Summary
Viene descritto un modello di lesione cerebrale meccanica nel pesce zebra adulto per studiare i meccanismi molecolari che regolano la loro elevata capacità rigenerativa. Il metodo spiega di creare una ferita da taglio nel tectum ottico di più specie di piccoli pesci per valutare le risposte rigenerative utilizzando l'immunocolorazione fluorescente.
Abstract
Mentre i pesci zebra hanno una capacità superiore di rigenerare il loro sistema nervoso centrale (SNC), il medaka ha una capacità rigenerativa del SNC inferiore. È stato sviluppato un modello di lesione cerebrale nel tectum ottico adulto di zebrafish e medaka e sono state eseguite analisi istologiche e molecolari comparative per chiarire i meccanismi molecolari che regolano l'elevata capacità rigenerativa di questo tessuto in queste specie di pesci. Qui viene presentato un modello di lesione da coltellata per il tectum ottico adulto utilizzando un ago e analisi istologiche per la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali neurali (NSC). Un ago è stato inserito manualmente nella regione centrale del tectum ottico, quindi i pesci sono stati perfusi intracardicamente e i loro cervelli sono stati sezionati. Questi tessuti sono stati quindi criosezionati e valutati utilizzando immunocolorazione contro i marcatori di proliferazione e differenziazione NSC appropriati. Questo modello di lesione del tectum fornisce risultati robusti e riproducibili sia nel pesce zebra che nel medaka, consentendo di confrontare le risposte NSC dopo l'infortunio. Questo metodo è disponibile per piccoli teleostei, tra cui zebrafish, medaka e killifish africani, e ci consente di confrontare la loro capacità rigenerativa e studiare meccanismi molecolari unici.
Introduction
Il pesce zebra (Danio rerio) ha una maggiore capacità di rigenerare il sistema nervoso centrale (SNC) rispetto ad altri mammiferi 1,2,3. Recentemente, per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla base di questa maggiore capacità rigenerativa, sono state eseguite analisi comparative della rigenerazione tissutale utilizzando la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione 4,5,6. Le strutture cerebrali nei pesci zebra e nei tetrapodi sono molto diverse 7,8,9. Ciò significa che sono stati sviluppati diversi modelli di lesioni cerebrali che utilizzano piccoli pesci con strutture cerebrali e caratteristiche biologiche simili per facilitare lo studio dei meccanismi molecolari sottostanti che contribuiscono a questa maggiore capacità rigenerativa.
Inoltre, medaka (Oryzias latipes) è un animale da laboratorio popolare con una bassa capacità di rigenerazione cardiaca e neuronale10,11,12,13 rispetto al pesce zebra. Zebrafish e medaka hanno strutture cerebrali e nicchie simili per le cellule staminali neurali adulte (NSC)14,15,16,17. Nel pesce zebra e nel medaka, il tectum ottico comprende due tipi di CSN, cellule staminali simil-neuroepiteliali e cellule gliali radiali (RGC)15,18. In precedenza era stata sviluppata una lesione da coltellata per il tectum ottico del pesce zebra adulto, e questo modello è stato utilizzato per studiare i meccanismi molecolari che regolano la rigenerazione cerebrale in questi animali 19,20,21,22,23. Questo modello di lesione da ferita da pugnalata di zebrafish giovane adulto ha indotto neurogenesi rigenerativa da RGC 19,24,25. Questa ferita da taglio nel tectum ottico è un metodo robusto e riproducibile 13,19,20,21,22,23,24,25. Quando lo stesso modello di lesione è stato applicato al medaka adulto, la bassa capacità neurogena degli RGC nel tectum ottico medaka è stata rivelata attraverso l'analisi comparativa della proliferazione e differenziazione degli RGC dopo la lesione13.
I modelli di lesione da taglio nel tectum ottico sono stati sviluppati anche nei modelli di mummichog26, ma i dettagli della lesione del tectum non sono stati ben documentati rispetto alla lesione telencefalica27. La lesione da coltellata nel tectum ottico utilizzando zebrafish e medaka consente lo studio delle risposte cellulari differenziali e dell'espressione genica tra specie con capacità rigenerativa differenziale. Questo protocollo descrive come eseguire una ferita da taglio nel tectum ottico usando un ago per iniezione. Questo metodo può essere applicato a piccoli pesci come zebrafish e medaka. I processi per la preparazione del campione per l'analisi istologica e l'analisi della proliferazione e differenziazione cellulare mediante immunoistochimica fluorescente e criosezioni sono spiegati qui.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso il National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Zebrafish e medaka sono stati mantenuti secondo procedure standard28.
1. Ferita da taglio nel tectum ottico adulto
- Preparare una soluzione madre di tricaina allo 0,4% (p/v) per l'anestesia. Per una soluzione madre da 100 ml, sciogliere 400 mg di tricaina metansolfonato (vedere Tabella dei materiali) in 90 mL di acqua distillata e regolare il pH a 7,0 utilizzando tampone Tris HCl 1 M (pH 9,0). Una volta regolato il pH, aggiungere acqua fino a 100 ml, quindi fare aliquote appropriate e conservarle a -20 °C.
- Per anestetizzare il pesce zebra adulto o il medaka, preparare una soluzione di tricaina allo 0,02 % (p/v) diluendo la soluzione di brodo di tricaina allo 0,4 % con acqua di impianto per pesci.
- Anestetizzare il pesce con una soluzione di tricaina allo 0,02%; Diventano anestetizzati quando non si muovono o rispondono al tocco (1-2 min).
- Posizionare il pesce anestetizzato su un vassoio di polistirolo (vedi Tabella dei materiali) e fissare il pesce in posizione verticale tra due aghi da 30 G inseriti verticalmente nel polistirolo.
- Tenere il corpo del pesce per evitare che la testa del pesce si muova e inserire verticalmente un ago da 30 G attraverso il cranio nella regione mediale di uno degli emisferi del tectum ottico (Figura 1A,B). La profondità di inserimento è ~0,75 mm, quasi pari alla metà della lunghezza dello smusso da 30 G. Questa profondità di inserimento induce lesioni cerebrali su zebrafish e medaka a causa delle dimensioni corporee simili di questi pesci.
NOTA: Medaka ha squame sul cranio. Gratta e rimuovi le squame usando l'ago da 30 G per indurre in modo efficiente e preciso la ferita da taglio (Figura 1C). - Trasferire il pesce ferito in un acquario con acqua fresca dell'impianto di pesce e spostare l'acquario nel sistema di allevamento dei pesci una volta che si sono completamente ripresi dall'anestesia.
NOTA: I pesci si riprenderanno e inizieranno a muoversi liberamente in pochi minuti. - Per l'analisi del lignaggio dopo la lesione, preparare acqua fresca di impianto per pesci contenente 5 mM di bromodeossiuridina (BrdU) (vedi tabella dei materiali) e quindi incubare il pesce con questa soluzione di BrdU 5 mM per un periodo di tempo predeterminato13,19 (come determinato da un disegno sperimentale). Quindi sezionare questi pesci come da fase 2 e valutare l'incorporazione di BrdU e l'identità della linea cellulare come appropriato.
NOTA: questo passaggio è facoltativo per l'analisi della linea cellulare. Per rilevare i segnali BrdU, eseguire il recupero dell'antigene come mostrato al punto 4.3.
2. Dissezione cerebrale
- Preparare una soluzione di tricaina allo 0,02%, un vassoio di polistirolo per la dissezione e una siringa da 10 ml contenente soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) con un tubo di prolunga e aghi da 30 G (vedere la tabella dei materiali) per la perfusione intracardica.
- Anestetizzare il pesce ferito in punti temporali selezionati.
- Posizionare i tovaglioli di carta sul vassoio di polistirolo e posizionare il pesce anestetizzato sugli asciugamani di carta.
- Tenere il corpo del pesce in posizione inserendo verticalmente due aghi da 30 G su entrambi i lati della pinna anale (Figura 2A).
- Fare un'incisione ventrale dall'ano al cuore (Figura 2B) e mantenere il cuore visibile inserendo altri due aghi da 30 G su ciascun lato di questo organo (Figura 2C).
NOTA: Il cuore è coperto dallo strato epiteliale argenteo dell'ipoderma sia nel pesce zebra che nel medaka (Figura 2C). - Rimuovere delicatamente lo strato epiteliale d'argento con la punta della pinza (Figura 2D).
- Inserire l'ago da 30 G nel ventricolo, mantenendo la smussatura verso l'alto, ed effettuare un'incisione nell'atrio usando la pinza (Figura 2E). Premere con cautela sulla siringa per spingere 1x PBS e confermare che l'atrio ha lavato il sangue.
NOTA: Per evitare che l'ago penetri nel ventricolo, inserire con cautela l'ago alla profondità della mezza smussatura e quindi regolare la profondità di inserimento. Se la perfusione è ben fatta, le branchie diventano bianche (Figura 2F,G). - Fermare la perfusione dopo che il sangue è stato drenato e le branchie diventano bianche.
- Rimuovere gli aghi che fissano il corpo del pesce in posizione e fissare il lato ventrale del pesce verso il basso (Figura 2H). Tagliare il midollo spinale e rimuovere il cranio dal tectum ottico e dal telencefalo (Figura 2I). Quindi, tagliare i nervi ottici e sezionare attentamente il cervello.
NOTA: Attenzione ai nervi ottici durante la dissezione perché i nervi sono collegati al tetto. Quando il nervo ottico viene tirato, il tectum ottico può essere staccato dal cervello. Se la rimozione del sangue non è completa, il cervello appare rosa chiaro (il cervello destro nella Figura 2J). - Trasferire il cervello in provette da 1,5 mL con 1 mL di paraformaldeide al 4% in 1x PBS e fissarle per una notte a 4 °C.
3. Preparazione delle sezioni congelate
- Lavare i cervelli fissi tre volte in 1x PBS per 5 minuti ciascuno.
- Per crioproteggere il cervello, trasferirli in provette da 1,5 ml con 1 mL di saccarosio al 30 % (p/v) in 1x PBS e incubarli per una notte a 4 °C. Preparare il composto incorporante (miscela 2:1 di composto PTOM e 30% di saccarosio, cfr. tabella dei materiali) combinando 30 ml di PTOM e 15 ml di saccarosio al 30 %. Conservare a 4 °C.
NOTA: Per rimuovere le bolle dal composto miscelato, centrifugare i tubi da 50 ml a 10.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente o posizionare i tubi in posizione verticale durante la notte. - Incubare un blocco di alluminio durante la notte a -80 °C per raffreddare il criomold (vedi Tabella dei materiali) immediatamente dopo che il cervello sezionato è incorporato nel criomold con il composto incorporato.
NOTA: l'azoto liquido può essere utilizzato anche per raffreddare il blocco di alluminio. In tal caso, il blocco di alluminio deve essere collocato in una scatola di polistirolo riempita con azoto liquido sufficiente a coprire il blocco di alluminio appena prima dell'incorporamento. Dopo aver confermato la sublimazione dell'azoto liquido, posizionare il criomold sul blocco di alluminio preraffreddato. È meglio confermare quanti criostampi possono essere posizionati sul blocco di alluminio contemporaneamente. Si consiglia di utilizzare azoto liquido o un blocco preraffreddato aggiuntivo per garantire spazio sufficiente per raffreddare rapidamente tutti i campioni. - Metti il blocco di alluminio preraffreddato in una scatola di polistirolo. Utilizzare una scatola di polistirolo con un coperchio per evitare che il blocco di alluminio si riscaldi.
- Per le sezioni coronali, incorporare il cervello in un criomold e regolare l'orientamento usando una pinza al microscopio (Figura 3A).
- Posizionare il criomold sul blocco di alluminio preraffreddato nella scatola di polistirolo e lasciare congelare il composto OCT (Figura 3B). Quando il composto OCT inizia a congelare, diventa bianco.
- Applicare un piccolo cerchio di composto OCT su un disco campione e montare il crioblocco per attaccare il crioblocco al disco del campione.
- Posizionare il disco del campione nel criostato e congelare completamente il composto OCT.
- Posizionare il disco del campione sulla testa del campione nel criostato.
- Impostare l'orientamento del crioblocco e tagliare lo Strumento di personalizzazione di Office per rimuovere eventuali regioni aggiuntive.
NOTA: regolare l'orientamento del piano di taglio durante il taglio del telencefalo. La lama è dotata di un criostato. È possibile regolare l'orientamento del piano di taglio modificando l'angolo della testa del campione. - Tagliare sezioni seriali spesse 14 μm attraverso l'intero tectum ottico utilizzando un criostato. Conservare i vetrini a -25 °C.
NOTA: la conservazione a lungo termine deve essere a -80 °C.
4. Immunocolorazione fluorescente
- Vetrini asciutti in un portavetri per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare i vetrini in 1x PBS per 30 minuti su RT. Se è necessario eseguire l'immunocolorazione con anticorpi anti-PCNA o BrdU, procedere al punto 4.2 o al punto 4.3.
- Preparare 500 mL di citrato di sodio da 10 mM in un becher da 500 mL e riscaldare il tampone citrato a 85 °C su un agitatore magnetico a piastra calda, quindi posizionare i vetrini in uno scaffale di colorazione dei vetrini e incubare il rack nel tampone citrato a 85 °C per 30 minuti. Per evitare l'ebollizione, mantenere la temperatura intorno agli 85 °C. Dopo il recupero dell'antigene, lavare i vetrini tre volte in Triton allo 0,1% in 1x PBS (PBSTr), con ogni lavaggio che richiede 5 minuti a RT.
NOTA: questo passaggio è facoltativo per il recupero dell'antigene nucleare cellulare proliferante (PCNA). - Preparare una soluzione di 2 N HCl diluendo 12 N HCl in acqua distillata. Utilizzando un bloccante liquido (vedere Tabella dei materiali), tracciare una linea come barriera idrofobica per mantenere la soluzione di 2 N HCl attorno alle sezioni.
- Posizionare i vetrini su vassoi immunocoloranti e applicare 200-300 μL della soluzione di 2N HCl. Incubare le vaschette a 37 °C per 30 min. Dopo il recupero dell'antigene, lavare tre volte con PBSTr allo 0,1% e ogni lavaggio richiede 5 minuti a RT.
NOTA: questo passaggio è facoltativo per il recupero dell'antigene BrdU.
- Posizionare i vetrini su vassoi immunocoloranti e applicare 200-300 μL della soluzione di 2N HCl. Incubare le vaschette a 37 °C per 30 min. Dopo il recupero dell'antigene, lavare tre volte con PBSTr allo 0,1% e ogni lavaggio richiede 5 minuti a RT.
- Assorbire e rimuovere la soluzione rimanente usando carta assorbente. Quindi, utilizzare un bloccante liquido per disegnare una barriera idrofobica per mantenere la soluzione anticorpale intorno alle sezioni, se necessario.
- Posizionare i vetrini su vassoi e applicare 200-300 μL di soluzione bloccante, siero di cavallo al 3% (v/v) in PBSTr) su ogni vetrino e incubare i vetrini per 1 ora a RT.
- Lavare le sezioni con PBSTr per 5 minuti a RT e ripetere tre volte.
- Preparare gli anticorpi primari (vedere Tabella dei materiali) utilizzando la soluzione bloccante (200-300 μL di soluzione anticorpale per ciascun vetrino). Rimuovere il PBSTr rimanente con carta assorbente e posizionare i vetrini sui vassoi immunomacchianti. Applicare la soluzione anticorpale primaria su ogni vetrino e incubare i vassoi per una notte a 4 °C.
- Lavare le sezioni con PBSTr per 5 minuti a RT e ripetere tre volte.
- Preparare una soluzione di anticorpi secondari fluorescenti (vedere Tabella dei materiali) utilizzando il tampone bloccante (1:500). Rimuovere il PBSTr rimanente con carta assorbente e posizionare i vetrini sui vassoi immunomacchianti. Applicare la soluzione anticorpale secondaria su ogni vetrino e vassoi ombreggianti con un foglio di alluminio. Incubare per 1-2 ore a RT.
- Lavare le sezioni con PBSTr per 5 minuti a RT tre volte senza esporle alla luce.
- Preparare la soluzione di Hoechst (diluizione 1:500 in 1x PBS, vedere Tabella dei materiali) per la colorazione nucleare. Rimuovere il PBSTr rimanente con carta assorbente e posizionare i vetrini sui vassoi immunomacchianti. Applicare la soluzione Hoechst su ogni vetrino e coprire i vassoi con un foglio di alluminio. Incubare per 30 minuti a RT.
- Lavare le sezioni con 1x PBS per 10 minuti a RT senza esporle alla luce.
- Assorbire e rimuovere il restante 1x PBS usando tovaglioli di carta e montare le sezioni su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio solubile in acqua (vedere Tabella dei materiali) per l'immunocolorazione fluorescente. Posizionare lentamente una slitta di copertura di 24 x 45 mm sulle sezioni. Conservare a 4 °C, senza esporre i vetrini alla luce.
- Osservare e visualizzare le sezioni al microscopio fluorescente o al microscopio confocale.
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Representative Results
La lesione della ferita da taglio nel tectum ottico utilizzando l'inserimento dell'ago nell'emisfero destro (Figura 1, Figura 4A e Figura 5A) induce varie risposte cellulari, tra cui la proliferazione delle cellule gliali radiali (RGC) e la generazione di neuroni appena nati. Allo stesso modo, le popolazioni invecchiate di zebrafish e medaka sono state utilizzate per contrastare eventuali effetti dell'invecchiamento nella risposta rigenerativa. Quindi è stata eseguita l'immunocolorazione fluorescente sulle sezioni congelate e la proliferazione e la differenziazione RGC sono state analizzate dopo la lesione del tectum nel pesce zebra e nel medaka (Figura 4-5) 13.
Sono stati utilizzati anticorpi contro un marcatore cellulare proliferante, antigene cellulare proliferante (PCNA), e un marcatore RGC, brain lipid-binding protein (BLBP), disponibile in zebrafish e medaka per valutare la proliferazione RGC in questi tessuti13,19. Come descritto in precedenza, la maggior parte degli RGC erano quiescenti (PCNA negativi) nell'emisfero controlaterale non danneggiato (Figura 4B)13. Tuttavia, la proliferazione di RGC è stata indotta a 2 giorni dopo l'infortunio (dpi) nel medaka tectum (Figura 4C, D) 13. L'induzione della proliferazione di RGC dopo la lesione è una caratteristica comune delle risposte rigenerative sia del pesce zebra che del medaka13,19.
L'etichettatura BrdU è un metodo semplice utilizzato per valutare la linea cellulare e analizzare la differenziazione RGC dopo lesione cerebrale (Figura 5A)13. L'immunocolorazione con anticorpi per un marcatore pan-neuronale, HuC e BrdU è stata precedentemente utilizzata per confrontare la differenziazione RGC nel tectum danneggiato di zebrafish e medaka (Figura 5B, C) 13. Se questi anticorpi sono disponibili nelle specie bersaglio, possono essere eseguite analisi comparative.
Se la lesione è indotta in modo appropriato, il sito della lesione si trova nella regione dorsale centrale nel tectum ottico (Figura 4C). La colorazione nucleare e la colorazione dell'ematossilina e dell'eosina possono quindi essere utilizzate per confermare il sito della lesione 13,19,20,21,22,23,24,25. Dopo la lesione, si può osservare una zona grigia periventricolare disturbata con colorazione nucleare (Figura 4C). Se la lesione si trova nella regione dorsale mediale, la proliferazione RGC non è significativamente aumentata25.
Figura 1: Lesione da coltellata nel tectum ottico adulto usando un ago . (A) Vista dorsale di un pesce zebra adulto. Il pesce zebra viene tenuto in posizione verticale tra due aghi piegati inseriti verticalmente in un polistirolo. (A») Immagine ingrandita dell'area riposta in (A). L'ago 30 G viene inserito nella regione mediale del confine tra due crani chiamati os frontale e os parietale sul tectum ottico. Il cerchio giallo indica il sito della lesione e le linee tratteggiate bianche indicano i due teschi sul tectum ottico. (B) Vista dorsale del medaka adulto. (B') Immagine ingrandita dell'area riposta in (B). L'ago da 30 G viene inserito nel bordo del tectum ottico. Il cerchio giallo indica il sito della lesione e le linee tratteggiate bianche indicano due teschi sul tectum ottico. (C) Medaka ha squame sul cranio. Le scaglie del cranio devono essere rimosse prima della ferita da taglio. La linea tratteggiata indica la scala sul tectum ottico. Barra scala: 2 mm in A-B, 1 mm in A', B' e C. Telencefalo (Tel), tectum ottico (OT), os frontale (F) e os parietale (P). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Perfusione intracardiaca in piccoli pesci adulti . (A) Vista ventrale di un pesce zebra fissato su polistirolo usando aghi piegati pronti per la perfusione intracardiaca e la dissezione cerebrale. (B) Un'incisione ventrale è fatta dall'origine delle pinne anali al torace. (C) Il cuore è dietro uno strato epiteliale argenteo chiamato ipoderma sia nel pesce zebra che nel medaka. Un'altra fissazione che utilizza un ago piegato accanto allo strato epiteliale d'argento consente un accesso più facile. La linea bianca continua indica il ventricolo (V) e la linea tratteggiata indica l'ipoderma. (D) Lo strato epiteliale d'argento viene rimosso prima della perfusione intracardica di 1x PBS. (E-G) Canula viene inserito nel ventricolo per la perfusione intracardiaca. Gills prima (F) e dopo (G) la perfusione intracardiaca. Se la rimozione del sangue non è completa, le branchie rimangono rosse. (H-J) Dissezione cerebrale dopo perfusione PBS per rimuovere il sangue dai tessuti. Rimuovere i teschi sul tectum ottico e sul telencefalo come mostrato in (I). Se la rimozione del sangue non è completa, il cervello appare rosa chiaro (il cervello destro in (J)). Barra scala: 2 mm in A-C e H, 1 mm in D-G e I-J. Il bulbo olfattivo (OB), il telencefalo (Tel), il tectum ottico (OT), il bulbo arterioso (Ba), il ventricolo (V) e l'atrio (At). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Incorporamento del cervello per le sezioni congelate . (A) Il cervello è incorporato in un criomold con un composto incorporante. Anteriore è giù. (B) I criostampi sono raffreddati su un blocco di alluminio preraffreddato. Telencefalo (Tel), tectum ottico (OT). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi dell'immunocolorazione fluorescente contro la proliferazione di RGC dopo lesione da tectum in medaka adulti. (A) Vista schematica della lesione della ferita da taglio all'emisfero destro del tectum ottico e della sezione coronale. (B-C) Risultati rappresentativi delle RGC proliferative (PCNA + BLBP + cellule) nel lato controlaterale non leso (B) e ferito (C) a 2 giorni dopo l'infortunio. La punta di freccia bianca in C' indica una zona grigia periventricolare disturbata dalla ferita da taglio. (D) Immagini ingrandite dell'area rivestita in (C). Le punte di freccia bianche in (D) indicano PCNA + BLBP + celle. Barra scala: 50 μm in B-D. Adattato con il permesso del riferimento13. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi dell'immunocolorazione fluorescente per la generazione di neuroni neonati dopo lesione del tectum. (A) Vista schematica del trattamento con bromodeossiuridina (BrdU) e della lesione della ferita da taglio nel tectum ottico e nella sezione coronale. (B-C) Risultati rappresentativi dei neuroni neonatali (cellule BrdU + HuC +) a 7 giorni dopo l'infortunio nel pesce zebra (B) e medaka (C) feriti. Barra scala: 50 μm in B-C. Adattato con il permesso del riferimento13. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Qui viene descritta una serie di metodi che possono essere utilizzati per indurre lesioni da coltellata nel tectum ottico utilizzando un ago per facilitare la valutazione della proliferazione e della differenziazione RGC dopo lesione cerebrale. Le ferite da taglio mediate da ago sono un metodo semplice ed efficiente che può essere applicato a molti campioni sperimentali utilizzando un set standard di strumenti. Sono stati sviluppati modelli di lesioni da coltellata per diverse regioni del cervello del pesce zebra 3,19,29. Il tectum ottico è una delle parti più grandi del cervello ed è facile da manipolare. Inoltre, la maggior parte degli RGC nel tectum ottico sono quiescenti in condizioni fisiologiche rispetto al telencefalo, rendendo più facile osservare la proliferazione e la differenziazione degli RGC a seconda della lesione 3,19.
Uno dei passaggi critici e delle limitazioni nelle lesioni da coltellata è l'inserimento manuale dell'ago; Una lesione consistente è necessaria per creare risultati riproducibili e facilitare l'analisi comparativa. La posizione precisa e la profondità dell'inserimento sono cruciali e aiutano a creare lesioni riproducibili negli esperimenti. Questo documento fornisce linee guida chiare per fare lesioni simili ogni volta. Inoltre, la proliferazione di RGC dopo la lesione è essenziale per la neurogenesi del tectum danneggiato. Nel pesce zebra ferito e nel medaka, la proliferazione RGC aumenta a 1 dpi e ritorna ai livelli basali, gli stessi dell'emisfero controlaterale illeso, a 7 dpi13,19.
La lesione da coltellata è uno dei metodi di lesione meccanica che inducono l'ablazione cellulare non specifica. Al contrario, sono stati sviluppati anche approcci transgenici all'ablazione cellulo-specifica come il sistema nitroreduttasi/metronidazolo30,31,32. Questi modelli di ablazione dovrebbero essere selezionati in base allo scopo sperimentale. L'ablazione aspecifica è adatta per lesioni cerebrali come ferite da taglio e ictus ischemico. Al contrario, l'ablazione cellulo-specifica potrebbe essere più appropriata per valutare la degenerazione di cellule specifiche associate a malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson.
Recentemente, sono stati sviluppati modelli di lesioni ischemiche utilizzando il pesce zebra33, ma questi modelli necessitano di linee transgeniche e microscopia fluorescente per monitorare il flusso sanguigno. Pertanto, questi modelli sono difficili da applicare a specie con approcci genetici scadenti e il loro rendimento è inferiore rispetto al modello di lesione da coltellata.
Come accennato in precedenza, la lesione da ferita da taglio nel tectum ottico è semplice e facilmente applicabile in altri modelli di piccoli pesci come killifish africano e mummichog con strumenti comuni26. Inoltre, l'analisi comparativa tra le specie è stata ben studiata utilizzando la tecnologia di sequenziamento. Pertanto, questo semplice metodo rimane essenziale quando si studia la capacità rigenerativa delle CSN nel pesce zebra utilizzando l'analisi comparativa delle risposte cellulari e dell'espressione genica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 e 21K15195 e da una sovvenzione interna di AIST, Giappone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
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