Summary
تم وصف نموذج إصابة الدماغ الميكانيكية في الزرد البالغ للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تنظم قدرتها العالية على التجدد. تشرح الطريقة إنشاء إصابة جرح طعنة في القفص البصري لأنواع متعددة من الأسماك الصغيرة لتقييم الاستجابات التجديدية باستخدام التلوين المناعي الفلوري.
Abstract
في حين أن الزرد لديه قدرة فائقة على تجديد الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، فإن medaka لديه قدرة أقل على تجديد الجهاز العصبي المركزي. تم تطوير نموذج إصابة الدماغ في القفص البصري البالغ لسمك الزرد والميداكا وتم إجراء تحليلات نسيجية وجزيئية مقارنة لتوضيح الآليات الجزيئية التي تنظم القدرة التجديدية العالية لهذا النسيج عبر هذه الأنواع من الأسماك. هنا يتم تقديم نموذج إصابة جرح الطعنة للصمت البصري البالغ باستخدام إبرة وتحليلات نسيجية لتكاثر وتمايز الخلايا الجذعية العصبية (NSCs). تم إدخال إبرة يدويا في المنطقة الوسطى من القفص البصري ، ثم تم ترشيح الأسماك داخل القلب ، وتم تشريح أدمغتها. ثم تم تشريح هذه الأنسجة بالتبريد وتقييمها باستخدام تلطيخ مناعي ضد علامات انتشار وتمايز NSC المناسبة. يوفر نموذج إصابة القفص هذا نتائج قوية وقابلة للتكرار في كل من الزرد والميداكا ، مما يسمح بمقارنة استجابات NSC بعد الإصابة. هذه الطريقة متاحة للأسماك الصغيرة ، بما في ذلك الزرد ، والميداكا ، وسمك الكيلي الأفريقي ، وتمكننا من مقارنة قدرتها على التجدد والتحقيق في الآليات الجزيئية الفريدة.
Introduction
الزرد (Danio rerio) لديها قدرة متزايدة على تجديد الجهاز العصبي المركزي (CNS) مقارنة بالثديياتالأخرى 1،2،3. في الآونة الأخيرة ، لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه القدرة التجديدية المتزايدة بشكل أفضل ، تم إجراء تحليلات مقارنة لتجديد الأنسجة باستخدام تقنية تسلسل الجيل التالي4،5،6. تختلف هياكل الدماغ في الزرد ورباعيات الأرجل تماما7،8،9. وهذا يعني أنه تم تطوير العديد من نماذج إصابات الدماغ باستخدام أسماك صغيرة ذات هياكل دماغية وخصائص بيولوجية مماثلة لتسهيل التحقيق في الآليات الجزيئية الأساسية التي تساهم في هذه القدرة التجديدية المتزايدة.
بالإضافة إلى ذلك ، medaka (Oryzias latipes) هو مختبر شهير ذو قدرة منخفضة على تجديد القلب والخلايا العصبية10،11،12،13 مقارنة بسمك الزرد. يمتلك الزرد والميداكا هياكل دماغية ومنافذ مماثلة للخلايا الجذعية العصبية البالغة (NSCs)14،15،16،17. في الزرد والميداكا ، يشتمل القفص البصري على نوعين من NSCs ، الخلايا الجذعية الشبيهة بالظهارة العصبية والخلايا الدبقية الشعاعية (RGCs)15,18. تم تطوير إصابة جرح طعنة للقفص البصري لسمك الزرد البالغ سابقا ، وتم استخدام هذا النموذج للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تنظم تجديد الدماغ في هذه الحيوانات19،20،21،22،23. هذا النموذج إصابة طعنة الزرد الشباب البالغين الناجم عن تكوين الخلايا العصبية التجديدية من RGCs19،24،25. إصابة جرح الطعنة هذه في القفص البصري هي طريقة قوية وقابلة للتكرار 13،19،20،21،22،23،24،25. عندما تم تطبيق نفس نموذج الإصابة على medaka للبالغين ، تم الكشف عن القدرة العصبية المنخفضة ل RGCs في medaka optic tectum من خلال التحليل المقارن لانتشار RGC والتمايز بعد الإصابة13.
كما تم تطوير نماذج إصابة جرح الطعنات في القفص البصري في نماذج المومياوات26 ، ولكن لم يتم توثيق تفاصيل إصابة القفص جيدا عند مقارنتها بإصابة الدماغ27. تسمح إصابة جرح الطعنة في القفص البصري باستخدام الزرد والميداكا بالتحقيق في الاستجابات الخلوية التفاضلية والتعبير الجيني بين الأنواع ذات القدرة التفاضلية على التجدد. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء إصابة جرح طعنة في القفص البصري باستخدام إبرة الحقن. يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأسماك الصغيرة مثل الزرد و medaka. يتم شرح عمليات تحضير العينات للتحليل النسيجي والانتشار الخلوي وتحليل التمايز باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية والأقسام المبردة هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في المعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا الصناعية المتقدمة. تم الحفاظ على الزرد والميداكا وفقا للإجراءات القياسية28.
1. إصابة جرح طعنة في القفص البصري للبالغين
- قم بإعداد محلول مخزون تريكايين بنسبة 0.4٪ (وزن / حجم) للتخدير. للحصول على محلول مخزون سعة 100 مل ، قم بإذابة 400 مجم من ثلاثي كايين ميثان سلفونات (انظر جدول المواد) في 90 مل من الماء المقطر واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 باستخدام 1 M Tris HCl buffer (pH 9.0). بمجرد ضبط درجة الحموضة ، أضف الماء حتى 100 مل ، ثم قم بعمل الحصص المناسبة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- لتخدير الزرد البالغ أو الميداكا ، قم بإعداد محلول تريكاين بنسبة 0.02٪ (وزن / حجم) عن طريق تخفيف محلول مخزون التريكائين بنسبة 0.4٪ بمياه منشأة الأسماك.
- تخدير الأسماك بمحلول تريكايين 0.02٪ ؛ يتم تخديرهم عندما لا يتحركون أو يستجيبون للمس (1-2 دقيقة).
- ضع السمك المخدر على صينية الستايروفوم (انظر جدول المواد) وثبت السمكة في وضع مستقيم بين إبرتين 30 جم يتم إدخالهما عموديا في الستايروفوم.
- أمسك جسم السمكة لمنع رأس السمكة من الحركة وأدخل إبرة 30 جم عموديا عبر الجمجمة في المنطقة الإنسية لأحد نصفي الكرة الأرضية البصريين (الشكل 1 أ ، ب). عمق الإدخال ~ 0.75 مم ، يساوي تقريبا نصف طول شطبة 30 G. يؤدي عمق الإدخال هذا إلى إصابة الدماغ على الزرد والميداكا بسبب حجم الجسم المماثل لهذه الأسماك.
ملاحظة: Medaka لديه قشور على الجمجمة. خدش وإزالة القشور باستخدام إبرة 30 G للحث على إصابة جرح الطعنة بكفاءة ودقة (الشكل 1C). - نقل الأسماك المصابة إلى حوض للأسماك مع مياه منشأة الأسماك العذبة ونقل الحوض إلى نظام تربية الأسماك بمجرد تعافيها تماما من التخدير.
ملاحظة: سوف تتعافى الأسماك وتبدأ في التحرك بحرية في غضون بضع دقائق. - لتحليل النسب بعد الإصابة ، قم بإعداد مياه منشأة الأسماك العذبة التي تحتوي على 5 mM bromodeoxyuridine (BrdU) (انظر جدول المواد) ثم احتضان الأسماك بمحلول BrdU 5 mM لفترة زمنية محددة مسبقا13,19 (على النحو الذي يحدده التصميم التجريبي). ثم قم بتشريح هذه الأسماك وفقا للخطوة 2 وتقييم دمج BrdU وهوية نسب الخلية حسب الاقتضاء.
ملاحظة: هذه الخطوة هي خطوة اختيارية لتحليل نسب الخلية. للكشف عن إشارات BrdU ، قم بإجراء استرجاع المستضد كما هو موضح في الخطوة 4.3.
2. تشريح الدماغ
- تحضير محلول تريكايين 0.02٪ ، وصينية ستايروفوم للتشريح ، ومحقنة سعة 10 مل تحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) مع أنبوب تمديد وإبر 30 جم (انظر جدول المواد) للنضح داخل القلب.
- تخدير الأسماك المصابة في نقاط زمنية محددة.
- ضع مناشف ورقية على صينية الستايروفوم وضع السمك المخدر على المناشف الورقية.
- ثبت جسم السمكة في مكانه عن طريق إدخال إبرتين 30 جم عموديا على جانبي الزعنفة الشرجية (الشكل 2 أ).
- قم بعمل شق بطني من فتحة الشرج إلى القلب (الشكل 2 ب) وحافظ على القلب مرئيا عن طريق إدخال إبرتين أخريين 30 جراما على كل جانب من هذا العضو (الشكل 2 ج).
ملاحظة: القلب مغطى بالطبقة الظهارية الفضية من تحت الجلد في كل من الزرد والميداكا (الشكل 2C). - قم بإزالة الطبقة الظهارية الفضية برفق بطرف الملقط (الشكل 2 د).
- أدخل إبرة 30 G في البطين ، مع الحفاظ على شطبة ، وقم بعمل شق في الأذين باستخدام الملقط (الشكل 2E). اضغط بعناية على المحقنة لدفع 1x PBS وتأكد من أن الأذين يغسل الدم.
ملاحظة: لمنع الإبرة من اختراق البطين، أدخل الإبرة بعناية إلى عمق نصف شطبة ثم اضبط عمق الإدراج. إذا تم التروية بشكل جيد ، تتحول الخياشيم إلى اللون الأبيض (الشكل 2F ، G). - أوقف التروية بعد تصريف الدم وتحول الخياشيم إلى اللون الأبيض.
- قم بإزالة الإبر التي تثبت جسم السمكة في مكانها وثبت الجانب البطني للأسماك لأسفل (الشكل 2H). قطع الحبل الشوكي وإزالة الجمجمة من القفص البصري والدماغ الدماغي (الشكل 2I). ثم ، قطع الأعصاب البصرية وتشريح الدماغ بعناية.
ملاحظة: احترس من الأعصاب البصرية أثناء التشريح لأن الأعصاب متصلة بالقفص. عندما يتم سحب العصب البصري ، يمكن فصل القفص البصري عن الدماغ. إذا لم تكتمل إزالة الدم ، يبدو الدماغ ورديا فاتحا (الدماغ الأيمن في الشكل 2J). - نقل الأدمغة إلى أنابيب 1.5 مل مع 1 مل من 4 ٪ بارافورمالدهيد في 1x PBS وتثبيتها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
3. تحضير المقاطع المجمدة
- اغسل الأدمغة الثابتة ثلاث مرات في 1x PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- لحماية الأدمغة بالتبريد ، قم بنقلها إلى أنابيب سعة 1.5 مل مع 1 مل من السكروز بنسبة 30٪ (وزن / حجم) في 1x PBS واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. تحضير مركب التضمين (خليط 2: 1 من مركب OCT وسكروز 30٪ ، انظر جدول المواد) عن طريق الجمع بين 30 مل من OCT و 15 مل من 30٪ سكروز. يخزن هذا في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
ملاحظة: لإزالة الفقاعات من المركب المختلط ، قم بطرد أنابيب 50 مل عند 10000 × جم لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو ضع الأنابيب في وضع مستقيم طوال الليل. - احتضان كتلة من الألومنيوم طوال الليل عند -80 درجة مئوية من أجل تبريد cryomold (انظر جدول المواد) مباشرة بعد تضمين الدماغ التشريحي في cryomold مع مركب التضمين.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام النيتروجين السائل لتبريد كتلة الألومنيوم. في هذه الحالة ، يجب وضع كتلة الألومنيوم في صندوق الستايروفوم المملوء بما يكفي من النيتروجين السائل لتغطية كتلة الألومنيوم قبل التضمين مباشرة. بعد التأكد من تسامي النيتروجين السائل ، ضع cryomold على كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا. من الأفضل تأكيد عدد قوالب التبريد التي يمكن وضعها على كتلة الألومنيوم مرة واحدة. ينصح باستخدام النيتروجين السائل أو كتلة إضافية مبردة مسبقا لضمان مساحة كافية لتبريد جميع العينات بسرعة. - ضع كتلة الألمنيوم المبردة مسبقا في صندوق الستايروفوم. استخدم صندوق الستايروفوم بغطاء لمنع كتلة الألومنيوم من الاحترار.
- بالنسبة للأقسام الإكليلية ، قم بتضمين الدماغ في cryomold واضبط الاتجاه باستخدام ملقط تحت المجهر (الشكل 3A).
- ضع cryomold على كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا في صندوق الستايروفوم واترك مركب OCT يتجمد (الشكل 3 ب). عندما يبدأ مركب OCT في التجمد ، يصبح أبيض.
- ضع دائرة صغيرة من مركب OCT على قرص عينة ، وقم بتركيب كتلة التبريد لتوصيل كتلة التبريد بقرص العينة.
- ضع قرص العينة في cryostat وقم بتجميد مركب OCT تماما.
- ضع قرص العينة على رأس العينة في جهاز التبريد.
- اضبط اتجاه كتلة التبريد وقم بقص OCT لإزالة أي مناطق إضافية.
ملاحظة: اضبط اتجاه مستوى القطع أثناء قطع الدماغ الدماغي. الشفرة مجهزة ب cryostat. من الممكن ضبط اتجاه مستوى القطع عن طريق تغيير زاوية رأس العينة. - قطع المقاطع التسلسلية بسمك 14 ميكرومتر من خلال الحاجز البصري بأكمله باستخدام cryostat. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة -25 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب أن يكون التخزين طويل الأجل عند -80 درجة مئوية.
4. الفلورسنت المناعي
- ينزلق الزجاج الجاف في رف منزلق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). اغسل الشرائح في 1x PBS لمدة 30 دقيقة في RT. إذا كان سيتم إجراء تلطيخ مناعي بأجسام مضادة ل PCNA أو BrdU ، فانتقل إلى الخطوة 4.2 أو الخطوة 4.3.
- تحضير 500 مل من سترات الصوديوم 10 مللي متر في دورق 500 مل وتسخين المخزن المؤقت سيترات إلى 85 درجة مئوية على محرك مغناطيسي ساخن ، ثم ضع الشرائح في رف تلطيخ منزلق واحتضان الرف في مخزن سيترات عند 85 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لتجنب الغليان ، حافظ على درجة الحرارة حوالي 85 درجة مئوية. بعد استرجاع المستضد ، اغسل الشرائح ثلاث مرات بنسبة 0.1٪ Triton في 1x PBS (PBSTr) ، مع كل غسلة تستغرق 5 دقائق في RT.
ملاحظة: هذه الخطوة هي خطوة اختيارية لاسترجاع المستضد النووي للخلايا (PCNA). - تحضير محلول 2 N HCl عن طريق تخفيف 12 N HCl في الماء المقطر. باستخدام مانع سائل (انظر جدول المواد) ، ارسم خطا كحاجز كاره للماء للحفاظ على محلول 2 N HCl حول الأقسام.
- ضع الشرائح على صواني تلطيخ المناعة وقم بتطبيق 200-300 ميكرولتر من محلول 2N HCl. احتضان الصواني على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد استرجاع المستضد ، اغسل ثلاث مرات بنسبة 0.1٪ PBSTr مع كل غسلة تستغرق 5 دقائق في RT.
ملاحظة: هذه الخطوة هي خطوة اختيارية لاسترجاع مستضد BrdU.
- ضع الشرائح على صواني تلطيخ المناعة وقم بتطبيق 200-300 ميكرولتر من محلول 2N HCl. احتضان الصواني على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد استرجاع المستضد ، اغسل ثلاث مرات بنسبة 0.1٪ PBSTr مع كل غسلة تستغرق 5 دقائق في RT.
- امتصاص وإزالة الحل المتبقي باستخدام المناشف الورقية. بعد ذلك ، استخدم حاصرات سائلة لرسم حاجز كاره للماء للحفاظ على محلول الجسم المضاد حول الأقسام حسب الضرورة.
- ضع الشرائح على الصواني وقم بتطبيق 200-300 ميكرولتر من محلول الحجب ، ومصل الحصان 3٪ (v / v) في PBSTr) على كل شريحة ، واحتضان الشرائح لمدة 1 ساعة في RT.
- اغسل الأقسام باستخدام PBSTr لمدة 5 دقائق في RT وكرر ثلاث مرات.
- قم بإعداد الأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد) باستخدام محلول الحجب (200-300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل شريحة). قم بإزالة PBSTr المتبقي باستخدام مناشف ورقية وضع الشرائح على صواني تلطيخ المناعة. ضع محلول الأجسام المضادة الأساسي على كل شريحة واحتضن الصواني طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الأقسام باستخدام PBSTr لمدة 5 دقائق في RT وكرر ثلاث مرات.
- تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية الفلورية (انظر جدول المواد) باستخدام المخزن المؤقت المانع (1: 500). قم بإزالة PBSTr المتبقي باستخدام مناشف ورقية وضع الشرائح على صواني تلطيخ المناعة. ضع محلول الأجسام المضادة الثانوي على كل شريحة وصواني تظليل بورق الألمنيوم. احتضان لمدة 1-2 ساعة في RT.
- اغسل الأقسام باستخدام PBSTr لمدة 5 دقائق في RT ثلاث مرات دون تعريضها للضوء.
- قم بإعداد محلول Hoechst (تخفيف 1: 500 في 1x PBS ، انظر جدول المواد) للتلطيخ النووي. قم بإزالة PBSTr المتبقي باستخدام مناشف ورقية وضع الشرائح على صواني تلطيخ المناعة. ضع محلول Hoechst على كل شريحة وقم بتغطية الصواني بورق الألمنيوم. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
- اغسل الأقسام باستخدام 1x PBS لمدة 10 دقائق في RT دون تعريضها للضوء.
- قم بامتصاص وإزالة 1x PBS المتبقية باستخدام مناشف ورقية وقم بتركيب الأقسام على الشرائح باستخدام وسيط تركيب قابل للذوبان في الماء (انظر جدول المواد) للتلطيخ المناعي الفلوري. ضع غطاء مقاس 24 × 45 مم ببطء على الأقسام. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، دون تعريض الشرائح للضوء.
- مراقبة وتصوير الأقسام تحت المجهر الفلوري أو المجهري متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تؤدي إصابة جرح الطعنة في القفص البصري باستخدام إدخال إبرة في نصف الكرة الأيمن (الشكل 1 والشكل 4 أ والشكل 5 أ) إلى استجابات خلوية مختلفة ، بما في ذلك تكاثر الخلايا الدبقية الشعاعية (RGC) وتوليد الخلايا العصبية حديثي الولادة. وبالمثل ، تم استخدام المجموعات العمرية من الزرد والميداكا لمواجهة أي آثار شيخوخة في الاستجابة التجديدية. ثم تم إجراء تلطيخ مناعي فلوري على الأقسام المجمدة ، وتم تحليل انتشار وتمايز RGC بعد إصابة القفص في الزرد والميداكا (الشكل 4-5)13.
تم استخدام الأجسام المضادة ضد علامة الخلايا المتكاثرة ، مستضد الخلايا المتكاثرة (PCNA) ، وعلامة RGC ، بروتين ربط الدهون في الدماغ (BLBP) ، المتوفر في الزرد والميداكا لتقييم انتشار RGC في هذه الأنسجة13,19. كما هو موضح سابقا ، كانت معظم RGCs هادئة (PCNA سلبية) في نصف الكرة غير المصاب المقابل (الشكل 4B)13. ومع ذلك ، تم تحفيز انتشار RGC في يومين بعد الإصابة (dpi) في medaka tectum (الشكل 4C ، D) 13. يعد تحريض انتشار RGC بعد الإصابة سمة مشتركة لكل من الاستجابات التجديدية لسمك الزرد و medaka13,19.
وضع العلامات BrdU هو طريقة بسيطة تستخدم لتقييم نسب الخلية وتحليل تمايز RGC بعد إصابة الدماغ (الشكل 5A) 13. تم استخدام التلوين المناعي بالأجسام المضادة لعلامة عموم الخلايا العصبية ، HuC ، و BrdU سابقا لمقارنة تمايز RGC في القفص المصاب من الزرد والميداكا (الشكل 5B ، C) 13. إذا كانت هذه الأجسام المضادة متوفرة في الأنواع المستهدفة ، يمكن إجراء تحليلات مقارنة.
إذا كانت الإصابة مستحثة بشكل مناسب ، يقع موقع الإصابة في المنطقة الظهرية المركزية في القفص البصري (الشكل 4C). يمكن بعد ذلك استخدام التلوين النووي وتلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين لتأكيد موقع الإصابة 13،19،20،21،22،23،24،25. بعد الإصابة ، يمكن ملاحظة منطقة رمادية محيطية حول البطين مضطربة مع تلطيخ نووي (الشكل 4C). إذا كانت الإصابة موجودة في المنطقة الظهرية الإنسية ، فإن انتشار RGC لا يزداد بشكل كبير25.
الشكل 1: إصابة جرح طعنة في القفص البصري البالغ باستخدام إبرة. أ: منظر ظهري لسمكة الزرد البالغة. يتم الاحتفاظ بسمك الزرد في وضع مستقيم بين إبرتين منحنيتين يتم إدخالهما عموديا في الستايروفوم. (أ') صورة مكبرة للمنطقة المحاصرة في (A). يتم إدخال إبرة 30 G في المنطقة الإنسية من الحدود بين جمجمتين تسمى os frontale و os parietale على الحاجز البصري. تشير الدائرة الصفراء إلى موقع الإصابة ، وتشير الخطوط البيضاء المتقطعة إلى الجماجمتين على الحاجز البصري. (ب) المنظر الظهري للميداكا البالغة. (ب') صورة مكبرة للمنطقة المحاصرة في (B). يتم إدخال إبرة 30 G في الحدود على الحاجز البصري. تشير الدائرة الصفراء إلى موقع الإصابة ، وتشير الخطوط البيضاء المتقطعة إلى جمجمتين على الحاجز البصري. (ج) ميداكا لها حراشف على الجمجمة. يجب إزالة قشور الجمجمة قبل إصابة جرح الطعنة. يشير الخط المتقطع إلى المقياس الموجود على المقياس البصري. شريط المقياس: 2 مم في A-B ، 1 مم في A 'و B 'و C. Telencephalon (Tel) ، القفص البصري (OT) ، نظام التشغيل الجبهي (F) ، ونظام التشغيل الجداري (P). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التروية داخل القلب في الأسماك البالغة الصغيرة. أ: منظر بطني لسمكة الزرد المثبتة على الستايروفوم باستخدام إبر مثنية جاهزة للتروية داخل القلب وتسلخ الدماغ. (ب) يجرى شق بطني من أصل الزعانف الشرجية إلى الصدر. (ج) يقع القلب خلف طبقة طلائية فضية تسمى تحت الجلد في كل من الزرد والميداكا. تثبيت آخر باستخدام إبرة منحنية بجانب الطبقة الظهارية الفضية يسمح بوصول أسهل. يشير الخط الأبيض الصلب إلى البطين (V) ، ويشير الخط المنقط إلى تحت الجلد. (د) تتم إزالة الطبقة الطلائية الفضية قبل التروية داخل القلب ل 1x PBS. (E-G) يتم إدخال القنية في البطين للتروية داخل القلب. الخياشيم قبل (F) وبعد (G) التروية داخل القلب. إذا لم تكتمل إزالة الدم ، تظل الخياشيم حمراء. (ح-ج) تشريح الدماغ بعد نضح PBS لإزالة الدم من الأنسجة. قم بإزالة الجماجم الموجودة على القفص البصري والدماغ البيني كما هو موضح في (I). إذا لم تكتمل إزالة الدم ، يبدو الدماغ ورديا فاتحا (الدماغ الأيمن في (J)). شريط المقياس: 2 مم في A-C و H ، 1 مم في D-G و I-J. البصلة الشمية (OB) ، الدماغ الدماغي (Tel) ، القفص البصري (OT) ، البصلة الشريانية (Ba) ، البطين (V) ، والأذين (At). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: دمج الدماغ للأقسام المجمدة. أ: الدماغ مضمن في جهاز تبريد مع مركب تضمين. الأمامي أسفل. (ب) تبرد القوالب المبردة على كتلة ألومنيوم مبردة مسبقا. تيلينسيفالون (هاتف) ، تيكتوم بصري (OT). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية للتلطيخ المناعي الفلوري ضد انتشار RGC بعد إصابة القفص في medaka البالغين . (أ) منظر تخطيطي لإصابة جرح الطعنة في نصف الكرة الأيمن من القفص البصري والقسم الإكليلي. (ب-ج) النتائج التمثيلية ل RGCs التكاثرية (خلايا PCNA + BLBP +) في الجانب المقابل غير المصاب (B) والمصاب (C) في 2 أيام بعد الإصابة. يشير رأس السهم الأبيض في C إلى منطقة رمادية محيطة بالبطين مضطربة بسبب إصابة جرح الطعنة. (د) صور مكبرة للمنطقة المحاصرة في (C). تشير رؤوس الأسهم البيضاء في (D) إلى خلايا PCNA + BLBP +. شريط المقياس: 50 ميكرومتر في B-D. مقتبس بإذن من المرجع13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية للتلطيخ المناعي الفلوري لتوليد الخلايا العصبية حديثي الولادة بعد إصابة القفص. (أ) منظر تخطيطي لعلاج البرومودوكيوريدين (BrdU) وإصابة جرح الطعنة في القفص البصري والقسم الإكليلي. (ب-ج) نتائج تمثيلية للخلايا العصبية حديثي الولادة (خلايا BrdU + HuC +) في 7 أيام بعد الإصابة في الزرد المصاب (B) و medaka (C). شريط المقياس: 50 ميكرومتر في B-C. مقتبس بإذن من المرجع13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يتم وصف مجموعة من الطرق التي يمكن استخدامها للحث على إصابات جرح الطعنات في القفص البصري باستخدام إبرة لتسهيل تقييم انتشار RGC والتمايز بعد إصابة الدماغ. جروح الطعنات بوساطة الإبرة هي طريقة بسيطة وفعالة يمكن تطبيقها على العديد من العينات التجريبية باستخدام مجموعة قياسية من الأدوات. تم تطوير نماذج إصابة جرح الطعنات لعدة مناطق من دماغ الزرد3،19،29. القفص البصري هو واحد من أكبر أجزاء الدماغ ويسهل التلاعب به. علاوة على ذلك ، فإن معظم RGCs في القفص البصري تكون هادئة في ظل الظروف الفسيولوجية عند مقارنتها بالدماغ الدماغي ، مما يسهل مراقبة انتشار RGC والتمايز اعتمادا على الإصابة 3,19.
واحدة من الخطوات والقيود الحاسمة في إصابات جرح الطعنات هي إدخال إبرة يدوي. الإصابة المستمرة ضرورية لخلق نتائج قابلة للتكرار وتسهيل التحليل المقارن. يعد الموقع الدقيق وعمق الإدخال أمرا بالغ الأهمية ويساعد في إحداث إصابات قابلة للتكرار في التجارب. تقدم هذه الورقة إرشادات واضحة لإحداث إصابات مماثلة في كل مرة. علاوة على ذلك ، فإن انتشار RGC بعد الإصابة ضروري لتكوين الخلايا العصبية للصمت المصاب. في أسماك الزرد المصابة والميداكا ، يزداد انتشار RGC عند 1 نقطة في البوصة ويعود إلى المستويات القاعدية ، كما هو الحال في نصف الكرة غير المصاب المقابل ، عند 7 نقطة في البوصة13,19.
إصابة جرح الطعنة هي إحدى طرق الإصابة الميكانيكية التي تحفز الاستئصال الخلوي غير المحدد. في المقابل ، تم أيضا تطوير مناهج معدلة وراثيا للاستئصال الخاص بالخلية مثل نظام نيتروريدوكتاز / ميترونيدازول30،31،32. يجب اختيار نماذج الاجتثاث هذه بناء على الغرض التجريبي. الاستئصال غير النوعي مناسب لإصابات الدماغ مثل جرح الطعنات والسكتة الدماغية. في المقابل ، قد يكون الاستئصال الخاص بالخلية أكثر ملاءمة لتقييم تنكس خلايا معينة مرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نماذج الإصابة الإقفارية باستخدام الزرد33 ، لكن هذه النماذج تحتاج إلى خطوط معدلة وراثيا ومجهر فلوري لمراقبة تدفق الدم. لذلك ، من الصعب تطبيق هذه النماذج على الأنواع ذات الأساليب الجينية الضعيفة ، وإنتاجيتها أقل من نموذج إصابة جرح الطعنة.
كما ذكر أعلاه ، فإن إصابة جرح الطعنة في القفص البصري بسيطة ويمكن تطبيقها بسهولة في نماذج الأسماك الصغيرة الأخرى مثل سمك الكيلي الأفريقي والموميشوغ باستخدام الأدوات الشائعة26. علاوة على ذلك ، تم التحقيق بشكل جيد في التحليل المقارن بين الأنواع باستخدام تقنية التسلسل. لذلك ، تظل هذه الطريقة البسيطة ضرورية عند دراسة القدرة التجديدية ل NSCs في الزرد باستخدام التحليل المقارن للاستجابات الخلوية والتعبير الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI رقم المنحة 18K14824 و 21K15195 ومنحة داخلية من AIST ، اليابان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , University of Oregon Press. (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
