Summary
En mekanisk hjärnskademodell hos vuxna zebrafiskar beskrivs för att undersöka de molekylära mekanismer som reglerar deras höga regenerativa kapacitet. Metoden förklarar att skapa en sticksårskada i optisk tektum hos flera arter av små fiskar för att utvärdera de regenerativa svaren med hjälp av fluorescerande immunfärgning.
Abstract
Medan zebrafiskar har en överlägsen förmåga att regenerera sitt centrala nervsystem (CNS), har medaka en lägre CNS-regenerativ kapacitet. En hjärnskademodell utvecklades i det vuxna optiska tektum hos zebrafiskar och medaka och jämförande histologiska och molekylära analyser utfördes för att belysa de molekylära mekanismerna som reglerar den höga regenerativa kapaciteten hos denna vävnad över dessa fiskarter. Här presenteras en sticksårskademodell för det vuxna optiska tektum med hjälp av en nål och histologiska analyser för proliferation och differentiering av neurala stamceller (NSC). En nål sattes manuellt in i den centrala regionen av optisk tektum, och sedan perfuserades fisken intrakardiellt och deras hjärnor dissekerades. Dessa vävnader kryosektionerades sedan och utvärderades med hjälp av immunfärgning mot lämpliga NSC-proliferations- och differentieringsmarkörer. Denna tektumskademodell ger robusta och reproducerbara resultat i både zebrafisk och medaka, vilket gör det möjligt att jämföra NSC-svar efter skada. Denna metod är tillgänglig för små teleoster, inklusive zebrafisk, medaka och afrikansk killifisk, och gör det möjligt för oss att jämföra deras regenerativa kapacitet och undersöka unika molekylära mekanismer.
Introduction
Zebrafiskar (Danio rerio) har en ökad förmåga att regenerera sitt centrala nervsystem (CNS) jämfört med andra däggdjur 1,2,3. För att bättre förstå de molekylära mekanismerna bakom denna ökade regenerativa kapacitet har jämförande analyser av vävnadsregenerering med nästa generations sekvenseringsteknik utförts 4,5,6. Hjärnstrukturerna hos zebrafiskar och tetrapoder är ganska olika 7,8,9. Detta innebär att flera hjärnskademodeller med små fiskar med liknande hjärnstrukturer och biologiska egenskaper har utvecklats för att underlätta undersökningen av de underliggande molekylära mekanismerna som bidrar till denna ökade regenerativa kapacitet.
Dessutom är medaka (Oryzias latipes) ett populärt laboratoriedjur med låg kapacitet för hjärt- och neuronal regenerering10,11,12,13 jämfört med zebrafisk. Zebrafisk och medaka har liknande hjärnstrukturer och nischer för vuxna neurala stamceller (NSC)14,15,16,17. I zebrafisk och medaka innehåller det optiska tektum två typer av NSC, neuroepitelliknande stamceller och radiella gliaceller (RGCs)15,18. En sticksårskada för optisk tektum hos vuxna zebrafiskar utvecklades tidigare, och denna modell användes för att undersöka de molekylära mekanismerna som reglerar hjärnregenerering hos dessa djur 19,20,21,22,23. Denna unga vuxna zebrafisk sticka sårskada modell inducerade regenerativ neurogenes från RGC 19,24,25. Denna sticksårskada i optisk tektum är en robust och reproducerbar metod 13,19,20,21,22,23,24,25. När samma skademodell tillämpades på vuxen medaka avslöjades den låga neurogena kapaciteten hos RGC i medaka optisk tektum via jämförande analys av RGC-proliferation och differentiering efter skada13.
Sticksårskademodeller i optisk tektum har också utvecklats i mummigrismodeller26, men detaljer om tektumskadan har inte dokumenterats väl jämfört med telencefalisk skada27. Sticksårskadan i optisk tektum med zebrafisk och medaka möjliggör undersökning av differentiella cellulära svar och genuttryck mellan arter med differentiell regenerativ kapacitet. Detta protokoll beskriver hur man utför en sticksårskada i optisk tektum med hjälp av en injektionsnål. Denna metod kan tillämpas på små fiskar som zebrafisk och medaka. Processerna för provberedning för histologisk analys och cellulär proliferation och differentieringsanalys med fluorescerande immunhistokemi och kryosektioner förklaras här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Zebrafisk och medaka upprätthölls enligt standardprocedurer28.
1. Sticksårskada i vuxen optisk tektum
- Förbered en 0,4% (w/v) trikainstamlösning för anestesi. För en 100 ml stamlösning, lös 400 mg trikainmetansulfonat (se materialtabell) i 90 ml destillerat vatten och justera pH till 7,0 med 1 M Tris HCl-buffert (pH 9,0). När pH-värdet har justerats, tillsätt vatten upp till 100 ml, gör sedan lämpliga alikvoter och förvara dem vid -20 °C.
- För att bedöva den vuxna zebrafisken eller medaka, bereda en 0,02 % (vikt/volym) trikainlösning genom att späda 0,4 % trikainstamlösningen med vatten från fiskanläggningen.
- Bedöva fisken med 0,02% tricainlösning; De blir sövda när de inte rör sig eller svarar på beröring (1-2 min).
- Placera den bedövade fisken på en frigolitbricka (se materialförteckning) och fixera fisken upprätt mellan två 30 G nålar som sätts in vertikalt i frigolit.
- Håll fiskkroppen för att förhindra att fiskhuvudet rör sig och sätt vertikalt in en 30 G nål genom skallen i den mediala regionen av en av de optiska tektumhalvorna (figur 1A, B). Införingsdjupet är ~ 0,75 mm, nästan lika med halva längden på 30 G-fasningen. Detta insättningsdjup inducerar hjärnskada på zebrafisk och medaka på grund av den liknande kroppsstorleken hos dessa fiskar.
OBS: Medaka har fjäll på skallen. Skrapa och ta bort vågen med 30 G-nålen för att effektivt och noggrant framkalla sticksårskadan (figur 1C). - Överför den skadade fisken till ett akvarium med färskt fiskanläggningsvatten och flytta tanken till fiskodlingssystemet när de har återhämtat sig helt från anestesin.
OBS: Fisken kommer att återhämta sig och börja röra sig fritt inom några minuter. - För härstamningsanalys efter skadan, förbered färskt fiskanläggningsvatten innehållande 5 mM bromoxiuridin (BrdU) (se materialtabell) och inkubera sedan fisken med denna 5 mM BrdU-lösning under en förutbestämd tid13,19 (bestämd genom en experimentell design). Dissekera sedan dessa fiskar enligt steg 2 och utvärdera BrdU-inkorporering och celllinjeidentitet efter behov.
OBS: Detta steg är ett valfritt steg för celllinjeanalys. För att detektera BrdU-signaler, utför antigenhämtning som visas i steg 4.3.
2. Hjärndissektion
- Bered 0,02% trikainlösning, en frigolitbricka för dissektion och en 10 ml spruta innehållande fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) med ett förlängningsrör och 30 G nålar (se materialförteckning) för intrakardiell perfusion.
- Bedöva den skadade fisken vid utvalda tidpunkter.
- Lägg pappershanddukar på frigolitbrickan och lägg den bedövade fisken på pappershanddukarna.
- Håll fiskkroppen på plats genom att vertikalt föra in två 30 G nålar på vardera sidan av analfenan (figur 2A).
- Gör ett ventralt snitt från anus till hjärtat (figur 2B) och håll hjärtat synligt genom att sätta in ytterligare två 30 G nålar på vardera sidan av detta organ (figur 2C).
OBS: Hjärtat är täckt av det silverfärgade epitelskiktet i hypodermis i både zebrafisk och medaka (figur 2C). - Ta försiktigt bort det silverepiteliala skiktet med spetsen på pincetten (figur 2D).
- För in 30 G-nålen i ventrikeln, håll avfasningen uppåt och gör ett snitt i förmaket med hjälp av pincetten (figur 2E). Tryck försiktigt ner sprutan för att trycka på 1x PBS och bekräfta att förmaket spolade blodet.
OBS: För att förhindra att nålen tränger in i ventrikeln, för försiktigt in nålen till halvfasningsdjupet och justera sedan införingsdjupet. Om perfusionen är väl gjord blir gälarna vita (figur 2F, G). - Stoppa perfusionen efter att blodet har tömts och gälarna blir vita.
- Ta bort nålarna som fixerar fiskkroppen på plats och fixera fiskens ventrala sida nedåt (figur 2H). Skär ryggmärgen och ta bort skallen från optisk tektum och telencephalon (figur 2I). Skär sedan de optiska nerverna och dissekera hjärnan noggrant.
OBS: Se upp för synnerverna under dissektionen, eftersom nerverna är anslutna till tektumet. När synnerven dras kan det optiska tektum lossas från hjärnan. Om blodborttagningen inte är fullständig ser hjärnan ljusrosa ut (höger hjärnhalva i figur 2J). - Överför hjärnorna till 1,5 ml rör med 1 ml 4 % paraformaldehyd i 1x PBS och fixera dem över natten vid 4 °C.
3. Beredning av frysta sektioner
- Tvätta de fasta hjärnorna tre gånger i 1x PBS i 5 minuter vardera.
- För att kryoskydda hjärnan, överför dem till 1,5 ml rör med 1 ml 30 % (w/v) sackaros i 1x PBS och inkubera dem över natten vid 4 °C. Bered inbäddningsmassan (2:1 blandning av OCT-förening och 30 % sackaros, se Materialförteckning) genom att kombinera 30 ml OCT och 15 ml 30 % sackaros. Förvara detta vid 4 °C.
OBS: För att avlägsna bubblorna från den blandade föreningen, centrifugera 50 ml rören vid 10 000 x g i 2 minuter vid rumstemperatur eller placera rören upprätt över natten. - Inkubera ett aluminiumblock över natten vid -80 °C för att kyla kryomolen (se materialtabell) omedelbart efter att den dissekerade hjärnan är inbäddad i kryopolen med inbäddningsföreningen.
OBS: Flytande kväve kan också användas för att kyla aluminiumblocket. I så fall ska aluminiumblocket placeras i en frigolitlåda fylld med tillräckligt med flytande kväve för att täcka aluminiumblocket strax före inbäddning. Efter att ha bekräftat sublimeringen av flytande kväve, placera kryopolen på det förkylda aluminiumblocket. Det är bättre att bekräfta hur många kryoformar som kan placeras på aluminiumblocket samtidigt. Det är lämpligt att använda flytande kväve eller ett extra förkylt block för att säkerställa tillräckligt med utrymme för att kyla alla prover snabbt. - Lägg det förkylda aluminiumblocket i en frigolitlåda. Använd en frigolitlåda med lock för att förhindra att aluminiumblocket värms upp.
- För koronala sektioner, bädda in hjärnan i en kryomold och justera orienteringen med pincett under mikroskopet (figur 3A).
- Placera kryomolen på det förkylda aluminiumblocket i frigolitlådan och låt OCT-föreningen frysa (figur 3B). När OCT-föreningen börjar frysa blir den vit.
- Applicera en liten cirkel av OCT-förening på en provskiva och montera kryoblocket för att fästa kryoblocket på provskivan.
- Placera provskivan i kryostaten och frys OCT-föreningen helt.
- Placera provskivan på provhuvudet i kryostaten.
- Ställ in kryoblockets orientering och trimma OCT för att ta bort eventuella extra regioner.
OBS: Justera skärplanets orientering medan du skär telencephalon. Bladet är utrustat med en kryostat. Det är möjligt att justera skärplanets orientering genom att ändra vinkeln på provhuvudet. - Skär 14 μm tjocka seriella sektioner genom hela optic tectum med hjälp av en kryostat. Förvara objektglasen vid -25 °C.
OBS: Långtidsförvaring bör vara vid -80 °C.
4. Fluorescerande immunfärgning
- Torka glasskivor i ett glidställ i 30 min vid rumstemperatur (RT). Tvätta glidbanor i 1x PBS i 30 min vid RT. Om immunfärgning med anti-PCNA- eller BrdU-antikroppar ska utföras, fortsätt till steg 4.2 eller steg 4.3.
- Bered 500 ml 10 mM natriumcitrat i en 500 ml bägare och värm citratbufferten till 85 °C på en magnetomrörare med värmeplatta, placera sedan objektglasen i ett inglasningsfärgningsställ och inkubera stället i citratbufferten vid 85 °C i 30 minuter. För att undvika kokning, håll temperaturen runt 85 °C. Efter antigenhämtning, tvätta glasen tre gånger i 0,1 % Triton i 1x PBS (PBSTr), där varje tvätt tar 5 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Detta steg är ett valfritt steg för hämtning av cellkärnantigen (PCNA). - Bered en 2 N HCl lösning genom att späda 12 N HCl i destillerat vatten. Använd en vätskeblockerare (se materialförteckning) och rita en linje som en hydrofob barriär för att hålla 2 N HCl-lösningen runt sektionerna.
- Placera objektglasen på immunfärgningsbrickor och applicera 200-300 μL av 2N HCl-lösningen. Inkubera brickorna vid 37 °C i 30 minuter. Efter antigenhämtning tvättas tre gånger i 0,1 % PBSTr och varje tvätt tar 5 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Detta steg är ett valfritt steg för BrdU-antigenhämtning.
- Placera objektglasen på immunfärgningsbrickor och applicera 200-300 μL av 2N HCl-lösningen. Inkubera brickorna vid 37 °C i 30 minuter. Efter antigenhämtning tvättas tre gånger i 0,1 % PBSTr och varje tvätt tar 5 minuter vid rumstemperatur.
- Absorbera och ta bort den återstående lösningen med pappershanddukar. Använd sedan en vätskeblockerare för att dra en hydrofob barriär för att hålla antikroppslösningen runt sektionerna efter behov.
- Placera objektglasen på brickor och applicera 200-300 μL blockeringslösning, 3% (v/v) hästserum i PBSTr) på varje objektglas och inkubera objektglasen i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta sektionerna med PBSTr i 5 min vid rumstemperatur och upprepa tre gånger.
- Bered de primära antikropparna (se materialförteckningen) med hjälp av blockeringslösningen (200-300 μL antikroppslösning för varje objektsglas). Ta bort återstående PBSTr med pappershanddukar och placera objektglasen på immunfärgningsbrickorna. Applicera den primära antikroppslösningen på varje objektglas och inkubera tråg över natten vid 4 °C.
- Tvätta sektionerna med PBSTr i 5 min vid rumstemperatur och upprepa tre gånger.
- Bered fluorescerande sekundär antikroppslösning (se materialförteckning) med hjälp av blockeringsbufferten (1:500). Ta bort återstående PBSTr med pappershanddukar och placera objektglasen på immunfärgningsbrickorna. Applicera den sekundära antikroppslösningen på varje bild och skuggbrickor med aluminiumfolie. Inkubera i 1-2 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta sektionerna med PBSTr i 5 min vid rumstemperatur tre gånger utan att utsätta dem för ljus.
- Bered Hoechst-lösning (1:500 spädning i 1x PBS, se materialtabell) för kärnfärgning. Ta bort återstående PBSTr med pappershanddukar och placera objektglasen på immunfärgningsbrickorna. Applicera Hoechst-lösningen på varje bild och täck brickorna med aluminiumfolie. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta sektionerna med 1x PBS i 10 minuter vid rumstemperatur utan att utsätta dem för ljus.
- Absorbera och ta bort de återstående 1x PBS med pappershanddukar och montera sektionerna på objektglas med ett vattenlösligt monteringsmedium (se materialförteckning) för fluorescerande immunfärgning. Sätt långsamt ett täckglas på 24 x 45 mm på sektionerna. Förvaras vid 4 °C utan att utsätta objektglasen för ljus.
- Observera och avbilda sektionerna under fluorescerande mikroskopi eller konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sticksårskada i optisk tektum med nålinsättning i höger halvklot (figur 1, figur 4A och figur 5A) inducerar olika cellulära svar, inklusive radiell gliacellsproliferation (RGC) och generering av nyfödda neuroner. På liknande sätt användes åldrade populationer av zebrafisk och medaka för att motverka eventuella åldrande effekter i det regenerativa svaret. Därefter utfördes fluorescerande immunfärgning på de frysta sektionerna, och RGC-proliferationen och differentieringen analyserades efter tektumskadan i zebrafisken och medaka (figur 4-5)13.
Antikroppar mot en prolifererande cellmarkör användes, prolifererande cellantigen (PCNA), och en RGC-markör, hjärnlipidbindande protein (BLBP), tillgängligt i zebrafisk och medaka för att utvärdera RGC-proliferationen i dessa vävnader13,19. Som tidigare beskrivits var de flesta RGC vilande (PCNA-negativa) i den kontralaterala oskadade halvklotet (figur 4B)13. Ändå inducerades RGC-proliferation 2 dagar efter skada (dpi) i medaka tectum (figur 4C, D)13. Induktion av RGC-proliferation efter skadan är ett vanligt inslag i både zebrafisken och medaka regenerativa svar13,19.
BrdU-märkning är en enkel metod som används för att utvärdera cellinje och analysera RGC-differentiering efter hjärnskada (Figur 5A)13. Immunfärgning med antikroppar för en panneuronal markör, HuC och BrdU användes tidigare för att jämföra RGC-differentiering i det skadade tektum hos zebrafisk och medaka (figur 5B, C)13. Om dessa antikroppar finns tillgängliga hos den djurart läkemedlet är avsett för kan jämförande analyser utföras.
Om skadan är lämpligt inducerad är skadestället beläget i den centrala dorsala regionen i optisk tektum (figur 4C). Nukleär färgning och hematoxylin och eosinfärgning kan sedan användas för att bekräfta skadestället 13,19,20,21,22,23,24,25. Efter skadan kan en störd periventrikulär gråzon med kärnfärgning observeras (figur 4C). Om skadan är belägen i den mediala dorsala regionen ökar RGC-proliferationen inte signifikant25.
Figur 1: Sticksårskada i vuxen optisk tektum med hjälp av en nål . (A) Ryggvy av en vuxen zebrafisk. Zebrafisk hålls upprätt mellan två böjda nålar som sätts in vertikalt i en frigolit. (A') Förstorad bild av det inramade området i (A). 30 G nål sätts in i den mediala regionen av gränsen mellan två skallar som kallas os frontale och os parietale på optisk tektum. Den gula cirkeln indikerar skadestället och vita streckade linjer indikerar de två skallarna på optisk tektum. (B) Ryggvy av vuxen medaka. (B') En förstorad bild av det inramade området i (B). 30 G nål sätts in i gränsen på optisk tektum. Den gula cirkeln indikerar skadestället och vita streckade linjer indikerar två skallar på optisk tektum. (C) Medaka har fjäll på skallen. Skallvågar ska tas bort före stickskadan. Den streckade linjen anger skalan på optisk tektum. Skalstång: 2 mm i A-B, 1 mm i A', B' och C. Telencephalon (Tel), optic tectum (OT), os frontale (F) och os parietale (P). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Intrakardiell perfusion hos små vuxna fiskar . (A) Ventral bild av en zebrafisk fixerad på frigolit med böjda nålar redo för intrakardiell perfusion och hjärndissektion. (B) Ett ventralt snitt görs från analfenornas ursprung till bröstet. (C) Hjärtat ligger bakom ett silverfärgat epitelskikt som kallas hypodermis i både zebrafisk och medaka. En annan fixering med en böjd nål bredvid silverepitelskiktet möjliggör enklare åtkomst. Den fasta vita linjen indikerar ventrikeln (V), och den prickade linjen indikerar hypodermis. (D) Silverepitelskiktet avlägsnas före intrakardiell perfusion av 1x PBS. (E-G) Canula sätts in i ventrikeln för intrakardiell perfusion. Gälar före (F) och efter (G) intrakardiell perfusion. Om blodavlägsnandet inte är fullständigt förblir gallen röda. (H–J) Hjärndissektion efter PBS-perfusion för att ta bort blodet från vävnaderna. Ta bort skallar på optisk tektum och telencefalon som visas i (I). Om blodborttagningen inte är fullständig ser hjärnan ljusrosa ut (höger hjärnhalva i (J)). Skalstång: 2 mm i A-C och H, 1 mm i D-G och I-J. Luktbulben (OB), telencephalon (Tel), optisk tektum (OT), bulbus arteriosus (Ba), ventrikel (V) och atrium (At). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Hjärninbäddning för frysta sektioner . (A) Hjärnan är inbäddad i en kryomol med en inbäddningsförening. Anterior är nere. (B) Kryoformar kyls på ett förkylt aluminiumblock. Telencephalon (Tel), optisk tektum (OT). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat av fluorescerande immunfärgning mot RGC-proliferation efter tektumskada hos vuxna medaka . (A) Schematisk bild av sticksårskadan på höger halvklot i optisk tektum och koronalsektion. (B-C) Representativa resultat av proliferativa RGC (PCNA + BLBP + celler) i den kontralaterala oskadade (B) och skadade (C) sidan 2 dagar efter skada. Vit pilspets i C' indikerar en störd periventrikulär gråzon av sticksårskadan. (D) Förstorade bilder av det inramade området i (C). Vita pilspetsar i (D) indikerar PCNA + BLBP + celler. Skalstång: 50 μm i B-D. Anpassad med tillstånd från referens13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa resultat av fluorescerande immunfärgning för generering av nyfödda neuroner efter tektumskada . (A) Schematisk bild av bromodeoxyuridin (BrdU) behandling och sticksårskada i optisk tektum och koronalsektion. (B-C) Representativa resultat av nyfödda neuroner (BrdU + HuC + celler) vid 7 dagar efter skada i den skadade zebrafisken (B) och medaka (C). Skalstång: 50 μm i B-C. Anpassad med tillstånd från referens13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs en uppsättning metoder som kan användas för att inducera sticksårskador i optic tectum med hjälp av en nål för att underlätta utvärderingen av RGC-proliferation och differentiering efter hjärnskada. Nålmedierade sticksår är en enkel, effektivt implementerad metod som kan tillämpas på många experimentella prover med hjälp av en standarduppsättning verktyg. Sticksårskademodeller för flera regioner i zebrafiskhjärnan har utvecklats 3,19,29. Det optiska tektum är en av de största delarna av hjärnan och är lätt att manipulera. Dessutom är de flesta RGC i optisk tektum vilande under fysiologiska förhållanden jämfört med telencephalon, vilket gör det lättare att observera RGC-proliferation och differentiering beroende på skadan 3,19.
Ett av de kritiska stegen och begränsningarna vid stickskador är manuell nålinsättning; En konsekvent skada är nödvändig för att skapa reproducerbara resultat och underlätta jämförande analys. Den exakta placeringen och djupet av insättningen är avgörande och hjälper till att skapa reproducerbara skador i experiment. Detta dokument ger tydliga riktlinjer för att göra liknande skador varje gång. Dessutom är spridningen av RGC efter skadan avgörande för neurogenesen hos det skadade tektumet. I skadade zebrafiskar och medaka ökar RGC-proliferationen vid 1 dpi och återgår till basala nivåer, samma som på den kontralaterala oskadade halvklotet, vid 7 dpi13,19.
Sticksårskada är en av de mekaniska skademetoder som inducerar icke-specifik cellablation. Däremot har transgena metoder för cellspecifik ablation såsom nitroreduktas / metronidazolsystem också utvecklats30,31,32. Dessa ablationsmodeller bör väljas utifrån det experimentella syftet. Icke-specifik ablation är lämplig för hjärnskador som sticksår och ischemisk stroke. Däremot kan cellspecifik ablation vara mer lämplig för att utvärdera degenerationen av specifika celler associerade med neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom.
Nyligen har ischemiska skademodeller med zebrafisk utvecklats33, men dessa modeller behöver transgena linjer och fluorescerande mikroskopi för att övervaka blodflödet. Därför är dessa modeller utmanande att tillämpa på arter med dåliga genetiska metoder, och deras genomströmning är lägre än sticksårskademodellen.
Som nämnts ovan är sticksårskada i optisk tektum enkel och lätt applicerad i andra små fiskmodeller som afrikansk killifish och mummichog med vanliga verktyg26. Dessutom har jämförande analys mellan arter undersökts väl med hjälp av sekvenseringsteknik. Därför är denna enkla metod fortfarande viktig när man studerar den regenerativa kapaciteten hos NSC i zebrafisk med hjälp av jämförande analys av cellulära svar och genuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 och 21K15195 och ett internt bidrag från AIST, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , University of Oregon Press. (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
