Summary
ここで説明する方法は、ラットの行動関連回路におけるコカイン誘発可塑性を光遺伝学的に逆転させるために使用される手順を概説する。視床-扁桃体シナプスの持続的な低周波光刺激は、長期うつ病(LTD)を誘発します。コカインを経験したラットにおける in vivo 光遺伝学的に誘導されたLTDは、その後の手がかり動機による薬物探索の減弱をもたらした。
Abstract
このプロトコルは、視床-扁桃体回路でコカイン誘発性を逆転させ、ラットにおけるその後のコカイン探索行動を減らすために光遺伝学的ツールを使用するために必要なステップを示しています。私たちの研究では、ラットが視聴覚キューと組み合わせてコカインを静脈内投与すると、視床の内側膝状核(MGN)から外側扁桃体(LA)の主要なニューロンへの入力で形成されるシナプスが、キューとコカインの関連が学習されるにつれて強くなることがわかりました。これらのシナプスでのコカイン誘発可塑性の逆転は、合図動機によるコカイン探索行動を減少させるという仮説を立てた。このような神経調節を in vivoで実現するために、MGN-LAシナプスの強度を低下させるシナプス長期抑制(LTD)を誘導したいと考えました。この目的のために、私たちは光を使って脳回路の神経調節を可能にするオプトジェネティクスを使用しました。興奮性オプシンoChiEFは、oChiEFを含むAAVをMGNに注入することにより、LAのシナプス前MGN末端に発現しました。次に、光ファイバーをLAに埋め込み、473 nmのレーザー光を1 Hzの周波数で15分間パルスして、LTDと逆コカイン誘発可塑性を誘導しました。この操作は、薬物探索行動を誘発するコカインに関連する手がかりの能力の長期的な低下をもたらします。
Introduction
薬物乱用は、米国および世界中で非常に深刻な公衆衛生問題です。何十年にもわたる集中的な研究にもかかわらず、効果的な治療オプションはほとんどありません1,2。治療の大きな後退は、慢性的な薬物使用が環境手がかりと薬物自体との間に長期的な連想記憶を生成するという事実です。薬物関連の手がかりへの再曝露は、継続的な薬物使用と再発を動機付ける生理学的および行動的反応を促進します3。新しい治療戦略は、薬物と手がかりの関連を調節することに関与する回路を操作することを目的とした記憶ベースの治療法を制定することです。最近、外側扁桃体(LA)のシナプス、特に視床の内側生殖核(MGN)から生じるシナプスは、手がかりに関連するコカインの自己投与を繰り返すことによって強化され、この増強がコカイン探索行動をサポートできることが観察されました4,5。したがって、MGN-LAシナプスの可塑性を逆転させることで、キュー誘発による回復を減衰させることができると提案されました。
特定の脳回路のシナプス可塑性を正確に標的にする能力は、この分野にとって大きな課題でした。従来の薬理学的ツールは、再発行動を減少させることにある程度成功しているが、個々のシナプスを操作できないことによって制限されている。しかし、in vivoオプトジェネティクスの最近の開発は、これらの制限を克服し、時間的および空間的精度で神経経路を制御するために必要なツールを提供しました6,7,8。特定の脳回路で光感受性オプシンを発現させることにより、レーザー光を使用して回路を活性化または阻害することができます。周波数依存性光刺激は、行動する動物における回路のシナプス可塑性を特異的に操作するために利用することができる。
この原稿は、 in vivo オプトジェネティクスを使用して行動に関連するMGN-LA回路を操作するために取られた手順を概説します。まず、興奮性オプシンoChIEFをMGNで発現させ、光ファイバーをLAに両側に移植した。次に、動物は、MGN-LA経路を増強する手がかり依存的な方法でコカインを自己投与するように訓練されました。次に、473nmのレーザー光による持続的な低周波刺激を用いて、回路固有のLTDを製造した。 コカイン使用によって誘発される可塑性を逆転させることは、薬物探索行動に関連する行動を引き起こす手がかりの能力の長期的な低下をもたらした。
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Protocol
このプロトコルに記載されている実験は、 実験動物の世話と使用のための 国立衛生研究所ガイドによって定められたガイドラインと一致しており、ピッツバーグ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。すべての手順は、到着時の体重が275〜325 gの成体のナイーブなSprague-Dawleyラットを使用して実行されました。
1.光ファイバーインプラントとパッチケーブルの構築
- 以前に公開されたプロトコルに従って光ファイバーインプラントを準備します 9.このプロトコルで説明されている実験では、200 μmコアファイバ(0.5 NA)とØ1.25 mmマルチモードLC / PCセラミックフェルール、Ø230 μmの穴サイズを使用しました。
- ドレメルツールを使用して、フェルールの下3分の1(フェルールの平坦な端に最も近い)にスコアを付けます。フェルールにスコアを付けることで、歯科用セメントに付着したままになり、実験の全範囲を通じて安全性が維持される可能性が高くなります。
- ワイヤーカッターを使用して、~35mmの繊維を切断します。ファイバーストリッピングツールを使用して、~25 mmのファイバーを剥がし、10 mmを露出させません。
- メーカーの指示に従って熱硬化性エポキシを準備します。樹脂粉末1gを硬化剤コンパウンド100mgに溶解する。鈍い25ゲージの針を1mLシリンジに取り付けます。シリンジにエポキシを入れ、鈍い25ゲージの針先を取り付けます。
- バイスまたはクランプを使用して、平らな面を上に向けて凸面を下に向けてフェルールをしっかりと保持します。エポキシ充填シリンジを使用して、フェルールの側面から余分なエポキシを拭き取るように注意しながら、フェルールの平らな面にエポキシを1滴加えます。
- ファイバーの剥がされた部分をフェルールに挿入して、さらに5mmの剥がされたファイバーを露出させます。LAインプラントの場合、線維は腹側からブレグマまで7.9 mmに移植されるため、剥がされていない線維の露出長は~13 mmである必要があります。
- エポキシが黒/琥珀色になるまで、ヒートガンで約30〜40秒間硬化させます。
- ダイヤモンドナイフでフェルールの凸端の界面でファイバーを直接刻み、指を使ってファイバーをそっとタップします。
- 止血剤で保持し、均等な圧力を加え、一連の研磨紙(高品位から低品位、5、3、1、0.3 μm)でそれぞれ20回の円形回転を行うことにより、フェルールの凸端を研磨します。
- ストリップされていないファイバーをテープとスコアストリップファイバーを使用してテーブルに固定し、腹側座標から2 mm余分に残します(LAインプラントの場合、ファイバーの最終長は~10 mmです)。止血剤を使用してフェルールを引っ張り、刻み目がついた繊維を均等に壊します。スコアリング時にファイバーを完全に切断しないように注意してください、そうしないとファイバーのコアが損傷します。
- 光ファイバーインプラントと互換性のあるパッチケーブルを構築します。カスタム設計のパッチケーブルを購入しました( 材料の表を参照)。あるいは、パッチケーブルは、以前に公開されたプロトコル9に従って構築することができる。
注意: フェルールファイバーとパッチケーブルファイバーの直径とNAは、神経活動を十分に刺激できない可能性のある過剰な光の損失を防ぐために、カップリング接合部で一致する必要があります。 - パッチケーブル/光ファイバーを適切なレーザー光源(473 nm、1 mW出力)に接続し、光センサーで出力を測定し、パッチケーブルと光ファイバーインプラントを介した光出力を測定します。正常に構築されたファイバーは、同心円の光を放出し、光損失は30%以下です。
2.げっ歯類の静脈内カテーテル法、ウイルス送達、および光ファイバー移植
- 手術のために動物を準備します。
- 施設のガイドラインに基づいて、選択した麻酔薬でラットを完全に麻酔します。1つの選択肢は、塩酸ケタミン(87.5-100 mg / kg、i.m.)および塩酸キシラジン(5 mg / kg、i.m.)です。つま先のピンチ反射がないかどうかを確認することにより、ラットが完全に麻酔されていることを確認します。
注意: ケタミンは、機関のガイドラインに従って取り扱わなければならない規制物質です。
注:麻酔薬の筋肉内注射は、腹腔内注射よりも迅速で信頼性の高い麻酔導入をもたらしたため、この研究では使用されています。ラットの呼吸と反応性を継続的に監視し、手術中は熱サポートを提供します。 - ラットの背中の広い領域(肩甲骨のすぐ上から背中の中央までの背中の上部)と、右前肢の下の首の領域、および頭皮を剃ります。
- ラットを手術領域に置き、目にプラルーブ(人工涙液)を適用します。体重量のカルプロフェン(鎮痛剤)を背中上部の皮膚から皮下(SC)注射し、次に5 mLの乳酸リンゲル溶液s.c.を腰の皮膚から注射します。
- 滅菌ガーゼをベタジンで濡らし、円運動を使用して剃毛した手術部位を拭き取ることにより、すべての手術部位を消毒します。その後、70%エタノールでこのプロセスを繰り返します。この交互のサイクルを3回繰り返します。
- 施設のガイドラインに基づいて、選択した麻酔薬でラットを完全に麻酔します。1つの選択肢は、塩酸ケタミン(87.5-100 mg / kg、i.m.)および塩酸キシラジン(5 mg / kg、i.m.)です。つま先のピンチ反射がないかどうかを確認することにより、ラットが完全に麻酔されていることを確認します。
- 以前に公開されたプロトコル4、10に従って静脈内カテーテル移植を行う。
注:カテーテル移植中の刺激を避けるために、この手術中は外科的ドレープは使用されません。使用前にすべての器具および機器を滅菌してください。滅菌手袋を使用し、滅菌されていない表面に接触した場合は手袋を交換してください。 - カテーテル移植の直後に、ラットを定位固定装置フレームに固定してAAV注射を行います。
- 局所麻酔薬として2%リドカイン(0.2〜0.3 mL)の皮下(s.c)注射を頭皮に届けます。.
注:局所麻酔薬は、外科的転帰の変化を避けるために、静脈内カテーテル移植中に使用されません。 - 26ゲージのステンレス鋼注射カニューレを、1 μLの濃縮AAV溶液で満たされたハミルトンシリンジに接続します:AAV5-hSyn-tdトマトまたはAAV5-hSyn-oChIEF-tdトマト
注:oChIEFは、青色光感受性オプシンチャネルロドプシン(ChR2)の変種であり、広範囲の周波数8,11に応答できるため、このプロトコルで説明されている低周波LTD実験だけでなく、高周波LTP実験(ここでは説明しません)。oChIEFコンストラクトは、ロジャー・ツィン博士から寄贈され、デュークウイルスベクターコアによってパッケージングと精製のために処理されました。MGN軸索終末における最適なウイルス発現を可能にするために、注射日からLTD誘導日までの間に少なくとも3〜4週間が必要である。
注意:一般に、AAVはバイオセーフティレベル1(BSL-1)生物と見なされており、ヘルパーウイルスを生産に使用しない限り、自己感染のリスクは低くなります。その使用にはIACUCの承認が必要であり、不必要な曝露を制限するために、制度上のガイドラインに従って適切なPPEを常に使用する必要があります。 - メスを使用して、頭蓋骨の前部から後部に0.5 mmの切開を行い、上にある組織を取り除き、頭蓋骨の表面を露出させます。
- ラットの頭を前軸/後軸に水平にし、脳定位座標をブレグマにゼロにします。
- 小さなドリルビットを備えたドレメルツールを使用して、頭蓋骨に3つの小さな穴を開けます。ドライバーを使用して、ステンレス鋼のネジ(M2x4 965-A2)を所定の位置にしっかりと取り付けます。
注意: 歯科用セメントを適切に結合し、頑丈で長持ちするヘッドキャップを作成するには、ネジが必要です。ネジの位置は、頭蓋骨の前後軸を横切って、AAV注射部位から離して広げる必要があります。 - 内側膝状核(MGN)の内側部分について、ラットブレインアトラス(ワトソンとパクシノス)12 からの座標に基づいてAAVを注入するための両側穴を開けます。ブレグマからのミリメートル、AP:-5.4;ML: ±3.0;DV: -6.6.MGNに配置されるまで、注入カニューレをゆっくりと下げます(4 mm / min)。濃縮AAV溶液を0.1 μL/分の速度で注入します。
- 注入が完了した後、注射カニューレを5分間そのままにして、カニューレから拡散させてから、カニューレを脳からゆっくりと引き出します。
- 局所麻酔薬として2%リドカイン(0.2〜0.3 mL)の皮下(s.c)注射を頭皮に届けます。.
- ウイルス注入の直後に、MGN−LA末端を標的とする光ファイバー4,9を移植し続ける。
- ドレメルツールを使用して、外側扁桃体を標的とする光ファイバーインプラント用の両側穴を開けます(単位:ブレグマからのmm、AP:-3.0;ML ±5.1) を参照してください。
- 鉗子を使用して光ファイバーインプラントのフェルールをつかみ、固定装置アダプターに固定して、しっかりと固定します。
- 繊維の先端がLAの背側部分(DV:-7.9 mm)に収まるまで、2 mm / minの速度でゆっくりと繊維を下げます。
- 最初にロックタイトインスタント接着剤の薄層を使用してフェルールを頭蓋骨に固定し、次に歯科用セメントと直径1.25mmのフェルールスリーブとダストカバーでフェルールを覆います。
注意: フェルールを頭蓋骨に固定するための接着剤の選択は、地域または施設の動物管理および使用委員会によって承認される必要があります。この研究では、複数の接着剤で試行錯誤した後、フェルールを頭蓋骨に確実に固定するためにロックタイトが使用されます。ただし、利用可能な代替案を検討することができます。
- 外科的処置の後、ラットを個別に飼い、食物と水への無料アクセスを提供します。施設のガイドラインに沿った術後ケアを提供する。開存性を維持するために、ゲンタマイシン(5 mg / mL)とヘパリン(30 USP / mL)を含む生理食塩水でカテーテルを毎日洗い流してください。手術後少なくとも5日後および行動実験開始の24時間前に、食物はラットを自由摂食体重の~90%に制限する。
3. げっ歯類コカインの自己投与と器械レバーの消滅
注:すべての行動手順は、1つの壁に2つの格納式レバー、各レバーの上に刺激ライト、トーンジェネレーター、ハウスライト、および輸液ポンプを備えた標準的なオペラントコンディショニングチャンバーで行われます。
- FR1強化スケジュールの下で、ラットを毎日1時間のコカイン(2 mg / mL)自己投与トレーニングセッションにさらします。.
- ラットを毎日オペラントチャンバーに入れ、ラットがレバープレスできるようにします。指定された「アクティブレバー」(左右のレバーで相殺)を押すと、コカイン注入(1.0 mg / kg /注入)と、複合光とトーンのキューが10秒間表示されます。指定された「非アクティブレバー」を押しても、プログラムされた効果はありません。
- ラットが3日間連続して少なくとも8回の注入/日を獲得するまで、少なくとも10日間自己投与実験を続けます。.20日目までに取得基準に達しなかった場合、研究から除外されます。
- 獲得基準が正常に満たされた後、ラットを6〜10dの1時間の機器絶滅セッションにかけます。
- ラットをオペラントチャンバーに入れ、ラットが自由にレバープレスできるようにします。ただし、アクティブレバーと非アクティブレバーの両方での応答は、プログラムされた結果にはなりません。
- ラットに、2日間連続で平均<25回のレバープレスが発生するまで、毎日器具の絶滅を続けてもらいます。
4. 株式会社の 生体内 光遺伝学的誘導
注:光遺伝学的阻害実験は、器械的絶滅の最終日から24時間後に行われます。
- カバーを外した清潔で標準的なげっ歯類のハウジングケージの上に吊り下げられたロータリージョイントを介して、パッチコードを473nmの青色レーザーダイオードに接続します。この設定により、げっ歯類は光遺伝学的刺激中にケージの周りを自由に動き回ることができます。
- 取扱説明書に従ってレーザーダイオードの電源を入れ、パルス発生器に接続します。設定を調整します, 電源を入れたときにラットが1Hzで900 2ミリ秒の光パルスを受信するようにします.
注意: レーザーの操作中は常に適切な目の保護具を使用する必要があります。 - 光センサーを使用して、パッチコードを通して光強度を測定します。パッチケーブルからの光出力が~5-7mWになるようにレーザーの強度を調整します。
- ラットを清潔なハウジングケージに入れます。ダストカバーとフェルールスリーブを取り外し、フェルールを露出させます。パッチコードを光ファイバーインプラントに両側に接続します。ラットがLTD誘導の前に3分間環境を探索できるようにします。
- パルス発生器をオンにして、光遺伝学的刺激を開始します。
注:可能性は低いですが、ラットが刺激に対して何らかの副作用を経験した場合、実験は直ちに終了し、ラットは施設のガイドラインに基づいて適切に安楽死されます。 - LTD誘導後、ラットをケージに3分間入れてから、ホームケージに戻します。
- 対照実験では、AAV5-tdTomato対照ウイルスを発現するラットに同じ刺激手順を使用します。偽の実験では、AAV5-oChIEFウイルスを発現するラットの光ファイバーにパッチコードを取り付けますが、15分間のセッションでは刺激は提供されません。
5.手がかり誘発性コカインシークに対する光遺伝学的刺激の効果をテストする
- in vivo光遺伝学的刺激の24時間後、ラットをオペラントコンディショニングチャンバーに戻します。ラットは、コカイン探索行動を評価するために、1時間の標準的な合図誘発性復職セッションを受けます。
注:キュー誘発性回復中、アクティブレバーでの応答により、コカイン関連のキューが10秒間表示されますが、コカインの注入は行われません。 - 最初の検査の少なくとも1週間後に2回目の復職検査を行い、光遺伝学的LTD誘導がコカイン探索の長期的な抑制をもたらすかどうかを判断します。
6. ウイルス発現および光ファイバー配置の組織学的検証のための染色、蛍光、およびイメージング
- 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と4%パラホルムアルデヒド(PFA)を作ります。両方の溶液を氷上に保管します。総容量は、研究のラットの数によって異なります(ラットあたり~100mLのPBSと200mLのPFAが使用されます)。
注意: PFAは有毒な化学物質であり、発がん性物質として知られています。吸入や皮膚との接触を避けるために適切な注意を払ってください。その使用と廃棄は、適切なPPEとケミカルフローフードの使用を含む制度上のガイドラインに従う必要があります。 - 蠕動ポンプを20 mL/minの流量でセットアップします。ポンプのチューブに1x PBSを充填します。チューブの端に鈍い20ゲージの針を取り付けます。
- ラットにペントバルビタールナトリウム(100 mg / kg、i.p.)を深く麻酔します。.先に進む前に、つま先のつまみに対する反応の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
注:灌流は最終処置であるため、ペントバルビタールナトリウムが使用されます。 - 外科用ハサミを使用して、横隔膜の下のラットの腹腔を切り開きます。胸郭を横方向の縁に沿って吻側に切り、ラットの心臓を露出させます。止血剤を使用して、胸郭の吻側部分を心臓から離して固定します。心臓を囲む上にある脂肪組織を切り取ります。
- 鈍い針を左心室から大動脈に挿入します。右心房に小さな穴を開けて、心臓に戻るときに溶液を排出します。
- 各ラットに1x PBSを5分間、続いて4%PFA、pH 7.4で10分間灌流します。
- ラットを斬首し、脳を抽出し、4%PFAに24時間後置します。次に、脳を30%スクロース溶液に2〜3 d移します。
- クライオスタットを使用して50μmで脳を切片化します。
- LAまたはMGNを含むすべてのスライスをスライドガラスとカバーガラスに取り付けます。
- 放射蛍光顕微鏡を使用した画像スライスを使用して、MGNにおけるAAV-oChIEF-tdTomatoの発現とLAへの投影、およびLA上の光ファイバーの配置を検証しました。
7.電気生理学実験のための灌流および急性脳スライスの準備
注:電気生理学的実験は、 in vivo LTDの成功を検証するために、動物のサブセットに対して実行されます。
- 表1〜34、13に列挙した試薬を用いて電気生理学溶液を調製する。HClですべての溶液のpHを7.4に調整し、浸透圧を300-310 mOsm / kgH 2Oに調整します。 実験前に溶液を新鮮にし、4°Cで最大1週間保存します。使用中は常にすべての溶液をカルボゲン(95%O 2/5%CO2)で飽和させてください。
- 地域または施設の動物の世話と使用のガイドラインに従ってイソフルランを使用して、密閉された安楽死チャンバーでラットを深く麻酔します。. 動物がつま先のピンチ反射によって完全に麻酔をかけられていることを確認します。
- 小さなビーカーに50mLの氷冷切断液を入れます。蠕動ポンプのチューブに溶液を充填し、流量を20 mL/minに調整します。チューブの端に鈍い20ゲージの針を取り付けます。
- 腹腔を開き(手順6.4および6.5を参照)、ラットに切断液を簡単に灌流します(最大1〜2分)。
- 灌流後、直ちにラットを斬首する。脳を取り出し、4°Cの切断溶液で満たされた小さなビーカーに30秒〜1分間入れます。
- へらで脳を移し、すぐにビブラトームのチャンバーに固定します。細かい鉗子を使用してピアを取り外します。チャンバーに4°Cの切断液を満たし、速度0.37 mm/秒、周波数70 Hzで扁桃体の急性冠状スライス(厚さ250 μm)を調製します。
- スライスが得られたら、それぞれを切断溶液で満たされた保持チャンバーに入れ、37°Cで10〜12分間インキュベートします。LAを含むスライスは、動物あたり約5〜7個得ることができる。
- スライスを室温(RT)保持溶液のビーカーに移し、実験前に>30分間回復させます。
注意: スライスは通常、保持溶液に4〜6時間保持されている間、健康なままです。AAVの蛍光性により、スライスは低照度状態に保たれます。
8. 生体外 電気生理学的記録
- 表4〜5に列挙した試薬を用いて細胞内溶液を調製する。
注:細胞内溶液は実験の前に作成する必要があり、-80°Cで長期(3〜12か月)または-20°Cで短期(1〜2か月)保存できます。 溶液は7.3にpH調整されています(Csベースの細胞内溶液の場合はCsOH、Kベースの細胞内溶液の場合はKOHを使用)。290-300 mOsm / kgH 2Oの最終浸透圧に調整します。 - ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した500 mMピクロトキシンストック溶液を調製します。
注:ピクロトキシンストックは分注され、-20°Cで保存されます。 使用当日、アリコートを解凍し、最終濃度100μMになるまで記録溶液に添加する。
注意:ピクロトキシンはGABAA 受容体の非競合的アンタゴニストであるため、ピクロトキシンの注入には刺激効果があります。経口摂取または皮膚吸収により重度の毒性を示します。.ピクロトキシンを扱うときは、常に適切なPPEを使用する必要があります。 - 電気生理学実験用に設計された正立顕微鏡にスライスを移します。
- 実験中は、31〜33°Cに加熱された記録溶液でスライスを連続的に浴灌流する。
- 4倍の対物レンズを使用してLAを拡大します。40倍の水浸レンズで形態によって主要なニューロンを特定します。
- Csベースの細胞内溶液(電圧クランプ実験用)またはKベースの細胞内溶液(電流クランプ実験用)のいずれかを充填したガラスピペット(3〜5MΩ)を使用して、全細胞パッチクランプ記録を取得します。
- 蛍光下でAAVに感染したMGN軸索投影を特定します(RFPフィルターを使用)。パルス発生器に接続された青色光(473 nm)DPSSレーザーを使用して投影を刺激します。
注意: レーザー露光を制限するために、コリメートされたレーザー光は顕微鏡の蛍光ポートに結合され、対物レンズを通してスライスに集束されます。
注:電圧クランプモードでは、興奮性シナプス後電流(EPSC)は0.1Hzで光学的に誘発されます。 AAVに感染したMGNニューロンからの入力を受け取るニューロンは、信頼性の高いEPSCを示します。 - ex vivo LTDを誘導するには、現在のクランプモードで、興奮性シナプス後電位(EPSP)の安定したベースラインを少なくとも10分間記録します。.次に、周波数1Hz(合計時間=15分)で473nmの光の900個の2msパルスを供給します。次に、EPSPを0.1Hzで≥60分間連続的に記録します。
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Representative Results
実験の順序を概説するタイムラインを 図1に示します。行動実験を通して、コカイン注入の数とアクティブレバーで行われた反応の数は、コカイン探索行動の強度の尺度として機能します。コカインの自己投与の最初の数日間は、積極的な反応の数は、2週目に安定する前に、各獲得日にわたって徐々に増加するはずです。逆に、非アクティブなレバー応答は、実験全体を通して低いままである必要があります(図2A)。器械消滅の初日には、コカインの予期せぬ欠如がコカイン探索行動のエスカレーションをもたらすため、通常、アクティブなレバー反応の数が増加します。ただし、ラットが新しい偶発事象を学習するにつれて、この応答はその後のセッションで徐々に減少し、6〜10 d以内のアクティブなレバー応答の数が少なく安定した数になります(図2B)。実験の自己投与段階または機器絶滅段階のいずれかで指定された取得基準に達しなかったラットは研究から削除され、データは最終分析に含まれません。
器械消滅後、コカイン関連の手がかりに再曝露すると、コカイン探索行動が回復し、その結果、能動的レバー反応の数が増加する。この増加は、対照実験の両方のグループで観察されます:oChIEFを欠くウイルスを注射されたラット(AAVコントロール)とレーザー刺激を受けなかったラット(SHAMコントロール; 図3A)しかし、MGN-LA末端のi n vivo 光遺伝学株式会社は、その後の手がかり誘発コカイン探索の減少を引き起こした。オプトジェネティックLTD誘導から24時間後、アクティブなレバープレスの数は、AAVコントロールとSHAMコントロールの両方と比較して大幅に減少しました(図3A)。この低レベルの反応は、7日後のその後の復職試験(ラットのサブセットで実施)でも維持され(図3B)、複数の復職試験で合図動機によるコカインシークが持続的に減少したことを示しています。
光学刺激にばく露された動物からの生体外電気生理学的記録は、回復の減衰が実際にMGN-LAシナプス可塑性の調節に少なくとも部分的に起因することを確認した。これは、光学LTDへの曝露後のLAニューロンにおける光学的に誘発されたEPSC振幅の減少によって証明されました(図4A)。EPSC振幅のこの減衰は、EPSC振幅がSHAMコントロールで変化しなかったため、視刺激を受けたニューロンに特異的でした。さらに、LTDは、すでにin vivo光刺激を受けたラットのスライスでは生成できませんでしたが、EPSPの上昇勾配の持続的な減少によって証明されるように、SHAM刺激を受けたラットのニューロンでは確実に誘発されました(図4B)。したがって、インビボ光刺激は、スライスにおけるさらなるLTD誘導を遮蔽するようである。記録中は、パッチの正常性を維持するために、記録期間中の直列抵抗を測定することが重要です。直列抵抗の変化が20%を超える細胞は、データ解析に受け入れられません。これは、直列抵抗の変化が受容体とチャネルのダイナミクスに影響を与える可能性があるため、>60分続くLTD実験では特に重要です。電気生理学的記録中に刺激される求心性神経がMGNに由来することを確実にするために、視床の範囲を通してスライスを収集することが重要です。これは、MGNの細胞体が実際に蛍光AAVを発現していることの検証として機能します。目視による確認に加えて、機能検証も必要です。電流クランプ条件下では、AAV-oChIEFに感染したMGNニューロンは、473nmの光刺激の高周波と低周波の両方に応答して活動電位を発火します(図4C)。
ウイルス発現と光ファイバーインプラントが組織学的に検証され、適切な配置が確認されるまで、すべての行動結果は暫定的であると見なされました(図5)。MGNまたはLAのいずれかにおけるAAV発現の欠如、および/または光ファイバーが背側LA内に正しく配置されていないものは実験分析から除外されましたが、場合によっては陰性の解剖学的コントロールとして含まれる場合があります。
図1:実験手順のタイムライン。 各実験段階の連続した時間経過および期間を含む、プロトコルの重要なステップの概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:コカイン自己投与の獲得と消滅。(A) 動物は、獲得全体でコカイン注入と能動的レバー反応の数が増加し、非アクティブレバー反応のレベルが低い。 (B) 絶滅の1日目にレバーを押すのが最初にブーストされた後、動物はアクティブなレバーと非アクティブなレバーの両方で反応を低く安定したレベルに低下させます。エラーバー、平均±SEM。この図は、Rich et al. 20194から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:in vivo光遺伝学LTDは、手がかり誘発性回復を弱める。(A)光学株式会社は、対照ウイルスまたは偽制御刺激を受けた動物と比較して、復帰中のアクティブなレバープレスの有意な減少を引き起こします。二元配置分散分析、群の主効果(F(2,27) = 7.04、P = 0.004)および日x群交互作用(F(2,27) = 8.08、P = 0.002); ボンフェローニの事後分析:****p < .001。(B)7日後、ラットは2回目の回復試験を受け、以前にMGN-LA LTDを受けた動物のアクティブレバープレスがSHAMコントロールと比較して有意に減少したことが明らかになりました。二元配置分散分析、群の主効果(F(1,32) = 5.04、P = 0.032)、有意な交互作用(F(1,32) = 7.69、P = 0.009); ボンフェローニの事後分析、**p < .01。エラーバー、平均±SEM、バーのn、ラットの数。この図は、Rich et al. 20194から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:in vivo低周波光遺伝学的刺激の機能検証(A)MGN-LAシナプスのin vivo デュアル半球LTDは、SHAMコントロールと比較してEPSC振幅を減衰させます(対応のないt検定、t(10)= 2.73、* P = 0.021)。挿入図: Erev-70 mV で誘発された平均 EPSC トレースのサンプル。スケールバー:50ミリ秒、200pA、バー単位のn、ラット数(ニューロン)。(B)インビボ光LTD誘導オクルードエクスビボ株式会社インビボLTD誘導の24時間後に、扁桃体スライスを調製し、同じ刺激プロトコルを適用した。MGN-LA末端におけるEPSP上昇勾配は、in vivo SHAM刺激を受けた動物由来のニューロンではex vivo光刺激によって減少したが、in vivo光学的LTD.nをイタリック体で受けた動物のニューロンでは減少しなかった。(C)AAV-oChIEFに感染したMGNニューロンからのサンプル電流クランプ記録。活動電位は、青色光刺激(5〜100Hz)によって誘発された。スケールバー:100ミリ秒、40mV。エラーバー、平均±SEM。この図は、Rich et al. 20194から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ウイルス発現と光ファイバー配置の組織学的検証。(A)LA(左)およびMGN(右)におけるDAPIおよびAAV-oChIEF-tdTomatoesの発現を示す代表的な顕微鏡画像。スケールバー:2 mm。 (B)AAV-oChIEF-tdトマトの注入と、LA(左)とMGN(右)の前後の範囲全体、およびLAの光ファイバー配置を示す概略図。濃い赤色の網掛けは許容可能な最小のウイルス拡散を表し、薄いピンクの網掛けは許容可能な最大の広がりを表します。青い円は、両方の半球での光ファイバーの配置の成功に対応しています。黒い円は、1つの半球のみでの光ファイバーの配置の成功に対応しています。黒い「X」は、ファイバー配置の失敗に対応します。最終解析に含めるには、ラットはLAでのウイルス二重半球発現と繊維の配置の成功を必要とした。座標はmmで、ブレグマより後方です。この図は、Rich et al. 20194から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ケミカル | ミリメートル | メガワット | g/1000 mL |
| N-メチル-D-グルカミン | 92 | 195.215 | 17.96 |
| 塩化カリウム | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| リン酸ナトリウム一塩基性 | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| 炭酸水素ナトリウム | 30 | 84.01 | 2.52 |
| ヘペス | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-グルコース | 25 | 180.16 | 4.5 |
| アスコルビン酸ナトリウム | 5 | 198.11 | 0.99 |
| チオ尿素 | 2 | 76.12 | 0.15 |
| ピルビン酸ナトリウム | 3 | 110 | 0.33 |
| 硫酸マグネシウム | 10 | 5.0 mLの2.0 Mストックを使用 | |
| 塩化カルシウム | 0.5 | 2.0 mストックを250 μL使用 | |
| 1. 1 Lの溶液に対して、850 mL ddH2Oに記載されている順序で塩を追加します | |||
| 2. 濃縮HClでpH 7.3-7.4(NMDGは塩基性溶液になります) | |||
| 3. 酸素化物を5〜10分間行い、MgSO4とCaCl2を追加します | |||
| 4.最終ボリュートムをddH2Oで1 Lにし、最終pHを再確認します | |||
| 5.浸透圧計で浸透圧を確認し、300-310 mOsm / kg H2Oに調整します | |||
表1:細胞外切断液の成分リスト。 NMDGベースの細胞外切断溶液の調製に使用される成分および説明書。
| ケミカル | ミリメートル | メガワット | g/1000 mL |
| N-メチル-D-グルカミン | 86 | 195.215 | 5.03 |
| 塩化カリウム | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| リン酸ナトリウム一塩基性 | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| 炭酸水素ナトリウム | 35 | 84.01 | 2.94 |
| ヘペス | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-グルコース | 25 | 180.16 | 4.5 |
| アスコルビン酸ナトリウム | 5 | 198.11 | 0.99 |
| チオ尿素 | 2 | 76.12 | 0.15 |
| ピルビン酸ナトリウム | 3 | 110 | 0.33 |
| 硫酸マグネシウム | 1 | 500 μLの2.0 mストックを使用 | |
| 塩化カルシウム | 2 | 1000 μLの2.0 mストックを使用 | |
| 1. 1 Lの溶液に対して、850 mL ddH2Oに記載されている順序で塩を追加します | |||
| 2. 1 N HClまたはKOHのpHを7.3〜7.4に | |||
| 3. 酸素化物を5〜10分間行い、MgSO4とCaCl2を追加します | |||
| 4.最終ボリュートムをddH2Oで1 Lにし、最終pHを再確認します | |||
| 5.浸透圧計で浸透圧を確認し、300-310 mOsm / kg H2Oに調整します | |||
表2:細胞外保持液の成分リスト。 細胞外保持液の調製に使用される成分および説明書。
| ケミカル | ミリメートル | メガワット | g/1000 mL |
| N-メチル-D-グルカミン | 119 | 195.215 | 6.95 |
| 塩化カリウム | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| リン酸ナトリウム一塩基性 | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| 炭酸水素ナトリウム | 26 | 84.01 | 2.18 |
| ヘペス | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-グルコース | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| 硫酸マグネシウム | 1 | 500 μLの2.0 mストックを使用 | |
| 塩化カルシウム | 2 | 1000 μLの2.0 mストックを使用 | |
| 1. 1 Lの溶液に対して、850 mL ddH2Oに記載されている順序で塩を追加します | |||
| 2. 1 N HClまたはKOHのpHを7.3〜7.4に | |||
| 3. 酸素化物を5〜10分間行い、MgSO4とCaCl2を追加します | |||
| 4.最終ボリュートムをddH2Oで1 Lにし、最終pHを再確認します | |||
| 5.浸透圧計で浸透圧を確認し、300-310 mOsm / kg H2Oに調整します | |||
表3:細胞外記録液の成分一覧。 細胞外記録液の調製に用いる成分及び説明書。
| ケミカル | ミリメートル | メガワット | ミリグラム/50ミリリットル |
| メタンスルホン酸セシウム | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| 塩化セシウム | 15 | 168.36 | 126.3 |
| セシウム-EGTA | 0.4 | 80 μL の 250 mM Cs-EGTA を追加 | |
| 茶クロリド | 5 | 165.705 | 41.4 |
| ヘペス | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-BR | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-グルタチオン | 1 | 307.323 | 15.4 |
| ホスホクレアチンナトリウム | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| マグネシウム-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. 40-45 mL HPLC グレード H2O から始めます。 | |||
| 2.ホスホクレアチン、ATP、GTPを常に氷上に保管してください。 | |||
| 3.表に記載されている順序で材料を追加します | |||
| 4. CsOHでpHを7.3に(約200 μLの2 M CsOH) | |||
| 5.浸透圧計を使用して浸透圧をチェックします。 | |||
| 6. HPLCグレードのH2Oを約285-290 mOsm / kg H2Oの最終浸透圧に加えます | |||
| 7. 500-1000 μLのアリコートを準備し、-80°Cまたは-20°Cで保存します | |||
表4:メタンスルホン酸セシウム細胞内電気生理学溶液の成分のリスト。 メタンスルホン酸セシウム細胞内溶液の調製に使用される成分および説明書。
| ケミカル | ミリメートル | メガワット | ミリグラム/50ミリリットル |
| グルコン酸カリウム | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| 塩化カリウム | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| 塩化ナトリウム | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-バプタ | 0.1 | 80 μLのK-バプタを加える | |
| ヘペス | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-グルタチオン | 1 | 307.323 | 15.4 |
| ホスホクレアチンナトリウム | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| マグネシウム-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| トリス-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. 40-45 mL HPLC グレード H2O から始めます。 | |||
| 2.ホスホクレアチン、ATP、GTPを常に氷上に保管してください。 | |||
| 3.表に記載されている順序で材料を追加します | |||
| 4. KOHでpHを7.3にする(2M KOHの約200μL) | |||
| 5.浸透圧計を使用して浸透圧をチェックします。 | |||
| 6. HPLCグレードのH2Oを約285-290 mOsm / kg H2Oの最終浸透圧に加えます | |||
| 7. 500-1000 μLのアリコートを準備し、-80°Cまたは-20°Cで保存します | |||
表5:グルコン酸カリウム細胞内電気生理学溶液の成分のリスト。 グルコン酸カリウム細胞内溶液の調製に使用される成分および説明書。
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Discussion
上述したように、適切な実験結果を達成するために重要ないくつかの重要なステップがある。このプロトコルは、コカインの自己投与を適切に獲得した動物にのみ有効である可能性が高く、これまでのところ、上記で概説したパラメーターを使用してのみテストされています。コカインの投与量、強化のスケジュール、およびキューパラメータは、行動の結果にほとんど影響を与えずに変更できる可能性がありますが、これは直接テストされていませんが、二次的な強化スケジュールが扁桃体非依存性のコカインシークにつながる可能性があることを除いて、これは直接テストされていません14。.プロトコル全体を通して、光ファイバーの適切な構造と機能を検証することが、光刺激の成功を確実にするのに役立ついくつかのポイントがあります。ヘッドキャップからの損失を防ぐためにフェルールを適切にスコアリングし、光ファイバーを研磨し、インプラントを介した光出力の損失が30%を超えないことをテストする必要があります9。さらに、レーザー刺激パラメータは重要な考慮事項です。レーザーは比較的低出力(5〜7 mW)で操作する必要があります。持続的な低周波刺激はLTDを誘導するために使用され、これは電気生理学的記録でMGN-LAシナプス強度を測定することによって機能的に検証することができます。最後に、結果は、グループあたり10匹の動物の最終的なnでキュー誘発回復の有意な減少を示しましたが、一部の動物は最終分析から除外する必要がある可能性が高いため、実験者はより大きなnから始めることを期待する必要があります。ウイルスや光ファイバーの適切な解剖学的配置と発現を検証し、組織学が確認された動物のデータのみを使用することが重要です。
このプロトコルで観察されたコカイン探索に対する強力な行動効果にもかかわらず、考慮しなければならないいくつかの制限があります。一つには、この方法は、コカインとペアになった単一の視聴覚キューで訓練されたラットでのみテストされています。複数の異なる手がかりが条件付けられたシナリオで何が起こるかは明らかではなく、これは人間の中毒をより正確に表現し、それによって複数の環境刺激が薬物使用と非常に関連しているようになります15,16,17。私たちの研究室からの証拠は、薬物探索を減らす光遺伝学LTDの能力は、薬物キューに関連する記憶を弱めるシナプス強度の低下によるものであることを示しています。しかし、コカインの自己投与に関連しない中立的な記憶がこのプロトコルによってどの程度影響を受ける可能性があるかは明らかではありません。さらに、この方法は1つの回路におけるシナプス強度にのみ影響するが、他の回路も記憶を符号化し、および/またはコカイン探索行動を駆動するために重要であり得る18、19、20。最後に、LTDは、ウイルスが十分に発現しているシナプスでのみ誘導でき、一部のシナプス結合が刺激プロトコルの影響を受けないままになる可能性があり、行動への影響を制限する可能性があることに注意する必要があります。さらに、証拠は、ニューロンとシナプスの小さなアンサンブルのみが特定の記憶のエンコードに関与していることを示唆しており、脳領域全体内でのLTD誘導が行動変化をもたらすための最良の戦略ではないという考えに信憑性を与えますが、ニューロンのキューまたはコンテキスト的にアクティブな集団を特に標的とする他のアプローチが存在します21、22.それにもかかわらず、このプロトコルは、おそらく低周波の光刺激が、コカインとキューのペアリングの繰り返しによって以前に増強されたシナプスへのLTD誘導を制限するため、キュー動機による薬物探索を弱めるのに効果的です4。
このプロトコルは、動物がリアルタイムで行動を行っている間にニューロンの活動が活性化または阻害される、より一般的に使用される光遺伝学的行動研究に大きな進歩をもたらします19,23。代わりに、光遺伝学は、コカイン誘発性可塑性を逆転させるための神経調節ツールとしてここで使用されています。この方法の利点は、光遺伝学的操作が行動テストから独立していることであり、その結果、光遺伝学の潜在的な交絡効果(例えば、局所回路効果、光刺激後の不応期、抗ドロミック刺激効果など)。24は結果に影響を与えるべきではなく、それによって仮説された神経メカニズムが行動の変化を媒介しているという確信を高める。したがって、この方法は、シナプス可塑性、特にLTPで起こるシナプス強度の増加が行動の変化にどのように関連しているかを調査する多くのアプリケーションで利用することができます。同様のアプローチは、機能不全の行動を引き起こす脳内の異常な接続がダウンレギュレーションされる可能性のある神経刺激技術の臨床応用にも関連している可能性があります。同様に、oChIEFウイルス構築物は低周波刺激および高周波刺激の両方に応答するため、記載された実験の範囲を超えてこれらの方法への潜在的な用途がある。例えば、光遺伝学的に誘導されたLTPは、広範囲の神経変性および神経発達障害に見られる可塑性の欠損を逆転させるのに有益である可能性がある25。さらに、MGN-LAシナプスにおける双方向可塑性も、恐怖関連障害に関連する行動の調節に直接関連しています8。
薬物を動機とする行動をサポートする特定の神経回路を調節することは、薬物使用からの長期的な禁欲を確立するために不可欠です。このプロトコルは、in vivoオプトジェネティクスの新たな進歩を利用して、環境合図の存在下でコカインの自己投与を繰り返すことによって強化される正確な神経回路の可塑性を逆転させます。この特定の神経調節の結果、その後の手がかりの再曝露がコカイン探索反応を引き起こす可能性が低下し、物質使用障害の将来の治療法の開発に重要な意味を持つ可能性があります。
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Disclosures
開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、USPHS助成金K01DA031745(MMT)、R01DA042029(MMT)、DA035805(YHH)、F31DA039646(MTR)、T32031111(MTR)、およびペンシルベニア州保健省からの支援に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
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