйте жидкостный блокатор, чтобы нарисовать гидрофобный барьер, чтобы удерживать раствор антител вокруг срезов по мере необходимости.
- Поместите предметные стекла на лотки и нанесите 200-300 мкл блокирующего раствора, 3% (об./об.) конской сыворотки в PBSTr) на каждое предметное стекло и инкубируйте предметные стекла в течение 1 ч при ЛТ.
- Промойте срезы PBSTr в течение 5 минут при RT и повторите три раза.
- Приготовьте первичные антитела (см. Таблицу материалов), используя блокирующий раствор (200-300 мкл раствора антител для каждого предметного стекла). Удалите остатки PBSTr бумажными полотенцами и поместите предметные стекла на лотки для иммуноокрашивания. Нанесите раствор первичного антитела на каждое предметное стекло и инкубируйте лотки в течение ночи при температуре 4 °C.
- Промойте срезы PBSTr в течение 5 минут при RT и повторите три раза.
- Готовят раствор флуоресцентного вторичного антитела (см. Таблицу материалов) с использованием блокирующего буфера (1:500). Удалите остатки PBSTr бумажными полотенцами и поместите предметные стекла на лотки для иммуноокрашивания. Нанесите раствор вторичных антител на каждое предметное стекло и затеняйте лотки алюминиевой фольгой. Инкубировать в течение 1-2 ч при РТ.
- Промойте срезы PBSTr в течение 5 мин при RT три раза, не подвергая их воздействию света.
- Приготовьте раствор Хёхста (разбавление 1:500 в 1x PBS, см. Таблицу материалов) для ядерного окрашивания. Удалите остатки PBSTr бумажными полотенцами и поместите предметные стекла на лотки для иммуноокрашивания. Нанесите раствор Hoechst на каждое предметное стекло и накройте лотки алюминиевой фольгой. Инкубировать в течение 30 мин при РТ.
- Промойте срезы 1x PBS в течение 10 минут при RT, не подвергая их воздействию света.
- Поглотите и удалите оставшийся 1x PBS с помощью бумажных полотенец и установите секции на предметные стекла с помощью водорастворимой монтажной среды (см. Таблицу материалов) для флуоресцентного иммуноокрашивания. Медленно установите покровное стекло размером 24 x 45 мм на секции. Хранить при температуре 4 °C, не подвергая предметные стекла воздействию света.
- Наблюдайте и визуализируйте срезы под флуоресцентной микроскопией или конфокальной микроскопией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ножевое ранение в тектуме зрительного нерва с помощью введения иглы в правое полушарие (рис. 1, рис. 4А и рис. 5А) индуцирует различные клеточные реакции, включая пролиферацию радиальных глиальных клеток (RGC) и генерацию нейронов новорожденных. Точно так же старые популяции рыбок данио-рерио и медаки использовались для противодействия любым эффектам старения в регенеративном ответе. Затем на замороженных срезах проводили флуоресцентное иммуноокрашивание, а также анализировали пролиферацию и дифференцировку RGC после повреждения тектума у рыбок данио-рерио и медаки (рис. 4-5)13.
Для оценки пролиферации в этих тканях использовали антитела против пролиферирующего клеточного маркера, пролиферирующего клеточного антигена (PCNA), и маркера RGC, липидсвязывающего белка мозга (BLBP), доступного у рыбок данио-рерио и медаки. Как было описано ранее, большинство RGC находились в состоянии покоя (PCNA отрицательный) в контралатеральном неповрежденном полушарии (рис. 4B)13. Тем не менее, пролиферация RGC была индуцирована через 2 дня после травмы (dpi) в тектуме медака (рис. 4C, D)13. Индукция пролиферации RGC после травмы является общей чертой регенеративных реакций как рыбок данио, так и медаки13,19.
Маркировка BrdU — это простой метод, используемый для оценки клеточного происхождения и анализа дифференцировки RGC после черепно-мозговой травмы (рис. 5A)13. Иммуноокрашивание антителами к паннейрональному маркеру HuC и BrdU ранее использовалось для сравнения дифференцировки RGC в поврежденном тектуме рыбок данио-рерио и медаки (рис. 5B, C)13. Если эти антитела имеются у целевых видов, можно провести сравнительный анализ.
Если травма вызвана соответствующим образом, место повреждения расположено в центрально-дорсальной области в тектуме зрительного нерва (рис. 4C). Затем можно использовать ядерное окрашивание и окрашивание гематоксилином и эозином для подтверждения места повреждения 13,19,20,21,22,23,24,25. После травмы может наблюдаться нарушенная перивентрикулярная серая зона с ядерным окрашиванием (рис. 4В). Если повреждение локализовано в медиальной дорсальной области, пролиферация RGC значительно не увеличивается25.
Рисунок 1: Ножевая рана в тектуме зрительного нерва взрослого человека с помощью иглы . (A) Вид на спину взрослой рыбки данио. Рыбок данио-рерио держат вертикально между двумя изогнутыми иглами, вставленными вертикально в пенополистирол. (А') Увеличенное изображение области в рамке в (A). Игла 30 G вводится в медиальную область границы между двумя черепами, называемую os frontale и os parietale на тектуме зрительного нерва. Желтый круг указывает на место повреждения, а белые пунктирные линии указывают на два черепа на тектуме зрительного нерва. (B) Вид на спину взрослой медаки. (В') Увеличенное изображение прямоугольной области в (B). Игла 30 G вводится в границу на тектуме зрительного нерва. Желтый круг указывает на место повреждения, а белые пунктирные линии указывают на два черепа на тектуме зрительного нерва. (C) Медака имеет чешуйки на черепе. Чешуйки черепа должны быть удалены до ножевого ранения. Пунктирной линией обозначена шкала на тектуме зрительного нерва. Масштабная линейка: 2 мм в A-B, 1 мм в A', B' и C. Головной мозг (Tel), тектум зрительного нерва (OT), os frontale (F) и os parietale (P). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Внутрисердечная перфузия у мелких взрослых рыб. (A) Вентральный вид рыбки данио, закрепленной на пенополистироле с помощью изогнутых игл, готовых к внутрисердечной перфузии и вскрытию мозга. (B) Вентральный разрез делается от начала анальных плавников до груди. (C) Сердце находится за серебристым эпителиальным слоем, называемым гиподермой, как у рыбок данио, так и у медаки. Другая фиксация с помощью изогнутой иглы рядом с эпителиальным слоем серебра обеспечивает более легкий доступ. Сплошная белая линия указывает на желудочек (V), а пунктирная линия указывает на гиподерму. (D) Эпителиальный слой серебра удаляют перед интракардиальной перфузией 1x PBS. (Э-Г) Канюлю вводят в желудочек для внутрисердечной перфузии. Жабры до (F) и после (G) внутрисердечной перфузии. Если удаление крови не завершено, жабры остаются красными. (Х-Дж) Рассечение мозга после перфузии PBS для удаления крови из тканей. Удалите черепа на тектуме зрительного нерва и головном мозге, как показано в (I). Если забор крови не завершен, мозг выглядит светло-розовым (правое полушарие мозга в (J)). Масштабная линейка: 2 мм в A-C и H, 1 мм в D-G и I-J. Обонятельная луковица (OB), головной мозг (Tel), тектум зрительного нерва (OT), артериальный бульб (Ba), желудочек (V) и предсердие (At). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Встраивание мозга для замороженных срезов . (А) Мозг встроен в криомолд со встроенным составом. Передняя часть опущена. (B) Криоформы охлаждаются на предварительно охлажденном алюминиевом блоке. Головной мозг (Tel), тектум зрительного нерва (OT). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты флуоресцентного иммуноокрашивания против пролиферации RGC после повреждения тектума у взрослого медаки . (A) Схематическое изображение ножевого ранения правого полушария тектума зрительного нерва и коронального отдела. (Б-С) Репрезентативные результаты пролиферативных RGC (PCNA + BLBP + клетки) на контралатеральной неповрежденной (B) и поврежденной (C) стороне через 2 дня после травмы. Белый наконечник стрелки в C' указывает на нарушенную перивентрикулярную серую зону из-за ножевого ранения. (D) Увеличенные изображения области в рамке в (C). Белыми стрелками в (D) обозначены ячейки PCNA + BLBP +. Масштабная линейка: 50 мкм в B-D. Адаптировано с разрешения Reference13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные результаты флуоресцентного иммуноокрашивания для генерации нейронов новорожденных после повреждения тектума . (A) Схематическое изображение лечения бромдезоксиуридином (BrdU) и ножевого ранения в тектуме зрительного нерва и корональном отделе. (Б-С) Репрезентативные результаты новорожденных нейронов (BrdU + HuC + клетки) через 7 дней после травмы у травмированных рыбок данио-рерио (B) и медаки (C). Масштабная линейка: 50 мкм в B-C. Адаптировано с разрешения Reference13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь описан набор методов, которые могут быть использованы для индуцирования ножевых ранений в тектуме зрительного нерва с использованием иглы для облегчения оценки пролиферации и дифференциации RGC после черепно-мозговой травмы. Игольчатые ножевые ранения представляют собой простой, эффективно реализованный метод, который может быть применен ко многим экспериментальным образцам с использованием стандартного набора инструментов. Были разработаны модели ножевых ранений для нескольких областей мозга рыбок данио-рерио 3,19,29. Тектум зрительного нерва является одной из самых больших частей мозга, и им легко манипулировать. Более того, большинство RGC в тектуме зрительного нерва находятся в состоянии покоя в физиологических условиях по сравнению с головным мозгом, что облегчает наблюдение за пролиферацией и дифференцировкой RGC в зависимости от повреждения 3,19.
Одним из важнейших шагов и ограничений при ножевых ранениях является ручное введение иглы; Последовательная травма необходима для получения воспроизводимых результатов и облегчения сравнительного анализа. Точное местоположение и глубина введения имеют решающее значение и помогают создавать воспроизводимые травмы в экспериментах. В этом документе содержатся четкие рекомендации по нанесению подобных травм каждый раз. Кроме того, пролиферация RGC после травмы имеет важное значение для нейрогенеза поврежденного тектума. У травмированных рыбок данио-рерио и медаки пролиферация RGC увеличивается на 1 dpi и возвращается к базальным уровням, таким же, как и в контралатеральном неповрежденном полушарии, при 7 dpi13,19.
Колотая рана является одним из методов механического повреждения, вызывающих неспецифическую клеточную абляцию. Напротив, трансгенные подходы к клеточно-специфической абляции, такие как система нитроредуктазы / метронидазола, также были разработаны30,31,32. Эти модели абляции должны быть выбраны на основе экспериментальной цели. Неспецифическая абляция подходит для черепно-мозговых травм, таких как ножевые ранения и ишемический инсульт. Напротив, клеточно-специфическая абляция может быть более подходящей для оценки дегенерации конкретных клеток, связанных с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона.
В последнее время были разработаны модели ишемического повреждения с использованием рыбок данио-рерио33, но эти модели нуждаются в трансгенных линиях и флуоресцентной микроскопии для мониторинга кровотока. Таким образом, эти модели сложно применить к видам с плохими генетическими подходами, и их пропускная способность ниже, чем у модели ножевых ранений.
Как упоминалось выше, ножевая рана в тектуме зрительного нерва проста и легко наносится на других моделях мелких рыб, таких как африканская рыба-убийца и мумичог, с помощью обычных инструментов26. Кроме того, сравнительный анализ между видами был хорошо изучен с использованием технологии секвенирования. Таким образом, этот простой метод остается важным при изучении регенеративной способности НСК у рыбок данио-рерио с использованием сравнительного анализа клеточных реакций и экспрессии генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом JSPS KAKENHI No 18K14824 и 21K15195 и внутренним грантом AIST, Япония.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , University of Oregon Press. (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
