Summary
Um modelo de lesão cerebral mecânica em peixes-zebra adultos é descrito para investigar os mecanismos moleculares que regulam sua alta capacidade regenerativa. O método explica para criar uma lesão por facada no tecto óptico de várias espécies de pequenos peixes para avaliar as respostas regenerativas usando imunomarcação fluorescente.
Abstract
Enquanto o peixe-zebra tem uma capacidade superior de regenerar seu sistema nervoso central (SNC), o medaka tem uma menor capacidade regenerativa do SNC. Um modelo de lesão cerebral foi desenvolvido no tecto óptico adulto de zebrafish e medaka e análises histológicas e moleculares comparativas foram realizadas para elucidar os mecanismos moleculares que regulam a alta capacidade regenerativa deste tecido entre essas espécies de peixes. Aqui é apresentado um modelo de lesão por arma branca para o tecto óptico adulto usando agulha e análises histológicas para proliferação e diferenciação das células-tronco neurais (NSCs). Uma agulha foi inserida manualmente na região central do tecto óptico e, em seguida, os peixes foram perfundidos intracárdicos e seus cérebros dissecados. Esses tecidos foram então criossecados e avaliados por imunomarcação contra os marcadores apropriados de proliferação e diferenciação do NSC. Este modelo de lesão tectum fornece resultados robustos e reprodutíveis tanto em zebrafish quanto em medaka, permitindo comparar as respostas do NSC após a lesão. Este método está disponível para pequenos teleósteos, incluindo zebrafish, medaka e killifish africano, e nos permite comparar sua capacidade regenerativa e investigar mecanismos moleculares únicos.
Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio) tem maior capacidade de regeneração do sistema nervoso central (SNC) quando comparado a outros mamíferos 1,2,3. Recentemente, para melhor compreender os mecanismos moleculares subjacentes a esse aumento da capacidade regenerativa, análises comparativas da regeneração tecidual utilizando tecnologia de sequenciamento de última geração têm sidorealizadas4,5,6. As estruturas cerebrais do peixe-zebra e dos tetrápodes são bastante diferentes 7,8,9. Isso significa que vários modelos de lesão cerebral usando peixes pequenos com estruturas cerebrais e características biológicas semelhantes foram desenvolvidos para facilitar a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes que contribuem para esse aumento da capacidade regenerativa.
Além disso, o medaka (Oryzias latipes) é um animal de laboratório popular com baixa capacidade de regeneração cardíaca e neuronal10,11,12,13 em comparação com o peixe-zebra. Zebrafish e medaka têm estruturas cerebrais e nichos semelhantes para células-tronco neurais adultas (NSCs)14,15,16,17. Em zebrafish e medaka, o tecto óptico inclui dois tipos de NSCs, células-tronco neuroepiteliais e células gliais radiais (RGCs)15,18. Uma lesão por arma branca no tecto óptico de zebrafish adultos foi previamente desenvolvida, e este modelo foi usado para investigar os mecanismos moleculares que regulam a regeneração cerebral nesses animais 19,20,21,22,23. Este modelo de lesão por arma branca induziu neurogênese regenerativa a partir de CGRs 19,24,25. Esta lesão por arma branca no tecto óptico é um método robusto e reprodutível13,19,20,21,22,23,24,25. Quando o mesmo modelo de lesão foi aplicado ao medaka adulto, a baixa capacidade neurogênica dos CGRs no tecto óptico de medaka foi revelada através da análise comparativa da proliferação e diferenciação do CGR após alesão13.
Modelos de lesão por arma branca no tecto óptico também foram desenvolvidos em modelos de mummichog26, mas detalhes da lesão tectômica não foram bem documentados quando comparados com lesão telencálica27. A lesão por arma branca no tecto óptico utilizando zebrafish e medaka permite a investigação das respostas celulares diferenciais e expressão gênica entre espécies com capacidade regenerativa diferencial. Este protocolo descreve como realizar uma lesão por arma branca no tecto óptico usando uma agulha de injeção. Este método pode ser aplicado a pequenos peixes como zebrafish e medaka. Os processos de preparação de amostras para análise histológica e análise de proliferação e diferenciação celular usando imunohistoquímica fluorescente e criossecções são explicados aqui.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada. Zebrafish e medaka foram mantidos de acordo com procedimentos padronizados28.
1. Ferimento por arma branca no tecto óptico adulto
- Preparar uma solução estoque de tricaína a 0,4% (p/v) para anestesia. Para uma solução-mãe de 100 ml, dissolver 400 mg de metanossulfonato de tricaína (ver Tabela de Materiais) em 90 ml de água destilada e ajustar o pH para 7,0 utilizando um tampão Tris HCl 1 M (pH 9,0). Uma vez ajustado o pH, adicionar água até 100 mL, fazer alíquotas apropriadas e armazená-las a -20 °C.
- Para anestesiar o peixe-zebra adulto ou medaka, preparar uma solução de tricaína a 0,02 % (p/v) diluindo a solução-mãe de tricaína a 0,4 % com água de instalações para peixes.
- Anestesiar os peixes com solução de tricaína a 0,02%; Ficam anestesiados quando não se movem ou não respondem ao toque (1-2 min).
- Coloque o peixe anestesiado em uma bandeja de isopor (ver Tabela de Materiais) e fixe o peixe na vertical entre duas agulhas de 30 G inseridas verticalmente no isopor.
- Segure o corpo do peixe para evitar que a cabeça do peixe se mova e insira verticalmente uma agulha de 30 G através do crânio na região medial de um dos hemisférios do tecto óptico (Figura 1A,B). A profundidade de inserção é de ~0,75 mm, quase igual à metade do comprimento do bisel de 30 G. Esta profundidade de inserção induz lesão cerebral em zebrafish e medaka devido ao tamanho corporal semelhante desses peixes.
NOTA: Medaka tem escamas no crânio. Coçar e remover as escamas usando a agulha 30 G para induzir com eficiência e precisão a lesão por arma branca (Figura 1C). - Transfira os peixes feridos para um tanque de peixes com água fresca e mova o tanque para o sistema de criação de peixes assim que eles se recuperarem totalmente da anestesia.
NOTA: Os peixes se recuperarão e começarão a se mover livremente dentro de alguns minutos. - Para a análise da linhagem após a lesão, preparar água fresca de instalação de peixes contendo 5 mM de bromodeoxiuridina (BrdU) (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, incubar os peixes com esta solução de 5 mM BrdU por um período de tempo pré-determinado13,19 (conforme determinado por um planejamento experimental). Em seguida, dissecar esses peixes de acordo com a etapa 2 e avaliar a incorporação de BrdU e a identidade da linhagem celular, conforme apropriado.
Observação : esta etapa é uma etapa opcional para análise de linhagem celular. Para detectar sinais BrdU, execute a recuperação de antígeno como mostrado na etapa 4.3.
2. Dissecção cerebral
- Preparar solução de tricaína a 0,02%, uma bandeja de isopor para dissecção e uma seringa de 10 mL contendo solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) com um tubo de extensão e agulhas de 30 G (ver Tabela de Materiais) para perfusão intracárdica.
- Anestesiar os peixes feridos em pontos de tempo selecionados.
- Coloque papel toalha na bandeja de isopor e coloque o peixe anestesiado sobre o papel toalha.
- Segure o corpo do peixe no lugar inserindo verticalmente duas agulhas de 30 G em cada lado da nadadeira anal (Figura 2A).
- Realizar incisão ventral do ânus ao coração (Figura 2B) e manter o coração visível inserindo mais duas agulhas de 30G de cada lado deste órgão (Figura 2C).
NOTA: O coração é coberto pela camada epitelial prateada da hipoderme, tanto no peixe-zebra quanto no medaka (Figura 2C). - Remover suavemente a camada epitelial de prata com a ponta da pinça (Figura 2D).
- Inserir a agulha 30G no ventrículo, mantendo o bisel para cima, e incidir no átrio com a pinça (Figura 2E). Pressione cuidadosamente a seringa para empurrar o PBS 1x e confirme se o átrio lavou o sangue.
NOTA: Para evitar que a agulha penetre no ventrículo, insira cuidadosamente a agulha até a profundidade do meio bisel e, em seguida, ajuste a profundidade de inserção. Se a perfusão for bem feita, as brânquias ficam brancas (Figura 2F,G). - Pare a perfusão depois que o sangue for drenado e as brânquias ficarem brancas.
- Retire as agulhas que fixam o corpo do peixe no lugar e fixe o peixe ventralmente para baixo (Figura 2H). Cortar a medula espinhal e remover o crânio do tecto óptico e do telencéfalo (Figura 2I). Em seguida, corte os nervos ópticos e disseque o cérebro cuidadosamente.
NOTA: Cuidado com os nervos ópticos durante a dissecção, porque os nervos estão conectados ao tecto. Quando o nervo óptico é puxado, o tecto óptico pode ser descolado do cérebro. Se a remoção de sangue não estiver completa, o cérebro parece rosa claro (o cérebro direito na Figura 2J). - Transfira os cérebros para tubos de 1,5 ml com 1 ml de paraformaldeído a 4 % em 1x PBS e fixe-os durante a noite a 4 °C.
3. Preparação das secções congeladas
- Lave os cérebros fixos três vezes em 1x PBS por 5 min cada.
- Para criar os cérebros, transfira-os para tubos de 1,5 ml com 1 ml de sacarose a 30 % (p/v) em 1x PBS e incube-os durante a noite a 4 °C. Preparar o composto de incorporação (mistura 2:1 de composto OCT e 30% de sacarose, ver Tabela de Materiais) combinando 30 mL de OCT e 15 mL de sacarose a 30%. Conservar a 4 °C.
NOTA: Para remover as bolhas do composto misturado, centrifugar os tubos de 50 mL a 10.000 x g por 2 min à temperatura ambiente ou colocar os tubos na vertical durante a noite. - Incubar um bloco de alumínio durante a noite a -80 °C para arrefecer o criomolde (ver Tabela de Materiais) imediatamente após o cérebro dissecado ser incorporado no criomolde com o composto incorporador.
NOTA: O nitrogênio líquido também pode ser usado para resfriar o bloco de alumínio. Nesse caso, o bloco de alumínio deve ser colocado em uma caixa de isopor preenchida com nitrogênio líquido suficiente para cobrir o bloco de alumínio pouco antes de incorporar. Após confirmar a sublimação do nitrogênio líquido, coloque o criomold sobre o bloco de alumínio pré-resfriado. É melhor confirmar quantos criomoldes podem ser colocados no bloco de alumínio de uma só vez. É aconselhável usar nitrogênio líquido ou um bloco pré-resfriado adicional para garantir espaço suficiente para resfriar todas as amostras rapidamente. - Coloque o bloco de alumínio pré-resfriado em uma caixa de isopor. Use uma caixa de isopor com tampa para evitar que o bloco de alumínio aqueça.
- Para cortes coronais, incorporar o cérebro em um criomold e ajustar a orientação usando pinça sob o microscópio (Figura 3A).
- Coloque o criomold sobre o bloco de alumínio pré-resfriado na caixa de isopor e deixe o composto OCT congelar (Figura 3B). Quando o composto OCT começa a congelar, torna-se branco.
- Aplique um pequeno círculo de composto OCT em um disco de amostra e monte o criobloco para prender o criobloco ao disco da amostra.
- Coloque o disco da amostra no criostato e congele completamente o composto de OCT.
- Coloque o disco da amostra na cabeça da amostra no criostato.
- Defina a orientação do criobloco e corte a OCT para remover quaisquer regiões extras.
NOTA: Ajuste a orientação do plano de corte durante o corte do telencéfalo. A lâmina é equipada com um criostato. É possível ajustar a orientação do plano de corte alterando o ângulo da cabeça do corpo de prova. - Cortar secções seriais de 14 μm de espessura através de todo o tecto óptico utilizando um criostato. Conservar as lâminas a -25 °C.
NOTA: O armazenamento a longo prazo deve ser a -80 °C.
4. Imunomarcação fluorescente
- Lâminas de vidro seco em um rack deslizante por 30 min à temperatura ambiente (RT). Lave as lâminas em 1x PBS por 30 min no RT. Se a imunomarcação com anticorpos anti-PCNA ou BrdU for realizada, prossiga para a etapa 4.2 ou etapa 4.3.
- Preparar 500 ml de citrato de sódio 10 mM num copo de 500 ml e aquecer o tampão citrato a 85 °C num agitador magnético de placa quente, em seguida, colocar as lâminas num suporte de coloração de lâminas e incubar o rack no tampão citrato a 85 °C durante 30 minutos. Para evitar a ebulição, mantenha a temperatura em torno de 85 °C. Após a recuperação do antígeno, lavar as lâminas três vezes em Triton a 0,1% em 1x PBS (PBSTr), com cada lavagem levando 5 min em RT.
NOTA: Esta etapa é uma etapa opcional para a recuperação do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA). - Preparar uma solução de HCl 2 N diluindo 12 N HCl em água destilada. Usando um bloqueador de líquidos (ver Tabela de Materiais), desenhe uma linha como uma barreira hidrofóbica para manter a solução de HCl 2 N ao redor das seções.
- Coloque as lâminas em bandejas de imunomarcação e aplique 200-300 μL da solução de HCl 2N. Incubar os tabuleiros a 37 °C durante 30 min. Após a recuperação do antigénio, lavar três vezes em PBSTr a 0,1 % com cada lavagem a tomar 5 minutos em RT.
NOTA: Esta etapa é uma etapa opcional para a recuperação de antígeno BrdU.
- Coloque as lâminas em bandejas de imunomarcação e aplique 200-300 μL da solução de HCl 2N. Incubar os tabuleiros a 37 °C durante 30 min. Após a recuperação do antigénio, lavar três vezes em PBSTr a 0,1 % com cada lavagem a tomar 5 minutos em RT.
- Absorva e retire a solução restante com papel toalha. Em seguida, use um bloqueador líquido para desenhar uma barreira hidrofóbica para manter a solução de anticorpos ao redor das seções, conforme necessário.
- Coloque as lâminas em bandejas e aplique 200-300 μL de solução bloqueadora, 3% (v/v) de soro de cavalo em PBSTr) em cada lâmina e incube as lâminas por 1 h no TR.
- Lave os cortes com PBSTr por 5 min no RT e repita três vezes.
- Preparar os anticorpos primários (ver Tabela de Materiais) utilizando a solução de bloqueio (200-300 μL de solução de anticorpos para cada lâmina). Retire o PBSTr restante com papel toalha e coloque as lâminas nas bandejas de imunomarcação. Aplicar a solução primária de anticorpos em cada lâmina e incubar tabuleiros durante a noite a 4 °C.
- Lave os cortes com PBSTr por 5 min no RT e repita três vezes.
- Preparar a solução de anticorpos secundários fluorescentes (ver Tabela de Materiais) utilizando o tampão de bloqueio (1:500). Retire o PBSTr restante com papel toalha e coloque as lâminas nas bandejas de imunomarcação. Aplique a solução de anticorpos secundários em todas as bandejas de lâmina e sombra com papel alumínio. Incubar por 1-2 h no TR.
- Lave os cortes com PBSTr por 5 min em TR três vezes sem expô-los à luz.
- Preparar a solução Hoechst (diluição de 1:500 em 1x PBS, ver Tabela de Materiais) para coloração nuclear. Retire o PBSTr restante com papel toalha e coloque as lâminas nas bandejas de imunomarcação. Aplique a solução Hoechst em cada lâmina e cubra as bandejas com papel alumínio. Incubar por 30 min no TR.
- Lave as seções com 1x PBS por 10 min no RT sem expô-las à luz.
- Absorva e remova o 1x PBS restante usando papel toalha e monte as seções em lâminas usando um meio de montagem solúvel em água (consulte a Tabela de Materiais) para imunomarcação fluorescente. Coloque lentamente uma tampa de 24 x 45 mm nas seções. Conservar a 4 °C, sem expor as lâminas à luz.
- Observar e obter imagens dos cortes sob microscopia fluorescente ou microscopia confocal.
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Representative Results
A lesão por arma branca no tecto óptico com inserção de agulha no hemisfério direito (Figura 1, Figura 4A e Figura 5A) induz várias respostas celulares, incluindo a proliferação de células gliais radiais (CGR) e a geração de neurônios recém-nascidos. Similarmente, populações envelhecidas de zebrafish e medaka foram usadas para neutralizar quaisquer efeitos do envelhecimento na resposta regenerativa. Em seguida, foi realizada imunomarcação fluorescente nos cortes congelados, e a proliferação e diferenciação do CGR foram analisadas após a lesão tectum no zebrafish e medaka (Figura 4-5)13.
Foram utilizados anticorpos contra um marcador celular em proliferação, o antígeno de proliferação celular (PCNA), e um marcador RGC, a proteína ligadora de lipídios cerebrais (BLBP), disponível em zebrafish e medaka para avaliar a proliferação do RGC nesses tecidos13,19. Como descrito anteriormente, a maioria dos CGRs era quiescente (PCNA negativo) no hemisfério não lesado contralateral (Figura 4B)13. Ainda, a proliferação do CGR foi induzida aos 2 dias pós-lesão (dpi) no tecto de medaka (Figura 4C,D)13. A indução da proliferação do RGC após a lesão é uma característica comum tanto da resposta regenerativa do peixe-zebra quanto do medaka13,19.
A marcação BrdU é um método simples utilizado para avaliar linhagens celulares e analisar a diferenciação do CGR após lesão cerebral (Figura 5A)13. A imunomarcação com anticorpos para um marcador pan-neuronal, HuC, e BrdU foi previamente utilizada para comparar a diferenciação do RGC no tecto lesado de zebrafish e medaka (Figura 5B,C)13. Se esses anticorpos estiverem disponíveis na espécie-alvo, análises comparativas podem ser realizadas.
Se a lesão for adequadamente induzida, o local da lesão está localizado na região centro-dorsal do tecto óptico (Figura 4C). A coloração nuclear e a coloração de hematoxilina e eosina podem então ser usadas para confirmar o local da lesão 13,19,20,21,22,23,24,25. Após a lesão, observa-se uma zona cinzenta periventricular perturbada com coloração nuclear (Figura 4C). Se a lesão estiver localizada na região dorsal medial, a proliferação do CGR não está significativamenteaumentada25.
Figura 1: Ferimento por arma branca no tecto óptico adulto com agulha . (A) Vista dorsal de um peixe-zebra adulto. O peixe-zebra é mantido ereto entre duas agulhas dobradas inseridas verticalmente em um isopor. (A') Imagem ampliada da área encaixotada em (A). A agulha 30 G é inserida na região medial da borda entre dois crânios chamados os frontale e os parietale no tecto óptico. O círculo amarelo indica o local da lesão, e linhas tracejadas brancas indicam os dois crânios no tecto óptico. (B) Vista dorsal do medaka adulto. (B') Uma imagem ampliada da área encaixotada em (B). A agulha de 30 G é inserida na borda do tecto óptico. O círculo amarelo indica o local da lesão, e linhas tracejadas brancas indicam dois crânios no tecto óptico. (C) Medaka tem escamas no crânio. As escamas do crânio devem ser removidas antes da lesão por arma branca. A linha tracejada indica a escala no tecto óptico. Barra de escala: 2 mm em A-B, 1 mm em A', B' e C. Telencéfalo (Tel), tecto óptico (OT), os frontale (F) e os parietale (P). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Perfusão intracardíaca em pequenos peixes adultos. (A) Vista ventral de um peixe-zebra fixado em isopor com agulhas dobradas prontas para perfusão intracardíaca e dissecção cerebral. (B) Uma incisão ventral é feita desde a origem das nadadeiras anais até o tórax. (C) O coração está atrás de uma camada epitelial prateada chamada hipoderme tanto no peixe-zebra quanto no medaka. Outra fixação com agulha dobrada ao lado da camada epitelial prateada facilita o acesso. A linha branca sólida indica o ventrículo (V) e a linha pontilhada indica a hipoderme. (D) A camada epitelial de prata é removida antes da perfusão intracárdica de 1x PBS. (E-G) A cânula é inserida no ventrículo para perfusão intracardíaca. Guelras antes (F) e após (G) a perfusão intracardíaca. Se a remoção de sangue não for completa, as brânquias permanecem vermelhas. (H-J) Dissecção cerebral após perfusão PBS para remover o sangue dos tecidos. Remover crânios no tecto óptico e telencéfalo, conforme mostrado em (I). Se a remoção de sangue não estiver completa, o cérebro parece rosa claro (o cérebro direito em (J)). Barra de escala: 2 mm em A-C e H, 1 mm em D-G e I-J. bulbo olfatório (OB), telencéfalo (Tel), tecto óptico (OT), bulbo arterial (Ba), ventrículo (V) e átrio (At). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Incorporação cerebral para seções congeladas . (A) O cérebro é embutido em um criomold com um composto de incorporação. A anterior é para baixo. (B) Os criomoldes são resfriados em bloco de alumínio pré-resfriado. Telencéfalo (Tel), tecto óptico (OT). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos da imunomarcação fluorescente contra a proliferação de RGC após lesão tectum em medaka adulto . (A) Visão esquemática da lesão por arma branca no hemisfério direito do tecto óptico e corte coronal. (B-C) Resultados representativos dos RGCs proliferativos (PCNA + BLBP + células) no lado contralateral não lesado (B) e lesado (C) aos 2 dias pós-lesão. A cabeça de seta branca em C' indica uma zona cinzenta periventricular perturbada pela lesão por arma branca. (D) Imagens ampliadas da área encaixotada em (C). As pontas de seta brancas em (D) indicam PCNA + BLBP + células. Barra de escala: 50 μm em B-D. Adaptado com permissão da Referência13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos da imunomarcação fluorescente para a geração de neurônios neonatais após lesão tectum . (A) Visão esquemática do tratamento com bromodeoxiuridina (BrdU) e da lesão por arma branca no tecto óptico e corte coronal. (B-C) Resultados representativos de neurônios recém-nascidos (BrdU + células HuC +) aos 7 dias pós-lesão no zebrafish lesado (B) e medaka (C). Barra de escala: 50 μm em B-C. Adaptado com permissão da Referência13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Descreve-se aqui um conjunto de métodos que podem ser utilizados para induzir lesões por arma branca no tecto óptico, utilizando uma agulha para facilitar a avaliação da proliferação e diferenciação do CGR após lesão cerebral. A facada mediada por agulha é um método simples e eficientemente implementado que pode ser aplicado a muitas amostras experimentais usando um conjunto padrão de ferramentas. Modelos de lesão por arma branca para várias regiões do cérebro do peixe-zebra foram desenvolvidos 3,19,29. O tecto óptico é uma das partes mais importantes do cérebro e é fácil de manipular. Além disso, a maioria dos CGRs no tecto óptico é quiescente em condições fisiológicas quando comparada ao telencéfalo, facilitando a observação da proliferação e diferenciação dos CGR dependendo dalesão3,19.
Uma das etapas críticas e limitações nas lesões por arma branca é a inserção manual da agulha; Uma lesão consistente é necessária para criar resultados reprodutíveis e facilitar a análise comparativa. A localização precisa e a profundidade de inserção são cruciais e ajudam a criar lesões reprodutíveis em experimentos. Este artigo fornece diretrizes claras para fazer lesões semelhantes a cada vez. Além disso, a proliferação do CGR após a lesão é essencial para a neurogênese do tecto lesado. Em zebrafish lesados e medaka, a proliferação do RGC aumenta em 1 dpi e retorna aos níveis basais, os mesmos do hemisfério contralateral não lesado, em 7 dpi13,19.
A lesão por arma branca é um dos métodos de lesão mecânica que induz ablação celular inespecífica. Em contraste, abordagens transgênicas para ablação célula-específica, como o sistema nitroredutase/metronidazol, também foram desenvolvidas30,31,32. Esses modelos de ablação devem ser selecionados com base no propósito experimental. A ablação inespecífica é adequada para lesões cerebrais, como ferimentos por arma branca e acidente vascular cerebral isquêmico. Em contraste, a ablação célula-específica pode ser mais apropriada para avaliar a degeneração de células específicas associadas a doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson.
Recentemente, modelos de lesão isquêmica utilizando zebrafish foram desenvolvidos33, mas esses modelos necessitam de linhas transgênicas e microscopia fluorescente para monitorar o fluxo sanguíneo. Portanto, esses modelos são desafiadores de aplicar a espécies com abordagens genéticas pobres, e seu rendimento é menor do que o modelo de lesão por arma branca.
Como mencionado acima, a lesão por arma branca no tecto óptico é simples e de fácil aplicação em outros modelos de peixes pequenos, como o killifish africano e o mummichog, com ferramentas comuns26. Além disso, a análise comparativa entre espécies tem sido bem investigada usando a tecnologia de sequenciamento. Portanto, este método simples permanece essencial ao estudar a capacidade regenerativa de NSCs em zebrafish usando análise comparativa de respostas celulares e expressão gênica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 e 21K15195 e uma bolsa interna da AIST, Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
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