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Summary
模拟人类疾病自然过程的心肌梗死（MI）动物模型对于了解病理生理学机制和测试新兴疗法的安全性和有效性至关重要。在这里，我们描述了通过部署经皮栓塞线圈创建的MI猪模型。
Abstract
心肌梗死 （MI） 是全球死亡的主要原因。尽管使用了循证治疗，包括冠状动脉血运重建和心血管药物，但仍有很大一部分患者在心肌梗死后出现病理性左心室重塑和进行性心力衰竭。因此，已经开发了新的治疗方案，例如细胞和基因疗法等，以修复和再生受伤的心肌。在这种情况下，心肌梗死的动物模型对于在临床转化之前探索这些实验疗法的安全性和有效性至关重要。猪等大型动物模型优于较小的动物模型，因为猪和人类心脏在冠状动脉解剖结构，心脏动力学和心肌梗死后愈合过程方面具有高度相似性。在这里，我们旨在通过永久线圈部署来描述猪中的MI模型。简言之，它包括通过逆行股骨通路的经皮选择性冠状动脉插管。冠状动脉造影后，在透视引导下将线圈部署在目标分支处。最后，通过反复冠状动脉造影证实完全闭塞。这种方法可行，重现性高，并模拟人非血运重建心肌梗死的发病机制，避免了传统的开胸手术和随后的术后炎症。根据随访时间，该技术适用于急性、亚急性或慢性心肌梗死模型。
Introduction
心肌梗死 （MI） 是全世界范围内最常见的死亡、发病率和残疾原因1.尽管目前取得了治疗进展，但仍有很大一部分患者在心肌梗死后出现不良心室重塑和进行性心力衰竭，导致心室功能不全和猝死导致预后不良2，3，4。因此，修复和/或再生受损心肌的新治疗方案正在接受审查，转化心肌梗死动物模型对于测试其安全性和有效性至关重要。虽然有几种模型已被用于心血管研究，包括大鼠5，6，小鼠7，8，狗9和绵羊10，但猪是模拟心脏缺血研究的最佳选择之一，因为它们在心脏大小，冠状动脉解剖学，心动，生理学，代谢和心肌梗死后愈合过程方面与人类高度相似11，12，13，14，15.
在这种情况下，许多不同的开放性手术和经皮方法可用于开发心肌梗死猪模型。开胸入路包括左外侧胸切开术，可用于进行冠状动脉结扎术16，17，心肌冷冻损伤，烧灼术12和冠状动脉放置水力闭塞器18 或肾收缩器19等。外科冠状动脉闭塞已被广泛用于测试新的治疗方案，如心脏组织工程和细胞治疗，因为它允许广泛的进入和视觉评估心脏;然而，与人类心肌梗死相反，它可导致手术粘连，邻近瘢痕形成和术后炎症17。心肌冷冻损伤和烧灼是易于重现的技术，但不能重现在人类中观察到的病理生理学心肌梗死进展12。另一方面，已经开发了几种经皮技术来产生暂时性或永久性冠状动脉阻塞。这些包括经冠状动脉或冠状动脉内乙醇消融20，21，通过球囊血管成形术22闭塞，或递送血栓形成物质如琼脂糖凝胶珠23，纤维蛋白原混合物9， 或线圈栓塞17，24。虽然球囊血管成形术更适合缺血/再灌注研究，但冠状动脉线圈部署是模拟非血运重建心肌梗死的最佳选择之一。这种经皮方法是可行的，始终可重复，并避免了开胸手术。它可以精确控制梗死位置，并导致类似于人类非再灌注心肌梗死的病理生理学。此外，线圈栓塞适用于急性，亚急性或慢性MI的建模;慢性充血性心力衰竭;或瓣膜病17.
本议定书旨在描述如何通过永久线圈部署来开发MI猪模型。简言之，它包括通过逆行股骨通路的经皮选择性冠状动脉插管。冠状动脉造影术后，在透视引导下将线圈部署在目标分支动脉处。最后，通过反复冠状动脉造影证实完全闭塞。
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Protocol
这项研究得到了德国Trias i Pujol健康研究所（IGTP）动物实验单位伦理委员会和政府当局（Generalitat de Catalunya;代码：10558 和 11208），并符合《实验动物护理和使用指南》25 中有关在研究和教学中使用动物的所有准则。
1.动物的术前准备
- 使用杂交的Landrace X男女大白猪（30-35公斤）。
- 在手术前将动物保持在禁食状态12小时。
2. 镇静、麻醉和镇痛
- 用肌内注射氯胺酮（3mg / kg），咪达唑仑（0.3mg / kg）和右美托咪定（0.03mg / kg）镇静动物。等待大约10-15分钟。
- 一旦猪被镇静，用氧气（90-100%）-异氟醚（1-2%）混合物和面罩通风，以确保最佳镇静。
- 将兽医软膏放在猪的眼睛上，以防止干燥。
注意：每20分钟重复一次。 - 静脉注射（IV）20 G导尿管，置于耳外侧静脉。给予丙泊酚（1-2mg / kg）以诱导麻醉。
- 一旦猪没有吞咽反射，使用气管插管（大小为6.5-7.0，30-35公斤）插管动物。
注意：根据猪的大小调整气管插管的大小。应迅速进行插管，以防止更深的麻醉平面和长时间的呼吸暂停。 - 静脉注射丁丙诺啡（0.01mg / kg）进行手术内镇痛。使用芬太尼透皮贴剂（100μg/ h）进行术后镇痛。
注意：芬太尼贴片应用于腹股沟皮肤，并且活性72小时以限制术后疼痛。其药理作用不会在分娩后立即开始，因此在开始程序之前应用它。 - 在将猪运送到血管介入放射学 （VIR） 室期间，进行气道面罩袋单元通气（20 次充气/分钟）。
- 将气管插管连接到配备气道传感器和二氧化碳图记录的麻醉机。
- 使用 FiO2 0.50 开始机械正压通气，潮气量为 10 mL/kg，呼吸频率为 16-20 次/分钟。用异氟醚（1-3%）维持麻醉。
注意：为了确认正确的手术麻醉平面，动物不应自发呼吸，也不应有角膜或瞳孔光反射。
3.手术区域的血流动力学监测和准备
- 将动物以仰卧姿势放在手术台上，并用胶带或绷带将四肢固定在手术台上。
- 将心电图（ECG）探针皮下放置在动物的四肢中，以记录实验过程中ST段，T波和心率的变化。
- 将脉搏血氧仪放在动物的舌头或嘴唇的角落上，将非侵入性压力袖带放在前肢上。
- 用探针测量直肠/食管温度。
- 在无菌条件下，用手术肥皂清洁右股骨区域，然后交替使用抗菌聚维酮 - 碘溶液和酒精3次。
- 确保外科医生进行手术洗手，并戴上无菌长袍和无菌手套。
- 用无菌手术垂线覆盖动物。
- 用肝素盐水溶液准备并冲洗针头，6F血管鞘，0.035英寸J头线，6F JR4 90厘米引导导管，0.014英寸200厘米导丝，150厘米长/ 0.017英寸内径微导管和造影剂注射歧管套件。
4. 血管通路
- 通过超声引导下穿刺经皮入路穿刺右股动脉。定位股浅动脉和股骨深动脉之间的分叉。
- 将换能器定位在股总动脉分岔近端2-3cm处，并将换能器的中心与股总动脉对齐。
- 将针头放在换能器的中心，并以大约45°的角度穿刺动脉。随后，使用改进的Seldinger技术26插入6F血管鞘。
注意：在显着痉挛或血肿的情况下，交叉到对侧股动脉。 - 用肝素盐水冲洗导管。（5000 IU普通肝素/ 1000毫升0.9%NaCL）。
- 通过鞘（300 IU / kg）施用肝素。
5. 冠状动脉造影
- 将J型尖端导线插入JR4导导管，并将导线穿过鞘进入升主动脉，然后将导管向上放在瓣膜表面上。
- 取下导线并将导管连接到注射歧管系统。清除整个系统。
- 在透视下，将导管插入左冠状动脉主动脉并注射10mL碘化造影剂以可视化左冠状动脉系统（图1A，C）。
注意：重要的是确保注射前动脉压波形不被阻尼，以避免冠状动脉夹层的风险。 - 在两个正交视图中进行血管造影：左前倾 40° 和右前斜 30° 投影。
- 在透视引导下，将预装在微导管上的 0.014 英寸导丝推进到左前前下降 （LAD） 或左屈远端 （LCX） 冠状动脉。
6. 线圈植入
- 在透视引导下，将微导管通过导线推进到应放置线圈植入物的所需位置。在LAD闭塞的情况下，将线圈远端放在第一个对角线分支，对于LCX，将线圈远端放在第一个边缘分支的远端。
注意：近端方法（在第一对角线或第一边缘分支之前）具有非常低的存活率。 - 取下导线并选择线圈。
注意：选择最佳的线圈尺寸和长度非常重要。小或短的线圈可能无法在血管腔中很好地定位，并且由于造影剂注射或自发性而具有非常高的远端迁移风险，从而导致较小的梗死尺寸。大或长的线圈可能向血管近端脱垂，并产生比预期更大的梗死。如果使用不可检测的线圈，选择正确的线圈尤其重要，因为它们无法被移除。最佳尺寸比要栓塞的容器的管腔大1-2mm，20-60mm之间的长度通常足以满足30-40-kg的猪。 - 通过微导管输送线圈，并在透视下缓慢注入5 mL碘化造影剂，以可视化线圈的正确位置。
- 取下导导管内的微导管，并将导导管放在侧支中，以进行对照注射，并确保在需要植入第二个线圈的情况下进入动脉。
- 等待线圈血栓形成并阻塞动脉。
注意：当动脉被阻塞时，可以观察到心电图的变化。检查完全动脉闭塞的另一种方法是每10分钟缓慢注射碘造影剂（图1B，D）。如果动脉在20-30分钟内没有闭塞，则可能需要另一个线圈植入物。
7. 程序结束
- 动脉闭塞后，连续静脉输注利多卡因（50-100μg/kg/min）至少1小时，以防止心律失常发作。
- 进行血管造影，以确保闭塞远端没有血流。
- 取下导丝、微导管和导引导管。
- 取下护套并进行手动压缩20分钟。
8. 术后程序和动物恢复
- 使用心电图、直肠温度、脉搏血氧仪和二氧化碳图监测动物，直到动物完全恢复。
注意：在室性心律失常的情况下，给予推注利多卡因（1.5-3.5mg / kg）。 - 给予IM注射托拉霉素（2.5mg / kg）作为预防性术后抗生素治疗。对于术后镇痛，在外科手术前给予透皮芬太尼贴剂（步骤2.6）。
- 关闭异氟醚并保持机械通气，直到动物开始自发呼吸。
- 当猪恢复吞咽反射时，取出气管插管。注意：检查动物在拔管前后是否具有良好的SpO2（超过95%）。
- 将动物运输到单独的笼子里。将动物放在热水毯上，并用热垂覆盖物，以避免术后体温过低。
注意：在猪完全恢复之前，不要将猪送回其他动物的陪伴下。 - 监测动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。
9. 术后疼痛评估和监测
- 在手术后随访期间，监测动物的一般状况，包括呼吸频率，食物和水的摄入量，与其他个体的活动和相互作用，皮肤的外观和颜色以及手术伤口的演变。
- 根据以下评分标准应用每日监督协议： - 重量：
0：正常
1：<10%的体重减轻
2：体重减轻10-20%
3：> 减重20%
- 身体状况：
0：良好：不突出的椎骨，骨盆或脊柱骨
2：常规：脊柱分割的证据，可触及的骨盆骨
3：消瘦：骨骼极度明显，很少或没有肉覆盖
- 行为：
0：正常：在您的环境中处于活动状态且具有交互性
1：活动略有下降，互动性降低
2：异常：活动明显下降，孤立
3：异常：不动或多动，可能自残
- 外貌：
0：正常：皮肤/头发有光泽，眼睛明亮
1：去除防腐，皮肤/头发没有光泽
2：皮肤/鼻腔分泌物不良
3：皮肤不好，姿势异常或驼背
- 行为障碍：
0：无
1：无法正常移动
2：无法到达食物/饮料，与其他动物隔离
3：意图隐藏/角落，对刺激没有反应（死亡）
- 临床体征：
0：无
1：体温过低、发热、轻度呼吸衰竭
2：手术伤口感染，中度呼吸衰竭伴粘液血性分泌物
3：心力衰竭，严重呼吸衰竭（发绀，张口）
得分：
- 1-5：每天监督动物一次。
- 6-12：如有必要，提供支持性治疗。
- 任何在上述任何参数中得分为3分或总分为>12的动物将被安乐死。
注意：动物护理人员应每天监测动物，研究和兽医团队每周监测两次。 - 虽然手术不会带来疼痛和痛苦，但如果任何动物表现出疼痛迹象，给予镇痛治疗（曲马多，口服，2-4mg / kg，每日）。如果任何动物对镇痛药没有反应并表现出慢性疼痛的迹象（概率非常低），则用麻醉过量（硫喷妥钠，IV，200mg / kg）对动物实施安乐死。
- 如果尽管给予抗生素治疗，手术伤口仍显示感染迹象（低概率），则每天治疗伤口并启动新的抗生素方案（硫酸头孢喹诺，IM，2mg / kg，每日）。
10. 安乐死法
- 如前所述，在先前的镇静和麻醉下，静脉注射硫喷妥钠过量（200mg / kg）。
- 通过监测生命体征（心电图、血压、二氧化碳图）来确认心肺骤停和死亡。
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Representative Results
心肌梗死存活率和位置
57头猪在冠状动脉LCX边缘分支（n = 25;12名女性和13名男性）或第一和第二对角分支（n = 32;16名女性和16名男性）之间的LAD中接受了冠状动脉线圈植入术，并随访了30天。在LCX边缘分支提交到MI的动物的存活率为80%（n = 20）。3头猪因盘管放置前房室传导阻滞和心搏停止相关致命并发症死亡，2头猪在盘管放置后经壁心肌梗死（VF）后死亡。在LAD时提交到心肌梗死的动物的存活率为72%（n = 23）：1头猪因线圈部署后AV阻滞和心搏停止而死亡，8头动物在VF后死亡（线圈部署后5头，心肌梗死后12-48小时2头，心肌梗死后26天死亡1头）。LCX边缘分支（直径2-2.5毫米）和中LAD（直径2.5-3毫米）MI之间的存活率不同，可能是由于LAD模型中较大的梗死延伸。
在心肌梗死后30天对所有动物进行磁共振成像（MRI）分析。 图2 显示了LCX边缘分支（图2A，C）和远端LAD（图2B，D）梗死模型的晚期钆增强MRI图像。如图所示，LCX 冠状动脉边缘动脉的线圈部署会影响左心室侧壁，而室间隔是远端 LAD 放置中受影响最大的区域。这些结果在心脏切片后也得到证实（图2E，F）。
图1：冠状动脉造影，前后投影。 前（A，B）和后线圈（白色箭头）部署（C，D）在LCX边缘分支和远端LAD冠状动脉中的代表性图像。 请点击此处查看此图的大图。
图2：磁共振成像和心脏组织切片。 LCX 边缘和远端 LAD 梗死的代表性 T1 3 室 （A，B） 和短轴 （C，D） 延迟增强图像。图像显示健康（黑色）和梗死（白色）心肌。LCX边缘（E）和远端LAD MI（F）之后的心脏切片照片。箭头表示梗死区域的位置和延伸。比例尺 = 1 cm 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
部署在冠状动脉中的线圈在猪中提供了可重复且一致的临床前非再灌注心肌梗死模型，可用于开发和测试新的心血管治疗策略。
在我们手中，随访时的死亡率为19%，与心肌梗死并发症有关，主要在手术的前24小时内。所有这些死亡都与非再灌注心肌梗死的自然病程有关，并且是该研究的主要结局。该方案中最关键的步骤之一依赖于微导管进入冠状动脉。在某些情况下，微导管的推进引起迷走神经反应，导致严重的低血压，房室传导阻滞，最后导致心搏停止。然而，这可以通过在推进微导管之前静脉推注肾上腺素（0.001mg / kg）来避免。另一个并发症是恶性心律失常的发生，可导致VF。这些发作通常发生在心肌梗死后 30 分钟。我们建议使用利多卡因连续输注速率（50-100μg/kg/min）至少1小时，以降低室性心律失常的风险。作为替代方案，可以连续输注胺碘酮（50-80μg/ kg / min）。然而，如果发生室性心律失常事件，我们建议推注利多卡因（1.5-3.5mg / kg）。在重度心动过缓的情况下，我们建议给予阿托品推注（0.01 mg / kg），去甲肾上腺素灌注（0.05-3μg/ kg / min）用于轻度或中度低血压，肾上腺素（0.03mg / kg）用于重度低血压，机电解离，房室传导阻滞或心搏停止。然而，当发生VF时，必须使用单相心脏除颤器进行320J心室除颤，并重复直到动物恢复心律。当需要多次心室除颤或发生心搏停止时，进行手动胸部按压（80-90次按压/分钟），将胸腔压压4英寸，并将动物连接到100%O2下的机械呼吸机。
如果介入手术延长超过一小时，则通过活化凝血时间测试监测抗凝水平以确保其大于300秒是有用的。如果它较短，应给予额外剂量的肝素。
如果冠状动脉线圈展开后未形成闭塞性血栓，我们建议放置另一个线圈。另一种选择可能是给予鱼精蛋白（1mg/ 100IU的UFH）以促进凝块形成，尽管在引导导管中存在血栓形成的风险，并且在对照注射期间随后进行栓塞。
已经描述了许多其他闭塞模型来模拟基于动脉结扎，类美粒收缩器或球囊充气停止冠状动脉血流的心肌梗死。然而，展开的线圈会引发凝血级联反应，血栓形成阻塞冠状动脉。与其他非侵入性技术（如球囊闭塞）相比，该机制尽可能接近地模拟人类心肌梗死的病理生理学。尽管与缺血再灌注模型27 相比，非再灌注心肌梗死导致更广泛的瘢痕形成、活度较低的心肌以及更大的心功能降低，但它更适合筛查抗炎治疗、反向心脏重塑以及用于治疗心血管疾病的基因或干细胞治疗28.
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Disclosures
作者无事可披露
Acknowledgments
我们感谢加泰罗尼亚比较医学和生物成像中心（CMCiB）和工作人员对动物模型执行的贡献。这项工作得到了卡洛斯三世学院（PI18/01227，PI18/00256，INT20/00052），西班牙心脏病学会和加泰罗尼亚政府[2017-SGR-483]的支持。这项工作还得到了Red de Terapia Celular - TerCel [RD16/0011/0006]和CIBER Cardiovascular [CB16/11/00403]项目的资助，作为国家I+D+I计划的一部分，并由ISCIII-Subdirección General de Evaluación y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional（FEDER）共同资助。Fadeuilhe博士得到了西班牙心脏病学会（西班牙马德里）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-F JR4 0-71"guiding catheter | Medtronic | LA6JR40 | 6F JR4 90 cm Guiding catheter |
| Adrenaline 1 mg/mL | B.Braun | National Code (NC). 602486 | Adrenaline |
| Atropine 1 mg/mL | B.Braun | NC. 635649 | Atropine |
| Betadine | Mylan | NC. 694109-1 | Povidone iodine solution |
| Bupaq 0.3 mg/mL | Richter Pharma AG | NC. 578816.6 | Buprenorphine |
| Dexdomitor 0.5 mg/mL | Orion Pharma | NC. 576303.3 | Dexmedetomidine |
| Draxxin | Zoetis | NC. 576313.2 | Tulathromycin |
| EMERALD Guidewire | Cordis | 502-585 | 0.035-inch J-tipped wire |
| External defibrillator | DigiCare | CS81XVET | Manual external defibrillator |
| Fendivia 100 µg/h | Takeda | NC. 658524.5 | Fentanyl transdermal patch |
| Guidewire Introducer Needle 18 G x 7 cm | Argon | GWI1802 | Introducer needle |
| Heparine 1% | ROVI | NC. 641647.1 | Heparin |
| Hi-Torque VersaTurn F | Abbott | 1013317J | 0.014-inch 200 cm Guidewire |
| IsoFlo | Zoetis | 50019100 | Isoflurane |
| Ketamidor | Richter Pharma AG, | NC. 580393.7 | Ketamine |
| Lidocaine 50 mg/mL | B.Braun | NC. 645572.2 | Lidocaine |
| MD8000vet | Meditech Equipment | MD8000vet | Multi-parameter monitor |
| Midazolam | Laboratorios Normon | NC. 624437.1 | Midazolam |
| Prelude.6F.11 cm (4.3").0.035" (0.89 mm).50 cm (19.7").Double Ended.Stainless Steel.6F.16 | Merit | PSI-6F-11-035 | 6F Vascular sheath |
| Propovet Multidosis 10 mg/mL | Zoetis | NC. 579742.7 | Propofol |
| RENEGADE STC-18 150/20/STRAIGHT/1RO | Boston Scientific | M001181370 | 150 cm length with 0.017-inch inner diameter Microcatheter |
| Ruschelit | Teleflex | 112482 | Endotracheal tube with balloon (#6.5) |
| SPUR II | Ambu | 325 012 000 | Airway mask bag unit-ventilation (AMBU) |
| Vasofix 20 G | B.Braun | 4269098 | 20 G Cannula |
| Visipaque 320 mg/mL USB 10 x 200 mL | General Electrics | 1177612 | Iodinated contrast medium |
| VortX-18 Diamond 3 mm/3.3 mm | Boston Scientific | M0013822030 | Coil |
| WATO EX-35 | Mindray | WATO EX-35Vet | Anesthesia machine |
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Tags
医学，第177期，心肌梗塞，猪，线圈部署，临床前模型。Erratum
Formal Correction: Erratum: Myocardial Infarction by Percutaneous Embolization Coil Deployment in a Swine Model
Posted by JoVE Editors on 05/26/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Myocardial Infarction by Percutaneous Embolization Coil Deployment in a Swine Model. The Protocol and Discussion sections were updated.
Step 3.5 was updated from:
Clean the right femoral area with surgical soap and antiseptic povidone-iodine solution under sterile conditions
to:
Clean the right femoral area with surgical soap followed by alternating antiseptic povidone-iodine solution and alcohol 3 times under sterile conditions.
Section 9 was updated from:
9. Euthanasia method
- Under previous sedation and anesthesia, as previously described, administer an IV sodium thiopental overdose (200 mg/kg).
- Confirm cardiorespiratory arrest and death by monitoring vital signs (electrocardiogram, blood pressure, capnography).
to:
9. Postoperative pain assessment and monitoring
- During the post-surgical follow-up, monitor the general condition of the animals, including the respiratory rate, food and water intake, activity and interaction with the other individuals, appearance and coloration of the skin, and the evolution of the surgical wound.
- Apply a daily supervision protocol according to the following scoring criteria:
- Weight:
0: Normal
1: <10% weight loss
2: 10-20% weight loss
3:> 20% weight loss
- Body condition:
0: Good: non-prominent vertebrae, pelvic or spinal bones
2: Regular: evidence of spinal segmentation, palpable pelvic bones
3: Emaciation: extremely marked skeleton, little or no meat to cover
- Behavior:
0: Normal: Active and interactive in your environment
1: Slight decline in activity and less interactive
2: Abnormal: pronounced decline in activity, isolated
3: Abnormal: Immobile or hyperactivity, possible self-harm
- Physical appearance:
0: Normal: skin/hair shiny and eyes bright
1: Disappears embalming, skin/hair without shine
2: Poor skin/nasal secretions
3: Poor skin, abnormal or hunched posture
- Behavioral disorders:
0: None
1: Inability to move normally
2: Unable to reach food/drink, isolated from other animals
3: Intention to hide/corner, does not respond to stimuli (dying)
- Clinical signs:
0: None
1: Hypothermia, fever, mild respiratory failure
2: Infection of the surgical wound, moderate respiratory failure with muco-bloody secretions
3: Heart failure, severe respiratory failure (cyanosis, open mouth)
Score:
- 1-5: Supervise the animals once a day.
- 6-12: Provide supportive therapy if necessary.
- Any animal with a score of 3 in any of the above parameters or with a total score >12 will be euthanized.
NOTE: The animals should be monitored daily by the animal care staff and twice a week by the research and veterinary team. - Although no pain and distress are expected from the procedure, if any animal shows signs of pain, give analgesic therapy (tramadol, oral, 2-4 mg/kg, daily). If any animal does not respond to analgesic medication and shows signs of chronic pain (very low probability), euthanize the animal with an anesthetic overdose (sodium thiopental, IV, 200 mg/kg).
- If the surgical wound shows signs of infection (low probability) despite the antibiotic therapy administered, treat the wound daily and initiate a new antibiotic regimen (cefquinome sulphate, IM, 2 mg/kg, daily).
10. Euthanasia method
- Under previous sedation and anesthesia, as previously described, administer an IV sodium thiopental overdose (200 mg/kg).
- Confirm cardiorespiratory arrest and death by monitoring vital signs (electrocardiogram, blood pressure, capnography).
