Summary
Yetişkin zebra balıklarında mekanik bir beyin hasarı modeli, yüksek rejeneratif kapasitelerini düzenleyen moleküler mekanizmaları araştırmak için tanımlanmıştır. Yöntem, floresan immünoboyama kullanarak rejeneratif yanıtları değerlendirmek için birden fazla küçük balık türünün optik tektumunda bir bıçak yarası yaralanması oluşturmayı açıklar.
Abstract
Zebra balığı, merkezi sinir sistemini (CNS) yenilemek için üstün bir kapasiteye sahipken, medaka daha düşük bir CNS rejeneratif kapasitesine sahiptir. Zebra balığı ve medaka'nın yetişkin optik tektumunda bir beyin hasarı modeli geliştirilmiş ve bu balık türleri arasında bu dokunun yüksek rejeneratif kapasitesini düzenleyen moleküler mekanizmaları aydınlatmak için karşılaştırmalı histolojik ve moleküler analizler yapılmıştır. Burada erişkin optik tektum için nöral kök hücrelerin (NSC) proliferasyonu ve farklılaşması için bir iğne ve histolojik analizler kullanılarak bir bıçak yarası yaralanma modeli sunulmuştur. Optik tektumun merkezi bölgesine manuel olarak bir iğne sokuldu ve daha sonra balıklar intrakardiyal olarak perfüze edildi ve beyinleri diseke edildi. Bu dokular daha sonra kriyoseksiyona tabi tutuldu ve uygun NSC proliferasyonu ve farklılaşma belirteçlerine karşı immün boyama kullanılarak değerlendirildi. Bu tektum yaralanma modeli, hem zebra balığı hem de medaka'da sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar ve yaralanma sonrası NSC yanıtlarını karşılaştırmaya olanak tanır. Bu yöntem, zebra balığı, medaka ve Afrika killifish dahil olmak üzere küçük teleostlar için mevcuttur ve rejeneratif kapasitelerini karşılaştırmamızı ve benzersiz moleküler mekanizmaları araştırmamızı sağlar.
Introduction
Zebra balığı (Danio rerio), diğer memelilere kıyasla merkezi sinir sistemini (CNS) yenileme yeteneğinde artışa sahiptir 1,2,3. Son zamanlarda, bu artan rejeneratif kapasitenin altında yatan moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için, yeni nesil dizileme teknolojisi kullanılarak doku rejenerasyonunun karşılaştırmalı analizleri yapılmıştır 4,5,6. Zebra balığı ve tetrapodlardaki beyin yapıları oldukça farklıdır 7,8,9. Bu, benzer beyin yapılarına ve biyolojik özelliklere sahip küçük balıkların kullanıldığı birkaç beyin hasarı modelinin, bu artan rejeneratif kapasiteye katkıda bulunan altta yatan moleküler mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştırmak için geliştirildiği anlamına gelir.
Ek olarak, medaka (Oryzias latipes), zebra balığı ile karşılaştırıldığında 10,11,12,13 kalp ve nöronal rejenerasyon için düşük kapasiteye sahip popüler bir laboratuvar hayvanıdır. Zebra balığı ve medaka, yetişkin nöral kök hücreler (NSC'ler) için benzer beyin yapılarına ve nişlere sahiptir14,15,16,17. Zebra balığı ve medaka'da, optik tektum iki tip NSC, nöroepitel benzeri kök hücreler ve radyal glial hücreler (RGC'ler) içerir15,18. Yetişkin zebra balıklarının optik tektumunda bıçak yarası yaralanması daha önce geliştirilmiş ve bu model bu hayvanlarda beyin rejenerasyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılmıştır 19,20,21,22,23. Bu genç yetişkin zebra balığı bıçak yarası yaralanma modeli, RGC'lerden 19,24,25 rejeneratif nörogeneze neden olmuştur. Optik tektumdaki bu bıçak yarası yaralanması sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntemdir 13,19,20,21,22,23,24,25. Aynı yaralanma modeli erişkin medakaya uygulandığında, medaka optik tektumdaki RGC'lerin düşük nörojenik kapasitesi, yaralanma sonrası RGC proliferasyonu ve farklılaşmasının karşılaştırmalı analizi ile ortaya konmuştur13.
Optik tektumdaki bıçak yarası yaralanma modelleri mummichog modelleri26'da da geliştirilmiştir, ancak tektum yaralanmasının ayrıntıları telensefalik yaralanma27 ile karşılaştırıldığında iyi belgelenmemiştir. Zebra balığı ve medaka kullanılarak optik tektumda bıçak yarası yaralanması, diferansiyel rejeneratif kapasiteye sahip türler arasındaki diferansiyel hücresel tepkilerin ve gen ekspresyonunun araştırılmasına olanak sağlar. Bu protokol, bir enjeksiyon iğnesi kullanılarak optik tektumda bıçak yarası yaralanmasının nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Bu yöntem zebra balığı ve medaka gibi küçük balıklara uygulanabilir. Burada histolojik analiz için numune hazırlama ve floresan immünohistokimya ve kriyoseksiyonlar kullanılarak hücresel proliferasyon ve farklılaşma analizi süreçleri açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel protokoller, Ulusal İleri Endüstriyel Bilim ve Teknoloji Enstitüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Zebra balığı ve medaka standart prosedürlere göre muhafaza edildi28.
1. Yetişkin optik tektumda bıçak yarası yaralanması
- Anestezi için% 0.4 (w / v) trikain stok çözeltisi hazırlayın. 100 mL'lik bir stok çözeltisi için, 400 mg trikain metansülfonatı ( Malzeme Tablosuna bakınız) 90 mL damıtılmış suda çözün ve 1 M Tris HCl tamponu (pH 9.0) kullanarak pH'ı 7.0'a ayarlayın. pH ayarlandıktan sonra, 100 mL'ye kadar su ekleyin, ardından uygun alikotları yapın ve -20 ° C'de saklayın.
- Yetişkin zebra balığı veya medaka'yı uyuşturmak için, %0,4'lük trikain stok çözeltisini balık tesisi suyuyla seyrelterek %0,02'lik (w/v) bir trikain çözeltisi hazırlayın.
- Balıkları% 0.02 trikain çözeltisi ile uyuşturun; hareket etmediklerinde veya dokunmaya tepki vermediklerinde uyuşturulurlar (1-2 dk).
- Anestezi uygulanan balığı bir strafor tepsiye yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve balığı strafora dikey olarak yerleştirilmiş iki 30 G iğne arasına dik olarak sabitleyin.
- Balık kafasının hareket etmesini önlemek için balık gövdesini tutun ve kafatasından optik tektum yarımkürelerinden birinin medial bölgesine dikey olarak 30 G'lik bir iğne yerleştirin (Şekil 1A, B). Yerleştirme derinliği ~ 0,75 mm'dir ve neredeyse 30 G eğimin uzunluğunun yarısına eşittir. Bu ekleme derinliği, bu balıkların benzer vücut büyüklüğü nedeniyle zebra balığı ve medaka üzerinde beyin hasarına neden olur.
NOT: Medaka'nın kafatasında pullar vardır. Bıçak yarası yaralanmasını etkili ve doğru bir şekilde indüklemek için 30 G iğnesini kullanarak pulları çizin ve çıkarın (Şekil 1C). - Yaralı balıkları taze balık tesisi suyu olan bir balık tankına aktarın ve anesteziden tamamen iyileştikten sonra tankı balık yetiştirme sistemine taşıyın.
NOT: Balıklar birkaç dakika içinde iyileşecek ve serbestçe hareket etmeye başlayacaktır. - Yaralanmadan sonra soy analizi için, 5 mM bromodeoksiüridin (BrdU) içeren taze balık tesisi suyu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve daha sonra balıkları bu 5 mM BrdU çözeltisi ile önceden belirlenmiş bir süre boyuncainkübe edin 13,19 (deneysel bir tasarımla belirlendiği gibi). Daha sonra bu balıkları adım 2'ye göre inceleyin ve BrdU birleşmesini ve hücre soy kimliğini uygun şekilde değerlendirin.
NOT: Bu adım, hücre soyağacı analizi için isteğe bağlı bir adımdır. BrdU sinyallerini algılamak için, adım 4.3'te gösterildiği gibi antijen alımını gerçekleştirin.
2. Beyin diseksiyonu
- İntrakardiyal perfüzyon için% 0.02 trikain çözeltisi, diseksiyon için bir strafor tepsi ve bir uzatma tüpü ve 30 G iğne (bkz. Malzeme Tablosu) ile fosfat tamponlu salin (1x PBS) içeren 10 mL'lik bir şırınga hazırlayın.
- Yaralı balıkları seçilen zaman noktalarında uyuşturun.
- Kağıt havluları strafor tepsiye yerleştirin ve anestezi uygulanan balıkları kağıt havluların üzerine yerleştirin.
- Anal yüzgecin her iki tarafına dikey olarak iki adet 30 G iğne yerleştirerek balık gövdesini yerinde tutun (Şekil 2A).
- Anüsten kalbe ventral bir kesi yapın (Şekil 2B) ve bu organın her iki tarafına iki adet 30 G iğne daha sokarak kalbi görünür tutun (Şekil 2C).
NOT: Kalp, hem zebra balığı hem de medaka'da hipodermisin gümüşi epitel tabakasında kaplıdır (Şekil 2C). - Forsepsin ucuyla gümüş epitel tabakasını yavaşça çıkarın (Şekil 2D).
- 30 G iğnesini ventriküle yerleştirin, eğimi yukarıda tutun ve forsepsleri kullanarak atriyuma bir kesi yapın (Şekil 2E). 1x PBS'yi itmek için şırıngaya dikkatlice bastırın ve atriyumun kanı temizlediğini onaylayın.
NOT: İğnenin ventriküle nüfuz etmesini önlemek için, iğneyi dikkatlice yarım eğimin derinliğine yerleştirin ve ardından yerleştirme derinliğini ayarlayın. Perfüzyon iyi yapılırsa, solungaçlar beyaza döner (Şekil 2F, G). - Kan boşaltıldıktan ve solungaçlar beyaza döndükten sonra perfüzyonu durdurun.
- Balık gövdesini yerine sabitleyen iğneleri çıkarın ve balık ventral tarafını aşağıya doğru sabitleyin (Şekil 2H). Omuriliği kesin ve kafatasını optik tektumdan ve telensefalondan çıkarın (Şekil 2I). Ardından, optik sinirleri kesin ve beyni dikkatlice inceleyin.
NOT: Diseksiyon sırasında optik sinirlere dikkat edin, çünkü sinirler tektuma bağlıdır. Optik sinir çekildiğinde, optik tektum beyinden ayrılabilir. Kan alma işlemi tamamlanmazsa, beyin açık pembe görünür ( Şekil 2J'de sağ beyin). - Beyinleri 1x PBS'de 1 mL% 4 paraformaldehit içeren 1.5 mL tüplere aktarın ve gece boyunca 4 ° C'de sabitleyin.
3. Dondurulmuş bölümlerin hazırlanması
- Sabit beyinleri her biri 5 dakika boyunca 1x PBS'de üç kez yıkayın.
- Beyinleri kriyoproteksiyona tabi tutmak için, 1x PBS'de 1 mL% 30 (w / v) sakkaroz ile 1.5 mL tüplere aktarın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Gömme bileşiğini (2:1 OCT bileşiği ve %30 sakkaroz karışımı, bakınız Malzeme Tablosu) 30 mL OCT ve 15 mL %30 sakkarozu birleştirerek hazırlayın. Bunu 4 °C'de saklayın.
NOT: Kabarcıkları karışık bileşikten çıkarmak için, 50 mL tüpleri oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj edin veya tüpleri gece boyunca dik olarak yerleştirin. - Bir alüminyum bloğu gece boyunca -80 ° C'de inkübe edin, böylece kriyomoldu soğutmak için disseke edilmiş beyin gömme bileşiği ile kriyomolda gömüldükten hemen sonra (bakınız Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Alüminyum bloğu soğutmak için sıvı azot da kullanılabilir. Bu durumda, alüminyum blok, gömmeden hemen önce alüminyum bloğu örtmek için yeterli sıvı azotla doldurulmuş bir Strafor kutuya yerleştirilmelidir. Sıvı azot süblimasyonunu onayladıktan sonra, kriyomoldu önceden soğutulmuş alüminyum blok üzerine yerleştirin. Alüminyum bloğa bir kerede kaç tane kriyomold yerleştirilebileceğini doğrulamak daha iyidir. Tüm numuneleri hızlı bir şekilde soğutmak için yeterli alan sağlamak için sıvı azot veya ek bir ön soğutmalı blok kullanılması önerilir. - Önceden soğutulmuş alüminyum bloğu strafor bir kutuya koyun. Alüminyum bloğun ısınmasını önlemek için kapaklı bir strafor kutu kullanın.
- Koronal kesitler için, beyni bir kriyomold içine gömün ve mikroskop altında forseps kullanarak oryantasyonu ayarlayın (Şekil 3A).
- Kriyomoldu strafor kutudaki önceden soğutulmuş alüminyum blok üzerine yerleştirin ve OCT bileşiğinin donmasına izin verin (Şekil 3B). OCT bileşiği donmaya başladığında, beyaz olur.
- Bir numune diskine küçük bir OCT bileşiği çemberi uygulayın ve kriyobloğu numune diskine bağlamak için kriyobloğu monte edin.
- Numune diskini kriyostata yerleştirin ve OCT bileşiğini tamamen dondurun.
- Numune diskini kriyostattaki numune kafasına yerleştirin.
- Kriyoblokun yönünü ayarlayın ve ekstra bölgeleri kaldırmak için OCT'yi kırpın.
NOT: Telensefalonu keserken kesme düzleminin yönünü ayarlayın. Bıçak bir kriyostat ile donatılmıştır. Numune kafasının açısını değiştirerek kesme düzleminin yönünü ayarlamak mümkündür. - Bir kriyostat kullanarak tüm optik tektum boyunca 14 μm kalınlığında seri kesitler kesin. Slaytları -25 °C'de saklayın.
NOT: Uzun süreli depolama -80 °C'de olmalıdır.
4. Floresan immünoboyama
- Kuru cam slaytlar oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca sürgü rafında kayar. Slaytları RT'de 30 dakika boyunca 1x PBS'de yıkayın. Anti-PCNA veya BrdU antikorları ile immün boyama yapılacaksa, adım 4.2 veya adım 4.3'e geçin.
- 500 mL'lik bir beherde 500 mL 10 mM sodyum sitrat hazırlayın ve sitrat tamponunu sıcak plakalı manyetik karıştırıcı üzerinde 85 ° C'ye ısıtın, ardından slaytları bir slayt boyama rafına yerleştirin ve rafı sitrat tamponunda 85 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Kaynamayı önlemek için, sıcaklığı 85 °C civarında tutun. Antijen alımından sonra, slaytları 1x PBS'de (PBSTr) % 0.1 Triton'da üç kez yıkayın, her yıkama RT'de 5 dakika sürer.
NOT: Bu adım, proliferasyon hücre nükleer antijeni (PCNA) alımı için isteğe bağlı bir adımdır. - Damıtılmış suda 12 N HCl seyrelterek 2 N HCl çözeltisi hazırlayın. Bir sıvı engelleyici kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu), 2 N HCl çözeltisini bölümlerin etrafında tutmak için hidrofobik bir bariyer olarak bir çizgi çizin.
- Slaytları immün boyama tepsilerine yerleştirin ve 2N HCl çözeltisinden 200-300 μL uygulayın. Tepsileri 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Antijen alımından sonra, %0.1 PBSTr'de üç kez yıkayın ve her yıkama RT'de 5 dakika sürer.
NOT: Bu adım, BrdU antijen alımı için isteğe bağlı bir adımdır.
- Slaytları immün boyama tepsilerine yerleştirin ve 2N HCl çözeltisinden 200-300 μL uygulayın. Tepsileri 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Antijen alımından sonra, %0.1 PBSTr'de üç kez yıkayın ve her yıkama RT'de 5 dakika sürer.
- Kalan çözeltiyi kağıt havlu kullanarak emer ve çıkarın. Daha sonra, antikor çözeltisini gerektiği gibi bölümlerin etrafında tutmak için hidrofobik bir bariyer çizmek için bir sıvı bloker kullanın.
- Slaytları tepsilere yerleştirin ve her slayta 200-300 μL blokaj çözeltisi, PBSTr'de% 3 (v / v) at serumu) uygulayın ve slaytları RT'de 1 saat boyunca inkübe edin.
- Bölümleri RT'de 5 dakika boyunca PBSTr ile yıkayın ve üç kez tekrarlayın.
- Bloke edici çözeltiyi (her slayt için 200-300 μL antikor çözeltisi) kullanarak birincil antikorları hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Kalan PBSTr'yi kağıt havlularla çıkarın ve slaytları immün boyama tepsilerine yerleştirin. Birincil antikor çözeltisini her slayta uygulayın ve tepsileri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Bölümleri RT'de 5 dakika boyunca PBSTr ile yıkayın ve üç kez tekrarlayın.
- Bloke edici tamponu (1:500) kullanarak floresan sekonder antikor çözeltisi hazırlayın (bkz. Kalan PBSTr'yi kağıt havlularla çıkarın ve slaytları immün boyama tepsilerine yerleştirin. İkincil antikor çözeltisini alüminyum folyo ile her slayt ve gölge tepsisine uygulayın. RT'de 1-2 saat inkübe edin.
- Bölümleri RT'de 5 dakika boyunca PBSTr ile ışığa maruz bırakmadan üç kez yıkayın.
- Nükleer boyama için Hoechst çözeltisini (1x PBS'de 1:500 seyreltme, Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. Kalan PBSTr'yi kağıt havlularla çıkarın ve slaytları immün boyama tepsilerine yerleştirin. Hoechst çözeltisini her slayda uygulayın ve tepsileri alüminyum folyo ile örtün. RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Bölümleri RT'de ışığa maruz bırakmadan 10 dakika boyunca 1x PBS ile yıkayın.
- Kalan 1x PBS'yi kağıt havlu kullanarak emer ve çıkarın ve floresan immünoboyama için suda çözünür bir montaj ortamı ( bkz. Bölümlerin üzerine yavaşça 24 x 45 mm'lik bir kapak kayması yerleştirin. Slaytları ışığa maruz bırakmadan 4 °C'de saklayın.
- Floresan mikroskobu veya konfokal mikroskopi altındaki bölümleri gözlemleyin ve görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sağ yarımküreye iğne sokulması kullanılarak optik tektumda bıçak yarası yaralanması (Şekil 1, Şekil 4A ve Şekil 5A), radyal glial hücre (RGC) proliferasyonu ve yenidoğan nöronlarının oluşumu dahil olmak üzere çeşitli hücresel yanıtları indükler. Benzer şekilde, zebra balığı ve medaka'nın yaşlı popülasyonları, rejeneratif yanıttaki yaşlanma etkilerine karşı koymak için kullanılmıştır. Daha sonra dondurulmuş kesitlerde floresan immünoboyama uygulandı ve zebra balığı ve medakada tektum hasarı sonrası RGC proliferasyonu ve farklılaşması analiz edildi (Şekil 4-5)13.
Bu dokulardaki RGC proliferasyonunu değerlendirmek için prolifere edici hücre belirtecine karşı antikorlar, prolifere edici hücre antijeni (PCNA) ve zebra balığı ve medaka'da bulunan bir RGC belirteci, beyin lipit bağlayıcı protein (BLBP) kullanıldı13,19. Daha önce tarif edildiği gibi, RGC'lerin çoğu kontralateral yaralanmamış yarımkürede sessizdi (PCNA negatif) (Şekil 4B)13. Yine de, RGC proliferasyonu medaka tektumunda yaralanma sonrası 2 günde (dpi) indüklenmiştir (Şekil 4C, D)13. Yaralanma sonrası RGC proliferasyonunun indüklenmesi hem zebra balığı hem de medaka rejeneratif yanıtlarının ortak bir özelliğidir13,19.
BrdU etiketleme, hücre soyunu değerlendirmek ve beyin hasarından sonra RGC farklılaşmasını analiz etmek için kullanılan basit bir yöntemdir (Şekil 5A)13. Pan-nöronal belirteç, HuC ve BrdU için antikorlarla immün boyama daha önce zebra balığı ve medaka'nın yaralı tektumundaki RGC farklılaşmasını karşılaştırmak için kullanılmıştır (Şekil 5B, C)13. Bu antikorlar hedef türlerde mevcutsa, karşılaştırmalı analizler yapılabilir.
Yaralanma uygun şekilde indüklenirse, yaralanma bölgesi optik tektumdaki merkez-dorsal bölgede bulunur (Şekil 4C). Nükleer boyama ve hematoksilin ve eozin boyama daha sonra yaralanma bölgesini doğrulamak için kullanılabilir 13,19,20,21,22,23,24,25. Yaralanmadan sonra, nükleer lekelenme ile bozulmuş bir periventriküler gri bölge gözlenebilir (Şekil 4C). Yaralanma medial dorsal bölgede bulunuyorsa, RGC proliferasyonu anlamlı olarak artmaz25.
Şekil 1: Bir iğne kullanılarak erişkin optik tektumda bıçak yarası yaralanması. (A) Yetişkin bir zebra balığının sırt görünümü. Zebra balığı, bir straforun içine dikey olarak yerleştirilen iki bükülmüş iğne arasında dik tutulur. (A') (A)'daki kutulu alanın büyütülmüş görüntüsü. 30 G iğne, optik tektumda os frontale ve os parietale adı verilen iki kafatası arasındaki sınırın medial bölgesine sokulur. Sarı daire yaralanma bölgesini gösterir ve beyaz kesikli çizgiler optik tektumdaki iki kafatasını gösterir. (B) Yetişkin medaka'nın dorsal görünümü. (B') (B)'deki kutulu alanın büyütülmüş görüntüsü. Optik tektumdaki sınıra 30 G iğne sokulur. Sarı daire yaralanma bölgesini gösterir ve beyaz kesikli çizgiler optik tektumdaki iki kafatasını gösterir. (C) Medaka'nın kafatasında pullar vardır. Kafatası pulları, bıçak yarası yaralanmasından önce çıkarılmalıdır. Kesikli çizgi, optik tektumdaki ölçeği gösterir. Ölçek çubuğu: A-B'de 2 mm, A', B' ve C'de 1 mm. Telensefalon (Tel), optik tektum (OT), os frontale (F) ve os parietale (P). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Küçük yetişkin balıklarda intrakardiyak perfüzyon. (A) İntrakardiyak perfüzyon ve beyin diseksiyonu için hazır bükülmüş iğneler kullanılarak strafor üzerine sabitlenmiş bir zebra balığının ventral görünümü. (B) Anal yüzgeçlerin kaynağından göğse ventral insizyon yapılır. (C) Kalp, hem zebra balığında hem de medakada hipodermis adı verilen gümüşi bir epitel tabakasının arkasındadır. Gümüş epitel tabakasının yanında bükülmüş bir iğne kullanılarak yapılan başka bir fiksasyon, daha kolay erişim sağlar. Düz beyaz çizgi ventrikülü (V) gösterir ve noktalı çizgi hipodermisi gösterir. (D) Gümüş epitel tabakası, 1x PBS'nin intrakardiyal perfüzyonundan önce çıkarılır. (E-G) Kanül, intrakardiyak perfüzyon için ventriküle yerleştirilir. İntrakardiyak perfüzyondan önce (F) ve (G)'den sonra solungaçlar. Kan alma işlemi tamamlanmazsa, solungaçlar kırmızı kalır. (H-J) PBS perfüzyonundan sonra kanı dokulardan çıkarmak için beyin diseksiyonu. Optik tektum ve telensefalon üzerindeki kafataslarını (I)'de gösterildiği gibi çıkarın. Kan alma işlemi tamamlanmazsa, beyin açık pembe görünür (sağ beyin (J)). Ölçek çubuğu: A-C ve H'de 2 mm, D-G ve I-J'de 1 mm. Koku alma ampulü (OB), telensefalon (Tel), optik tektum (OT), bulbus arteriyozus (Ba), ventrikül (V) ve atriyum (At). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Dondurulmuş bölümler için beyin gömme . (A) Beyin, gömme bileşiği olan bir kriyomold içine gömülüdür. Ön kısım aşağıda. (B) Kriyomoldlar önceden soğutulmuş bir alüminyum blok üzerinde soğutulur. Telensefalon (Tel), optik tektum (OT). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Erişkin medakada tektum hasarı sonrası RGC proliferasyonuna karşı floresan immünoboyamanın temsili sonuçları . (A) Optik tektum ve koronal kesitin sağ yarımküresinde bıçak yarası yaralanmasının şematik görünümü. (B-C) Yaralanma sonrası 2 gün içinde kontralateral yaralanmamış (B) ve yaralı (C) tarafta proliferatif RGC'lerin (PCNA + BLBP + hücreler) temsili sonuçları. C' deki beyaz ok ucu, bıçak yarası yaralanması nedeniyle rahatsız olmuş bir periventriküler gri bölgeyi gösterir. (D) (C)'deki kutulu alanın büyütülmüş görüntüleri. (D) içindeki beyaz ok uçları PCNA + BLBP + hücrelerini gösterir. Ölçek çubuğu: B-D cinsinden 50 μm. Referans13'ün izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tektum hasarından sonra yenidoğan nöronların oluşumu için floresan immünoboyamanın temsili sonuçları . (A) Bromodeoksiüridin (BrdU) tedavisinin şematik görünümü ve optik tektum ve koronal kesitte bıçak yarası yaralanması. (B-C) Yaralı zebra balığı (B) ve medaka'da (C) yaralanmadan 7 gün sonra yenidoğan nöronlarının (BrdU + HuC + hücreleri) temsili sonuçları. Ölçek çubuğu: B-C cinsinden 50 μm. Referans13'ün izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, beyin hasarı sonrası RGC proliferasyonunun ve farklılaşmasının değerlendirilmesini kolaylaştırmak için bir iğne kullanarak optik tektumda bıçak yarası yaralanmalarını indüklemek için kullanılabilecek bir dizi yöntem açıklanmaktadır. İğne aracılı bıçak yaraları, standart bir alet seti kullanılarak birçok deneysel örneğe uygulanabilen basit, verimli bir şekilde uygulanan bir yöntemdir. Zebra balığı beyninin çeşitli bölgeleri için bıçak yarası yaralanma modelleri geliştirilmiştir 3,19,29. Optik tektum, beynin en büyük bölümlerinden biridir ve manipüle edilmesi kolaydır. Ayrıca, optik tektumdaki çoğu RGC, telensefalona kıyasla fizyolojik koşullar altında sessizdir, bu da yaralanmaya bağlı olarak RGC proliferasyonunu ve farklılaşmasını gözlemlemeyi kolaylaştırır 3,19.
Bıçak yarası yaralanmalarında kritik adımlardan ve sınırlamalardan biri manuel iğne yerleştirmedir; tekrarlanabilir sonuçlar yaratmak ve karşılaştırmalı analizi kolaylaştırmak için tutarlı bir yaralanma gereklidir. Yerleştirmenin kesin konumu ve derinliği çok önemlidir ve deneylerde tekrarlanabilir yaralanmalar yaratmaya yardımcı olur. Bu makale, her seferinde benzer yaralanmalar yapmak için net kurallar sunmaktadır. Ayrıca, yaralanmadan sonra RGC'nin çoğalması, yaralı tektumun nörojenezi için gereklidir. Yaralı zebra balığı ve medaka'da, RGC proliferasyonu 1 dpi'de artar ve kontralateral yaralanmamış yarımkürede olduğu gibi 7 dpi13,19'da bazal seviyelere geri döner.
Bıçak yarası yaralanması, spesifik olmayan hücre ablasyonunu indükleyen mekanik yaralanma yöntemlerinden biridir. Buna karşılık, nitroredüktaz/metronidazol sistemi gibi hücreye özgü ablasyona transgenik yaklaşımlar da geliştirilmiştir30,31,32. Bu ablasyon modelleri deneysel amaca göre seçilmelidir. Spesifik olmayan ablasyon, bıçak yaralanması ve iskemik inme gibi beyin yaralanmaları için uygundur. Buna karşılık, hücreye özgü ablasyon, Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklarla ilişkili spesifik hücrelerin dejenerasyonunu değerlendirmek için daha uygun olabilir.
Son zamanlarda, zebra balığı kullanan iskemik yaralanma modelleri geliştirilmiştir33, ancak bu modellerin kan akışını izlemek için transgenik çizgilere ve floresan mikroskopiye ihtiyacı vardır. Bu nedenle, bu modellerin zayıf genetik yaklaşımlara sahip türlere uygulanması zordur ve verimleri bıçak yarası yaralanma modelinden daha düşüktür.
Yukarıda belirtildiği gibi, optik tektumdaki bıçak yarası yaralanması, Afrika killifish ve mummichog gibi diğer küçük balık modellerinde yaygın aletlerle basit ve kolay bir şekilde uygulanır26. Ayrıca, türler arasındaki karşılaştırmalı analiz, dizileme teknolojisi kullanılarak iyi araştırılmıştır. Bu nedenle, bu basit yöntem, hücresel tepkilerin ve gen ekspresyonunun karşılaştırmalı analizini kullanarak zebra balığında NSC'lerin rejeneratif kapasitesini incelerken gerekli olmaya devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, JSPS KAKENHI Hibe Numarası 18K14824 ve 21K15195 ve AIST, Japonya'nın dahili hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , University of Oregon Press. (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
