Summary
En mekanisk hjerneskademodell hos den voksne sebrafisken er beskrevet for å undersøke de molekylære mekanismene som regulerer deres høye regenerative kapasitet. Metoden forklarer å skape en stikksårskade i optisk tektum av flere arter av liten fisk for å evaluere de regenerative responsene ved hjelp av fluorescerende immunfarging.
Abstract
Mens sebrafisk har en overlegen kapasitet til å regenerere sentralnervesystemet (CNS), har medaka en lavere CNS-regenerativ kapasitet. En hjerneskademodell ble utviklet i det voksne optiske tektumet til sebrafisk og medaka, og komparative histologiske og molekylære analyser ble utført for å belyse de molekylære mekanismene som regulerer den høye regenerative kapasiteten til dette vevet på tvers av disse fiskeartene. Her presenteres en stikksårskademodell for den voksne optiske tektum ved hjelp av nål og histologiske analyser for proliferasjon og differensiering av nevrale stamceller (NSC). En nål ble manuelt satt inn i det sentrale området av optisk tektum, og deretter ble fisken intrakardialt perfundert, og hjernen deres ble dissekert. Disse vevene ble deretter kryoseksjonert og evaluert ved hjelp av immunfarging mot passende NSC-proliferasjons- og differensieringsmarkører. Denne tektumskademodellen gir robuste og reproduserbare resultater i både sebrafisk og medaka, noe som gjør det mulig å sammenligne NSC-responser etter skade. Denne metoden er tilgjengelig for små teleoster, inkludert sebrafisk, medaka og afrikansk killifish, og gjør det mulig for oss å sammenligne deres regenerative kapasitet og undersøke unike molekylære mekanismer.
Introduction
Sebrafisk (Danio rerio) har økt evne til å regenerere sentralnervesystemet (CNS) sammenlignet med andre pattedyr 1,2,3. Nylig, for bedre å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for denne økte regenerative kapasiteten, har komparative analyser av vevregenerering ved hjelp av neste generasjons sekvenseringsteknologi blitt utført 4,5,6. Hjernestrukturene hos sebrafisk og tetrapoder er ganske forskjellige: 7,8,9. Dette betyr at flere hjerneskademodeller med små fisk med lignende hjernestrukturer og biologiske egenskaper er utviklet for å lette undersøkelsen av de underliggende molekylære mekanismene som bidrar til denne økte regenerative kapasiteten.
I tillegg er medaka (Oryzias latipes) et populært laboratoriedyr med lav kapasitet for hjerte- og nevronregenerering10,11,12,13 sammenlignet med sebrafisk. Sebrafisk og medaka har lignende hjernestrukturer og nisjer for voksne nevrale stamceller (NSC)14,15,16,17. I sebrafisk og medaka omfatter optisk tektum to typer NSC, nevroepitellignende stamceller og radiale gliaceller (RGC)15,18. En stikksårskade for optisk tektum hos voksne sebrafisk ble tidligere utviklet, og denne modellen ble brukt til å undersøke molekylære mekanismer som regulerer hjernens regenerering hos disse dyrene 19,20,21,22,23. Denne unge voksne sebrafiskstikkskademodellen induserte regenerativ nevrogenese fra RGC 19,24,25. Denne stikksårskaden i optisk tektum er en robust og reproduserbar metode 13,19,20,21,22,23,24,25. Når samme skademodell ble anvendt på voksen medaka, ble den lave nevrogene kapasiteten til RGC i medaka optisk tektum avslørt via komparativ analyse av RGC-proliferasjon og differensiering etter skade13.
Stikksårskademodeller i optisk tektum er også utviklet i mummichog modell26, men detaljer om tektumskaden er ikke godt dokumentert sammenlignet med telencefalisk skade27. Stikksårskaden i optisk tektum ved bruk av sebrafisk og medaka gjør det mulig å undersøke differensialcellulære responser og genuttrykk mellom arter med differensiell regenerativ kapasitet. Denne protokollen beskriver hvordan man utfører en stikksårskade i optisk tektum ved hjelp av en injeksjonsnål. Denne metoden kan brukes på små fisk som sebrafisk og medaka. Prosessene for prøvepreparering for histologisk analyse og cellulær proliferasjon og differensieringsanalyse ved bruk av fluorescerende immunhistokjemi og kryoseksjoner er forklart her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Sebrafisk og medaka ble vedlikeholdt i henhold til standard prosedyre28.
1. Stikksårskade i voksen optisk tektum
- Lag en 0,4 % (w/v) trikain stamløsning for anestesi. For en 100 ml stamløsning løses 400 mg trikain metansulfonat (se materialfortegnelse) i 90 ml destillert vann og justerer pH til 7,0 ved bruk av 1 M Tris HCl-buffer (pH 9,0). Når pH er justert, tilsett vann opp til 100 ml, lag deretter passende alikoter og oppbevar dem ved -20 °C.
- For å bedøve den voksne sebrafisken eller medaka tilberedes en 0,02 % (w/v) trikainoppløsning ved å fortynne 0,4 % trikain stamløsning med fiskeanleggsvann.
- Bedøv fisken med 0,02% tricaine løsning; De blir bedøvet når de ikke beveger seg eller reagerer på berøring (1-2 min).
- Plasser den bedøvede fisken på et Styrofoam-brett (se materialfortegnelse) og fest fisken oppreist mellom to 30 G nåler satt vertikalt inn i Styrofoam.
- Hold fiskekroppen for å forhindre at fiskehodet beveger seg og stikk vertikalt en 30 G nål gjennom skallen inn i medialområdet på en av de optiske tektumhalvkulene (figur 1A, B). Innsettingsdybden er ~0,75 mm, nesten lik halvparten av lengden på 30 G skråkant. Denne innsettingsdybden induserer hjerneskade på sebrafisk og medaka på grunn av den samme kroppsstørrelsen til disse fiskene.
MERK: Medaka har skalaer på skallen. Skrap og fjern vektene med 30 G nålen for effektivt og nøyaktig å indusere stikksårskaden (figur 1C). - Overfør den skadde fisken til et akvarium med ferskvann, og flytt tanken til fiskeavlssystemet når de er fullstendig gjenopprettet fra anestesien.
MERK: Fisken vil komme seg og begynne å bevege seg fritt i løpet av få minutter. - For avstamningsanalyse etter skaden, tilbered ferskt fiskeanleggsvann som inneholder 5 mM bromodeoksyuridin (BrdU) (se materialtabell) og inkuber deretter fisken med denne 5 mM BrdU-løsningen i en forhåndsbestemt tidsperiode13,19 (som bestemt av et eksperimentelt design). Dissekere deretter disse fiskene i henhold til trinn 2 og evaluere BrdU-innlemmelse og celleavstamningsidentitet etter behov.
MERK: Dette trinnet er et valgfritt trinn for analyse av celleavstamning. For å oppdage BrdU-signaler, utfør antigenhenting som vist i trinn 4.3.
2. Hjerne disseksjon
- Klargjør 0,02 % trikainoppløsning, et isoporbrett for disseksjon og en 10 ml sprøyte inneholdende fosfatbufret saltvann (1x PBS) med forlengelsesrør og 30 G nåler (se materialfortegnelse) for intrakardial perfusjon.
- Bedøv den skadde fisken på utvalgte tidspunkter.
- Legg papirhåndklær på Styrofoam-brettet og legg den bedøvede fisken på papirhåndklærne.
- Hold fiskekroppen på plass ved å sette inn to 30 G nåler vertikalt på hver side av gattfinnen (figur 2A).
- Lag et ventralt snitt fra endetarmsåpning til hjerte (figur 2B) og hold hjertet synlig ved å sette inn ytterligere to 30 G nåler på hver side av dette organet (figur 2C).
MERK: Hjertet er dekket av det sølvfargede epitellaget av hypodermis i både sebrafisk og medaka (figur 2C). - Fjern sølvepitellaget forsiktig med tuppen av tangen (figur 2D).
- Sett 30 G nålen inn i ventrikkelen, hold skråningen oppe, og gjør et snitt i atriet ved hjelp av tangen (figur 2E). Trykk forsiktig ned sprøyten for å presse 1x PBS og bekreft at atriumet skyllet blodet.
MERK: For å forhindre at nålen trenger inn i ventrikkelen, stikk kanylen forsiktig inn i dybden av den halve skråningen og juster deretter innsettingsdybden. Hvis perfusjonen er godt utført, blir gjellene hvite (figur 2F,G). - Stopp perfusjonen etter at blodet er drenert og gjellene blir hvite.
- Fjern nålene som fester fiskekroppen på plass og fest fisken ventralt med ventralsiden ned (figur 2H). Klipp ryggmargen og fjern skallen fra optikum og telencephalon (figur 2I). Deretter kutter du optiske nerver og dissekerer hjernen nøye.
MERK: Se opp for optiske nerver under disseksjon fordi nerver er koblet til tektum. Når optisk nerve trekkes, kan optisk tektum løsnes fra hjernen. Hvis blodfjerningen ikke er fullført, ser hjernen lys rosa ut (høyre hjernehalvdel i figur 2J). - Overfør hjernen til 1,5 ml rør med 1 ml 4 % paraformaldehyd i 1x PBS og fikser dem over natten ved 4 °C.
3. Klargjøring av frosne seksjoner
- Vask de faste hjernene tre ganger i 1x PBS i 5 min hver.
- For å kryobeskytte hjernen, overfør dem til 1,5 ml rør med 1 ml 30 % (w/v) sukrose i 1x PBS og inkuber dem over natten ved 4 °C. Forbered innebyggingsforbindelsen (2:1 blanding av OCT-forbindelse og 30 % sukrose, se materialtabell) ved å kombinere 30 ml OCT og 15 ml 30 % sukrose. Oppbevares ved 4 °C.
MERK: For å fjerne boblene fra den blandede forbindelsen, sentrifuge 50 ml rørene ved 10.000 x g i 2 minutter ved romtemperatur eller plasser rørene stående over natten. - Inkuber en aluminiumsblokk over natten ved -80 °C for å avkjøle kryomolden (se materialfortegnelse) umiddelbart etter at den dissekerte hjernen er innebygd i kryomolden med innebyggingsforbindelsen.
MERK: Flytende nitrogen kan også brukes til å avkjøle aluminiumsblokken. I så fall bør aluminiumsblokken plasseres i en Styrofoam-boks fylt med nok flytende nitrogen til å dekke aluminiumsblokken like før innebygging. Etter å ha bekreftet sublimeringen av flytende nitrogen, plasser kryomold på den forkjølte aluminiumsblokken. Det er bedre å bekrefte hvor mange kryomolder som kan plasseres på aluminiumblokken samtidig. Det anbefales å bruke flytende nitrogen eller en ekstra forkjølt blokk for å sikre nok plass til å avkjøle alle prøvene raskt. - Sett den forkjølte aluminiumsblokken i en Styrofoam-boks. Bruk en Styrofoam-boks med lokk for å forhindre at aluminiumsblokken varmes opp.
- For koronale snitt, legg hjernen inn i en kryomold og juster retningen ved hjelp av tang under mikroskopet (figur 3A).
- Plasser kryomolden på den forkjølte aluminiumsblokken i isoporboksen og la OCT-forbindelsen fryse (figur 3B). Når OCT-forbindelsen begynner å fryse, blir den hvit.
- Påfør en liten sirkel av OCT-forbindelse på en prøveplate, og monter kryoblokken for å feste kryoblokken til prøveskiven.
- Plasser prøveskiven i kryostaten, og frys OCT-forbindelsen helt.
- Plasser prøveskiven på prøvehodet i kryostaten.
- Still inn retningen til kryoblokken og trim OCT for å fjerne eventuelle ekstra regioner.
MERK: Juster retningen på skjæringsplanet mens telencephalon skjæres. Bladet er utstyrt med en kryostat. Det er mulig å justere orienteringen til skjæreplanet ved å endre vinkelen på prøvehodet. - Skjær 14 μm tykke serielle seksjoner gjennom hele optisk tektum ved hjelp av en kryostat. Lagre lysbildene ved -25 °C.
MERK: Langtidslagring bør være ved -80 °C.
4. Fluorescerende immunfarging
- Tørk glassglass i et lysbildestativ i 30 min ved romtemperatur (RT). Vask lysbilder i 1x PBS i 30 min på RT. Hvis immunfarging med antistoffer mot PCNA eller BrdU skal utføres, gå videre til trinn 4.2 eller trinn 4.3.
- Forbered 500 ml 10 mM natriumsitrat i et 500 ml beger og varm sitratbufferen til 85 °C på en magnetomrører, legg deretter lysbildene i et lysbildefargestativ og inkuber stativet i citratbufferen ved 85 °C i 30 minutter. For å unngå koking, hold temperaturen rundt 85 °C. Etter antigenuthenting vasker du lysbildene tre ganger i 0,1 % Triton i 1x PBS (PBSTr), og hver vask tar 5 min ved RT.
MERK: Dette trinnet er et valgfritt trinn for proliferering av PCNA-henting (Cell Nuclear Antigen). - Klargjør en 2 N HCl-løsning ved å fortynne 12 N HCl i destillert vann. Bruk en væskeblokker (se materialfortegnelse), tegn en linje som en hydrofob barriere for å holde 2 N HCl-løsningen rundt seksjonene.
- Plasser lysbildene på immunfargingsbrett og påfør 200-300 μL av 2N HCl-løsningen. Inkuber brettene ved 37 °C i 30 minutter. Etter antigenuthenting, vask tre ganger i 0,1 % PBSTr med hver vask som tar 5 min ved RT.
MERK: Dette trinnet er et valgfritt trinn for henting av BrdU-antigen.
- Plasser lysbildene på immunfargingsbrett og påfør 200-300 μL av 2N HCl-løsningen. Inkuber brettene ved 37 °C i 30 minutter. Etter antigenuthenting, vask tre ganger i 0,1 % PBSTr med hver vask som tar 5 min ved RT.
- Absorber og fjern den gjenværende løsningen ved hjelp av papirhåndklær. Bruk deretter en væskeblokker til å tegne en hydrofob barriere for å holde antistoffløsningen rundt seksjonene etter behov.
- Plasser lysbildene på brett og påfør 200-300 μL blokkeringsløsning, 3% (v / v) hesteserum i PBSTr) til hvert lysbilde, og inkuber lysbildene i 1 time ved RT.
- Vask seksjonene med PBSTr i 5 min ved RT og gjenta tre ganger.
- Forbered de primære antistoffene (se materialtabellen) ved hjelp av blokkeringsløsningen (200-300 μL antistoffoppløsning for hvert lysbilde). Fjern den gjenværende PBSTr med papirhåndklær og legg lysbildene på immunfargingsbrettene. Påfør den primære antistoffoppløsningen på hvert lysbilde og inkuber brettene over natten ved 4 °C.
- Vask seksjonene med PBSTr i 5 min ved RT og gjenta tre ganger.
- Klargjør fluorescerende sekundær antistoffoppløsning (se materialtabell) ved bruk av blokkeringsbufferen (1:500). Fjern den gjenværende PBSTr med papirhåndklær og legg lysbildene på immunfargingsbrettene. Påfør den sekundære antistoffløsningen på hvert lysbilde og skyggebrett med aluminiumsfolie. Inkubere i 1-2 timer ved RT.
- Vask seksjonene med PBSTr i 5 min ved RT tre ganger uten å utsette dem for lys.
- Forbered Hoechst-løsning (1:500 fortynning i 1x PBS, se materialtabell) for kjernefysisk farging. Fjern den gjenværende PBSTr med papirhåndklær og legg lysbildene på immunfargingsbrettene. Påfør Hoechst-løsningen på hvert lysbilde og dekk skuffene med aluminiumsfolie. Inkuber i 30 min ved RT.
- Vask seksjonene med 1x PBS i 10 min ved RT uten å utsette dem for lys.
- Absorber og fjern de resterende 1x PBS ved hjelp av papirhåndklær og monter seksjonene på lysbilder ved hjelp av et vannløselig monteringsmedium (se Materialfortegnelse) for fluorescerende immunfarging. Sett sakte et deksel på 24 x 45 mm på seksjonene. Oppbevares ved 4 °C, uten å utsette lysbildene for lys.
- Observer og avbilde seksjonene under fluorescerende mikroskopi eller konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stikksårskade i optisk tektum ved hjelp av nålstikk i høyre hemisfære (figur 1, figur 4A og figur 5A) induserer ulike cellulære responser, inkludert radial gliacelleproliferasjon (RGC) og generering av nyfødte nevroner. På samme måte ble eldre populasjoner av sebrafisk og medaka brukt til å motvirke eventuelle aldringseffekter i den regenerative responsen. Deretter ble fluorescerende immunfarging utført på de frosne seksjonene, og RGC-proliferasjon og differensiering ble analysert etter tektumskaden i sebrafisk og medaka (figur 4-5)13.
Antistoffer mot en prolifererende cellemarkør ble brukt, prolifererende celleantigen (PCNA), og en RGC-markør, hjernelipidbindende protein (BLBP), tilgjengelig i sebrafisk og medaka for å evaluere RGC-proliferasjonen i disse vevene13,19. Som tidligere beskrevet var de fleste RGC hvilende (PCNA-negative) på den kontralaterale uskadde hemisfæren (figur 4B)13. Likevel ble RGC-proliferasjon indusert 2 dager etter skade (dpi) i medaka tektum (figur 4C,D)13. Induksjon av RGC-spredning etter skaden er et vanlig trekk ved både sebrafisk og medaka regenerativ respons13,19.
BrdU-merking er en enkel metode som brukes til å evaluere celleavstamning og analysere RGC-differensiering etter hjerneskade (figur 5A) 13. Immunfarging med antistoffer mot en pannevronal markør, HuC, og BrdU ble tidligere brukt til å sammenligne RGC-differensiering i skadet tektum hos sebrafisk og medaka (figur 5B,C)13. Dersom disse antistoffene er tilgjengelige hos målartene, kan komparative analyser utføres.
Hvis skaden er adekvat indusert, ligger skadestedet i det sentral-dorsale området i optikumtektumet (figur 4C). Nukleær farging og hematoksylin- og eosinfarging kan da brukes til å bekrefte skadestedet 13,19,20,21,22,23,24,25. Etter skaden kan man observere en forstyrret periventrikulær gråsone med nukleær farging (figur 4C). Hvis skaden er lokalisert i mediale dorsale regionen, er RGC-proliferasjonen ikke signifikant økt25.
Figur 1 Stikksårskade i voksen optikumtektum med nål. (A) Dorsal visning av en voksen sebrafisk. Sebrafisk holdes oppreist mellom to bøyde nåler satt vertikalt inn i en Styrofoam. (A') Forstørret bilde av boksområdet i (A). 30 G nål settes inn i medialområdet av grensen mellom to hodeskaller kalt os frontale og os parietale på optisk tektum. Den gule sirkelen indikerer skadestedet, og hvite stiplede linjer indikerer de to hodeskallene på optisk tektum. (B) Dorsal utsikt over voksen medaka. (B') Et forstørret bilde av boksområdet i (B). 30 G nål settes inn i grensen på optisk tektum. Den gule sirkelen indikerer skadestedet, og hvite stiplede linjer indikerer to hodeskaller på optisk tektum. (C) Medaka har skjell på skallen. Hodeskalleskalaer skal fjernes før stikksårskaden. Den stiplede linjen indikerer skalaen på optisk tektum. Vektstang: 2 mm i A-B, 1 mm i A', B' og C. Telencephalon (Tel), optisk tektum (OT), os frontale (F) og os parietale (P). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Intrakardial perfusjon hos liten voksen fisk. (A) Ventral visning av en sebrafisk festet på Styrofoam ved hjelp av bøyde nåler klar for intrakardial perfusjon og hjernedisseksjon. (B) Et ventralt snitt er laget fra opprinnelsen til analfinnene til brystet. (C) Hjertet er bak et sølvfarget epitellag kalt hypodermis i både sebrafisk og medaka. En annen fiksering ved hjelp av en bøyd nål ved siden av sølvepitellaget gir lettere tilgang. Den heltrukne hvite linjen indikerer ventrikkelen (V), og den stiplede linjen indikerer hypodermis. (D) Sølvepitellaget fjernes før intrakardial perfusjon av 1x PBS. (VG Nett) Canula settes inn i ventrikkelen for intrakardial perfusjon. Gjeller før (F) og etter (G) den intrakardiale perfusjonen. Hvis blodfjerningen ikke er fullført, forblir gjellene røde. (H-J) Hjernedisseksjon etter PBS-perfusjon for å fjerne blodet fra vevet. Fjern hodeskaller på optisk tektum og telencephalon som vist i (I). Hvis blodfjerningen ikke er fullført, ser hjernen lys rosa ut (høyre hjernehalvdel i (J)). Vektstang: 2 mm i A-C og H, 1 mm i D-G og I-J. Den olfaktoriske pæren (OB), telencephalon (Tel), optisk tektum (OT), bulbus arteriosus (Ba), ventrikkel (V) og atrium (At). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Hjerneinnebygging for frosne seksjoner . (A) Hjernen er innebygd i en kryomold med en innebyggingsforbindelse. Anterior er nede. (B) Cryomolds avkjøles på en forkjølt aluminiumsblokk. Telencephalon (Tel), optisk tektum (OT). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av fluorescerende immunfarging mot RGC-proliferasjon etter tektumskade i voksen medaka . (A) Skjematisk fremstilling av stikksårskaden på høyre hemisfære av optikumtektum og koronalsnitt. (B-C) Representative resultater av proliferative RGC (PCNA + BLBP + celler) på kontralateral uskadd (B) og skadet (C) side 2 dager etter skade. Hvit pilspiss i C' indikerer en forstyrret periventrikulær gråsone på grunn av stikksårskaden. (D) Forstørrede bilder av det boksede området i (C). Hvite pilspisser i (D) indikerer PCNA + BLBP + celler. Skala bar: 50 μm i B-D. Tilpasset med tillatelse fra referanse13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative resultater av fluorescerende immunfarging for generering av nyfødte nevroner etter tektumskade . (A) Skjematisk fremstilling av behandling med bromodeoksyuridin (BrdU) og stikksårskaden i optikustektum og koronalsnitt. (B-C) Representative resultater av nyfødte nevroner (BrdU + HuC + celler) 7 dager etter skade hos den skadede sebrafisken (B) og medaka (C). Skala bar: 50 μm i B-C. Tilpasset med tillatelse fra referanse13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives et sett med metoder som kan brukes til å indusere stikksårskader i optisk tektum ved hjelp av en nål for å lette evalueringen av RGC-proliferasjon og differensiering etter hjerneskade. Nålmedierte stikksår er en enkel, effektivt implementert metode som kan brukes på mange eksperimentelle prøver ved hjelp av et standard sett med verktøy. Stikksårskademodeller for flere regioner i sebrafiskhjernen er utviklet 3,19,29. Den optiske tektum er en av de største delene av hjernen og er lett å manipulere. Videre er de fleste RGC i optisk tektum hvilende under fysiologiske forhold sammenlignet med telencephalon, noe som gjør det lettere å observere RGC-proliferasjon og differensiering avhengig av skaden 3,19.
Et av de kritiske trinnene og begrensningene ved stikksårskader er manuell nålinnsetting; En konsistent skade er nødvendig for å skape reproduserbare resultater og legge til rette for komparativ analyse. Den nøyaktige plasseringen og dybden av innsetting er avgjørende og bidrar til å skape reproduserbare skader i eksperimenter. Dette papiret gir klare retningslinjer for å gjøre lignende skader hver gang. Videre er spredning av RGC etter skaden avgjørende for nevrogenesen til det skadede tektumet. I skadet sebrafisk og medaka øker RGC-spredning ved 1 dpi og går tilbake til basale nivåer, det samme som i den kontralaterale uskadde halvkule, ved 7 dpi13,19.
Stikksårskade er en av de mekaniske skademetodene som induserer uspesifikk celleablasjon. I motsetning til dette har transgene tilnærminger til cellespesifikk ablasjon som nitroreduktase / metronidazolsystem også blitt utviklet30,31,32. Disse ablasjonsmodellene bør velges ut fra det eksperimentelle formålet. Ikke-spesifikk ablasjon er egnet for hjerneskader som stikksår og iskemisk slag. I motsetning til dette kan cellespesifikk ablasjon være mer hensiktsmessig for å evaluere degenerasjonen av spesifikke celler assosiert med nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons sykdom.
Nylig har iskemiske skademodeller ved hjelp av sebrafisk blitt utviklet33, men disse modellene trenger transgene linjer og fluorescerende mikroskopi for å overvåke blodstrømmen. Derfor er disse modellene utfordrende å anvende på arter med dårlige genetiske tilnærminger, og gjennomstrømningen er lavere enn stikksårskademodellen.
Som nevnt ovenfor er stikksårskade i optisk tektum enkel og lett påføres i andre små fiskemodeller som afrikansk killifish og mummichog med vanlige verktøy26. Videre er komparative analyser mellom arter godt undersøkt ved hjelp av sekvenseringsteknologi. Derfor er denne enkle metoden fortsatt viktig når man studerer den regenerative kapasiteten til NSC hos sebrafisk ved hjelp av komparativ analyse av cellulære responser og genuttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 og 21K15195 og et internt tilskudd fra AIST, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , University of Oregon Press. (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
