Summary
I metodi qui descritti delineano una procedura utilizzata per invertire optogeneticamente la plasticità indotta dalla cocaina in un circuito comportamentale rilevante nei ratti. La stimolazione ottica sostenuta a bassa frequenza delle sinapsi talamo-amigdala induce depressione a lungo termine (LTD). La LTD indotta optogeneticamente in vivo in ratti con esperienza di cocaina ha determinato la successiva attenuazione della ricerca di droga motivata da spunti.
Abstract
Questo protocollo dimostra i passaggi necessari per utilizzare strumenti optogenetici per invertire la plasticità indotta dalla cocaina nei circuiti talamo-amigdala per ridurre i successivi comportamenti di ricerca della cocaina nel ratto. Nella nostra ricerca, abbiamo scoperto che quando i ratti si auto-somministrano cocaina per via endovenosa accoppiata con un segnale audiovisivo, le sinapsi si formano agli input dal nucleo genicolato mediale del talamo (MGN) sui principali neuroni dell'amigdala laterale (LA) diventano più forti man mano che viene appresa l'associazione cue-cocaina. Abbiamo ipotizzato che l'inversione della plasticità indotta dalla cocaina in queste sinapsi ridurrebbe il comportamento di ricerca della cocaina motivato dal segnale. Per realizzare questo tipo di neuromodulazione in vivo, abbiamo voluto indurre la depressione sinaptica a lungo termine (LTD), che diminuisce la forza delle sinapsi MGN-LA. A tal fine, abbiamo usato l'optogenetica, che consente la neuromodulazione dei circuiti cerebrali usando la luce. L'opsina eccitatoria oChiEF è stata espressa sui terminali presinaptici MGN nel LA infondendo un AAV contenente oChiEF nel MGN. Le fibre ottiche sono state quindi impiantate nel LA e la luce laser a 473 nm è stata pulsata ad una frequenza di 1 Hz per 15 minuti per indurre LTD e invertire la plasticità indotta dalla cocaina. Questa manipolazione produce una riduzione duratura della capacità dei segnali associati alla cocaina di indurre azioni di ricerca di droga.
Introduction
L'abuso di sostanze è un problema di salute pubblica molto serio negli Stati Uniti e in tutto il mondo. Nonostante decenni di intensa ricerca, ci sono pochissime opzioni terapeutiche efficaci 1,2. Una grave battuta d'arresto per il trattamento è il fatto che l'uso cronico di droghe genera memorie associative a lungo termine tra i segnali ambientali e il farmaco stesso. La riesposizione a segnali correlati alla droga guida risposte fisiologiche e comportamentali che motivano il consumo continuato di droghe e la ricaduta3. Una nuova strategia terapeutica è quella di mettere in atto trattamenti basati sulla memoria che mirano a manipolare i circuiti coinvolti nella regolazione delle associazioni farmaco-segnale. Recentemente, è stato osservato che le sinapsi nell'amigdala laterale (LA), in particolare quelle derivanti dal nucleo genicolato mediale (MGN) del talamo, sono rafforzate da ripetute auto-somministrazioni di cocaina associate a cue, e che questo potenziamento può supportare il comportamento di ricerca della cocaina 4,5. Pertanto, è stato proposto che il reintegro indotto dal cue potrebbe essere attenuato invertendo la plasticità nelle sinapsi MGN-LA.
La capacità di indirizzare con precisione la plasticità sinaptica di uno specifico circuito cerebrale è stata una grande sfida per il campo. Gli strumenti farmacologici tradizionali hanno avuto un certo successo nel ridurre i comportamenti di ricaduta, ma sono limitati dall'incapacità di manipolare le singole sinapsi. Tuttavia, il recente sviluppo dell'optogenetica in vivo ha fornito gli strumenti necessari per superare queste limitazioni e controllare i percorsi neurali con precisione temporale e spaziale 6,7,8. Esprimendo opsine sensibili alla luce in uno specifico circuito cerebrale, la luce laser può quindi essere utilizzata per attivare o inibire il circuito. La stimolazione ottica dipendente dalla frequenza può essere utilizzata per manipolare specificamente la plasticità sinaptica del circuito in un animale che si comporta.
Questo manoscritto delinea la procedura adottata per manipolare il circuito MGN-LA rilevante dal punto di vista comportamentale utilizzando l'optogenetica in vivo . In primo luogo, l'opsina eccitatoria oChIEF è stata espressa nel MGN e le fibre ottiche sono state impiantate bilateralmente nel LA. Gli animali sono stati quindi addestrati ad auto-somministrarsi cocaina in modo dipendente dal segnale, che potenzia il percorso MGN-LA. Successivamente, la stimolazione sostenuta a bassa frequenza con luce laser a 473 nm è stata utilizzata per produrre LTD specifico del circuito. L'inversione della plasticità indotta dall'uso di cocaina ha generato una riduzione duratura della capacità dei segnali di innescare azioni associate al comportamento di ricerca di droghe.
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Protocol
Gli esperimenti descritti in questo protocollo erano coerenti con le linee guida stabilite dalla National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Pittsburgh. Tutte le procedure sono state eseguite utilizzando ratti Sprague-Dawley adulti e ingenui che pesavano 275-325 g all'arrivo.
1. Costruzione di impianti in fibra ottica e cavi patch
- Preparare impianti di fibre ottiche seguendo protocolli precedentemente pubblicati9. Gli esperimenti descritti in questo protocollo hanno utilizzato una fibra centrale da 200 μm (0,5 NA) e una ghiera ceramica multimodale LC/PC Ø1,25 mm, dimensione del foro Ø230 μm.
- Usate uno strumento Dremel per segnare il terzo inferiore di una ghiera (più vicina all'estremità piatta della ghiera). Segnare le ghiere li aiuta a rimanere attaccati al cemento dentale, aumentando la probabilità che rimangano sicuri durante l'intera portata della sperimentazione.
- Utilizzare tronchesi per tagliare ~ 35 mm di fibra. Utilizzare lo strumento di rimozione delle fibre per rimuovere ~ 25 mm di fibra, lasciando 10 mm non esposti.
- Preparare la resina epossidica termopolimerizzabile secondo le istruzioni del produttore. Sciogliere 1 g di resina in polvere in 100 mg di composto indurente. Collegare un ago smussato da 25 gauge a una siringa da 1 ml. Riempire la siringa con resina epossidica e attaccare una punta dell'ago smussata calibro 25.
- Utilizzare una morsa o un morsetto per tenere saldamente la ghiera con il lato piatto rivolto verso l'alto e il lato convesso rivolto verso il basso. Con la siringa riempita di resina epossidica, aggiungere una goccia di resina epossidica sul lato piatto della ghiera, usando cautela per rimuovere la resina epossidica in eccesso dai lati della ghiera.
- Inserire la porzione di fibra spogliata attraverso la ghiera consentendo un extra di 5 mm di fibra spogliata esposta. Nel caso di impianti LA, la fibra verrà impiantata ventrale di 7,9 mm al bregma, quindi la lunghezza esposta della fibra non spogliata dovrebbe essere ~ 13 mm.
- Polimerizzare la resina epossidica con una pistola termica per circa 30-40 s fino a quando non diventa di colore nero / ambra.
- Segna la fibra direttamente all'interfaccia dell'estremità convessa della ghiera con coltello diamantato e usa un dito per toccare delicatamente la fibra.
- Lucidare l'estremità convessa della ghiera tenendo con un emostato, assicurandosi di applicare una pressione uniforme e facendo 20 rotazioni circolari ciascuna su una serie di carta lucidante (da alta a bassa qualità; 5, 3, 1, 0,3 μm).
- Fissare la fibra non spogliata al tavolo utilizzando nastro adesivo e fibra strippata, lasciando 2 mm in più oltre la coordinata ventrale (per gli impianti LA, la lunghezza finale della fibra è ~ 10 mm). Usa un emostatico per tirare la ghiera e rompere uniformemente la fibra dove è stata segnata. Fare attenzione a non tagliare completamente la fibra durante il punteggio, altrimenti il nucleo della fibra sarà danneggiato.
- Costruisci cavi patch compatibili con gli impianti in fibra ottica. Sono stati acquistati cavi patch progettati su misura (vedi tabella dei materiali). In alternativa, i cavi patch possono essere costruitiseguendo i protocolli 9 precedentemente pubblicati.
NOTA: il diametro e il NA della fibra di ghiera e della fibra del cavo patch devono corrispondere alla giunzione di accoppiamento per evitare un'eccessiva perdita di luce, che può comportare un fallimento nello stimolare sufficientemente l'attività neurale. - Misurare l'emissione luminosa attraverso il cavo patch e gli impianti in fibra ottica collegando il cavo patch/fibra ottica a una sorgente di luce laser appropriata (473 nm, uscita 1 mW) e misurando l'uscita con un sensore di luce. Una fibra costruita con successo emetterà un cerchio concentrico di luce e non avrà più del 30% di perdita di luce.
2. Cateterismo endovenoso dei roditori, consegna del virus e impianto di fibre ottiche
- Preparare l'animale per l'intervento chirurgico.
- Anestetizzare completamente i ratti con anestetico di scelta basato su linee guida istituzionali. Un'opzione è la ketamina cloridrato (87,5-100 mg/kg, i.m.) e la xilazina cloridrato (5 mg/kg, i.m.). Assicurarsi che il ratto sia completamente anestetizzato controllando la mancanza di un riflesso del pizzico della punta.
ATTENZIONE: La ketamina è una sostanza controllata che deve essere maneggiata secondo le linee guida istituzionali.
NOTA: L'iniezione intramuscolare di anestetici viene utilizzata in questo studio in quanto ha prodotto un'induzione dell'anestesia più rapida e affidabile rispetto all'iniezione intraperitoneale. Monitorare continuamente la respirazione e la reattività del ratto e fornire supporto termico durante l'intervento chirurgico. - Rasare una vasta area della schiena del ratto (parte superiore della schiena da appena sopra le scapole al centro della schiena) e l'area del collo sotto l'arto anteriore destro e il cuoio capelluto.
- Posizionare il ratto nell'area chirurgica e applicare puralube (lacrime artificiali) agli occhi. Iniettare un volume corporeo di carprofen (analgesico) per via sottocutanea (s.c.) attraverso la pelle della parte superiore della schiena, quindi iniettare 5 mL di soluzione di Ringer lattato s.c. attraverso la pelle della parte bassa della schiena.
- Disinfettare tutti i siti chirurgici bagnando un pezzo di garza sterile con betadine e asciugandolo lungo l'area chirurgica rasata con un movimento circolare. Quindi ripetere il processo con etanolo al 70%. Ripeti questo ciclo alternato tre volte.
- Anestetizzare completamente i ratti con anestetico di scelta basato su linee guida istituzionali. Un'opzione è la ketamina cloridrato (87,5-100 mg/kg, i.m.) e la xilazina cloridrato (5 mg/kg, i.m.). Assicurarsi che il ratto sia completamente anestetizzato controllando la mancanza di un riflesso del pizzico della punta.
- Eseguire l'impianto di catetere endovenoso secondo i protocolli precedentemente pubblicati 4,10.
NOTA: Durante questo intervento chirurgico non viene utilizzato un drappo chirurgico per evitare irritazioni durante l'impianto del catetere. Sterilizzare tutti gli strumenti e le attrezzature prima dell'uso. Utilizzare guanti sterili e cambiare i guanti se viene contattata una superficie non sterile. - Immediatamente dopo l'impianto del catetere, fissare il ratto in un telaio stereotassico per eseguire iniezioni AAV.
- Somministrare un'iniezione sottocutanea (s.c) di lidocaina al 2% (0,2-0,3 ml) sul cuoio capelluto come anestetico locale.
NOTA: L'anestetico locale non viene utilizzato durante l'impianto del catetere endovenoso per evitare alterazioni degli esiti chirurgici. - Collegare una cannula di iniezione in acciaio inossidabile calibro 26 a una siringa Hamilton riempita con 1 μL di soluzione concentrata di AAV: AAV5-hSyn-tdPomodoro o AAV5-hSyn-oChIEF-tdPomodoro
NOTA: oChIEF è una variante della canale opsina sensibile alla luce blurhodopsin (ChR2), che può rispondere ad una vasta gamma di frequenze 8,11, e quindi ha utilità per gli esperimenti LTD a bassa frequenza discussi in questo protocollo, ma anche per esperimenti LTP ad alta frequenza (non discussi qui). Il costrutto oChIEF è stato donato dal Dr. Roger Tsien e lavorato per il confezionamento e la purificazione dal Duke Viral Vector Core. Sono necessarie almeno 3-4 settimane tra il giorno dell'iniezione e il giorno dell'induzione della LTD per consentire un'espressione ottimale del virus nei terminali assoni MGN.
ATTENZIONE: Generalmente, AAV è considerato un organismo di livello 1 di biosicurezza (BSL-1), con basso rischio di autoinfezione a meno che non venga utilizzato un virus helper nella sua produzione. Il suo utilizzo richiede l'approvazione IACUC e DPI adeguati devono essere utilizzati in ogni momento in conformità con le linee guida istituzionali per limitare l'esposizione non necessaria. - Usando un bisturi, fai un'incisione di 0,5 mm dalla parte anteriore a quella posteriore del cranio e rimuovi il tessuto sovrastante per esporre la superficie del cranio.
- Livellare la testa del ratto nell'asse anteriore/posteriore e zero coordinate stereotassiche al bregma.
- Praticare tre piccoli fori attraverso il cranio usando uno strumento Dremel dotato di una piccola punta da trapano. Utilizzare un cacciavite per montare saldamente le viti in acciaio inossidabile (M2x4 965-A2) in posizione.
NOTA: Le viti sono necessarie per il corretto legame del cemento dentale e la creazione di tappi robusti e duraturi. La posizione delle viti deve essere distribuita lungo l'asse antero-posteriore del cranio e lontano dal sito di iniezione AAV. - Praticare fori bilaterali per l'iniezione di AAV in base alle coordinate del Rat Brain Atlas (Watson e Paxinos)12 per la porzione mediale del nucleo genicolato mediale (MGN); in mm da bregma, AP: -5.4; ML: ±3.0; DV: -6.6. Abbassare lentamente le cannule di iniezione (4 mm/min) fino a posizionarle nel MGN. Iniettare una soluzione concentrata di AAV ad una velocità di 0,1 μL/min.
- Lasciare la cannula iniettabile in posizione per 5 minuti dopo che le infusioni sono state completate per consentire la diffusione lontano dalla cannula e quindi ritirare lentamente la cannula dal cervello.
- Somministrare un'iniezione sottocutanea (s.c) di lidocaina al 2% (0,2-0,3 ml) sul cuoio capelluto come anestetico locale.
- Subito dopo le iniezioni di virus, continuare a impiantare fibre ottiche 4,9 mirate ai terminali MGN-LA.
- Utilizzare uno strumento Dremel per praticare fori bilaterali per impianti in fibra ottica mirati all'amigdala laterale (in mm da bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
- Utilizzare una pinza per afferrare la ghiera dell'impianto in fibra ottica e fissarla agli adattatori stereotassici in modo che siano tenuti saldamente in posizione.
- Abbassare lentamente le fibre ad una velocità di 2 mm / min, fino a quando la punta della fibra si trova nella porzione dorsale del LA (DV: -7,9 mm).
- Fissare le ghiere al cranio utilizzando prima un sottile strato di adesivo istantaneo Loctite, seguito da cemento dentale e ghiere di copertura con manicotti di ghiera di 1,25 mm di diametro e coperture antipolvere.
NOTA: La scelta dell'adesivo per fissare le ghiere al cranio deve essere approvata dal comitato locale o istituzionale per la cura e l'uso degli animali. La loctite viene utilizzata per questo studio per fissare in modo affidabile le ghiere al cranio dopo tentativi ed errori con adesivi multipli; tuttavia, le alternative disponibili possono essere considerate.
- A seguito di procedure chirurgiche, i ratti domestici individualmente e forniscono libero accesso a cibo e acqua. Fornire cure postoperatorie coerenti con le linee guida istituzionali. Cateteri di lavaggio ogni giorno con soluzione salina contenente gentamicina (5 mg / ml) ed eparina (30 USP / ml) per mantenere la pervietà. Almeno 5 giorni dopo l'intervento chirurgico e 24 ore prima dell'inizio degli esperimenti comportamentali, il cibo limita i ratti a ~ 90% del loro peso di alimentazione libera.
3. Autosomministrazione di cocaina nei roditori ed estinzione della leva strumentale
NOTA: Tutte le procedure comportamentali sono condotte in camere di condizionamento operanti standard, dotate di due leve retrattili su una parete, una luce di stimolo sopra ogni leva, un generatore di toni, una luce domestica e una pompa di infusione.
- Sottoporre ratti a sessioni giornaliere di auto-somministrazione di cocaina (2 mg / ml) di 1 ora secondo un programma di rinforzo FR1.
- Metti i ratti in camera operante ogni giorno e consenti ai ratti di premere a leva. Una pressione sulla "leva attiva" designata (controbilanciata tra le leve sinistra e destra) provoca un'infusione di cocaina (1,0 mg/kg/infusione) e una presentazione di 10 s di un segnale luminoso e tonale composto. Una pressione sulla "leva inattiva" designata non ha effetti programmati.
- Continuare gli esperimenti di auto-somministrazione per almeno 10 giorni e fino a quando i ratti ottengono con successo almeno 8 infusioni / giorno in 3 giorni consecutivi. Il mancato raggiungimento dei criteri di acquisizione entro il giorno 20 comporta l'esclusione dallo studio.
- Dopo che i criteri di acquisizione sono stati soddisfatti con successo, sottoporre i ratti a sessioni di estinzione strumentale di 1 ora per 6-10 d.
- Posizionare i ratti in camere operanti e consentire ai ratti di premere liberamente. Tuttavia, le risposte su entrambe le leve attive e inattive non hanno conseguenze programmate.
- Fai in modo che i ratti continuino l'estinzione strumentale ogni giorno fino a quando non si verifica una media di < 25 pressioni a leva per due giorni consecutivi.
4. Induzione optogenetica in vivo di LTD
NOTA: Gli esperimenti di inibizione optogenetica si svolgono 24 ore dopo l'ultimo giorno di estinzione strumentale.
- Collegare i cavi patch a un diodo laser blu da 473 nm tramite un giunto rotante sospeso sopra una gabbia di alloggiamento per roditori standard e pulita con il coperchio rimosso. Questa configurazione consente ai roditori di muoversi liberamente intorno alla gabbia durante la stimolazione optogenetica.
- Accendere il diodo laser secondo le istruzioni operative e collegarlo a un generatore di impulsi. Regola le impostazioni, in modo che quando acceso il ratto riceverà 900 impulsi di luce da 2 ms a 1 Hz.
ATTENZIONE: È necessario utilizzare sempre un'adeguata protezione per gli occhi durante l'utilizzo del laser. - Misurare l'intensità della luce attraverso il cavo patch utilizzando un sensore di luce. Regolare l'intensità del laser in modo che l'emissione luminosa attraverso il cavo patch sia ~5-7 mW.
- Metti i ratti in una gabbia pulita. Rimuovere i coperchi antipolvere e i manicotti di ghiera, esponendo le ghiere. Collegare bilateralmente i cavi patch agli impianti in fibra ottica. Consentire ai ratti di esplorare l'ambiente per 3 minuti prima dell'induzione di LTD.
- Accendere il generatore di impulsi per avviare la stimolazione optogenetica.
NOTA: Sebbene improbabile, se il ratto sperimenta reazioni avverse alla stimolazione, l'esperimento viene immediatamente interrotto e i ratti vengono adeguatamente eutanizzati in base alle linee guida istituzionali. - Dopo l'induzione LTD, tenere i ratti nella gabbia per 3 minuti, quindi rimetterli nelle loro gabbie domestiche.
- Per gli esperimenti di controllo, utilizzare la stessa procedura di stimolazione sui ratti che esprimono il virus di controllo AAV5-tdTomato. Per esperimenti fittizi, attaccare un cavo patch alla fibra ottica dei ratti che esprimono il virus AAV5-oChIEF, ma nessuna stimolazione viene erogata durante una sessione di 15 minuti.
5. Testare l'effetto della stimolazione optogenetica sulla ricerca di cocaina indotta da cue
- 24 ore dopo le stimolazioni optogenetiche in vivo, rimettere i ratti in camere di condizionamento operanti. I ratti sono sottoposti a una sessione di reintegrazione indotta da segnali standard di 1 ora per valutare il comportamento di ricerca della cocaina.
NOTA: Durante il reintegro indotto dal cue, una risposta sulla leva attiva produce una presentazione di 10 secondi del segnale associato alla cocaina, ma nessuna infusione di cocaina. - Dare un secondo test di reintegrazione almeno 1 settimana dopo il primo test per determinare se l'induzione optogenetica LTD provoca una soppressione a lungo termine della ricerca di cocaina
6. Colorazione, fluorescenza e imaging per la verifica istologica dell'espressione virale e del posizionamento delle fibre ottiche
- Produrre 1x tampone fosfato salino (PBS) e 4% paraformaldeide (PFA). Conservare entrambe le soluzioni su ghiaccio. Il volume totale dipenderà dal numero di ratti nello studio (~ 100 ml di PBS e 200 ml di PFA saranno utilizzati per ratto).
ATTENZIONE: Il PFA è una sostanza chimica tossica e cancerogena nota. Faccia attenzione per evitare l'inalazione e il contatto con la pelle. Il suo uso e smaltimento dovrebbero essere conformi alle linee guida istituzionali, compreso l'uso di DPI adeguati e di una cappa a flusso chimico. - Impostare la pompa peristaltica ad una portata di 20 ml/min. Riempire il tubo della pompa con 1x PBS. Attaccare un ago smussato calibro 20 all'estremità del tubo.
- Anestetizzare profondamente i ratti con pentobarbital di sodio (100 mg/kg, i.p.). Confermare la profondità dell'anestesia per mancanza di risposta al pizzicamento del dito del piede prima di procedere ulteriormente.
NOTA: Il pentobarbital di sodio viene utilizzato poiché la perfusione è una procedura terminale. - Utilizzare le forbici chirurgiche per tagliare la cavità addominale del ratto sotto il diaframma. Tagliare la gabbia toracica rostralmente lungo i bordi laterali per esporre il cuore del topo. Utilizzare emostatico per bloccare la porzione rostrale della gabbia toracica lontano dal cuore. Tagliare via qualsiasi tessuto adiposo sovrastante che circonda il cuore.
- Inserire l'ago smussato attraverso il ventricolo sinistro e fino all'aorta. Tagliare un piccolo foro nell'atrio destro per drenare la soluzione mentre ritorna al cuore.
- Perfondere ogni ratto con 1x PBS per 5 minuti seguito da 4% PFA, pH 7,4 per 10 min.
- Decapitare il ratto, estrarre il cervello e postfissarlo in PFA al 4% per 24 ore. Quindi trasferire il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% per 2-3 d.
- Sezione cervelli a 50 μm usando un criostato.
- Montare tutte le fette contenenti LA o MGN su vetrini e coprivetrino.
- Fette di immagine utilizzando un microscopio epifluorescente per verificare l'espressione di AAV-oChIEF-tdTomato nel MGN e le sue proiezioni al LA, nonché il posizionamento della fibra ottica sopra il LA.
7. Preparazione di perfusione e fette acute di cervello per esperimenti di elettrofisiologia
NOTA: Gli esperimenti elettrofisiologici vengono eseguiti su un sottogruppo di animali per convalidare il successo della LTD in vivo .
- Preparare soluzioni elettrofisiologiche utilizzando i reagenti elencati nelle tabelle 1-3 4,13. Regolare il pH di tutte le soluzioni a 7,4 con HCl e regolare l'osmolarità a 300-310 mOsm/kg H2O. Preparare le soluzioni fresche prima degli esperimenti e conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana. Saturare tutte le soluzioni con carbogeno (95% O 2/5% CO2) in ogni momento durante l'uso.
- Usando l'isoflurano secondo le linee guida locali o istituzionali per la cura e l'uso degli animali, anestetizzare profondamente il ratto in una camera di eutanasia chiusa. Confermare che l'animale sia completamente anestetizzato tramite il riflesso del pizzico della punta.
- Riempire un piccolo becher con 50 ml di soluzione di taglio ghiacciata. Riempire il tubo della pompa peristaltica con soluzione e regolare la portata a 20 mL/min. Attaccare un ago smussato calibro 20 all'estremità del tubo.
- Aprire la cavità addominale (vedere i punti 6.4 e 6.5) e perfondere brevemente il ratto con la soluzione di taglio (massimo 1-2 minuti).
- Dopo la perfusione, decapitare immediatamente il ratto. Rimuovere il cervello e metterlo in un piccolo becher riempito con una soluzione di taglio a 4 °C per 30 s-1 min.
- Trasferisci i cervelli con una spatola e fissali rapidamente alla camera di un vibratomo. Rimuovere la pia usando una pinza fine. Riempire la camera con una soluzione di taglio a 4 °C e preparare fette coronali acute (250 μm di spessore) dell'amigdala ad una velocità di 0,37 mm/sec e una frequenza di 70 Hz.
- Una volta ottenute le fette, porre ciascuna in una camera di mantenimento riempita con soluzione di taglio e incubare a 37 °C per 10-12 minuti. Si possono ottenere circa 5-7 fette contenenti il LA per animale.
- Trasferire le fette in un becher di soluzione di mantenimento a temperatura ambiente (RT) e lasciare recuperare per >30 minuti prima della sperimentazione.
NOTA: Le fette rimangono generalmente sane mentre vengono conservate in soluzione per 4-6 ore. A causa della natura fluorescente dell'AAV, le fette vengono mantenute in condizioni di scarsa illuminazione.
8. Registrazioni elettrofisiologiche ex vivo
- Preparare soluzioni intracellulari utilizzando i reagenti elencati nelle tabelle 4-5.
NOTA: Le soluzioni intracellulari devono essere preparate prima degli esperimenti e possono essere conservate a lungo termine (3-12 mesi) a -80 °C o a breve termine (1-2 mesi) a -20 °C. Le soluzioni sono regolate a pH a 7,3 (con CsOH per la soluzione intracellulare a base di Cs e con KOH per la soluzione intracellulare a base di K). Regolare ad un'osmolarità finale di 290-300 mOsm/kg H2O. - Preparare 500 mM di soluzione madre di picrotossina disciolta in dimetilsolfossido (DMSO).
NOTA: le scorte di picrotossina sono aliquotate e conservate a -20 °C. Il giorno dell'uso, le aliquote vengono scongelate e aggiunte alla soluzione di registrazione fino a una concentrazione finale di 100 μM.
ATTENZIONE: La picrotossina è un antagonista non competitivo dei recettori GABAA , quindi l'infusione di picrotossina ha un effetto stimolante. È gravemente tossico per ingestione orale o assorbimento cutaneo. DPI adeguati devono essere utilizzati in ogni momento quando si lavora con picrotossina. - Trasferire le fette su un microscopio verticale progettato per esperimenti di elettrofisiologia.
- Durante gli esperimenti, bagnare continuamente le fette di perfuse con soluzione di registrazione riscaldata a 31-33 °C.
- Ingrandisci il LA usando un obiettivo 4x. Identificare i principali neuroni per morfologia con una lente ad immersione in acqua 40x.
- Utilizzare una pipetta di vetro (3-5 MΩ) riempita con una soluzione intracellulare basata su Cs (per esperimenti di morsetto di tensione) o una soluzione intracellulare a base di K (per esperimenti di pinza in corso) per ottenere registrazioni di patch clamp a cellule intere.
- Identificare le proiezioni assonale MGN infette da AAV in fluorescenza (utilizzando un filtro RFP). Stimolare le proiezioni utilizzando un laser DPSS a luce blu (473 nm) collegato a un generatore di impulsi.
ATTENZIONE: Per limitare l'esposizione laser, la luce laser collimata è accoppiata a una porta fluorescente sul microscopio e focalizzata sulla fetta attraverso l'obiettivo.
NOTA: In modalità morsetto di tensione, le correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) sono evocate otticamente a 0,1 Hz. I neuroni che ricevono input da neuroni MGN infetti da AAV mostreranno EPSC affidabili. - Per indurre ex vivo LTD, in modalità corrente di morsetto, registrare una linea basale stabile di potenziali postsinaptici eccitatori (EPSP) per almeno 10 minuti. Successivamente, fornire 900 impulsi da 2 ms di luce a 473 nm a una frequenza di 1 Hz (tempo totale = 15 min). Quindi registrare continuamente EPSP a 0,1 Hz per ≥60 minuti.
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Representative Results
Una sequenza temporale che delinea l'ordine degli esperimenti è mostrata nella Figura 1. Durante gli esperimenti comportamentali, il numero di infusioni di cocaina e il numero di risposte effettuate sulla leva attiva servono come misura dell'intensità del comportamento di ricerca della cocaina. Durante i primi giorni di auto-somministrazione di cocaina, il numero di risposte attive dovrebbe aumentare gradualmente durante ogni giorno di acquisizione, prima di stabilizzarsi durante la seconda settimana. Al contrario, le risposte della leva inattiva dovrebbero rimanere basse per tutta la durata dell'esperimento (Figura 2A). Il primo giorno dell'estinzione strumentale, c'è tipicamente un aumento del numero di risposte attive della leva, poiché l'assenza inaspettata di cocaina si traduce nell'escalation del comportamento di ricerca della cocaina. Tuttavia, questa risposta diminuirà gradualmente con le sessioni successive man mano che i ratti apprendono la nuova contingenza, risultando in un numero basso e stabile di risposte attive della leva entro 6-10 d (Figura 2B). I ratti che non riescono a raggiungere i criteri di acquisizione specificati nelle fasi di auto-somministrazione o di estinzione strumentale dell'esperimento vengono rimossi dallo studio e i dati non vengono inclusi nell'analisi finale.
A seguito dell'estinzione strumentale, la riesposizione a segnali associati alla cocaina ripristina il comportamento di ricerca della cocaina, con conseguente aumento del numero di risposte attive della leva. Questo aumento è stato osservato in entrambi i gruppi di esperimenti di controllo: ratti a cui è stato iniettato virus privo di oChIEF (controllo AAV) e ratti che non hanno ricevuto stimolazione laser (controllo SHAM; Figura 3A) Tuttavia, in vivo optogenetic LTD dei terminali MGN-LA hanno causato una riduzione della successiva ricerca di cocaina indotta da cue. 24 ore dopo l'induzione optogenetica LTD, il numero di presse a leva attive è stato significativamente ridotto rispetto sia ai controlli AAV che ai controlli SHAM (Figura 3A). Questo basso livello di risposta è stato mantenuto durante un successivo test di reintegrazione 7 giorni dopo (condotto in un sottogruppo di ratti) (Figura 3B), indicando una riduzione persistente della ricerca di cocaina motivata da segnali attraverso più test di reintegrazione.
Registrazioni elettrofisiologiche ex vivo di animali esposti a stimolazione ottica hanno confermato che l'attenuazione nel reintegro era effettivamente dovuta almeno in parte a una modulazione della plasticità sinaptica MGN-LA. Ciò è stato evidenziato da una diminuzione dell'ampiezza EPSC evocata otticamente nei neuroni LA in seguito all'esposizione a LTD ottico (Figura 4A). Questa attenuazione dell'ampiezza EPSC era specifica per i neuroni che ricevevano stimolazione ottica, poiché l'ampiezza EPSC rimaneva invariata nei controlli SHAM. Inoltre, LTD non è stato in grado di essere generato in fette di ratti che avevano già ricevuto stimolazione ottica in vivo, ma è stato evocato in modo affidabile nei neuroni di ratti sottoposti a stimolazione SHAM, come evidenziato da una riduzione sostenuta della pendenza di aumento dell'EPSP (Figura 4B). Pertanto, la stimolazione ottica in vivo sembra occludere un'ulteriore induzione di LTD nella fetta. Durante la registrazione, è importante misurare la resistenza in serie per tutta la durata della registrazione per garantire la salute mantenuta della patch. Le celle con una variazione della resistenza in serie superiore al 20% non sono accettate per l'analisi dei dati. Ciò è particolarmente importante per gli esperimenti LTD che durano >60 minuti, poiché i cambiamenti nella resistenza in serie possono influenzare la dinamica del recettore e del canale. Per garantire che le afferenze stimolate durante le registrazioni elettrofisiologiche abbiano origine nel MGN, è importante raccogliere fette attraverso l'estensione del talamo. Ciò serve come convalida che i corpi cellulari del MGN esprimono effettivamente fluorescentmente AAV. Oltre alla conferma visiva, è necessaria anche la convalida funzionale. In condizioni di morsetto di corrente, i neuroni MGN infetti da AAV-oChIEF attivano potenziali d'azione in risposta alle alte e basse frequenze della stimolazione luminosa a 473 nm (Figura 4C).
Tutti i risultati comportamentali sono stati considerati provvisori fino a quando l'espressione virale e gli impianti di fibre ottiche sono stati verificati istologicamente e il corretto posizionamento è stato confermato (Figura 5). La mancanza di espressione di AAV sia nel MGN che nel LA e/o in quelli in cui le fibre ottiche non erano correttamente posizionate all'interno della LA dorsale sono stati esclusi dall'analisi sperimentale, ma in alcuni casi possono essere inclusi come controllo anatomico negativo.
Figura 1: Cronologia della procedura sperimentale. Una descrizione delle fasi critiche del protocollo, compreso il decorso sequenziale e la durata di ogni fase sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Acquisizione ed estinzione dell'autosomministrazione di cocaina. (A) Gli animali mostrano un numero crescente di infusioni di cocaina e risposte attive della leva attraverso l'acquisizione e un basso livello di risposte di leva inattive. (B) Dopo un iniziale aumento della pressione della leva il giorno 1 dell'estinzione, gli animali diminuiscono rispondendo sia sulle leve attive che su quelle inattive a un livello basso e stabile. Barre di errore, media ±SEM. Questa cifra è stata modificata da Rich et al. 20194. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: La LTD optogenetica in vivo attenua il reintegro indotto dal cue. (A) Optical LTD provoca una significativa riduzione delle pressioni attive a leva durante il reintegro rispetto agli animali che hanno ricevuto il virus di controllo o la stimolazione di controllo SHAM. ANOVA bidirezionale, effetto principale del gruppo (F(2,27) = 7,04, P = 0,004) e interazione giorno x gruppo (F(2,27) = 8,08, P = 0,002); Analisi post hoc di Bonferroni: ***p <.001. (B) 7 giorni dopo, i ratti sono stati sottoposti a un secondo test di reintegrazione, rivelando una significativa riduzione della pressione attiva della leva negli animali precedentemente sottoposti a controlli MGN-LA LTD rispetto ai controlli SHAM. ANOVA a due vie, effetto principale del gruppo (F(1,32) = 5,04, P = 0,032), interazione significativa (F(1,32) = 7,69, P = 0,009); Analisi post hoc di Bonferroni, **p < .01. Barre di errore, media ±SEM, n in barre, numero di ratti. Questa cifra è stata modificata da Rich et al. 20194. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Validazione funzionale della stimolazione optogenetica a bassa frequenza in vivo (A) In vivo dual hemisphere LTD delle sinapsi MGN-LA attenua l'ampiezza EPSC rispetto ai controlli SHAM (Unpaired t-test, t(10) = 2.73, *P = .021). Riquadro: tracce EPSC medie del campione evocate a Erev-70 mV. Barre della scala: 50 ms, 200 pA, n in barre, numero di ratti (neuroni). (B) L'induzione ottica LTD in vivo occlude ex vivo LTD. 24 ore dopo l'induzione in vivo LTD, sono state preparate fette di amigdala ed è stato applicato lo stesso protocollo di stimolazione. La pendenza di aumento dell'EPSP ai terminali MGN-LA è stata ridotta dalla stimolazione ottica ex vivo nei neuroni di animali che avevano ricevuto stimolazione SHAM in vivo, ma non nei neuroni di animali che avevano ricevuto LTD ottico in vivo. n in corsivo, numero di neuroni. (C) Campionare le registrazioni dei morsetti di corrente da neuroni MGN infetti da AAV-oChIEF. I potenziali d'azione sono stati indotti dalla stimolazione della luce blu (5-100 Hz). Barre scala: 100 ms, 40 mV. Barre di errore, media ±SEM. Questa cifra è stata modificata da Rich et al. 20194. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Verifica istologica dell'espressione virale e dei posizionamenti delle fibre ottiche. (A ) Immagini microscopiche rappresentative che mostrano l'espressione di DAPI e AAV-oChIEF-tdTomato in LA (a sinistra) e MGN (a destra). Barra della scala: 2 mm. ( B ) Schema che mostra l'iniezione di AAV-oChIEF-tdTomato e in tutta l'estensione antero-posteriore del LA (a sinistra) e MGN (a destra) e i posizionamenti delle fibre ottiche nel LA. L'ombreggiatura rosso scuro mostra la rappresentazione della più piccola diffusione del virus accettabile, mentre l'ombreggiatura rosa chiaro mostra la rappresentazione della più grande diffusione accettabile. I cerchi blu corrispondono al corretto posizionamento delle fibre ottiche in entrambi gli emisferi. I cerchi neri corrispondono al corretto posizionamento delle fibre ottiche in un solo emisfero. La "X" nera corrisponde al posizionamento non riuscito della fibra. Per essere inclusi nell'analisi finale, i ratti richiedevano l'espressione virale del doppio emisfero nel Los Angeles e il posizionamento di successo delle fibre. Le coordinate sono in mm, posteriormente al bregma. Questa cifra è stata modificata da Rich et al. 20194. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Chimico | millimetro | MW | g/1000 mL |
| N-metil-D-glucamina | 92 | 195.215 | 17.96 |
| Cloruro di potassio | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Sodio fosfato monobasico | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bicarbonato di sodio | 30 | 84.01 | 2.52 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glucosio | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Ascorbato di sodio | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Tiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Piruvato di sodio | 3 | 110 | 0.33 |
| Solfato di magnesio | 10 | Utilizzare 5,0 ml di 2,0 m di brodo | |
| Cloruro di calcio | 0.5 | Utilizzare 250 μL di 2,0 M di stock | |
| 1. Per 1 L di soluzione, aggiungere i sali nell'ordine indicato a 850 mL ddH2O | |||
| 2. pH con HCl concentrato a 7,3-7,4 (NMDG fa una soluzione basica) | |||
| 3. Ossigenare per 5-10 minuti, quindi aggiungere MgSO4 e CaCl2 | |||
| 4. Portare la voluta finale a 1 L con ddH2O e ricontrollare il pH finale | |||
| 5. Controllare l'osmolarità con l'osmometro e regolare a 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabella 1: Elenco degli ingredienti per la soluzione di taglio extracellulare. Ingredienti e istruzioni utilizzati per la preparazione della soluzione di taglio extracellulare a base di NMDG.
| Chimico | millimetro | MW | g/1000 mL |
| N-metil-D-glucamina | 86 | 195.215 | 5.03 |
| Cloruro di potassio | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Sodio fosfato monobasico | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bicarbonato di sodio | 35 | 84.01 | 2.94 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glucosio | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Ascorbato di sodio | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Tiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Piruvato di sodio | 3 | 110 | 0.33 |
| Solfato di magnesio | 1 | Utilizzare 500 μL di 2,0 M di stock | |
| Cloruro di calcio | 2 | Utilizzare 1000 μL di 2,0 M di stock | |
| 1. Per 1 L di soluzione, aggiungere i sali nell'ordine indicato a 850 mL ddH2O | |||
| 2. pH con 1 N HCl o KOH a 7,3-7,4 | |||
| 3. Ossigenare per 5-10 minuti, quindi aggiungere MgSO4 e CaCl2 | |||
| 4. Portare la voluta finale a 1 L con ddH2O e ricontrollare il pH finale | |||
| 5. Controllare l'osmolarità con l'osmometro e regolare a 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabella 2: Elenco degli ingredienti per la soluzione di ritenuta extracellulare. Ingredienti e istruzioni utilizzati per la preparazione della soluzione di ritenuta extracellulare.
| Chimico | millimetro | MW | g/1000 mL |
| N-metil-D-glucamina | 119 | 195.215 | 6.95 |
| Cloruro di potassio | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Sodio fosfato monobasico | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bicarbonato di sodio | 26 | 84.01 | 2.18 |
| HEPES | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-glucosio | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| Solfato di magnesio | 1 | Utilizzare 500 μL di 2,0 M di stock | |
| Cloruro di calcio | 2 | Utilizzare 1000 μL di 2,0 M di stock | |
| 1. Per 1 L di soluzione, aggiungere i sali nell'ordine indicato a 850 mL ddH2O | |||
| 2. pH con 1 N HCl o KOH a 7,3-7,4 | |||
| 3. Ossigenare per 5-10 minuti, quindi aggiungere MgSO4 e CaCl2 | |||
| 4. Portare la voluta finale a 1 L con ddH2O e ricontrollare il pH finale | |||
| 5. Controllare l'osmolarità con l'osmometro e regolare a 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabella 3: Elenco degli ingredienti per la soluzione di registrazione extracellulare. Ingredienti e istruzioni utilizzati per la preparazione della soluzione di registrazione extracellulare.
| Chimico | millimetro | MW | mg/50 mL |
| Metansolfonato di cesio | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| Cloruro di cesio | 15 | 168.36 | 126.3 |
| Cesio-EGTA | 0.4 | Aggiungere 80 μL di 250 mM Cs-EGTA | |
| TEA-Cloruro | 5 | 165.705 | 41.4 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-BR | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-glutatione | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Fosfocreatina di sodio | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. Iniziare con 40-45 mL di grado HPLC H2O | |||
| 2. Mantenere fosfocreatina, ATP e GTP sul ghiaccio in ogni momento. | |||
| 3. Aggiungi gli ingredienti nell'ordine indicato nella tabella | |||
| 4. pH a 7,3 con CsOH (circa 200 μL di 2 M CsOH) | |||
| 5. Utilizzare l'osmometro per controllare l'osmolarità. | |||
| 6. Aggiungere H2O di grado HPLC a un'osmolarità finale di circa 285-290 mOsm/kg H2O | |||
| 7. Preparare aliquote da 500-1000 μL e conservare a -80 °C o -20 °C | |||
Tabella 4: Elenco degli ingredienti per la soluzione elettrofisiologica intracellulare di cesio metansolfonato. Ingredienti e istruzioni utilizzati per la preparazione della soluzione intracellulare di cesio metansolfonato.
| Chimico | millimetro | MW | mg/50 mL |
| Gluconato di potassio | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| Cloruro di potassio | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| Cloruro di sodio | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-BAPTA | 0.1 | Aggiungere 80 μL di K-BAPTA | |
| HEPES | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-glutatione | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Fosfocreatina di sodio | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| Tris-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. Iniziare con 40-45 mL di grado HPLC H2O | |||
| 2. Mantenere fosfocreatina, ATP e GTP sul ghiaccio in ogni momento. | |||
| 3. Aggiungi gli ingredienti nell'ordine indicato nella tabella | |||
| 4. pH a 7,3 con KOH (circa 200 μL di 2 M KOH) | |||
| 5. Utilizzare l'osmometro per controllare l'osmolarità. | |||
| 6. Aggiungere H2O di grado HPLC a un'osmolarità finale di circa 285-290 mOsm/kg H2O | |||
| 7. Preparare aliquote da 500-1000 μL e conservare a -80 °C o -20 °C | |||
Tabella 5: Elenco degli ingredienti per la soluzione elettrofisiologica intracellulare di gluconato di potassio. Ingredienti e istruzioni utilizzati per la preparazione della soluzione intracellulare di gluconato di potassio.
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Discussion
Come descritto sopra, ci sono diversi passaggi critici che sono importanti per ottenere i risultati sperimentali corretti. Il protocollo sarà probabilmente efficace solo negli animali che acquisiscono correttamente l'autosomministrazione di cocaina e, ad oggi, è stato testato solo utilizzando i parametri sopra descritti. È possibile che la dose di cocaina, il programma di rinforzo e i parametri di cue possano essere modificati con probabilmente scarso effetto sui risultati comportamentali, con l'eccezione che un programma di rinforzo di secondo ordine può portare alla ricerca di cocaina indipendente dall'amigdala che potrebbe ridurre l'efficacia della procedura, sebbene questo non sia stato testato direttamente14 . Ci sono diversi punti in tutto il protocollo in cui la convalida della corretta costruzione e funzionamento delle fibre ottiche, contribuirà a garantire una stimolazione ottica di successo. È necessario valutare correttamente le ghiere per prevenire la perdita dalla copertura e lucidare le fibre ottiche e verificare che la perdita di emissione luminosa attraverso gli impianti non superi il 30%9. Inoltre, i parametri di stimolazione laser sono considerazioni importanti. Il laser deve funzionare a una potenza relativamente bassa (5-7 mW). La stimolazione sostenuta a bassa frequenza viene utilizzata per indurre LTD, e questo può essere convalidato funzionalmente misurando la forza sinaptica MGN-LA con registrazioni elettrofisiologiche. Infine, i risultati hanno indicato una significativa riduzione del reintegro indotto da cue con un n finale di 10 animali per gruppo, tuttavia, gli sperimentatori dovrebbero prevedere di iniziare con un n più grande, poiché è probabile che alcuni animali dovranno essere esclusi dall'analisi finale. È fondamentale verificare il corretto posizionamento anatomico e l'espressione del virus e delle fibre ottiche e utilizzare solo i dati degli animali in cui è stata verificata l'istologia.
Nonostante il robusto effetto comportamentale sulla ricerca di cocaina osservato con questo protocollo, ci sono diverse limitazioni che devono essere considerate. Per uno, il metodo è stato testato solo in ratti che sono stati addestrati con un singolo segnale audiovisivo abbinato alla cocaina. Non è chiaro cosa accadrebbe in uno scenario in cui fossero condizionati più segnali diversi, che sarebbe una rappresentazione più accurata della dipendenza umana, in cui più stimoli ambientali diventano altamente associati all'uso di droghe15,16,17. Le prove del nostro laboratorio indicano che la capacità di optogenetic LTD di ridurre la ricerca di farmaci è dovuta a una diminuzione della forza sinaptica che indebolisce i ricordi associati ai farmaci. Tuttavia, non è chiaro fino a che punto i ricordi neutri o non associati all'autosomministrazione di cocaina potrebbero essere influenzati da questo protocollo. Inoltre, mentre il metodo influisce solo sulla forza sinaptica in un circuito, altri circuiti possono anche essere importanti per codificare la memoria e / o guidare il comportamento di ricerca della cocaina18,19,20. Infine, va notato che LTD può essere indotta solo nelle sinapsi in cui il virus è sufficientemente espresso, probabilmente lasciando alcune connessioni sinaptiche non influenzate dal protocollo di stimolazione, che potenzialmente limita l'impatto comportamentale. Inoltre, l'evidenza suggerisce che solo piccoli insiemi di neuroni e sinapsi sono coinvolti nella codifica di una particolare memoria, dando credito all'idea che l'induzione di LTD all'interno di un'intera regione del cervello non sia la migliore strategia per effettuare cambiamenti comportamentali, mentre esistono altri approcci per indirizzare specificamente popolazioni di neuroni attivi o contestualmente attivi21, 22. Nonostante ciò, il protocollo è efficace nell'attenuare la ricerca di droghe motivata da spunti, probabilmente perché la stimolazione ottica a bassa frequenza limita l'induzione LTD alle sinapsi che sono state precedentemente potenziate da ripetuti accoppiamenti cocaina-segnale4.
Questo protocollo fornisce un progresso significativo agli studi comportamentali optogenetici più comunemente usati in cui l'attività dei neuroni viene attivata o inibita mentre l'animale sta eseguendo il comportamento in tempo reale19,23. Invece, l'optogenetica viene utilizzata qui come strumento neuromodulatore per invertire la plasticità indotta dalla cocaina. Un vantaggio di questo metodo è che la manipolazione optogenetica è indipendente dal test comportamentale, in modo tale che i potenziali effetti confondenti dell'optogenetica (ad esempio, effetti del circuito locale, periodo refrattario dopo la stimolazione della luce, effetti di stimolazione antidromica, ecc. 24 non dovrebbe influenzare i risultati, aumentando così la fiducia che il meccanismo neurale ipotizzato stia mediando i cambiamenti nel comportamento. Questo metodo può quindi essere utilizzato in una serie di applicazioni che studiano come la plasticità sinaptica, in particolare un aumento della forza sinaptica come accade con LTP, si riferisce ai cambiamenti nel comportamento. Approcci simili potrebbero anche essere rilevanti per l'applicazione clinica delle tecnologie di stimolazione neurale in cui le connessioni anormali nel cervello che guidano il comportamento disfunzionale possono essere sottoregolate. Allo stesso modo, poiché il costrutto virale oChIEF risponde alle stimolazioni sia a bassa che ad alta frequenza, ci sono potenziali applicazioni a questi metodi oltre lo scopo degli esperimenti descritti. Ad esempio, l'LTP indotta optogeneticamente può essere utile per invertire i deficit di plasticità riscontrati in una vasta gamma di disturbi neurodegenerativi e dello sviluppo neurologico25. Inoltre, la plasticità bidirezionale nelle sinapsi MGN-LA è stata anche direttamente collegata alla regolazione dei comportamenti rilevanti per i disturbi associati alla paura8.
Modulare i circuiti neurali specifici che supportano i comportamenti motivati dalla droga è essenziale per stabilire l'astinenza a lungo termine dall'uso di droghe. Questo protocollo utilizza nuovi progressi nell'optogenetica in vivo per invertire la plasticità di un preciso circuito neurale che viene rafforzato da ripetute auto-somministrazione di cocaina in presenza di segnali ambientali. Il risultato di questa specifica neuromodulazione è una ridotta probabilità che le successive riesposizioni di segnali inneschino una risposta alla ricerca di cocaina, che può avere importanti implicazioni per lo sviluppo di future terapie per i disturbi da uso di sostanze.
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Disclosures
Nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere il supporto delle sovvenzioni USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) e del Dipartimento della Salute della Pennsylvania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
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