Summary
Een mechanisch hersenletselmodel bij de volwassen zebravis wordt beschreven om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die hun hoge regeneratieve capaciteit reguleren. De methode legt uit om een steekwondletsel te creëren in het optische tectum van meerdere soorten kleine vissen om de regeneratieve reacties te evalueren met behulp van fluorescerende immunostaining.
Abstract
Terwijl zebravissen een superieur vermogen hebben om hun centrale zenuwstelsel (CZS) te regenereren, heeft medaka een lager CZS-regeneratief vermogen. Een hersenletselmodel werd ontwikkeld in het volwassen optische tectum van zebravissen en medaka en vergelijkende histologische en moleculaire analyses werden uitgevoerd om de moleculaire mechanismen op te helderen die de hoge regeneratieve capaciteit van dit weefsel bij deze vissoorten reguleren. Hier wordt een steekwondletselmodel gepresenteerd voor het volwassen optische tectum met behulp van een naald en histologische analyses voor proliferatie en differentiatie van de neurale stamcellen (NSC's). Een naald werd handmatig ingebracht in het centrale gebied van het optische tectum, en vervolgens werden de vissen intracardiaal doordrenkt en hun hersenen werden ontleed. Deze weefsels werden vervolgens gecryosectie en geëvalueerd met behulp van immunostaining tegen de juiste NSC-proliferatie- en differentiatiemarkers. Dit tectumletselmodel biedt robuuste en reproduceerbare resultaten in zowel zebravissen als medaka, waardoor NSC-responsen na letsel kunnen worden vergeleken. Deze methode is beschikbaar voor kleine teleosts, waaronder zebravissen, medaka en Afrikaanse killivissen, en stelt ons in staat om hun regeneratieve capaciteit te vergelijken en unieke moleculaire mechanismen te onderzoeken.
Introduction
Zebravissen (Danio rerio) hebben een verhoogd vermogen om hun centrale zenuwstelsel (CZS) te regenereren in vergelijking met andere zoogdieren 1,2,3. Onlangs, om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze verhoogde regeneratieve capaciteit beter te begrijpen, zijn vergelijkende analyses van weefselregeneratie met behulp van next-generation sequencing-technologie uitgevoerd 4,5,6. De hersenstructuren bij zebravissen en tetrapoden zijn heel verschillend 7,8,9. Dit betekent dat verschillende hersenletselmodellen met behulp van kleine vissen met vergelijkbare hersenstructuren en biologische kenmerken zijn ontwikkeld om het onderzoek naar de onderliggende moleculaire mechanismen die bijdragen aan deze verhoogde regeneratieve capaciteit te vergemakkelijken.
Bovendien is medaka (Oryzias latipes) een populair proefdier met een lage capaciteit voor hart- en neuronale regeneratie10,11,12,13 in vergelijking met zebravissen. Zebravissen en medaka hebben vergelijkbare hersenstructuren en niches voor volwassen neurale stamcellen (NSC's)14,15,16,17. Bij zebravissen en medaka omvat het optische tectum twee soorten NSC's, neuro-epitheliale-achtige stamcellen en radiale gliacellen (RGC's)15,18. Een steekwondletsel voor het optische tectum van volwassen zebravissen werd eerder ontwikkeld en dit model werd gebruikt om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die de hersenregeneratie bij deze dieren reguleren 19,20,21,22,23. Dit jongvolwassen zebravis steekwond letsel model geïnduceerde regeneratieve neurogenese van RGCs 19,24,25. Dit steekwondletsel in het optische tectum is een robuuste en reproduceerbare methode 13,19,20,21,22,23,24,25. Toen hetzelfde letselmodel werd toegepast op volwassen medaka, werd de lage neurogene capaciteit van RGC's in medaka optisch tectum onthuld via de vergelijkende analyse van RGC-proliferatie en differentiatie na letsel13.
Steekwondletselmodellen in het optische tectum zijn ook ontwikkeld in mummichog-modellen26, maar details van het tectumletsel zijn niet goed gedocumenteerd in vergelijking met telencefalisch letsel27. Het steekwondletsel in het optische tectum met behulp van zebravissen en medaka maakt het mogelijk om de differentiële cellulaire responsen en genexpressie tussen soorten met differentieel regeneratief vermogen te onderzoeken. Dit protocol beschrijft hoe een steekwondletsel in het optische tectum moet worden uitgevoerd met behulp van een injectienaald. Deze methode kan worden toegepast op kleine vissen zoals zebravissen en medaka. De processen voor monstervoorbereiding voor histologische analyse en cellulaire proliferatie- en differentiatieanalyse met behulp van fluorescerende immunohistochemie en cryosecties worden hier uitgelegd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Zebravis en medaka werden onderhouden volgens standaardprocedures28.
1. Steekwondletsel in het volwassen optische tectum
- Bereid een 0,4% (w / v) tricaïne-stamoplossing voor anesthesie. Los voor een stamoplossing van 100 ml 400 mg tricaïnemethaansulfonaat (zie materiaaltabel) op in 90 ml gedestilleerd water en stel de pH in op 7,0 met behulp van 1 M Tris HCl-buffer (pH 9,0). Zodra de pH is aangepast, voegt u water tot 100 ml toe, maakt u vervolgens de juiste aliquots en bewaart u deze bij -20 °C.
- Om de volwassen zebravis of medaka te verdoven, bereidt u een tricaïne-oplossing van 0,02 % (m/v) door de 0,4 % tricaïne-stamoplossing te verdunnen met visfaciliteitswater.
- Verdoof de vis met 0,02% tricaïne-oplossing; Ze worden verdoofd wanneer ze niet bewegen of reageren op aanraking (1-2 min).
- Plaats de verdoofde vis op een piepschuimen bakje (zie materiaaltabel) en bevestig de vis rechtop tussen twee naalden van 30 G die verticaal in het piepschuim zijn gestoken.
- Houd het vissenlichaam vast om te voorkomen dat de vissenkop beweegt en steek verticaal een naald van 30 G door de schedel in het mediale gebied van een van de optische tectumhelften (figuur 1A, B). De insteekdiepte is ~0,75 mm, bijna gelijk aan de helft van de lengte van de 30 G schuine kant. Deze inbrengdiepte veroorzaakt hersenletsel bij zebravissen en medaka vanwege de vergelijkbare lichaamsgrootte van deze vissen.
OPMERKING: Medaka heeft schubben op de schedel. Krab en verwijder de schubben met de naald van 30 G om het steekwondletsel efficiënt en nauwkeurig op te wekken (figuur 1C). - Breng de gewonde vissen over in een aquarium met vers visfaciliteitswater en verplaats de tank naar het viskweeksysteem zodra ze volledig zijn hersteld van de anesthesie.
OPMERKING: Vissen zullen zich herstellen en binnen een paar minuten vrij beginnen te bewegen. - Voor afstammingsanalyse na het letsel bereidt u vers visfaciliteitswater dat 5 mM bromodeoxyuridine (BrdU) bevat (zie tabel met materialen) en incubeert u de vis vervolgens met deze 5 mM BrdU-oplossing gedurende een vooraf bepaalde hoeveelheid tijd13,19 (zoals bepaald door een experimenteel ontwerp). Ontleed vervolgens deze vissen volgens stap 2 en evalueer brdU-opname en cellijnidentiteit indien van toepassing.
OPMERKING: Deze stap is een optionele stap voor analyse van de celafstamming. Om BrdU-signalen te detecteren, voert u het ophalen van antigeen uit zoals weergegeven in stap 4.3.
2. Hersendissectie
- Bereid 0,02% tricaïne-oplossing, een piepschuimen bakje voor dissectie en een spuit van 10 ml met fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS) met een verlengbuis en 30 G naalden (zie materiaaltabel) voor intracardiale perfusie.
- Verdoof de gewonde vis op geselecteerde tijdstippen.
- Leg papieren handdoeken op de piepschuimen bak en leg de verdoofde vis op de papieren handdoekjes.
- Houd het vissenlichaam op zijn plaats door verticaal twee naalden van 30 G aan weerszijden van de anaalvin in te brengen (figuur 2A).
- Maak een ventrale incisie van de anus naar het hart (figuur 2B) en houd het hart zichtbaar door nog eens twee naalden van 30 G aan elke kant van dit orgaan in te brengen (figuur 2C).
OPMERKING: Het hart is bedekt met de zilverachtige epitheellaag van de hypodermis in zowel zebravis als medaka (figuur 2C). - Verwijder voorzichtig de zilveren epitheellaag met de punt van de tang (figuur 2D).
- Steek de naald van 30 G in de ventrikel, houd de schuine kant omhoog en maak een incisie in het atrium met behulp van de tang (figuur 2E). Druk voorzichtig op de spuit om de 1x PBS in te drukken en bevestig dat het atrium het bloed heeft gespoeld.
OPMERKING: Om te voorkomen dat de naald de ventrikel binnendringt, steekt u de naald voorzichtig in op de diepte van de halve schuine kant en past u vervolgens de inbrengdiepte aan. Als de perfusie goed is gedaan, worden kieuwen wit (figuur 2F, G). - Stop de perfusie nadat het bloed is afgevoerd en de kieuwen wit worden.
- Verwijder de naalden die het vislichaam op zijn plaats bevestigen en bevestig de vis met de ventrale kant naar beneden (figuur 2H). Knip het ruggenmerg door en verwijder de schedel van het optische tectum en telencephalon (figuur 2I). Snijd vervolgens de oogzenuwen door en ontleed de hersenen zorgvuldig.
OPMERKING: Pas op voor de oogzenuwen tijdens de dissectie omdat de zenuwen verbonden zijn met het tectum. Wanneer de oogzenuw wordt getrokken, kan het optische tectum worden losgemaakt van de hersenen. Als de bloedverwijdering niet volledig is, zien de hersenen er lichtroze uit (de rechterhersenhelft in figuur 2J). - Breng de hersenen over in buisjes van 1,5 ml met 1 ml 4% paraformaldehyde in 1x PBS en fixeer ze 's nachts bij 4 °C.
3. Bereiding van bevroren secties
- Was de vaste hersenen drie keer in 1x PBS gedurende elk 5 minuten.
- Om de hersenen te cryoprotecteren, brengt u ze over in buisjes van 1,5 ml met 1 ml 30% (w / v) sucrose in 1x PBS en incubeert u ze een nacht bij 4 °C. Bereid de inbeddingsverbinding (2:1 mengsel van OCT-verbinding en 30% sucrose, zie materiaaltabel) door 30 ml OCT en 15 ml 30% sacharose te combineren. Bewaar dit bij 4 °C.
OPMERKING: Om de bubbels uit de gemengde verbinding te verwijderen, centrifugeert u de buizen van 50 ml gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur op 10.000 x g of plaatst u de buizen een nacht rechtop. - Incubeer een aluminium blok 's nachts bij -80 °C om de cryomold te koelen (zie Materiaaltabel) onmiddellijk nadat de ontleedde hersenen zijn ingebed in de cryomold met de inbeddingsverbinding.
OPMERKING: Vloeibare stikstof kan ook worden gebruikt om het aluminium blok te koelen. In dat geval moet het aluminiumblok in een piepschuimen doos worden geplaatst die is gevuld met voldoende vloeibare stikstof om het aluminiumblok vlak voor inbedding te bedekken. Nadat u de sublimatie van vloeibare stikstof hebt bevestigd, plaatst u de cryomold op het voorgekoelde aluminiumblok. Het is beter om te bevestigen hoeveel cryomolds tegelijkertijd op het aluminium blok kunnen worden geplaatst. Het is raadzaam om vloeibare stikstof of een extra voorgekoeld blok te gebruiken om voldoende ruimte te bieden om alle monsters snel te koelen. - Doe het voorgekoelde aluminium blok in een piepschuimen doos. Gebruik een piepschuimen doos met een deksel om te voorkomen dat het aluminium blok opwarmt.
- Voor coronale secties sluit u de hersenen in een cryomold in en past u de oriëntatie aan met behulp van een tang onder de microscoop (figuur 3A).
- Plaats de cryomold op het voorgekoelde aluminium blok in de piepschuimdoos en laat de OCT-verbinding bevriezen (figuur 3B). Wanneer de OCT-verbinding begint te bevriezen, wordt deze wit.
- Breng een kleine cirkel van OCT-verbinding aan op een monsterschijf en monteer het cryoblok om het cryoblok aan de monsterschijf te bevestigen.
- Plaats de monsterschijf in de cryostaat en vries de OCT-verbinding volledig in.
- Plaats de monsterschijf op de monsterkop in de cryostaat.
- Stel de oriëntatie van het cryoblok in en trim de OCT om eventuele extra gebieden te verwijderen.
OPMERKING: Pas de oriëntatie van het snijvlak aan tijdens het snijden van het telencephalon. Het mes is uitgerust met een cryostaat. Het is mogelijk om de oriëntatie van het snijvlak aan te passen door de hoek van de monsterkop te veranderen. - Snijd 14 μm dikke seriële secties door het hele optische tectum met behulp van een cryostaat. Bewaar de dia's bij -25 °C.
OPMERKING: Langdurige opslag moet bij -80 °C zijn.
4. Fluorescerende immunostaining
- Droog glas schuift gedurende 30 minuten in een schuifrek bij kamertemperatuur (RT). Was dia's in 1x PBS gedurende 30 min bij RT. Als immunostaining met anti-PCNA- of BrdU-antilichamen moet worden uitgevoerd, gaat u verder met stap 4.2 of stap 4.3.
- Bereid 500 ml natriumcitraat van 10 mM in een bekerglas van 500 ml en verwarm de citraatbuffer tot 85 °C op een magnetische roerder met hete plaat, plaats de dia's vervolgens in een schuifkleuringsrek en incubeer het rek in de citraatbuffer bij 85 °C gedurende 30 minuten. Om koken te voorkomen, houdt u de temperatuur rond de 85 °C. Na het ophalen van antigeen, was de dia's drie keer in 0,1% Triton in 1x PBS (PBSTr), waarbij elke wasbeurt 5 minuten duurde bij RT.
OPMERKING: Deze stap is een optionele stap voor het prolifereren van het ophalen van celkernantigeen (PCNA). - Bereid een 2 N HCl-oplossing door 12 N HCl in gedestilleerd water te verdunnen. Teken met behulp van een vloeistofblokker (zie materiaaltabel) een lijn als een hydrofobe barrière om de 2 N HCl-oplossing rond de secties te houden.
- Plaats de dia's op immunokleurbakken en breng 200-300 μL van de 2N HCl-oplossing aan. Incubeer de trays op 37 °C gedurende 30 min. Na het ophalen van antigeen, driemaal wassen in 0,1 % PBSTr waarbij elke wasbeurt 5 minuten bij RT duurt.
OPMERKING: Deze stap is een optionele stap voor het ophalen van BrdU-antigeen.
- Plaats de dia's op immunokleurbakken en breng 200-300 μL van de 2N HCl-oplossing aan. Incubeer de trays op 37 °C gedurende 30 min. Na het ophalen van antigeen, driemaal wassen in 0,1 % PBSTr waarbij elke wasbeurt 5 minuten bij RT duurt.
- Absorbeer en verwijder de resterende oplossing met keukenpapier. Gebruik vervolgens een vloeistofblokker om een hydrofobe barrière te tekenen om de antilichaamoplossing zo nodig rond de secties te houden.
- Plaats de dia's op trays en breng 200-300 μL blokkeeroplossing, 3% (v/v) paardenserum in PBSTr) aan op elke dia en incuber de dia's gedurende 1 uur bij RT.
- Was de secties met PBSTr gedurende 5 minuten bij RT en herhaal dit drie keer.
- Bereid de primaire antilichamen (zie tabel met materialen) met behulp van de blokkerende oplossing (200-300 μl antilichaamoplossing voor elke dia). Verwijder de resterende PBSTr met keukenpapier en plaats de dia's op de immunostaining-trays. Breng de primaire antilichaamoplossing aan op elke dia en incubeer trays 's nachts bij 4 °C.
- Was de secties met PBSTr gedurende 5 minuten bij RT en herhaal dit drie keer.
- Bereid fluorescerende secundaire antilichaamoplossing (zie materiaaltabel) met behulp van de blokkeringsbuffer (1:500). Verwijder de resterende PBSTr met keukenpapier en plaats de dia's op de immunostaining-trays. Breng de secundaire antilichaamoplossing aan op elke schuif- en schaduwbakken met aluminiumfolie. Incubeer gedurende 1-2 uur bij RT.
- Was de secties met PBSTr gedurende 5 minuten bij RT drie keer zonder ze bloot te stellen aan licht.
- Bereid de Hoechst-oplossing (1:500 verdunning in 1x PBS, zie materiaaltabel) voor nucleaire kleuring. Verwijder de resterende PBSTr met keukenpapier en plaats de dia's op de immunostaining-trays. Breng de Hoechst-oplossing aan op elke dia en bedek de trays met aluminiumfolie. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
- Was de secties met 1x PBS gedurende 10 minuten bij RT zonder ze bloot te stellen aan licht.
- Absorbeer en verwijder de resterende 1x PBS met keukenpapier en monteer de secties op dia's met behulp van een in water oplosbaar montagemedium (zie materiaaltabel) voor fluorescerende immunokleuring. Plaats langzaam een coverslip van 24 x 45 mm op de secties. Bewaren bij 4 °C, zonder de dia's bloot te stellen aan licht.
- Observeer en beeld de secties onder fluorescerende microscopie of confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Steekwondletsel in het optische tectum met behulp van naaldinbrenging in de rechterhersenhelft (figuur 1, figuur 4A en figuur 5A) induceert verschillende cellulaire reacties, waaronder radiale gliacelproliferatie (RGC) en het genereren van pasgeboren neuronen. Evenzo werden verouderde populaties van zebravissen en medaka gebruikt om eventuele verouderingseffecten in de regeneratieve respons tegen te gaan. Vervolgens werd fluorescerende immunostaining uitgevoerd op de bevroren secties en werden de RGC-proliferatie en -differentiatie geanalyseerd na het tectumletsel bij de zebravis en medaka (figuur 4-5)13.
Antilichamen tegen een prolifererende celmarker werden gebruikt, prolifererend celantigeen (PCNA), en een RGC-marker, hersenlipidenbindend eiwit (BLBP), beschikbaar in zebravissen en medaka om de RGC-proliferatie in deze weefsels te evalueren13,19. Zoals eerder beschreven, waren de meeste RGC's rustig (PCNA-negatief) in de contralaterale niet-gewonde hemisfeer (figuur 4B)13. Toch werd RGC-proliferatie geïnduceerd op 2 dagen na het letsel (dpi) in het medaka tectum (figuur 4C,D)13. Inductie van RGC-proliferatie na de verwonding is een gemeenschappelijk kenmerk van zowel de zebravis als de medaka regeneratieve responsen13,19.
BrdU-labeling is een eenvoudige methode die wordt gebruikt om de cellijn te evalueren en RGC-differentiatie na hersenletsel te analyseren (figuur 5A)13. Immunostaining met antilichamen voor een panneuronale marker, HuC en BrdU werd eerder gebruikt om RGC-differentiatie in het gewonde tectum van zebravissen en medaka te vergelijken (figuur 5B,C)13. Als deze antilichamen beschikbaar zijn in de doelsoort, kunnen vergelijkende analyses worden uitgevoerd.
Als het letsel op de juiste manier wordt geïnduceerd, bevindt de plaats van het letsel zich in het centrale dorsale gebied in het optische tectum (figuur 4C). Nucleaire kleuring en hematoxyline- en eosinekleuring kunnen vervolgens worden gebruikt om de verwondingsplaats 13,19,20,21,22,23,24,25 te bevestigen. Na het letsel kan een verstoorde periventriculaire grijze zone met nucleaire kleuring worden waargenomen (figuur 4C). Als de verwonding zich in het mediale dorsale gebied bevindt, is de RGC-proliferatie niet significant verhoogd25.
Figuur 1: Steekwondletsel bij volwassen optisch tectum met behulp van een naald. (A) Dorsale weergave van een volwassen zebravis. Zebravis wordt rechtop gehouden tussen twee gebogen naalden die verticaal in een piepschuim worden gestoken. (A') Vergrote afbeelding van het ingepakte gebied in (A). 30 G naald wordt ingebracht in het mediale gebied van de grens tussen twee schedels genaamd os frontale en os parietale op het optische tectum. De gele cirkel geeft de plaats van het letsel aan en witte stippellijnen geven de twee schedels op het optische tectum aan. (B) Dorsale weergave van volwassen medaka. B') Een vergrote afbeelding van het ingepakte gebied in (B). 30 G naald wordt ingebracht in de rand van het optische tectum. De gele cirkel geeft de plaats van het letsel aan en witte stippellijnen geven twee schedels op het optische tectum aan. (C) Medaka heeft schubben op de schedel. Schedelschubben moeten worden verwijderd voordat de steekwond gewond raakt. De stippellijn geeft de schaal op het optische tectum aan. Schaalbalk: 2 mm in A-B, 1 mm in A', B' en C. Telencephalon (Tel), optic tectum (OT), os frontale (F) en os parietale (P). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Intracardiale perfusie bij kleine volwassen vissen. (A) Ventrale weergave van een zebravis gefixeerd op piepschuim met behulp van gebogen naalden die klaar zijn voor intracardiale perfusie en hersendissectie. (B) Een ventrale incisie wordt gemaakt van de oorsprong van de anale vinnen naar de borst. (C) Het hart bevindt zich achter een zilverachtige epitheellaag die de hypodermis wordt genoemd in zowel zebravissen als medaka. Een andere fixatie met behulp van een gebogen naald naast de zilveren epitheellaag zorgt voor gemakkelijkere toegang. De ononderbroken witte lijn geeft de ventrikel (V) aan en de stippellijn geeft de hypodermis aan. (D) De zilveren epitheellaag wordt verwijderd vóór de intracardiale perfusie van 1x PBS. (E-G) Canula wordt ingebracht in de ventrikel voor intracardiale perfusie. Kieuwen voor (F) en na (G) de intracardiale perfusie. Als de bloedverwijdering niet volledig is, blijven de kieuwen rood. (H-J) Hersendissectie na PBS-perfusie om het bloed uit de weefsels te verwijderen. Verwijder schedels op het optische tectum en telencephalon zoals weergegeven in (I). Als de bloedverwijdering niet volledig is, zien de hersenen er lichtroze uit (de rechterhersenhelft in (J)). Schaalbalk: 2 mm in A-C en H, 1 mm in D-G en I-J. De bulbus olfactorius (OB), telencephalon (Tel), optisch tectum (OT), bulbus arteriosus (Ba), ventrikel (V) en atrium (At). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Herseninbedding voor bevroren secties . (A) De hersenen zijn ingebed in een cryomold met een inbeddingsverbinding. Anterior is down. (B) Cryomolds worden gekoeld op een voorgekoeld aluminium blok. Telencephalon (Tel), optisch tectum (OT). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van fluorescerende immunostaining tegen RGC-proliferatie na tectumletsel bij volwassen medaka . (A) Schematische weergave van het steekwondletsel aan de rechterhersenhelft van het optische tectum en de coronale sectie. (B-C) Representatieve resultaten van proliferatieve RGC's (PCNA + BLBP + cellen) in de contralaterale onbeschadigde (B) en gewonde (C) zijde 2 dagen na het letsel. Witte pijlpunt in C' duidt op een verstoorde periventriculaire grijze zone door het steekwondletsel. (D) Vergrote afbeeldingen van het ingepakte gebied in (C). Witte pijlpunten in (D) geven PCNA + BLBP + cellen aan. Schaalbalk: 50 μm in B-D. Aangepast met toestemming van Referentie13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van de fluorescerende immunostaining voor de generatie van pasgeboren neuronen na tectumletsel . (A) Schematische weergave van de behandeling met bromodeoxyuridine (BrdU) en het steekwondletsel in het optische tectum en de coronale sectie. (B-C) Representatieve resultaten van pasgeboren neuronen (BrdU + HuC + cellen) 7 dagen na het letsel bij de gewonde zebravis (B) en medaka (C). Schaalbalk: 50 μm in B-C. Aangepast met toestemming van Referentie13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een reeks methoden beschreven die kunnen worden gebruikt om steekwondletsels in het optische tectum te induceren met behulp van een naald om de evaluatie van RGC-proliferatie en differentiatie na hersenletsel te vergemakkelijken. Naaldgemedieerde steekwonden zijn een eenvoudige, efficiënt geïmplementeerde methode die op veel experimentele monsters kan worden toegepast met behulp van een standaardset gereedschappen. Steekwondletselmodellen voor verschillende regio's van het zebravisbrein zijn ontwikkeld 3,19,29. Het optische tectum is een van de grootste delen van de hersenen en is gemakkelijk te manipuleren. Bovendien zijn de meeste RGC's in het optische tectum rustig onder fysiologische omstandigheden in vergelijking met het telencephalon, waardoor het gemakkelijker is om RGC-proliferatie en differentiatie te observeren, afhankelijk van het letsel 3,19.
Een van de kritieke stappen en beperkingen bij steekwondletsels is het handmatig inbrengen van naalden; Een consistente verwonding is noodzakelijk om reproduceerbare resultaten te creëren en vergelijkende analyse te vergemakkelijken. De precieze locatie en diepte van het inbrengen zijn cruciaal en helpen bij het creëren van reproduceerbare verwondingen in experimenten. Dit artikel geeft duidelijke richtlijnen voor het maken van vergelijkbare verwondingen elke keer. Bovendien is de proliferatie van RGC na het letsel essentieel voor de neurogenese van het gewonde tectum. Bij gewonde zebravissen en medaka neemt de RGC-proliferatie toe bij 1 dpi en keert terug naar basale niveaus, hetzelfde als in de contralaterale niet-gewonde hemisfeer, bij 7 dpi13,19.
Steekwondletsel is een van de mechanische letselmethoden die niet-specifieke celablatie induceren. Daarentegen zijn transgene benaderingen van celspecifieke ablatie zoals nitroreductase / metronidazolsysteem ook ontwikkeld30,31,32. Deze ablatiemodellen moeten worden geselecteerd op basis van het experimentele doel. Aspecifieke ablatie is geschikt voor hersenletsel zoals steekwonden en ischemische beroerte. Daarentegen kan celspecifieke ablatie geschikter zijn voor het evalueren van de degeneratie van specifieke cellen geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson.
Onlangs zijn ischemische letselmodellen met zebravissen ontwikkeld33, maar deze modellen hebben transgene lijnen en fluorescerende microscopie nodig om de bloedstroom te controleren. Daarom zijn deze modellen een uitdaging om toe te passen op soorten met een slechte genetische benadering en is hun doorvoer lager dan het steekwondletselmodel.
Zoals hierboven vermeld, is steekwondletsel in het optische tectum eenvoudig en gemakkelijk toe te passen in andere kleine vismodellen zoals Afrikaanse killifish en mummichog met gewone gereedschappen26. Bovendien is vergelijkende analyse tussen soorten goed onderzocht met behulp van sequencing-technologie. Daarom blijft deze eenvoudige methode essentieel bij het bestuderen van het regeneratieve vermogen van NSC's in zebravissen met behulp van vergelijkende analyse van cellulaire responsen en genexpressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 en 21K15195 en een interne subsidie van AIST, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , University of Oregon Press. (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
