Summary
En mekanisk hjerneskademodel i de voksne zebrafisk beskrives for at undersøge de molekylære mekanismer, der regulerer deres høje regenerative kapacitet. Metoden forklarer at skabe en stiksårskade i det optiske tektum hos flere arter af små fisk for at evaluere de regenerative reaktioner ved hjælp af fluorescerende immunfarvning.
Abstract
Mens zebrafisk har en overlegen kapacitet til at regenerere deres centralnervesystem (CNS), har medaka en lavere CNS regenerativ kapacitet. En hjerneskademodel blev udviklet i det voksne optiske tektum hos zebrafisk og medaka, og komparative histologiske og molekylære analyser blev udført for at belyse de molekylære mekanismer, der regulerer vævets høje regenerative kapacitet på tværs af disse fiskearter. Her præsenteres en stiksårskademodel for det voksne optiske tektum ved hjælp af en nål og histologiske analyser for spredning og differentiering af de neurale stamceller (NSC'er). En nål blev manuelt indsat i det centrale område af det optiske tectum, og derefter blev fisken intrakardialt perfuseret, og deres hjerner blev dissekeret. Disse væv blev derefter kryosektioneret og evalueret ved hjælp af immunfarvning mod de relevante NSC-proliferations- og differentieringsmarkører. Denne tectum-skademodel giver robuste og reproducerbare resultater i både zebrafisk og medaka, hvilket gør det muligt at sammenligne NSC-responser efter skade. Denne metode er tilgængelig for små teleoster, herunder zebrafisk, medaka og afrikansk killifish, og gør det muligt for os at sammenligne deres regenerative kapacitet og undersøge unikke molekylære mekanismer.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) har en øget evne til at regenerere deres centralnervesystem (CNS) sammenlignet med andre pattedyr 1,2,3. For nylig, for bedre at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for denne øgede regenerative kapacitet, er komparative analyser af vævsregenerering ved hjælp af næste generations sekventeringsteknologi blevet udført 4,5,6. Hjernestrukturerne hos zebrafisk og tetrapoder er helt forskellige 7,8,9. Det betyder, at flere hjerneskademodeller ved hjælp af små fisk med lignende hjernestrukturer og biologiske træk er blevet udviklet for at lette undersøgelsen af de underliggende molekylære mekanismer, der bidrager til denne øgede regenerative kapacitet.
Derudover er medaka (Oryzias latipes) et populært forsøgsdyr med en lav kapacitet til hjerte- og neuronal regenerering10,11,12,13 sammenlignet med zebrafisk. Zebrafisk og medaka har lignende hjernestrukturer og nicher til voksne neurale stamceller (NSC'er)14,15,16,17. I zebrafisk og medaka omfatter det optiske tectum to typer NSC'er, neuroepitellignende stamceller og radiale gliaceller (RGC'er)15,18. Der er tidligere udviklet en stiksårskade for det optiske tektum hos voksne zebrafisk, og denne model blev brugt til at undersøge de molekylære mekanismer, der regulerer hjernens regenerering hos disse dyr 19,20,21,22,23. Denne unge voksne zebrafisk stiksårsskademodel inducerede regenerativ neurogenese fra RGC'er 19,24,25. Denne stiksårskade i det optiske tektum er en robust og reproducerbar metode 13,19,20,21,22,23,24,25. Da den samme skademodel blev anvendt på voksen medaka, blev RGC'ernes lave neurogene kapacitet i medaka optisk tectum afsløret via den komparative analyse af RGC-proliferation og differentiering efter skade13.
Der er også udviklet modeller for stiksårsskader i det optiske tektum i mummichog-modeller26, men detaljer om tectum-skaden er ikke veldokumenterede sammenlignet med telencephalicskade27. Stiksårskaden i det optiske tektum ved hjælp af zebrafisk og medaka muliggør undersøgelse af differentialcellulære reaktioner og genekspression mellem arter med differentiel regenerativ kapacitet. Denne protokol beskriver, hvordan man udfører en stiksårskade i det optiske tektum ved hjælp af en injektionsnål. Denne metode kan anvendes på små fisk som zebrafisk og medaka. Processerne til prøveforberedelse til histologisk analyse og cellulær proliferation og differentieringsanalyse ved anvendelse af fluorescerende immunhistokemi og kryosektioner forklares her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Zebrafisk og medaka blev vedligeholdt i henhold til standardprocedurer28.
1. Stiksårskade i voksenoptisk tektum
- Forbered en 0,4% (w / v) tricainstamopløsning til anæstesi. For en 100 ml stamopløsning opløses 400 mg tricainmethansulfonat (se materialetabel) i 90 ml destilleret vand og pH-værdien justeres til 7,0 ved hjælp af 1 M Tris HCl-buffer (pH 9,0). Når pH-værdien er justeret, tilsættes vand op til 100 ml, derefter laves passende alikvoter, og de opbevares ved -20 °C.
- For at bedøve den voksne zebrafisk eller medaka fremstilles en 0,02 % (w/v) tricainopløsning ved at fortynde 0,4 % tricainstamopløsningen med vand fra fiskeanlægget.
- Bedøv fisken med 0,02% tricainopløsning; De bliver bedøvet, når de ikke bevæger sig eller reagerer på berøring (1-2 min).
- Placer den bedøvede fisk på en isoporbakke (se materialetabel), og fastgør fisken lodret mellem to 30 G nåle, der indsættes lodret i isopor.
- Hold fiskekroppen for at forhindre fiskehovedet i at bevæge sig, og stik lodret en 30 G nål gennem kraniet ind i det mediale område af en af de optiske tectum-halvkugler (figur 1A, B). Indføringsdybden er ~0,75 mm, næsten lig med halvdelen af længden af 30 G-skråningen. Denne indsættelsesdybde inducerer hjerneskade på zebrafisk og medaka på grund af den lignende kropsstørrelse af disse fisk.
BEMÆRK: Medaka har skalaer på kraniet. Skællene skrabes og fjernes med 30 G-kanylen for effektivt og præcist at fremkalde stiksårskaden (figur 1C). - Overfør de skadede fisk til et akvarium med ferskvandsfacilitetsvand, og flyt tanken til fiskeavlssystemet, når de er kommet sig helt efter bedøvelsen.
BEMÆRK: Fisk vil komme sig og begynde at bevæge sig frit inden for få minutter. - Til afstamningsanalyse efter skaden fremstilles ferskvand i anlægget indeholdende 5 mM bromodeoxyuridin (BrdU) (se materialetabellen) og derefter inkuberes fisken med denne 5 mM BrdU-opløsning i et forudbestemt tidsrum13,19 (bestemt ved et eksperimentelt design). Derefter dissekeres disse fisk i henhold til trin 2, og evaluer BrdU-inkorporering og celleafstamningsidentitet efter behov.
BEMÆRK: Dette trin er et valgfrit trin til analyse af celleafstamning. For at detektere BrdU-signaler skal du udføre antigenhentning som vist i trin 4.3.
2. Hjernedissektion
- Forbered 0,02% tricainopløsning, en isoporbakke til dissektion og en 10 ml sprøjte indeholdende fosfatbufret saltvand (1x PBS) med et forlængerrør og 30 G nåle (se materialetabel) til intrakardial perfusion.
- Bedøv den skadede fisk på udvalgte tidspunkter.
- Læg køkkenrulle på isoporbakken, og læg den bedøvede fisk på køkkenrullet.
- Hold fiskekroppen på plads ved lodret at indsætte to 30 G nåle på hver side af analfinnen (figur 2A).
- Lav et ventralt snit fra anus til hjertet (figur 2B) og hold hjertet synligt ved at indsætte yderligere to 30 G nåle på hver side af dette organ (figur 2C).
BEMÆRK: Hjertet er dækket af det sølvfarvede epitellag af hypodermis hos både zebrafisk og medaka (figur 2C). - Fjern forsigtigt sølvepitellagettet med spidsen af tangen (figur 2D).
- Indsæt 30 G-nålen i ventriklen, hold skråningen opad, og lav et snit i atriumet ved hjælp af tangen (figur 2E). Tryk forsigtigt ned på sprøjten for at skubbe 1x PBS og bekræft, at atriet skyllede blodet.
BEMÆRK: For at forhindre nålen i at trænge ind i ventriklen skal nålen forsigtigt indsættes i dybden af den halve skråning og derefter justere indføringsdybden. Hvis perfusionen er godt udført, bliver gællerne hvide (figur 2F, G). - Stop perfusionen, efter at blodet er drænet, og gællerne bliver hvide.
- Fjern nålene, der fastgør fiskekroppen på plads, og fastgør fiskens ventrale side nedad (figur 2H). Skær rygmarven og fjern kraniet fra optisk tectum og telencephalon (figur 2I). Skær derefter synsnerverne og disseker hjernen omhyggeligt.
BEMÆRK: Pas på synsnerverne under dissektionen, fordi nerverne er forbundet med tectum. Når synsnerven trækkes, kan det optiske tektum løsnes fra hjernen. Hvis blodfjernelsen ikke er færdig, ser hjernen lyserød ud (højre hjernehalvdel i figur 2J). - Overfør hjernen til 1,5 ml rør med 1 ml 4 % paraformaldehyd i 1x PBS og fiks dem natten over ved 4 °C.
3. Forberedelse af frosne sektioner
- Vask de faste hjerner tre gange i 1x PBS i 5 min hver.
- For at kryobeskytte hjernen overføres de til 1,5 ml reagensglas med 1 ml 30 % (w/v) saccharose i 1x PBS og inkuberes natten over ved 4 °C. Indlejringsforbindelsen (2:1 blanding af OCT-forbindelse og 30% saccharose, se materialetabel) fremstilles ved at kombinere 30 ml OCT og 15 ml 30 % saccharose. Opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: For at fjerne boblerne fra den blandede forbindelse centrifugeres 50 ml rørene ved 10.000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur eller placeres rørene lodret natten over. - Der inkuberes en aluminiumsblok natten over ved -80 °C for at afkøle kryomolen (se materialetabellen) umiddelbart efter, at den dissekerede hjerne er indlejret i kryomolen med indlejringsforbindelsen.
BEMÆRK: Flydende nitrogen kan også bruges til at afkøle aluminiumsblokken. I så fald skal aluminiumsblokken placeres i en isoporkasse fyldt med nok flydende nitrogen til at dække aluminiumsblokken lige før indlejring. Efter bekræftelse af sublimeringen af flydende nitrogen anbringes kryomolen på den forkølede aluminiumsblok. Det er bedre at bekræfte, hvor mange kryomolder der kan placeres på aluminiumsblokken på én gang. Det anbefales at bruge flydende nitrogen eller en ekstra forkølet blok for at sikre tilstrækkelig plads til hurtigt at afkøle alle prøver. - Sæt den forkølede aluminiumsblok i en isoporkasse. Brug en isoporkasse med låg for at forhindre, at aluminiumsblokken opvarmes.
- For koronale sektioner skal du integrere hjernen i en cryomold og justere orienteringen ved hjælp af tang under mikroskopet (figur 3A).
- Anbring cryomold på den forkølede aluminiumsblok i isoporboksen, og lad OCT-forbindelsen fryse (figur 3B). Når OCT-forbindelsen begynder at fryse, bliver den hvid.
- Påfør en lille cirkel af OCT-forbindelse på en prøveskive, og monter kryoblokken for at fastgøre kryoblokken til prøveskiven.
- Prøveskiven anbringes i kryostaten og OCT-forbindelsen fryses helt.
- Prøveskiven anbringes på prøvehovedet i kryostaten.
- Indstil kryoblokkens retning, og trim OCT for at fjerne eventuelle ekstra regioner.
BEMÆRK: Juster skæreplanets retning, mens du skærer telencephalon. Bladet er udstyret med en kryostat. Det er muligt at justere skæreplanets retning ved at ændre prøvehovedets vinkel. - Skær 14 μm tykke serielle sektioner gennem hele det optiske tektum ved hjælp af en kryostat. Opbevar objektglassene ved -25 °C.
BEMÆRK: Langtidsopbevaring skal være ved -80 °C.
4. Fluorescerende immunfarvning
- Tørt glas glider i et diasstativ i 30 minutter ved stuetemperatur (RT). Vask rutsjebaner i 1x PBS i 30 min ved RT. Hvis immunfarvning med anti-PCNA- eller BrdU-antistoffer skal udføres, skal du fortsætte til trin 4.2 eller trin 4.3.
- Der fremstilles 500 ml 10 mM natriumcitrat i et 500 ml bægerglas, og citratbufferen opvarmes til 85 °C på en magnetomrører med kogeplade, hvorefter objektglassene anbringes i et diasfarvestativ, og risten inkuberes i citratbufferen ved 85 °C i 30 minutter. For at undgå kogning skal temperaturen holdes omkring 85 °C. Efter antigenudtagning vaskes objektglassene tre gange i 0,1 % Triton i 1x PBS (PBSTr), hvor hver vask tager 5 minutter ved RT.
BEMÆRK: Dette trin er et valgfrit trin til prolifererende hentning af cellekerneantigen (PCNA). - Der fremstilles en 2 N HCl-opløsning ved fortynding af 12 N HCl i destilleret vand. Brug en væskeblokker (se materialetabel) til at tegne en linje som en hydrofob barriere for at holde 2 N HCl-opløsningen omkring sektionerne.
- Anbring objektglassene på immunfarvningsbakker, og påfør 200-300 μL af 2N HCl-opløsningen. Bakkerne inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Efter antigenudtagning vaskes tre gange i 0,1 % PBSTr, hvor hver vask tager 5 minutter ved RT.
BEMÆRK: Dette trin er et valgfrit trin til hentning af BrdU-antigen.
- Anbring objektglassene på immunfarvningsbakker, og påfør 200-300 μL af 2N HCl-opløsningen. Bakkerne inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Efter antigenudtagning vaskes tre gange i 0,1 % PBSTr, hvor hver vask tager 5 minutter ved RT.
- Absorber og fjern den resterende opløsning ved hjælp af køkkenrulle. Brug derefter en væskeblokker til at tegne en hydrofob barriere for at holde antistofopløsningen omkring sektionerne efter behov.
- Anbring objektglassene på bakker og påfør 200-300 μL blokeringsopløsning, 3% (v/v) hesteserum i PBSTr) på hvert objektglas, og inkuber objektglassene i 1 time ved RT.
- Vask sektionerne med PBSTr i 5 min ved RT og gentag tre gange.
- Forbered de primære antistoffer (se materialetabellen) ved hjælp af blokeringsopløsningen (200-300 μL antistofopløsning for hvert dias). Fjern den resterende PBSTr med køkkenrulle og læg diasene på immunfarvningsbakkerne. Påfør den primære antistofopløsning på hvert objektglas og inkuber bakkerne natten over ved 4 °C.
- Vask sektionerne med PBSTr i 5 min ved RT og gentag tre gange.
- Forbered fluorescerende sekundær antistofopløsning (se materialetabel) ved hjælp af blokeringsbufferen (1:500). Fjern den resterende PBSTr med køkkenrulle og læg diasene på immunfarvningsbakkerne. Påfør den sekundære antistofopløsning på hvert dias og skyggebakker med aluminiumsfolie. Inkuber i 1-2 timer ved RT.
- Vask sektionerne med PBSTr i 5 minutter ved RT tre gange uden at udsætte dem for lys.
- Hoechst-opløsningen (1:500 fortynding i 1x PBS, se materialetabellen) fremstilles til kernefarvning. Fjern den resterende PBSTr med køkkenrulle og læg diasene på immunfarvningsbakkerne. Påfør Hoechst-løsningen på hvert dias, og dæk bakkerne med aluminiumsfolie. Inkuber i 30 minutter ved RT.
- Vask sektionerne med 1x PBS i 10 minutter ved RT uden at udsætte dem for lys.
- Absorber og fjern de resterende 1x PBS ved hjælp af køkkenrulle og monter sektionerne på dias ved hjælp af et vandopløseligt monteringsmedium (se materialetabel) til fluorescerende immunfarvning. Sæt langsomt et 24 x 45 mm dæksel på sektionerne. Opbevares ved 4 °C uden at udsætte objektglassene for lys.
- Observer og billede sektionerne under fluorescerende mikroskopi eller konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stiksårskade i det optiske tektum ved hjælp af nåleindsættelse i højre halvkugle (figur 1, figur 4A og figur 5A) inducerer forskellige cellulære reaktioner, herunder proliferation af radial gliacelle (RGC) og generering af nyfødte neuroner. På samme måde blev ældre populationer af zebrafisk og medaka brugt til at modvirke eventuelle aldringseffekter i det regenerative respons. Derefter blev fluorescerende immunfarvning udført på de frosne sektioner, og RGC-proliferation og differentiering blev analyseret efter tectum-skaden i zebrafisk og medaka (figur 4-5)13.
Antistoffer mod en prolifererende cellemarkør blev anvendt, prolifererende celleantigen (PCNA) og en RGC-markør, hjernelipidbindende protein (BLBP), tilgængelig i zebrafisk og medaka til evaluering af RGC-proliferation i disse væv13,19. Som tidligere beskrevet var de fleste RGC'er hvilende (PCNA-negative) på den kontralaterale uskadte halvkugle (figur 4B)13. Alligevel blev RGC-proliferation induceret 2 dage efter skade (dpi) i medaka tectum (figur 4C, D)13. Induktion af RGC-spredning efter skaden er et fælles træk ved både zebrafiskens og medaka regenerative reaktioner13,19.
BrdU-mærkning er en simpel metode, der bruges til at evaluere celleafstamning og analysere RGC-differentiering efter hjerneskade (figur 5A)13. Immunfarvning med antistoffer til en panneuronal markør, HuC og BrdU blev tidligere brugt til at sammenligne RGC-differentiering i det skadede tektum hos zebrafisk og medaka (figur 5B, C)13. Hvis disse antistoffer er tilgængelige i målarterne, kan der udføres sammenlignende analyser.
Hvis skaden er hensigtsmæssigt fremkaldt, er skadestedet placeret i det centrale dorsale område i det optiske tektum (figur 4C). Nuklear farvning og hæmatoxylin og eosinfarvning kan derefter bruges til at bekræfte skadestedet 13,19,20,21,22,23,24,25. Efter skaden kan der observeres en forstyrret periventrikulær gråzone med nuklear farvning (figur 4C). Hvis skaden er placeret i den mediale dorsale region, øges RGC-proliferation ikke signifikant25.
Figur 1: Stiksårskade i voksen optisk tectum ved hjælp af en nål . (A) Rygbillede af en voksen zebrafisk. Zebrafisk holdes oprejst mellem to bøjede nåle indsat lodret i en isopor. (A') Forstørret billede af det indrammede område i (A). 30 G nål indsættes i det mediale område af grænsen mellem to kranier kaldet os frontale og os parietale på det optiske tectum. Den gule cirkel angiver skadestedet, og hvide stiplede linjer angiver de to kranier på det optiske tectum. (B) Dorsal udsigt over voksen medaka. (B') Et forstørret billede af det indrammede område i (B). 30 G nål indsættes i grænsen på det optiske tektum. Den gule cirkel angiver skadestedet, og hvide stiplede linjer angiver to kranier på det optiske tektum. (C) Medaka har skæl på kraniet. Kranieskæl skal fjernes inden stiksårskaden. Den stiplede linje angiver skalaen på det optiske tektum. Vægtstang: 2 mm i A-B, 1 mm i A', B' og C. Telencephalon (Tel), optisk tectum (OT), os frontale (F) og os parietale (P). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Intrakardiel perfusion hos små voksne fisk . (A) Ventral visning af en zebrafisk fastgjort på isopor ved hjælp af bøjede nåle klar til intrakardial perfusion og hjernedissektion. (B) Et ventralt snit er lavet fra oprindelsen af analfinnerne til brystet. (C) Hjertet er bag et sølvfarvet epitellag kaldet hypodermis i både zebrafisk og medaka. En anden fiksering ved hjælp af en bøjet nål ved siden af sølvepitellaget giver lettere adgang. Den faste hvide linje angiver ventriklen (V), og den stiplede linje angiver hypodermis. (D) Sølvepitellaget fjernes før intrakardial perfusion af 1x PBS. (E-G) Canula indsættes i ventriklen til intrakardial perfusion. Gæller før (F) og efter (G) den intrakardiale perfusion. Hvis blodfjernelsen ikke er fuldstændig, forbliver gællerne røde. (H-J) Hjernedissektion efter PBS-perfusion for at fjerne blodet fra vævene. Fjern kranier på optisk tectum og telencephalon som vist i (I). Hvis blodfjernelsen ikke er færdig, ser hjernen lyserød ud (højre hjernehalvdel i (J)). Vægtstang: 2 mm i A-C og H, 1 mm i D-G og I-J. Den olfaktoriske pære (OB), telencephalon (Tel), optisk tectum (OT), bulbus arteriosus (Ba), ventrikel (V) og atrium (At). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Indlejring af hjernen for frosne sektioner . (A) Hjernen er indlejret i en kryomol med en indlejringsforbindelse. Anterior er nede. (B) Kryomolder afkøles på en forkølet aluminiumsblok. Telencephalon (Tel), optisk tectum (OT). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater af fluorescerende immunfarvning mod RGC-proliferation efter tectumskade hos voksen medaka . (A) Skematisk billede af stiksårskaden på højre halvkugle af det optiske tektum og koronale afsnit. (B-C) Repræsentative resultater af proliferative RGC'er (PCNA + BLBP + celler) i den kontralaterale uskadte (B) og skadede (C) side 2 dage efter skaden. Hvid pilespids i C' angiver en forstyrret periventrikulær gråzone ved stiksårskaden. (D) Forstørrede billeder af det indrammede område i (C). Hvide pilespidser i (D) angiver PCNA + BLBP + celler. Skalabjælke: 50 μm i B-D. Tilpasset med tilladelse fra reference13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative resultater af fluorescerende immunfarvning til generering af nyfødte neuroner efter tectumskade . (A) Skematisk billede af bromodeoxyuridinbehandling (BrdU) og stiksårskaden i optisk tectum og koronalafsnit. (B-C) Repræsentative resultater af nyfødte neuroner (BrdU + HuC + celler) 7 dage efter skade hos den skadede zebrafisk (B) og medaka (C). Skalabjælke: 50 μm i B-C. Tilpasset med tilladelse fra reference13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives et sæt metoder, som kan bruges til at fremkalde stiksårskader i det optiske tektum ved hjælp af en nål for at lette evalueringen af RGC-spredning og differentiering efter hjerneskade. Nålemedierede stiksår er en enkel, effektivt implementeret metode, der kan anvendes på mange eksperimentelle prøver ved hjælp af et standard sæt værktøjer. Derer udviklet modeller for stiksårskader for flere områder af zebrafiskens hjerne 3,19,29. Det optiske tektum er en af de største dele af hjernen og er let at manipulere. Desuden er de fleste RGC'er i det optiske tektum hvilende under fysiologiske forhold sammenlignet med telencephalon, hvilket gør det lettere at observere RGC-spredning og differentiering afhængigt af skaden 3,19.
Et af de kritiske trin og begrænsninger i stiksårskader er manuel nålindsættelse; En konsekvent skade er nødvendig for at skabe reproducerbare resultater og lette sammenlignende analyser. Den præcise placering og dybde af indsættelsen er afgørende og hjælper med at skabe reproducerbare skader i forsøg. Dette papir giver klare retningslinjer for at gøre lignende skader hver gang. Desuden er spredning af RGC efter skaden afgørende for neurogenesen af det skadede tectum. Hos skadede zebrafisk og medaka øges RGC-spredningen ved 1 dpi og vender tilbage til basale niveauer, det samme som i den kontralaterale uskadede halvkugle, ved 7 dpi13,19.
Stiksårskade er en af de mekaniske skademetoder, der inducerer ikke-specifik celleablation. I modsætning hertil er transgene tilgange til cellespecifik ablation såsom nitroreduktase / metronidazolsystem også blevet udviklet30,31,32. Disse ablationsmodeller bør vælges ud fra det eksperimentelle formål. Ikke-specifik ablation er velegnet til hjerneskade såsom stiksår og iskæmisk slagtilfælde. I modsætning hertil kan cellespecifik ablation være mere passende til evaluering af degeneration af specifikke celler forbundet med neurodegenerative sygdomme såsom Parkinsons sygdom.
For nylig er iskæmiske skademodeller ved hjælp af zebrafisk blevet udviklet33, men disse modeller har brug for transgene linjer og fluorescerende mikroskopi for at overvåge blodgennemstrømningen. Derfor er disse modeller udfordrende at anvende på arter med dårlige genetiske tilgange, og deres gennemstrømning er lavere end modellen for stiksårskader.
Som nævnt ovenfor er stiksårskader i det optiske tektum enkle og let anvendelige i andre små fiskemodeller som afrikansk killifish og mummichog med fælles værktøjer26. Desuden er komparativ analyse mellem arter blevet grundigt undersøgt ved hjælp af sekventeringsteknologi. Derfor forbliver denne enkle metode afgørende, når man studerer NSC'ernes regenerative kapacitet hos zebrafisk ved hjælp af komparativ analyse af cellulære reaktioner og genekspression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI bevillingsnummer 18K14824 og 21K15195 og en intern bevilling fra AIST, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , University of Oregon Press. (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
