Summary
成体ゼブラフィッシュの機械的脳損傷モデルを用いて、ゼブラフィッシュの高い再生能力を調節する分子機構を調べることが記載されている。この方法は、蛍光免疫染色を用いて再生応答を評価するために、複数の種の小魚の視蓋に刺創損傷を作り出すことを説明している。
Abstract
ゼブラフィッシュは中枢神経系(CNS)の再生能力が優れていますが、メダカはCNSの再生能力が低いです。ゼブラフィッシュとメダカの成体視蓋で脳損傷モデルを開発し、これらの魚種全体でこの組織の高い再生能力を制御する分子メカニズムを解明するために、比較組織学的および分子学的解析を行いました。ここでは、針を使用した成人の視蓋の刺創損傷モデルと、神経幹細胞(NSC)の増殖と分化のための組織学的分析を示します。針を視蓋の中央領域に手動で挿入し、次に魚を心臓内に灌流し、そしてそれらの脳を解剖した。次に、これらの組織を凍結切片化し、適切なNSC増殖および分化マーカーに対して免疫染色を使用して評価しました。このテクタム損傷モデルは、ゼブラフィッシュとメダカの両方で堅牢で再現性のある結果を提供し、損傷後のNSC反応を比較することができます。この方法は、ゼブラフィッシュ、メダカ、アフリカメダカなどの小型硬骨魚に利用でき、それらの再生能力を比較し、独自の分子メカニズムを調べることができます。
Introduction
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、他の哺乳類と比較して中枢神経系(CNS)を再生する能力が向上しています1,2,3。最近、この再生能力の増加の根底にある分子メカニズムをよりよく理解するために、次世代シーケンシング技術を使用した組織再生の比較分析が行われています4,5,6。ゼブラフィッシュとテトラポッドの脳構造はかなり異なります7,8,9。これは、この再生能力の増加に寄与する基礎となる分子メカニズムの研究を容易にするために、同様の脳構造と生物学的特徴を持つ小魚を使用したいくつかの脳損傷モデルが開発されたことを意味します。
さらに、メダカ(Oryzias latipes)は、ゼブラフィッシュと比較して心臓およびニューロンの再生能力が低い人気のある実験動物です10,11,12,13。ゼブラフィッシュとメダカは、成体神経幹細胞(NSC)の脳構造とニッチが似ています14,15,16,17。ゼブラフィッシュとメダカでは、視蓋には神経上皮様幹細胞と放射状グリア細胞(RGC)の2種類のNSCが含まれています15,18。成体ゼブラフィッシュの視蓋の刺創損傷は以前に開発されており、このモデルを使用して、これらの動物の脳再生を制御する分子メカニズムを調査しました19,20,21,22,23。この若年成体のゼブラフィッシュ刺し傷損傷モデルは、RGCs19,24,25から再生神経新生を誘導した。視蓋におけるこの刺し傷損傷は、堅牢で再現性のある方法である13、19、20、21、22、23、24、25。同じ損傷モデルを成人メダカに適用したところ、損傷後のRGC増殖と分化の比較解析により、メダカ視野におけるRGCの神経原性能力が低いことが明らかになりました13。
視蓋の刺し傷損傷モデルは、ミイラモデル26でも開発されていますが、終脳損傷と比較した場合、蓋損傷の詳細は十分に文書化されていません27。ゼブラフィッシュとメダカを用いた視蓋の刺創損傷により、再生能力の異なる種間の細胞応答と遺伝子発現の違いを調べることができます。このプロトコルは、注射針を使用して視蓋の刺し傷損傷を行う方法を説明しています。この方法は、ゼブラフィッシュやメダカなどの小魚にも適用できます。ここでは、蛍光免疫組織化学および凍結切片を用いた組織学的解析および細胞増殖および分化解析のためのサンプル調製のプロセスについて説明します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての実験プロトコルは、国立研究開発法人産業技術総合研究所の動物管理・利用委員会で承認されました。ゼブラフィッシュとメダカは、標準的な手順28に従って維持されました。
1.成人の視蓋の刺し傷損傷
- 麻酔用の0.4%(w / v)トリカインストック溶液を調製します。100 mLのストック溶液の場合、400 mgのトリカインメタンスルホン酸塩( 材料の表を参照)を90 mLの蒸留水に溶解し、1 MトリスHClバッファー(pH 9.0)を使用してpHを7.0に調整します。pHが調整されたら、100 mLまでの水を加え、適切なアリコートを作り、-20°Cで保存します。
- 成体のゼブラフィッシュやメダカを麻酔するには、0.4%トリカイン原液を魚施設の水で希釈して、0.02%(w/v)のトリカイン溶液を調製します。
- 0.02%トリカイン溶液で魚を麻酔する。彼らは動かないか、タッチに反応しないとき(1〜2分)に麻酔をかけられます。
- 麻酔をかけた魚を発泡スチロールのトレイ( 材料の表を参照)に置き、発泡スチロールに垂直に挿入された2本の30G針の間に魚を直立させて固定します。
- 魚の頭が動かないように魚体を持ち、頭蓋から視蓋半球の1つの内側領域に30 Gの針を垂直に挿入します(図1A、B)。挿入深さは~0.75mmで、30Gのベベルの長さの半分にほぼ相当します。この挿入深さは、ゼブラフィッシュとメダカの体格が似ているため、これらの魚に脳損傷を誘発します。
注:メダカは頭蓋骨に鱗があります。30 Gの針を使用して鱗を引っ掻いて取り除き、刺し傷の損傷を効率的かつ正確に誘発します(図1C)。 - 負傷した魚を鮮魚施設の水を入れた水槽に移し、麻酔から完全に回復したら水槽を養殖システムに移します。
注:魚は回復し、数分以内に自由に動き始めます。 - 損傷後の系統分析のために、5 mMブロモデオキシウリジン(BrdU)を含む鮮魚施設の水を調製し(材料の表を参照)、次にこの5 mM BrdU溶液で魚を所定の時間インキュベートします13,19(実験計画によって決定)。次に、ステップ2に従ってこれらの魚を解剖し、BrdUの取り込みと細胞系譜の同一性を適宜評価します。
注:このステップは、細胞系譜解析のオプションステップです。BrdUシグナルを検出するには、ステップ4.3に示すように抗原賦活化を行います。
2.脳解剖
- 0.02%トリカイン溶液、解剖用の発泡スチロールトレイ、および心臓内灌流用の延長チューブと30 G針( 材料の表を参照)を備えたリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を含む10 mLシリンジを準備します。
- 選択した時点で負傷した魚を麻酔します。
- 発泡スチロールのトレイにペーパータオルを置き、麻酔をかけた魚をペーパータオルの上に置きます。
- 臀鰭の両側に2本の30G針を垂直に挿入して、魚体を所定の位置に保持します(図2A)。
- 肛門から心臓まで腹側を切開し(図2B)、この臓器の両側にさらに2本の30G針を挿入して心臓を見えるようにします(図2C)。
注:心臓は、ゼブラフィッシュとメダカの両方で皮下組織の銀色の上皮層で覆われています(図2C)。 - 鉗子の先端で銀の上皮層をそっと取り除きます(図2D)。
- 30 Gの針を心室に挿入し、斜角を上に保ち、鉗子を使用して心房を切開します(図2E)。シリンジを慎重に押し下げて1x PBSを押し、心房が血液を洗い流したことを確認します。
注意: 針が心室を貫通するのを防ぐために、針をハーフベベルの深さまで慎重に挿入してから、挿入深さを調整します。灌流がうまくいけば、えらは白くなります(図2F、G)。 - 血液が排出され、えらが白くなったら灌流を止めます。
- 魚体を所定の位置に固定している針を取り外し、魚の腹側を下にして固定します(図2H)。脊髄を切断し、視蓋と終脳から頭蓋骨を取り除きます(図2I)。次に、視神経を切断し、脳を慎重に解剖します。
注:神経は蓋に接続されているため、解剖中は視神経に注意してください。視神経が引っ張られると、視蓋が脳から剥離することができます。血液除去が完了していない場合、脳は淡いピンク色に見えます( 図2Jの右脳)。 - 脳を1x PBS中の1 mLの4%パラホルムアルデヒドを含む1.5 mLチューブに移し、4°Cで一晩固定します。
3.凍結切片の準備
- 固定された脳を1x PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
- 脳を凍結保護するには、1x PBS中の1 mLの30%(w / v)スクロースを含む1.5 mLチューブに移し、4°Cで一晩インキュベートします。 30 mLのOCTと15 mLの30%スクロースを組み合わせて、包埋化合物(OCT化合物と30%スクロースの2:1混合物、 材料の表を参照)を調製します。これを4°Cで保存してください。
注意: 混合コンパウンドから気泡を除去するには、50 mLチューブを10,000 x g で室温で2分間遠心分離するか、チューブを一晩直立させます。 - 解剖した脳を埋め込み化合物とともにクライオモールドに埋め込んだ直後に、アルミニウムブロックを-80°Cで一晩インキュベートして、クライオモールド( 材料の表を参照)を冷却します。
注意: 液体窒素を使用して、アルミニウムブロックを冷却することもできます。その場合、アルミニウムブロックは、埋め込む直前にアルミニウムブロックを覆うのに十分な液体窒素で満たされた発泡スチロールの箱に入れる必要があります。液体窒素の昇華を確認したら、予冷したアルミニウムブロックの上にクライオモールドを置きます。一度にいくつのクライオモールドをアルミブロックに配置できるかを確認することをお勧めします。液体窒素または追加の予冷ブロックを使用して、すべてのサンプルをすばやく冷却するのに十分なスペースを確保することをお勧めします。 - 予冷したアルミブロックを発泡スチロールの箱に入れます。アルミブロックが温まるのを防ぐために、蓋付きの発泡スチロールの箱を使用してください。
- 冠状切片の場合は、脳をクライオモールドに埋め込み、顕微鏡下で鉗子を使用して向きを調整します(図3A)。
- 発泡スチロールボックス内の予冷アルミニウムブロックにクライオモールドを置き、OCTコンパウンドを凍結させます(図3B)。OCT化合物が凍結し始めると、白色になります。
- OCT化合物の小さな円を試料ディスクに塗布し、クライオブロックをマウントしてクライオブロックを試料ディスクに取り付けます。
- 検体ディスクをクライオスタットに入れ、OCTコンパウンドを完全に凍結させます。
- 試料ディスクをクライオスタットの試料ヘッドに置きます。
- クライオブロックの向きを設定し、OCT をトリミングして余分な領域を削除します。
注意: 終脳を切断しながら、切断面の向きを調整します。ブレードにはクライオスタットが装備されています。試験片ヘッドの角度を変えることで切断面の向きを調整することができます。 - クライオスタットを使用して、光学蓋全体を通して厚さ14μmのシリアルセクションを切断します。スライドは-25°Cで保管してください。
注意: 長期保管は-80°Cである必要があります。
4. 蛍光免疫染色
- 乾いたガラスをスライドラックに室温(RT)で30分間スライドさせます。スライドを1x PBSでRTで30分間洗浄します。抗PCNA抗体またはBrdU抗体による免疫染色を行う場合は、ステップ4.2またはステップ4.3に進みます。
- 500 mLビーカーに500 mLの10 mMクエン酸ナトリウムを調製し、ホットプレートマグネチックスターラーでクエン酸バッファーを85°Cに温めてから、スライド染色ラックに入れ、ラックをクエン酸バッファー中で85°Cで30分間インキュベートします。沸騰しないように、温度を約85°Cに保ちます。 抗原賦活化後、スライドを1x PBS(PBSTr)中の0.1%トリトンで3回洗浄し、各洗浄はRTで5分かかります。
注:このステップは、増殖細胞核抗原(PCNA)検索のためのオプションのステップです。 - 12 N HClを蒸留水で希釈して、2 N HCl溶液を調製します。液体ブロッカー( 材料の表を参照)を使用して、疎水性バリアとして線を引き、2 N HCl溶液を切片の周りに保ちます。
- スライドを免疫染色トレイに置き、200〜300 μLの2N HCl溶液を塗布します。トレイを37°Cで30分間インキュベートします。抗原賦活化後、0.1%PBSTrで3回洗浄し、各洗浄はRTで5分間かかります。
注:このステップは、BrdU抗原賦活化のためのオプションのステップです。
- スライドを免疫染色トレイに置き、200〜300 μLの2N HCl溶液を塗布します。トレイを37°Cで30分間インキュベートします。抗原賦活化後、0.1%PBSTrで3回洗浄し、各洗浄はRTで5分間かかります。
- ペーパータオルを使用して残りの溶液を吸収して除去します。次に、液体ブロッカーを使用して疎水性バリアを描画し、必要に応じて抗体溶液を切片の周りに保持します。
- スライドをトレイに置き、200〜300 μLのブロッキング溶液、PBSTr中の3%(v / v)ウマ血清をすべてのスライドに適用し、RTで1時間インキュベートします。
- 切片をPBSTrでRTで5分間洗浄し、3回繰り返します。
- ブロッキング溶液(スライドごとに200〜300 μLの抗体溶液)を使用して一次抗体( 材料の表を参照)を調製します。ペーパータオルで残りのPBSTrを取り除き、スライドを免疫染色トレイに置きます。一次抗体溶液をすべてのスライドに適用し、トレイを4°Cで一晩インキュベートします。
- 切片をPBSTrでRTで5分間洗浄し、3回繰り返します。
- ブロッキングバッファー(1:500)を使用して蛍光二次抗体溶液( 材料の表を参照)を調製します。ペーパータオルで残りのPBSTrを取り除き、スライドを免疫染色トレイに置きます。二次抗体溶液をすべてのスライドに塗布し、アルミホイルでトレイをシェードします。RTで1〜2時間インキュベートします。
- 切片をPBSTrでRTで5分間、光にさらさずに3回洗浄します。
- 核染色用のヘキスト溶液(1x PBSで1:500希釈、 材料表を参照)を調製します。ペーパータオルで残りのPBSTrを取り除き、スライドを免疫染色トレイに置きます。すべてのスライドにHoechstソリューションを適用し、トレイをアルミホイルで覆います。RTで30分間インキュベートします。
- 切片を光にさらさずにRTで10分間1x PBSで洗浄します。
- ペーパータオルを使用して残りの1x PBSを吸収して除去し、蛍光免疫染色用の水溶性封入剤( 材料の表を参照)を使用してスライドに切片をマウントします。24 x 45 mmのカバーガラスをセクションにゆっくりとセットします。スライドを光にさらさずに4°Cで保存してください。
- 蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡下で切片を観察し、画像化します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
右半球への針挿入による視蓋の刺し傷損傷(図1、 図4A、 図5A)は、放射状グリア細胞(RGC)の増殖や新生児ニューロンの生成など、さまざまな細胞応答を誘導します。同様に、ゼブラフィッシュとメダカの高齢集団は、再生応答における老化の影響を打ち消すために使用されました。その後、凍結切片に対して蛍光免疫染色を行い、ゼブラフィッシュとメダカのテクタム損傷後のRGC増殖と分化を解析しました(図4-5)13。
ゼブラフィッシュおよびメダカで利用可能な増殖細胞マーカー、増殖細胞抗原(PCNA)、およびRGCマーカー、脳脂質結合タンパク質(BLBP)に対する抗体を用いて、これらの組織におけるRGC増殖を評価した13、19。前述のように、ほとんどのRGCは、反対側の無傷の半球で静止(PCNA陰性)でした(図4B)13。それでも、RGC増殖はメダカ蓋の損傷後2日(dpi)に誘導されました(図4C、D)13。損傷後のRGC増殖の誘導は、ゼブラフィッシュとメダカの両方の再生応答に共通する特徴である13,19。
BrdU標識は、細胞系譜を評価し、脳損傷後のRGC分化を分析するために使用される簡単な方法です(図5A)13。汎神経マーカーであるHuC、およびBrdUに対する抗体による免疫染色は、ゼブラフィッシュとメダカの損傷した蓋骨におけるRGC分化を比較するために以前に使用されていました(図5B、C)13。これらの抗体が標的種で入手可能であれば、比較解析を行うことができます。
損傷が適切に誘発される場合、損傷部位は視蓋の中心背側領域に位置する(図4C)。次いで、核染色ならびにヘマトキシリンおよびエオジン染色を使用して、損傷部位13、19、20、21、22、23、24、25を確認することができる。損傷後、核染色を伴う脳室周囲グレーゾーンの乱れが観察されます(図4C)。損傷が内側背側領域にある場合、RGC増殖は有意に増加しない25。
図1:針を用いた成体の視蓋の刺し傷損傷 。 (A)成体のゼブラフィッシュの背側図。ゼブラフィッシュは、発泡スチロールに垂直に挿入された2本の曲がった針の間で直立した状態に保たれます。(A')(A)における四角部分の拡大画像。30 Gの針は、視蓋上のオス フロンターレとオス 頭頂と呼ばれる2つの 頭 蓋骨の間の境界の内側領域に挿入されます。黄色の円は損傷部位を示し、白い破線は視蓋上の2つの頭蓋骨を示します。(B)大人のメダカの背側図。(B')(B)における四角部分の拡大画像である。30Gの針を視蓋の境界に挿入します。黄色の円は損傷部位を示し、白い破線は視蓋上の2つの頭蓋骨を示します。(C)メダカは頭蓋骨に鱗があります。頭蓋骨の鱗は、刺し傷の怪我の前に取り除く必要があります。破線は視蓋上の目盛りを示す。スケールバー: A-Bで2ミリメートル、 A'、 B' および Cで1ミリメートル。終脳(Tel)、視蓋(OT)、 osフロンターレ (F)、および 頭頂( P)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:小型成魚の心臓内灌流 。 (A)心臓内灌流と脳解離の準備ができている曲がった針を使用して発泡スチロールに固定されたゼブラフィッシュの腹側図。(B)腹側切開は、肛門鰭の起点から胸部まで行われます。(C)心臓は、ゼブラフィッシュとメダカの両方で皮下組織と呼ばれる銀色の上皮層の後ろにあります。銀上皮層の横にある曲がった針を使用した別の固定により、より簡単にアクセスできます。白い実線は心室(V)を示し、点線は皮下組織を示します。(D)銀上皮層は、1x PBSの心内灌流の前に除去されます。(E-G)カニューラは心臓内灌流のために心室に挿入されます。心臓内灌流の前(F)と後のえら。除血が完了していない場合、えらは赤のままです。(H-J)組織から血液を除去するためのPBS灌流後の脳解剖。(I)に示すように、視蓋と終脳の頭蓋骨を取り除きます。除血が完了していない場合、脳は薄いピンク色に見えます(J)の右脳)。スケールバー: A-C および Hで2ミリメートル、 D-GとI-J で1ミリメートル 。 嗅球(OB)、終脳(Tel)、視神経(OT)、動脈球(Ba)、心室(V)、および心房(At)である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:凍結切片の脳埋め込み 。 (A)脳は、埋め込み化合物を含むクライオモールドに埋め込まれています。前部がダウンしています。(B)凍結成形品は、予冷されたアルミニウムブロック上で冷却される。終脳(電話)、視蓋(OT)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:成人メダカにおけるテクタム損傷後のRGC増殖に対する蛍光免疫染色の代表的な結果 。 (a)視蓋および冠状断面の右半球への刺し傷損傷の模式図。(B-C)損傷後2日目における反対側の無傷(B)および負傷(C)側における増殖性RGC(PCNA+BLBP+細胞)の代表的な結果。 C' の白い矢印は、刺創損傷による脳室周囲グレーゾーンの乱れを示す。(D)(C)の四角部分の拡大画像。(D)中の白い矢印はPCNA+BLBP+細胞を示す。スケールバー: B-Dで50μm。参考文献13の許可を得て適応。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:テクタム損傷後の新生児ニューロンの生成に対する蛍光免疫染色の代表的な結果 。 (a)視蓋および冠状断面におけるブロモデオキシウリジン(BrdU)治療および刺し傷損傷の模式図。(B-C)損傷したゼブラフィッシュ(B)およびメダカ(C)における損傷後7日目の新生児ニューロン(BrdU+HuC+細胞)の代表的な結果。スケールバー: B-Cで50μm。参考文献13の許可を得て適応。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、脳損傷後のRGC増殖および分化の評価を容易にするために針を利用して視蓋に刺創損傷を誘発するために使用できる一連の方法について説明する。針介在刺創は、シンプルで効率的に実装された方法であり、標準的なツールセットを使用して多くの実験サンプルに適用できます。ゼブラフィッシュ脳のいくつかの領域についての刺し傷損傷モデルが開発されている3、19、29。視蓋は脳の最も大きな部分の1つであり、操作が簡単です。さらに、視蓋内のほとんどのRGCは、終脳と比較して生理学的条件下で静止しているため、損傷に応じてRGCの増殖と分化を観察しやすくなります3,19。
刺し傷の重要なステップと制限の1つは、手動の針挿入です。再現性のある結果を作成し、比較分析を容易にするには、一貫した損傷が必要です。挿入の正確な位置と深さは非常に重要であり、実験で再現可能な損傷を作成するのに役立ちます。この論文は、毎回同様の怪我をするための明確なガイドラインを提供します。さらに、損傷後のRGCの増殖は、損傷した蓋の神経新生に不可欠です。負傷したゼブラフィッシュとメダカでは、RGCの増殖は1 dpiで増加し、反対側の損傷していない半球と同じように、7 dpi13,19で基底レベルに戻ります。
刺し傷損傷は、非特異的な細胞アブレーションを誘発する機械的損傷方法の1つです。対照的に、ニトロレダクターゼ/メトロニダゾール系などの細胞特異的アブレーションへのトランスジェニックアプローチも開発されています30、31、32。これらのアブレーションモデルは、実験目的に基づいて選択する必要があります。非特異的アブレーションは、刺し傷や虚血性脳卒中などの脳損傷に適しています。対照的に、パーキンソン病などの神経変性疾患に関連する特定の細胞の変性を評価するには、細胞特異的アブレーションがより適切である可能性があります。
最近、ゼブラフィッシュを用いた虚血性損傷モデルが開発されているが33、これらのモデルは血流を監視するためにトランスジェニックラインと蛍光顕微鏡検査を必要とする。したがって、これらのモデルは、遺伝的アプローチが不十分な種に適用するのは困難であり、そのスループットは刺し傷モデルよりも低くなります。
上述のように、視蓋における刺創損傷は単純であり、一般的な道具を用いてアフリカメダカおよびミイラなどの他の小魚モデルに容易に適用される26。さらに、種間の比較分析は、シーケンシング技術を使用して十分に調査されています。したがって、この簡単な方法は、細胞応答と遺伝子発現の比較解析を使用してゼブラフィッシュのNSCの再生能力を研究する際に依然として不可欠です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
本研究は、JSPS科研費18K14824、21K15195、および産総研学内助成の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , University of Oregon Press. (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
