Summary
מודל מכני של פגיעה מוחית בדגי זברה בוגרים מתואר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהם. השיטה מסבירה יצירת פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של מינים רבים של דגים קטנים כדי להעריך את התגובות הרגנרטיביות באמצעות אימונוסטיישן פלואורסצנטי.
Abstract
בעוד שלדגי זברה יש יכולת מעולה לחדש את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS), למדאקה יש יכולת התחדשות CNS נמוכה יותר. מודל של פגיעה מוחית פותח בטקטום האופטי הבוגר של דגי זברה ומדאקה ובוצעו ניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים השוואתיים כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה של רקמה זו על פני מיני דגים אלה. כאן מוצג מודל פגיעה בפצע דקירה עבור טקטום אופטי בוגר באמצעות מחט וניתוחים היסטולוגיים להתרבות והתמיינות של תאי גזע עצביים (NSCs). מחט הוחדרה ידנית לאזור המרכזי של הטקטום האופטי, ואז הדגים היו מחוררים תוך לב, ומוחם נותח. רקמות אלה הוקפאו והוערכו באמצעות אימונוסטיין כנגד סמני ההתפשטות וההתמיינות המתאימים של NSC. מודל פגיעות טקטום זה מספק תוצאות חזקות וניתנות לשחזור הן בדגי זברה והן במדאקה, ומאפשר להשוות את תגובות המל"ל לאחר פציעה. שיטה זו זמינה לטלאוסטים קטנים, כולל דגי זברה, מדאקה וקיליפיש אפריקאי, ומאפשרת לנו להשוות את יכולת ההתחדשות שלהם ולחקור מנגנונים מולקולריים ייחודיים.
Introduction
לדגי זברה (Danio rerio) יש יכולת מוגברת לחדש את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS) בהשוואה ליונקים אחרים 1,2,3. לאחרונה, כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס יכולת התחדשות מוגברת זו, בוצעו ניתוחים השוואתיים של התחדשות רקמות באמצעות טכנולוגיית ריצוף הדור הבא 4,5,6. מבני המוח בדגי זברה וטטרפודים שונים למדי 7,8,9. משמעות הדבר היא שמספר מודלים של פגיעות מוחיות המשתמשים בדגים קטנים עם מבני מוח דומים ומאפיינים ביולוגיים דומים פותחו כדי להקל על חקירת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים התורמים ליכולת התחדשות מוגברת זו.
בנוסף, מדאקה (Oryzias latipes) היא חיית מעבדה פופולרית עם יכולת נמוכה להתחדשות לב ועצב10,11,12,13 בהשוואה לדגי זברה. לדגי זברה ולמדקה יש מבני מוח ונישות דומים עבור תאי גזע עצביים בוגרים (NSCs)14,15,16,17. בדגי זברה ובמדאקה, הטקטום האופטי כולל שני סוגים של תאי גזע גזעיים דמויי נוירואפיתל ותאי גליה רדיאליים (RGCs)15,18. בעבר פותחה פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של דגי זברה בוגרים, ומודל זה שימש לחקר המנגנונים המולקולריים המווסתים את התחדשות המוח בבעלי חיים אלה 19,20,21,22,23. מודל פציעת פצע דקירה של דג זברה בוגר צעיר זה גרם לנוירוגנזה רגנרטיבית מ-RGCs 19,24,25. פציעת פצע דקירה זו בטקטום האופטי היא שיטה חזקה וניתנת לשחזור 13,19,20,21,22,23,24,25. כאשר אותו מודל פציעה יושם על מדאקה בוגרת, היכולת הנוירוגנית הנמוכה של RGCs בטקטום האופטי של מדאקה התגלתה באמצעות ניתוח השוואתי של התפשטות והתמיינות RGC לאחר פציעה13.
מודלים של פגיעות פצע דקירה בטקטום האופטי פותחו גם במודלים של מומיצ'וג26, אך פרטים על פגיעת הטקטום לא תועדו היטב בהשוואה לפגיעה טלנצפלית27. פציעת פצע הדקירה בטקטום האופטי באמצעות דגי זברה ומדאקה מאפשרת לחקור את התגובות התאיות הדיפרנציאליות ואת ביטוי הגנים בין מינים בעלי יכולת התחדשות דיפרנציאלית. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע פגיעה בפצע דקירה בטקטום האופטי באמצעות מחט הזרקה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על דגים קטנים כמו דגי זברה ו medaka. התהליכים להכנת דגימות לניתוח היסטולוגי וניתוח התפשטות והתמיינות תאים באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית והקפאה מוסברים כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במכון הלאומי למדע וטכנולוגיה תעשייתיים מתקדמים. דגי זברה ומדאקה נשמרו על פי נהלים סטנדרטיים28.
1. פצע דקירה בטקטום האופטי למבוגרים
- הכינו תמיסת מלאי טריקאין של 0.4% (w/v) להרדמה. לקבלת תמיסת מלאי של 100 מ"ל, יש להמיס 400 מ"ג טריקאין מתאן-סולפונט (ראו טבלת חומרים) ב-90 מ"ל מים מזוקקים ולהתאים את רמת החומציות ל-7.0 באמצעות חיץ Tris HCl של 1 M (pH 9.0). לאחר התאמת ה- pH, הוסף מים עד 100 מ"ל, ולאחר מכן בצע aliquots המתאימים ולאחסן אותם ב -20 °C.
- כדי להרדים את דגי הזברה הבוגרים או המדאקה, הכינו תמיסת טריקאין 0.02% (w/v) על ידי דילול תמיסת מלאי הטריקאין 0.4% במי מתקן דגים.
- מרדימים את הדג עם תמיסת טריקאין 0.02%; הם מורדמים כאשר הם אינם זזים או מגיבים למגע (1-2 דקות).
- הניחו את הדג המורדם על מגש קלקר (ראו טבלת חומרים) וקיבעו את הדג זקוף בין שתי מחטים של 30 גרם המוחדרות אנכית לתוך הקלקר.
- החזיקו את גוף הדג כדי למנוע מראש הדג לזוז והכניסו אנכית מחט של 30 גרם דרך הגולגולת לאזור המדיאלי של אחת מהמיספרות הטקטום האופטיות (איור 1A,B). עומק ההכנסה הוא ~0.75 מ"מ, כמעט שווה למחצית מאורך השיפוע של 30 G. עומק החדרה זה גורם לפגיעה מוחית בדגי זברה ובמדאקה בגלל גודל הגוף הדומה של דגים אלה.
הערה: למדאקה יש קשקשים על הגולגולת. גרדו והסירו את הקשקשים באמצעות מחט 30G כדי לגרום ביעילות ובדייקנות לפציעת פצע הדקירה (איור 1C). - העבירו את הדגים הפצועים למכל דגים עם מי מתקן דגים מתוקים והעבירו את המיכל למערכת גידול הדגים לאחר שהתאוששו לחלוטין מההרדמה.
הערה: דגים יתאוששו ויתחילו לנוע בחופשיות תוך מספר דקות. - לניתוח שושלת לאחר הפציעה, הכינו מי מתקן דגים טריים המכילים 5 mM bromodeoxyuridine (BrdU) (ראו טבלת חומרים) ולאחר מכן דגרו על הדגים עם תמיסת 5 mM BrdU זו למשך פרק זמן קבוע מראש13,19 (כפי שנקבע על ידי תכנון ניסיוני). לאחר מכן נתחו דגים אלה לפי שלב 2 והעריכו את שילוב BrdU ואת זהות שושלת התאים בהתאם לצורך.
הערה: שלב זה הוא שלב אופציונלי לניתוח שושלת תאים. כדי לזהות אותות BrdU, בצע אחזור אנטיגן כפי שמוצג בשלב 4.3.
2. דיסקציה מוחית
- הכינו תמיסת טריקאין 0.02%, מגש קלקר לדיסקציה ומזרק 10 מ"ל המכיל מלח חוצץ פוספט (1x PBS) עם צינור מאריך ומחטים 30 גרם (ראה טבלת חומרים) לזילוח תוך לבבי.
- מרדימים את הדג הפצוע בנקודות זמן נבחרות.
- הניחו מגבות נייר על מגש הקלקר והניחו את הדג המורדם על מגבות הנייר.
- החזיקו את גוף הדג במקומו על-ידי החדרה אנכית של שתי מחטים של 30 גרם משני צדי סנפיר פי הטבעת (איור 2A).
- בצעו חתך גחוני מפי הטבעת אל הלב (איור 2B) ושמרו על הלב גלוי על-ידי החדרת שתי מחטים נוספות של 30 G בכל צד של האיבר הזה (איור 2C).
הערה: הלב מכוסה בשכבת האפיתל הכסופה של ההיפודרמיס גם בדגי זברה וגם במדאקה (איור 2C). - הסירו בעדינות את שכבת האפיתל הכסופה עם קצה המלקחיים (איור 2D).
- הכניסו את מחט 30G לתוך החדר, שמרו על השיפוע כלפי מעלה, ובצעו חתך לתוך האטריום באמצעות המלקחיים (איור 2E). בזהירות לחץ למטה על המזרק כדי לדחוף את PBS 1x ולאשר כי אטריום שטף את הדם.
הערה: כדי למנוע מהמחט לחדור לחדר, הכנס בזהירות את המחט לעומק חצי השיקוע ולאחר מכן כוונן את עומק ההחדרה. אם הזילוח עשוי היטב, הזימים הופכים לבנים (איור 2F,G). - עצור את הזילוח לאחר ניקוז הדם והזימים הופכים לבנים.
- הסירו את המחטים המקבעות את גוף הדג במקומו וקיבעו את הצד הגחוני של הדג כלפי מטה (איור 2H). חתכו את חוט השדרה והוציאו את הגולגולת מהטקטום האופטי ומהטלנספלון (איור 2I). לאחר מכן, לחתוך את עצבי הראייה לנתח את המוח בזהירות.
הערה: היזהרו מעצבי הראייה במהלך הדיסקציה מכיוון שהעצבים מחוברים לטקטום. כאשר עצב הראייה נמשך, טקטום הראייה יכול להיות מנותק מהמוח. אם הסרת הדם לא הושלמה, המוח נראה ורוד בהיר (המוח הימני באיור 2J). - העבר את המוח לתוך צינורות 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde ב 1x PBS ולתקן אותם לילה ב 4 ° C.
3. הכנת חלקים מוקפאים
- שטפו את המוחות הקבועים שלוש פעמים ב-PBS אחד במשך 5 דקות כל אחד.
- כדי להגן על המוח, העבירו אותם לצינורות של 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של 30% (w/v) סוכרוז ב-1x PBS ודגרו עליהם למשך הלילה ב-4°C. הכינו את תרכובת ההטבעה (תערובת 2:1 של תרכובת OCT ו-30% סוכרוז, ראו טבלת חומרים) על ידי שילוב של 30 מ"ל OCT ו-15 מ"ל של 30% סוכרוז. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
הערה: כדי להסיר את הבועות מהתרכובת המעורבת, צנטריפוגו את צינורות 50 מ"ל ב 10,000 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר או הניחו את הצינורות זקופים למשך הלילה. - יש לדגור על גוש אלומיניום למשך הלילה בטמפרטורה של -80°C על מנת לקרר את הקריומולד (ראו טבלת חומרים) מיד לאחר שהמוח המנותח מוטמע בקריומולד עם תרכובת ההטבעה.
הערה: ניתן להשתמש בחנקן נוזלי גם כדי לקרר את בלוק האלומיניום. במקרה כזה, בלוק האלומיניום צריך להיות ממוקם בקופסת קלקר מלאה בחנקן נוזלי מספיק כדי לכסות את בלוק האלומיניום ממש לפני ההטבעה. לאחר אישור סובלימציה של חנקן נוזלי, הניחו את הקריומולד על בלוק האלומיניום המקורר מראש. עדיף לאשר כמה cryomolds ניתן להציב על בלוק אלומיניום בבת אחת. מומלץ להשתמש בחנקן נוזלי או בלוק מקורר מראש נוסף כדי להבטיח מספיק מקום לקרר את כל הדגימות במהירות. - הכניסו את בלוק האלומיניום המקורר מראש לקופסת קלקר. השתמשו בקופסת קלקר עם מכסה כדי למנוע התחממות גוש האלומיניום.
- עבור מקטעי העטרה, הטמיעו את המוח בקריומולד והתאימו את הכיוון באמצעות מלקחיים מתחת למיקרוסקופ (איור 3A).
- הניחו את הקריומולד על בלוק האלומיניום המקורר מראש בקופסת הקלקר ואפשרו לתרכובת OCT לקפוא (איור 3B). כאשר תרכובת OCT מתחילה לקפוא, היא הופכת ללבנה.
- החל עיגול קטן של תרכובת OCT על דיסק דגימה, והרכיב את ה- cryoblock כדי לחבר את ה- cryoblock לדיסק הדגימה.
- הניחו את דיסק הדגימה בהקפאה והקפיאו את תרכובת ה-OCT לחלוטין.
- הניחו את דיסק הדגימה על ראש הדגימה בהקפאה.
- הגדר את כיוון ה- cryoblock וחתוך את ה- OCT כדי להסיר אזורים מיותרים.
הערה: התאם את כיוון מישור החיתוך בעת חיתוך הטלנספלון. הלהב מצויד בהקפאה. ניתן להתאים את כיוון מישור החיתוך על ידי שינוי זווית ראש הדגימה. - חותכים מקטעים טוריים בעובי 14 מיקרומטר דרך כל הטקטום האופטי באמצעות קריוסטט. אחסן את השקופיות ב -25 ° C.
הערה: אחסון לטווח ארוך צריך להיות ב -80 ° C.
4. פלואורסצנטי immunostaining
- ייבשו את מגלשות הזכוכית במדף שקופיות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שטפו שקופיות ב- 1x PBS למשך 30 דקות ב- RT. אם immunostaining עם נוגדנים anti-PCNA או BrdU הוא לבצע, להמשיך לשלב 4.2 או שלב 4.3.
- הכינו 500 מ"ל של נתרן ציטראט בנפח 10 מ"מ בכוס של 500 מ"ל וחממו את מאגר הציטראט ל-85°C על מערבל מגנטי של פלטה חמה, ולאחר מכן הניחו את המגלשות במדף לצביעת שקופיות ודגרו על המדף במאגר הציטראט בטמפרטורה של 85°C למשך 30 דקות. כדי למנוע רתיחה, לשמור על הטמפרטורה סביב 85 °C (75 °F). לאחר שליפת האנטיגן, שטפו את המגלשות שלוש פעמים ב-0.1% טריטון ב-1x PBS (PBSTr), כאשר כל שטיפה אורכת 5 דקות ב-RT.
הערה: שלב זה הוא שלב אופציונלי לאחזור אנטיגן גרעיני תאי (PCNA). - הכינו תמיסת HCl 2 N על ידי דילול 12 N HCl במים מזוקקים. באמצעות חוסם נוזלים (ראה טבלת חומרים), צייר קו כמחסום הידרופובי כדי לשמור על תמיסת 2 N HCl סביב המקטעים.
- הניחו את השקופיות על מגשי אימונוסטיין ומרחו 200-300 μL של תמיסת 2N HCl. יש לדגור על המגשים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. לאחר שליפת האנטיגן, יש לשטוף שלוש פעמים ב-PBSTr של 0.1% כאשר כל שטיפה אורכת 5 דקות ב-RT.
הערה: שלב זה הוא שלב אופציונלי לאחזור אנטיגן BrdU.
- הניחו את השקופיות על מגשי אימונוסטיין ומרחו 200-300 μL של תמיסת 2N HCl. יש לדגור על המגשים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. לאחר שליפת האנטיגן, יש לשטוף שלוש פעמים ב-PBSTr של 0.1% כאשר כל שטיפה אורכת 5 דקות ב-RT.
- סופגים ומסירים את התמיסה הנותרת באמצעות מגבות נייר. לאחר מכן, השתמש בחוסם נוזלים כדי לצייר מחסום הידרופובי כדי לשמור על תמיסת הנוגדנים סביב החלקים לפי הצורך.
- הניחו את המגלשות על מגשים ומרחו 200-300 מיקרוליטר של תמיסת חסימה, 3% (v/v) נסיוב סוסים ב-PBSTr) על כל מגלשה, ודגרו על המגלשות במשך שעה אחת ב-RT.
- שטפו את המקטעים עם PBSTr במשך 5 דקות ב-RT וחזרו על הפעולה שלוש פעמים.
- הכינו את הנוגדנים הראשוניים (ראו טבלת חומרים) באמצעות תמיסת החסימה (200-300 מיקרוליטר תמיסת נוגדנים לכל שקופית). הסר את ה- PBSTr שנותר עם מגבות נייר והנח את המגלשות על מגשי ההכתמה החיסונית. יש למרוח את תמיסת הנוגדנים העיקרית על כל מגלשה ולדגור על מגשים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- שטפו את המקטעים עם PBSTr במשך 5 דקות ב-RT וחזרו על הפעולה שלוש פעמים.
- הכינו תמיסת נוגדנים שניונית פלואורסצנטית (ראו טבלת חומרים) באמצעות החיץ החוסם (1:500). הסר את ה- PBSTr שנותר עם מגבות נייר והנח את המגלשות על מגשי ההכתמה החיסונית. יש למרוח את תמיסת הנוגדנים המשנית על כל מגשי החלקה והצללה ברדיד אלומיניום. יש לדגור במשך 1-2 שעות ב-RT.
- שטפו את המקטעים עם PBSTr במשך 5 דקות ב-RT שלוש פעמים מבלי לחשוף אותם לאור.
- הכינו תמיסת Hoechst (דילול 1:500 ב-1x PBS, ראו טבלת חומרים) לצביעה גרעינית. הסר את ה- PBSTr שנותר עם מגבות נייר והנח את המגלשות על מגשי ההכתמה החיסונית. יש למרוח את תמיסת Hoechst על כל מגלשה ולכסות את המגשים ברדיד אלומיניום. דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
- שטפו את המקטעים עם 1x PBS למשך 10 דקות ב-RT מבלי לחשוף אותם לאור.
- יש לספוג ולהסיר את 1x PBS הנותרים באמצעות מגבות נייר ולהרכיב את החלקים על שקופיות באמצעות אמצעי הרכבה מסיס במים (ראה טבלת חומרים) עבור צביעה חיסונית פלואורסצנטית. הניחו באיטיות כיסוי בגודל 24X45 מ"מ על המקטעים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C, מבלי לחשוף את השקופיות לאור.
- התבוננו ודמיינו את החלקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי באמצעות החדרת מחט להמיספרה הימנית (איור 1, איור 4A ואיור 5A) גורמת לתגובות תאיות שונות, כולל התפשטות תאי גליה רדיאליים (RGC) ויצירת תאי עצב שזה עתה נולדו. באופן דומה, אוכלוסיות מבוגרות של דגי זברה ומדאקה שימשו כדי לנטרל השפעות הזדקנות כלשהן בתגובה הרגנרטיבית. לאחר מכן בוצעה הצבעה חיסונית פלואורסצנטית במקטעים הקפואים, והתפשטות והתמיינות RGC נותחו לאחר פגיעת הטקטום בדגי הזברה ובמדאקה (איור 4-5)13.
נעשה שימוש בנוגדנים נגד סמן תאי מתפשט, אנטיגן תאי מתפשט (PCNA), וסמן RGC, חלבון קושר שומנים במוח (BLBP), הזמין בדגי זברה ובמדאקה כדי להעריך את התפשטות RGC ברקמות אלה13,19. כפי שתואר קודם לכן, רוב ה-RGCs היו שקטים (PCNA שלילי) בחצי הכדור הנגדי שלא נפגע (איור 4B)13. ובכל זאת, התפשטות RGC נגרמה יומיים לאחר הפציעה (dpi) בטקטום המדאקה (איור 4C,D)13. השראת התפשטות RGC לאחר הפציעה היא תכונה נפוצה הן של דגי הזברה והן של תגובות רגנרטיביות של מדאקה13,19.
תיוג BrdU הוא שיטה פשוטה המשמשת להערכת שושלת תאים ולניתוח התמיינות RGC לאחר פגיעה מוחית (איור 5A)13. צביעה חיסונית עם נוגדנים עבור סמן פאן-עצבי, HuC, ו-BrdU שימשה בעבר להשוואת התמיינות RGC בטקטום הפגוע של דגי זברה ומדאקה (איור 5B,C)13. אם נוגדנים אלה זמינים במין היעד, ניתן לבצע ניתוחים השוואתיים.
אם הפציעה נגרמת כראוי, אתר הפציעה ממוקם באזור המרכזי-גבי בטקטום האופטי (איור 4C). לאחר מכן ניתן להשתמש בצביעה גרעינית ובצביעת המטוקסילין ואוזין כדי לאשר את אתר הפציעה 13,19,20,21,22,23,24,25. לאחר הפציעה ניתן להבחין באזור אפור פריוונטריקולרי מופרע עם כתמים גרעיניים (איור 4C). אם הפציעה ממוקמת באזור הגבי המדיאלי, התפשטות RGC אינה מוגברת באופן משמעותי25.
איור 1: פציעת פצע דקירה בטקטום אופטי בוגר באמצעות מחט. (A) מבט גבי על דג זברה בוגר. דג הזברה נשמר זקוף בין שתי מחטים כפופות המוחדרות אנכית לתוך קלקר. (א') תמונה מוגדלת של האזור בתיבה (A). מחט 30 גרם מוחדרת לאזור המדיאלי של הגבול בין שתי גולגולות הנקראות os frontale ו- os parietale על טקטום אופטי. העיגול הצהוב מציין את מקום הפגיעה, וקווים מקווקווים לבנים מציינים את שתי הגולגולות על הטקטום האופטי. (B) מבט דורסלי על מדאקה בוגרת. (ב') תמונה מוגדלת של האזור הארוז בתיבה (B). מחט 30 גרם מוחדרת לגבול בטקטום האופטי. העיגול הצהוב מציין את מקום הפגיעה, וקווים מקווקווים לבנים מציינים שתי גולגולות על הטקטום האופטי. (C) למדאקה יש קשקשים על הגולגולת. יש להסיר את קשקשי הגולגולת לפני פציעת פצע הדקירה. הקו המקווקו מציין את קנה המידה על הטקטום האופטי. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ ב-A-B, 1 מ"מ ב-A', B' ו-C. Telencephalon (Tel), טקטום אופטי (OT), os frontale (F) ו-os parietale (P). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זילוח תוך-לבבי בדגים בוגרים קטנים. (A) מבט גחוני של דג זברה המקובע על קלקר באמצעות מחטים כפופות המוכנות לזילוח תוך לבבי ולדיסקציה מוחית. (B) חתך גחוני נעשה ממוצא הסנפירים האנאליים לחזה. (C) הלב נמצא מאחורי שכבת אפיתל כסופה שנקראת היפודרמיס גם בדגי זברה וגם במדאקה. קיבוע נוסף באמצעות מחט כפופה לצד שכבת האפיתל הכסופה מאפשר גישה קלה יותר. הקו הלבן המוצק מציין את החדר (V), והקו המקווקו מציין את ההיפודרמיס. (D) שכבת אפיתל הכסף מוסרת לפני זילוח תוך לבבי של 1x PBS. (ה-ג) קנולה מוחדרת לחדר עבור זילוח תוך לבבי. זימים לפני (F) ואחרי (G) זילוח תוך לבבי. אם הסרת הדם אינה מלאה, הזימים נשארים אדומים. (ח-י) דיסקציה מוחית לאחר זילוח PBS כדי להסיר את הדם מהרקמות. הסר גולגולות על טקטום אופטי וטלנספלון כפי שמוצג ב-(I). אם הסרת הדם לא הושלמה, המוח נראה ורוד בהיר (המוח הימני ב-(J)). סרגל קנה מידה: 2 מ"מ ב- A-C ו- H, 1 מ"מ ב- D-G ו- I-J. פקעת הריח (OB), טלנספלון (Tel), טקטום אופטי (OT), בולבוס ארטריוזוס (Ba), חדר (V) ואטריום (At). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הטבעה מוחית עבור מקטעים קפואים. (A) המוח מוטמע בקריומולד עם תרכובת הטבעה. הקדמי למטה. (B) Cryomolds מקוררים על בלוק אלומיניום מקורר מראש. טלנספלון (Tel), טקטום אופטי (OT). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מייצגות של כתמים חיסוניים פלואורסצנטיים כנגד התפשטות RGC לאחר פגיעת טקטום במדאקה בוגרת . (A) מבט סכמטי על פגיעת פצע הדקירה בהמיספרה הימנית של הטקטום האופטי והחתך העטרתי. (ב-ג) תוצאות מייצגות של RGCs שגשוגיים (PCNA + BLBP + תאים) בצד הנגדי הלא נפגע (B) והפצוע (C) יומיים לאחר הפציעה. ראש חץ לבן ב-C' מצביע על הפרעה באזור האפור הפריוונטריקולרי עקב פציעת פצע הדקירה. (D) תמונות מוגדלות של האזור הארוז ב- (C). ראשי חץ לבנים ב- (D) מציינים PCNA + BLBP + תאים. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר ב-B-D. הותאם באישור הפניה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות מייצגות של צביעה חיסונית פלואורסצנטית עבור יצירת תאי עצב ביילודים לאחר פגיעה בטקטום . (A) מבט סכמטי על הטיפול בברומודוקסיורידין (BrdU) ועל פציעת פצע הדקירה בטקטום האופטי ובחתך העטרה. (ב-ג) תוצאות מייצגות של נוירונים ביילוד (BrdU + HuC + תאים) לאחר 7 ימים לאחר הפציעה בדגי הזברה הפגועים (B) ובמדאקה (C). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר ב-B-C. הותאם באישור הפניה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן מתוארת קבוצה של שיטות שניתן להשתמש בהן כדי לגרום לפציעות פצע דקירה בטקטום האופטי באמצעות מחט כדי להקל על הערכת התפשטות RGC והתמיינות לאחר פגיעה מוחית. פצעי דקירה בתיווך מחט הם שיטה פשוטה ויעילה המיושמת שניתן ליישם על דגימות ניסיוניות רבות באמצעות סט כלים סטנדרטי. מודלים של פגיעה בפצעי דקירה עבור מספר אזורים במוח דגי הזברה פותחו 3,19,29. הטקטום האופטי הוא אחד האזורים הגדולים ביותר במוח וקל לתמרן אותו. יתר על כן, רוב RGCs בטקטום האופטי שקטים בתנאים פיזיולוגיים בהשוואה לטלנצפלון, מה שמקל על צפייה בהתפשטות ובהתמיינות RGC בהתאם לפציעה 3,19.
אחד השלבים והמגבלות הקריטיים בפציעות פצעי דקירה הוא החדרת מחט ידנית; פגיעה עקבית נחוצה ליצירת תוצאות הניתנות לשחזור ולהקלה על ניתוח השוואתי. המיקום המדויק והעומק של ההחדרה הם קריטיים ועוזרים ליצור פציעות הניתנות לשחזור בניסויים. מאמר זה מספק הנחיות ברורות לביצוע פציעות דומות בכל פעם. יתר על כן, התפשטות RGC לאחר הפציעה חיונית לנוירוגנזה של הטקטום הפגוע. בדגי זברה פגועים ובמדאקה, התפשטות RGC עולה ב 1 dpi וחוזרת לרמות בסיסיות, כמו בחצי הכדור הנגדי שלא נפגע, ב 7 dpi13,19.
פציעת פצע דקירה היא אחת משיטות הפגיעה המכניות הגורמות לאבלציה של תאים לא ספציפיים. לעומת זאת, גישות טרנסגניות לאבלציה ספציפית לתאים כגון מערכת nitroreductase/metronidazole פותחו גם 30,31,32. יש לבחור מודלים אלה של אבלציה בהתבסס על מטרת הניסוי. אבלציה לא ספציפית מתאימה לפגיעות מוחיות כגון פצעי דקירה ושבץ איסכמי. לעומת זאת, אבלציה ספציפית לתאים עשויה להיות מתאימה יותר להערכת התנוונות של תאים ספציפיים הקשורים למחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון.
לאחרונה פותחו מודלים של פגיעה איסכמית באמצעות דגי זברה33, אך מודלים אלה זקוקים לקווים טרנסגניים ולמיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח על זרימת הדם. לכן, מודלים אלה מאתגרים ליישום על מינים עם גישות גנטיות גרועות, והתפוקה שלהם נמוכה יותר ממודל הפציעה מפצע דקירה.
כפי שהוזכר לעיל, פגיעה בפצע דקירה בטקטום האופטי היא פשוטה ומיושמת בקלות במודלים אחרים של דגים קטנים כגון קיליפיש אפריקאי ומומיצ'וג עם כלים נפוצים26. יתר על כן, ניתוח השוואתי בין מינים נחקר היטב באמצעות טכנולוגיית ריצוף. לכן, שיטה פשוטה זו נותרה חיונית כאשר חוקרים את יכולת ההתחדשות של NSCs בדגי זברה באמצעות ניתוח השוואתי של תגובות תאיות וביטוי גנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי JSPS KAKENHI מענק מספר 18K14824 ו 21K15195 ומענק פנימי של AIST, יפן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , University of Oregon Press. (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
