Summary
描述了成年斑马鱼的机械脑损伤模型，以研究调节其高再生能力的分子机制。该方法解释了在多种小鱼的视顶上造成刺伤，以使用荧光免疫染色评估再生反应。
Abstract
虽然斑马鱼具有卓越的中枢神经系统（CNS）再生能力，但青鳉鱼具有较低的CNS再生能力。在斑马鱼和青鳉鱼的成年视顶中建立了脑损伤模型，并进行了比较组织学和分子分析，以阐明调节这些鱼类中该组织高再生能力的分子机制。这里提出了成人视顶的刺伤损伤模型，使用针头和组织学分析来分析神经干细胞（NSC）的增殖和分化。手动将针插入视顶的中心区域，然后对鱼进行心内灌注，并解剖它们的大脑。然后对这些组织进行冷冻切片，并使用针对适当的NSC增殖和分化标志物的免疫染色进行评估。这种顶盖损伤模型在斑马鱼和青鳉鱼中提供了可靠且可重复的结果，可以比较受伤后的NSC反应。这种方法可用于小型硬骨鱼，包括斑马鱼、青鳉鱼和非洲鳉鱼，使我们能够比较它们的再生能力并研究独特的分子机制。
Introduction
与其他哺乳动物相比，斑马鱼（Danio rerio）具有更高的中枢神经系统（CNS）再生能力1，2，3。最近，为了更好地了解这种再生能力增加的分子机制，已经使用下一代测序技术对组织再生进行了比较分析4，5，6。斑马鱼和四足动物的大脑结构完全不同7，8，9。这意味着已经开发了几种使用具有相似大脑结构和生物学特征的小鱼的脑损伤模型，以促进对有助于增加再生能力的潜在分子机制的研究。
此外，青鳉鱼（Oryzias latipes）是一种受欢迎的实验动物，与斑马鱼相比，心脏和神经元再生能力低10，11，12，13。斑马鱼和青鳉鱼具有相似的大脑结构和成体神经干细胞（NSC）的生态位14，15，16，17。在斑马鱼和青鳉鱼中，视顶包括两种类型的NSC，神经上皮样干细胞和径向神经胶质细胞（RGC）15，18。先前开发了成年斑马鱼视顶的刺伤损伤，该模型用于研究调节这些动物脑再生的分子机制19，20，21，22，23。这种年轻成年斑马鱼刺伤损伤模型诱导了RGC19，24，25的再生神经发生。这种视顶刺伤是一种稳健且可重复的方法13，19，20，21，22，23，24，25。当相同的损伤模型应用于成年青鳉鱼时，通过对损伤后RGC增殖和分化的比较分析，揭示了青鳉鱼视顶RGCs的低神经源性能力13。
木乃伊模型26 中也开发了视盖中的刺伤损伤模型，但与端脑损伤27 相比，顶盖损伤的细节尚未得到充分记录。使用斑马鱼和青鳉鱼在视顶的刺伤损伤可以研究具有不同再生能力的物种之间的差异细胞反应和基因表达。该协议描述了如何使用注射针在视顶进行刺伤。这种方法可以应用于斑马鱼和青鳉鱼等小鱼。本文介绍了使用荧光免疫组织化学和冷冻切片进行组织学分析以及细胞增殖和分化分析的样品制备过程。
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Protocol
所有实验方案均由国家先进工业科学技术研究所的机构动物护理和使用委员会批准。斑马鱼和青鳉鱼按照标准程序进行饲养28.
1.成人视顶刺伤
- 准备0.4%（w / v）三卡因储备溶液进行麻醉。对于 100 mL 储备溶液，将 400 mg 甲磺酸三卡因（参见 材料表）溶解在 90 mL 蒸馏水中，并使用 1 M Tris HCl 缓冲液 （pH 9.0） 将 pH 值调节至 7.0。调节pH值后，加入高达100mL的水，然后制作适当的等分试样并将其储存在-20°C。
- 为了麻醉成年斑马鱼或青鳉鱼，通过将0.4%的三卡因储备溶液与鱼设施水稀释来制备0.02%（w / v）三卡因溶液。
- 用0.02%三卡因溶液麻醉鱼;当他们不移动或对触摸做出反应时，它们会变得麻醉（1-2分钟）。
- 将麻醉的鱼放在聚苯乙烯泡沫塑料托盘上（见 材料表），并将鱼直立固定在垂直插入聚苯乙烯泡沫塑料中的两个 30 G 针之间。
- 握住鱼体以防止鱼头移动，并将30 G针穿过颅骨垂直插入其中一个视顶半球的内侧区域（图1A，B）。插入深度为 ~0.75 mm，几乎等于 30 G 斜面长度的一半。这种插入深度会导致斑马鱼和青鳉鱼的脑损伤，因为这些鱼的体型相似。
注意：青鳉鱼的头骨上有鳞片。使用30 G针划伤并去除鳞屑，以有效，准确地诱导刺伤（图1C）。 - 将受伤的鱼转移到装有新鲜鱼设施水的鱼缸中，并在从麻醉中完全恢复后将鱼缸移至鱼类繁殖系统。
注意：鱼会在几分钟内恢复并开始自由移动。 - 对于损伤后的谱系分析，制备含有5mM溴脱氧尿苷（BrdU）（参见 材料表）的新鲜鱼设施水，然后用该5mM BrdU溶液孵育鱼预定时间13，19 （由实验设计确定）。然后按照步骤2解剖这些鱼，并酌情评估BrdU掺入和细胞谱系身份。
注意：此步骤是细胞谱系分析的可选步骤。要检测BrdU信号，请执行步骤4.3所示的抗原修复。
2.脑解剖
- 准备0.02%三卡因溶液，用于解剖的聚苯乙烯泡沫塑料托盘和含有磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）的10 mL注射器，带有延长管和30 G针头（参见 材料表）用于心内灌注。
- 在选定的时间点麻醉受伤的鱼。
- 将纸巾放在聚苯乙烯泡沫塑料托盘上，然后将麻醉的鱼放在纸巾上。
- 通过在臀鳍的两侧垂直插入两根 30 G 针来将鱼体固定到位（图 2A）。
- 从肛门到心脏做一个腹侧切口（图2B），并通过在该器官的每一侧插入另外两根30 G针来保持心脏可见（图2C）。
注意：心脏被斑马鱼和青鳉鱼皮下皮下的银色上皮层覆盖（图2C）。 - 用镊子的尖端轻轻去除银上皮层（图2D）。
- 将30 G针插入心室，保持斜面向上，并使用镊子切入心房（图2E）。小心地按下注射器以推动1x PBS并确认心房冲洗了血液。
注意：为防止针头穿透心室，请小心地将针头插入半斜面的深度，然后调整插入深度。如果灌注做得好，鳃会变白（图2F，G）。 - 排出血液后停止灌注，鳃变白。
- 取下将鱼体固定到位的针头，并将鱼腹侧朝下固定（图2H）。切断脊髓并从视顶和端脑中取出颅骨（图2I）。然后，切断视神经并仔细解剖大脑。
注意：在解剖过程中要注意视神经，因为神经连接到顶盖。当视神经被拉动时，视顶可以从大脑中分离出来。如果血液去除未完成，大脑看起来呈浅粉红色（ 图2J中的右脑）。 - 将大脑转移到1.5mL管中，在1x PBS中加入1mL的4%多聚甲醛，并在4°C下固定过夜。
3. 冷冻切片的制备
- 在1x PBS中洗涤固定的大脑三次，每次5分钟。
- 为了冷冻保护大脑，将它们转移到1x PBS中含有1mL 30%（w / v）蔗糖的1.5mL管中，并在4°C下孵育过夜。 通过混合 30 mL OCT 和 15 mL 30% 蔗糖来制备包埋化合物（OCT 化合物和 30% 蔗糖的 2：1 混合物，参见 材料表）。将其储存在4°C。
注意：要从混合化合物中去除气泡，请在室温下以 10，000 x g 离心 50 mL 管 2 分钟或将管直立放置过夜。 - 将铝块在-80°C下孵育过夜，以便在解剖的大脑与包埋化合物一起嵌入冷冻体后立即冷却冷冻体（参见 材料表）。
注意：液氮也可用于冷却铝块。在这种情况下，铝块应放置在装有足够液氮的聚苯乙烯泡沫塑料盒中，以便在嵌入之前覆盖铝块。确认液氮升华后，将冷冻机放在预冷的铝块上。最好确认一次可以在铝块上放置多少个冷冻模具。建议使用液氮或额外的预冷块，以确保有足够的空间快速冷却所有样品。 - 将预冷的铝块放入聚苯乙烯泡沫塑料盒中。使用带盖的聚苯乙烯泡沫塑料盒，以防止铝块变暖。
- 对于冠状切片，将大脑嵌入冷冻机中，并在显微镜下使用镊子调整方向（图3A）。
- 将冷冻剂放在聚苯乙烯泡沫塑料盒中的预冷铝块上，让OCT化合物冻结（图3B）。当OCT化合物开始冻结时，它会变成白色。
- 在标本盘上涂上一小圈OCT化合物，并安装冷冻块以将冷冻块连接到标本盘上。
- 将样品盘放入低温恒温器中并完全冷冻OCT化合物。
- 将标本盘放在低温恒温器的标本头上。
- 设置冷冻块的方向并修剪 OCT 以删除任何额外的区域。
注意：在切割端脑时调整切割平面的方向。刀片配有低温恒温器。可以通过改变试样头的角度来调整切割平面的方向。 - 使用低温恒温器在整个光学顶盖上切割 14 μm 厚的连续切片。将载玻片储存在-25°C。
注意：长期储存应在-80°C。
4. 荧光免疫染色
- 在室温（RT）下在载玻片架中干燥载玻片30分钟。在室温下在 1x PBS 中洗涤载玻片 30 分钟。如果要使用抗PCNA或BrdU抗体进行免疫染色，请继续执行步骤4.2或步骤4.3。
- 在500mL烧杯中制备500mL的10mM柠檬酸钠，并在热板磁力搅拌器上将柠檬酸盐缓冲液加热至85°C，然后将载玻片放入载玻片染色架中，并将架子在85°C的柠檬酸盐缓冲液中孵育30分钟。为避免沸腾，请将温度保持在85°C左右。 抗原修复后，在1x PBS（PBSTr）的0.1%Triton中洗涤载玻片三次，每次洗涤在室温下需要5分钟。
注意：此步骤是增殖细胞核抗原（PCNA）修复的可选步骤。 - 通过在蒸馏水中稀释12N HCl来制备2N HCl溶液。使用液体阻断剂（参见 材料表），画一条线作为疏水屏障，以保持2 N HCl溶液围绕切片。
- 将载玻片放在免疫染色托盘上，并应用 200-300 μL 的 2N HCl 溶液。将托盘在37°C孵育30分钟。抗原修复后，在0.1%PBSTr中洗涤三次，每次洗涤在室温下洗涤5分钟。
注意：此步骤是BrdU抗原修复的可选步骤。
- 将载玻片放在免疫染色托盘上，并应用 200-300 μL 的 2N HCl 溶液。将托盘在37°C孵育30分钟。抗原修复后，在0.1%PBSTr中洗涤三次，每次洗涤在室温下洗涤5分钟。
- 吸收并用纸巾去除剩余的溶液。然后，根据需要使用液体阻滞剂绘制疏水屏障，以将抗体溶液保持在切片周围。
- 将载玻片放在托盘上，向每张载玻片上应用 200-300 μL 封闭溶液、3% （v/v） PBSTr 中的马血清，并将载玻片在室温下孵育 1 小时。
- 用PBSTr在室温下清洗切片5分钟，重复三次。
- 使用封闭溶液（每张载玻片200-300μL抗体溶液）制备一抗（参见 材料表）。用纸巾取出剩余的PBSTr，并将载玻片放在免疫染色托盘上。将一抗溶液应用于每张载玻片，并将托盘在4°C孵育过夜。
- 用PBSTr在室温下清洗切片5分钟，重复三次。
- 使用封闭缓冲液（1：500）制备荧光二抗溶液（见 材料表）。用纸巾取出剩余的PBSTr，并将载玻片放在免疫染色托盘上。用铝箔将二抗溶液涂在每张载玻片和遮阳托盘上。在室温下孵育1-2小时。
- 用PBSTr在室温下清洗切片5分钟三次，不要暴露在光线下。
- 制备Hoechst溶液（1x PBS中的1：500稀释，参见 材料表）用于核染色。用纸巾取出剩余的PBSTr，并将载玻片放在免疫染色托盘上。将Hoechst溶液应用于每张载玻片，并用铝箔覆盖托盘。在室温下孵育30分钟。
- 用 1x PBS 在室温下清洗切片 10 分钟，不要将它们暴露在光线下。
- 使用纸巾吸收并去除剩余的1x PBS，并使用水溶性封片介质（参见 材料表）将切片安装在载玻片上进行荧光免疫染色。慢慢地将 24 x 45 毫米的盖玻片放在切片上。储存在4°C，不要将载玻片暴露在光线下。
- 在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察切片并成像。
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Representative Results
使用针插入右半球的视顶刺伤（图1，图 4A和 图5A）诱导各种细胞反应，包括径向神经胶质细胞（RGC）增殖和新生神经元的产生。同样，斑马鱼和青鳉鱼的老年种群被用来抵消再生反应中的任何衰老影响。然后对冷冻切片进行荧光免疫染色，分析斑马鱼和青鳉鱼顶盖损伤后的RGC增殖和分化（图4-5）13。
使用斑马鱼和青鳉鱼中可用的针对增殖细胞标志物的抗体，增殖细胞抗原（PCNA）和RGC标志物，脑脂质结合蛋白（BLBP）来评估这些组织中的RGC增殖13，19。如前所述，大多数RGC在对侧未受伤半球中处于静止状态（PCNA阴性）（图4B）13。 尽管如此，RGC增殖是在青鳉顶受伤后2天（dpi）诱导的（图4C，D）13。损伤后诱导RGC增殖是斑马鱼和青鳉鱼再生反应的共同特征13，19。
BrdU标记是一种简单的方法，用于评估细胞谱系和分析脑损伤后的RGC分化（图5A）13。用泛神经元标志物、HuC 和 BrdU 的抗体进行免疫染色以前用于比较斑马鱼和青鳉鱼受伤顶盖中的 RGC 分化（图 5B，C）13。如果这些抗体在目标物种中可用，则可以进行比较分析。
如果损伤被适当诱导，损伤部位位于视顶的中央背侧区域（图 4C）。然后可以使用核染色以及苏木精和伊红染色来确认损伤部位13，19，20，21，22，23，24，25。受伤后，可以观察到具有核染色的脑室周围灰色区域紊乱（图4C）。如果损伤位于内侧背侧区域，则RGC增殖不会显着增加25。
图1：使用针头刺伤成人视顶 。 （A）成年斑马鱼的背视图。斑马鱼在垂直插入聚苯乙烯泡沫塑料中的两根弯曲针之间保持直立。（A'）（A） 中框框区域的放大图像。将 30 G 针插入视顶上称为 额 叶和顶 叶 的两个颅骨之间边界的内侧区域。黄色圆圈表示损伤部位，白色虚线表示视顶上的两个头骨。（B）成年青鳉鱼背视图。（二）（B） 中框框区域的放大图像。将30 G针插入视顶的边界。黄色圆圈表示损伤部位，白色虚线表示视顶上的两个头骨。（C）青鳉鱼头骨上有鳞片。颅骨鳞片应在刺伤前切除。虚线表示光学顶端的刻度。比例尺： A-B 为 2 毫米， A'、 B' 和 C 为 1 毫米。端脑（Tel），视顶（OT），额 叶 （F）和 顶 叶（P）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：小型成年鱼的心内灌注 。 （A）斑马鱼的腹侧视图固定在聚苯乙烯泡沫塑料上，使用弯曲的针头准备进行心内灌注和脑解剖。（B）腹侧切口从臀鳍的原点到胸部。（C）心脏位于斑马鱼和青鳉鱼中称为皮下组织的银色上皮层后面。在银上皮层旁边使用弯曲的针进行另一种固定，以便更容易进入。白色实线表示心室 （V），虚线表示皮下组织。（D）在1x PBS的心内灌注之前去除银上皮层。（E-G）将套管插入心室进行心内灌注。心内灌注前（F）和（G）后的鳃。如果血液去除不完全，鳃保持红色。（H-J）PBS灌注后进行脑解剖，以去除组织中的血液。如（I）所示，切除视顶和端脑上的颅骨。如果血液去除不完全，大脑看起来是浅粉红色的（（J）中的右脑）。比例尺： A-C 和 H 为 2 毫米， D-G 和 I-J 为 1 毫米。嗅球 （OB）、端脑 （Tel）、视顶 （OT）、动脉球 （Ba）、心室 （V） 和心房 （At）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：冷冻部分的大脑嵌入。 （A）大脑嵌入带有包埋化合物的冷冻体中。前部向下。（B）低温模具在预冷的铝块上冷却。端脑（电话），视顶（OT）。请点击此处查看此图的大图。
图4：成人青鳉鱼顶盖损伤后针对RGC增殖的荧光免疫染色的代表性结果 。 （A）视顶和冠状截面右半球刺伤示意图。（乙-丙）损伤后2天对侧未受伤（B）和受伤（C）侧增殖RGC（PCNA + BLBP +细胞）的代表性结果。 C' 中的白色箭头表示刺伤造成的脑室周围灰色地带紊乱。（D） （C） （C） 盒装区域的放大图像。（D）中的白色箭头表示PCNA + BLBP +单元格。比例尺：50 μm 在 B-D 中。经参考文献13许可改编。 请点击此处查看此图的大图。
图5：荧光免疫染色在顶盖损伤后生成新生儿神经元的代表性结果 。 （A）溴脱氧尿苷（BrdU）治疗与视顶和冠状动脉切片刺伤的示意图。（乙-丙）受伤斑马鱼（B）和青鳉鱼（C）受伤后7天新生儿神经元（BrdU + HuC +细胞）的代表性结果。比例尺：50 μm 在 B-C 中。经参考文献13许可改编。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这里描述了一组方法，可用于利用针头诱导视盖中的刺伤，以促进脑损伤后RGC增殖和分化的评估。针头介导的刺伤是一种简单、高效实施的方法，可以使用一套标准工具应用于许多实验样品。斑马鱼大脑几个区域的刺伤损伤模型已经开发出来3，19，29。视顶是大脑中最大的部分之一，易于操作。此外，与端脑相比，视顶中的大多数RGC在生理条件下是静止的，因此更容易观察到RGC的增殖和分化，具体取决于损伤3，19。
刺伤的关键步骤和限制之一是手动针头插入;一致的损伤对于创建可重复的结果和促进比较分析是必要的。插入的精确位置和深度至关重要，有助于在实验中产生可重复的损伤。本文为每次进行类似伤害提供了明确的指导方针。此外，损伤后RGC的增殖对于损伤顶盖的神经发生至关重要。在受伤的斑马鱼和青鳉鱼中，RGC 增殖在 1 dpi 时增加并恢复到基础水平，与对侧未受伤半球相同，为 7 dpi13，19。
刺伤是诱导非特异性细胞消融的机械损伤方法之一。相比之下，还开发了用于细胞特异性消融的转基因方法，例如硝基还原酶/甲硝唑系统30，31，32。这些消融模型应根据实验目的进行选择。非特异性消融适用于刺伤和缺血性中风等脑损伤。相比之下，细胞特异性消融可能更适合评估与神经退行性疾病（如帕金森病）相关的特定细胞的退化。
最近，已经开发了使用斑马鱼的缺血性损伤模型33种，但这些模型需要转基因系和荧光显微镜来监测血流。因此，这些模型很难应用于遗传方法较差的物种，并且它们的通量低于刺伤模型。
如上所述，视顶的刺伤很简单，很容易应用于其他小型鱼类模型，例如非洲鳉鱼和木乃伊鱼，使用常用工具26。此外，使用测序技术对物种之间的比较分析进行了很好的研究。因此，在通过细胞反应和基因表达的比较分析来研究斑马鱼中NSCs的再生能力时，这种简单的方法仍然是必不可少的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了JSPS KAKENHI授权号18K14824和21K15195以及日本AIST的内部资助的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
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