Summary
Los métodos descritos aquí describen un procedimiento utilizado para revertir optogenéticamente la plasticidad inducida por la cocaína en un circuito conductualmente relevante en ratas. La estimulación óptica sostenida de baja frecuencia de las sinapsis tálamo-amígdala induce depresión a largo plazo (LTD). La LTD inducida optogenéticamente in vivo en ratas experimentadas con cocaína resultó en la posterior atenuación de la búsqueda de drogas motivada por señales.
Abstract
Este protocolo demuestra los pasos necesarios para usar herramientas optogenéticas para revertir la plasticidad inducida por la cocaína en los circuitos tálamo-amígdala para reducir los comportamientos posteriores de búsqueda de cocaína en la rata. En nuestra investigación, descubrimos que cuando las ratas se autoadministran cocaína intravenosa combinada con una señal audiovisual, las sinapsis formadas en las entradas del núcleo geniculado medial del tálamo (MGN) en las neuronas principales de la amígdala lateral (LA) se vuelven más fuertes a medida que se aprende la asociación señal-cocaína. Planteamos la hipótesis de que la reversión de la plasticidad inducida por la cocaína en estas sinapsis reduciría el comportamiento de búsqueda de cocaína motivado por señales. Para lograr este tipo de neuromodulación in vivo, queríamos inducir la depresión sináptica a largo plazo (LTD), que disminuye la fuerza de las sinapsis MGN-LA. Para ello, utilizamos la optogenética, que permite la neuromodulación de los circuitos cerebrales utilizando la luz. La opsina excitatoria oChiEF se expresó en terminales MGN presinápticos en el LA mediante la infusión de un AAV que contenía oChiEF en el MGN. Luego se implantaron fibras ópticas en el LA y se pulsó luz láser de 473 nm a una frecuencia de 1 Hz durante 15 minutos para inducir LTD y revertir la plasticidad inducida por la cocaína. Esta manipulación produce una reducción duradera en la capacidad de las señales asociadas con la cocaína para inducir acciones de búsqueda de drogas.
Introduction
El abuso de sustancias es un problema de salud pública muy grave en los Estados Unidos y en todo el mundo. A pesar de décadas de intensa investigación, hay muy pocas opciones terapéuticas efectivas 1,2. Un revés importante para el tratamiento es el hecho de que el uso crónico de drogas genera recuerdos asociativos a largo plazo entre las señales ambientales y la droga en sí. La reexposición a señales relacionadas con las drogas impulsa respuestas fisiológicas y conductuales que motivan el uso continuo de drogas y la recaída3. Una estrategia terapéutica novedosa es promulgar tratamientos basados en la memoria que tienen como objetivo manipular los circuitos involucrados en la regulación de las asociaciones de señales de drogas. Recientemente, se observó que las sinapsis en la amígdala lateral (LA), específicamente las que surgen del núcleo geniculado medial (MGN) del tálamo, se fortalecen con la autoadministración repetida de cocaína asociada a la señal, y que esta potenciación puede apoyar el comportamiento de búsqueda de cocaína 4,5. Por lo tanto, se propuso que la reincorporación inducida por señales podría atenuarse invirtiendo la plasticidad en las sinapsis MGN-LA.
La capacidad de apuntar con precisión a la plasticidad sináptica de un circuito cerebral específico ha sido un gran desafío para el campo. Las herramientas farmacológicas tradicionales han tenido cierto éxito en la disminución de los comportamientos de recaída, pero están limitadas por la incapacidad de manipular las sinapsis individuales. Sin embargo, el reciente desarrollo de la optogenética in vivo ha proporcionado las herramientas necesarias para superar estas limitaciones y controlar las vías neuronales con precisión temporal y espacial 6,7,8. Al expresar opsinas sensibles a la luz en un circuito cerebral específico, la luz láser se puede usar para activar o inhibir el circuito. La estimulación óptica dependiente de la frecuencia se puede utilizar para manipular específicamente la plasticidad sináptica del circuito en un animal que se comporta.
Este manuscrito describe el procedimiento tomado para manipular el circuito MGN-LA relevante para el comportamiento utilizando optogenética in vivo . En primer lugar, la opsina excitatoria oChIEF se expresó en el MGN y las fibras ópticas se implantaron bilateralmente en el LA. Luego, los animales fueron entrenados para autoadministrarse cocaína de una manera dependiente de la señal, lo que potencia la vía MGN-LA. A continuación, se utilizó estimulación sostenida de baja frecuencia con luz láser de 473 nm para producir LTD específico para el circuito. Revertir la plasticidad inducida por el consumo de cocaína generó una reducción duradera en la capacidad de las señales para desencadenar acciones que están asociadas con el comportamiento de búsqueda de drogas.
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Protocol
Los experimentos descritos en este protocolo fueron consistentes con las pautas establecidas por la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh. Todos los procedimientos se realizaron con ratas Sprague-Dawley adultas e ingenuas que pesaban 275-325 g a su llegada.
1. Construcción de implantes de fibra óptica y cables de conexión
- Preparar los implantes de fibra óptica siguiendo los protocolos publicados anteriormente9. Los experimentos descritos en este protocolo utilizaron fibra de núcleo de 200 μm (0,5 NA) y virola cerámica LC/PC multimodo de Ø1,25 mm, tamaño de orificio de Ø230 μm.
- Use una herramienta Dremel para puntuar el tercio inferior de una virola (más cercano al extremo plano de la virola). La puntuación de las virolas les ayuda a mantenerse unidos al cemento dental, lo que aumenta la probabilidad de que permanezcan seguros durante toda la experimentación.
- Use cortadores de alambre para cortar ~ 35 mm de fibra. Use la herramienta de extracción de fibra para pelar ~ 25 mm de fibra, dejando 10 mm sin exponer.
- Prepare epoxi curable por calor de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Disuelva 1 g de polvo de resina en 100 mg de compuesto endurecedor. Coloque una aguja roma de calibre 25 a una jeringa de 1 ml. Llene la jeringa con epoxi y coloque una punta de aguja roma de calibre 25.
- Use un vicio o abrazadera para sujetar firmemente la virola con el lado plano hacia arriba y el lado convexo hacia abajo. Con la jeringa llena de epoxi, agregue una gota de epoxi al lado plano de la virola, teniendo cuidado de limpiar el exceso de epoxi de los lados de la virola.
- Inserte la porción pelada de fibra a través de la virola dejando expuestos 5 mm adicionales de fibra pelada. En el caso de los implantes LA, la fibra se implantará 7,9 mm ventral a bregma, por lo que la longitud expuesta de la fibra sin pelar debe ser ~ 13 mm.
- Cura el epoxi con una pistola de calor durante unos 30-40 s hasta que se vuelva de color negro / ámbar.
- Marque la fibra directamente en la interfaz del extremo convexo de la virola con un cuchillo de diamante y use un dedo para golpear suavemente la fibra.
- Pule el extremo convexo de la virola sosteniendo con un hemostático, asegurándose de aplicar una presión uniforme y haciendo 20 rotaciones circulares cada una en una serie de papel de pulir (de alto grado a bajo grado; 5, 3, 1, 0.3 μm).
- Asegure la fibra sin pelar a la mesa con cinta adhesiva y puntúe la fibra pelada, dejando 2 mm adicionales más allá de la coordenada ventral (para los implantes LA, la longitud final de la fibra es ~ 10 mm). Use un hemostático para tirar de la virola y romper uniformemente la fibra donde se ha marcado. Tenga cuidado de no cortar la fibra por completo al puntuar, o de lo contrario el núcleo de la fibra se dañará.
- Construya cables de conexión que sean compatibles con implantes de fibra óptica. Se compraron cables de conexión diseñados a medida (consulte la Tabla de materiales). Alternativamente, los cables de conexión se pueden construir siguiendo los protocolos9 publicados anteriormente.
NOTA: El diámetro y la NA de la fibra de virola y la fibra del cable de conexión deben coincidir en la unión de acoplamiento para evitar la pérdida excesiva de luz, lo que puede resultar en una falla para estimular suficientemente la actividad neuronal. - Mida la salida de luz a través del cable de conexión y los implantes de fibra óptica conectando el cable de conexión/fibra óptica a una fuente de luz láser adecuada (473 nm, salida de 1 mW) y midiendo la salida con un sensor de luz. Una fibra construida con éxito emitirá un círculo concéntrico de luz y no tendrá más del 30% de pérdida de luz.
2. Cateterismo intravenoso de roedores, administración de virus e implantación de fibra óptica
- Preparar al animal para la cirugía.
- Anestesiar completamente a las ratas con anestesia de elección basada en pautas institucionales. Una opción es clorhidrato de ketamina (87,5-100 mg/kg, m.i.) y clorhidrato de xilazina (5 mg/kg, m.i.). Asegúrese de que la rata esté completamente anestesiada comprobando la falta de un reflejo de pellizco del dedo del pie.
PRECAUCIÓN: La ketamina es una sustancia controlada que debe manejarse de acuerdo con las pautas institucionales.
NOTA: La inyección intramuscular de anestésicos se utiliza en este estudio, ya que produjo una inducción de anestesia más rápida y confiable que la inyección intraperitoneal. Controle continuamente la respiración y la capacidad de respuesta de la rata y proporcione soporte térmico durante toda la cirugía. - Afeite un área grande de la espalda de la rata (parte superior de la espalda desde justo por encima de los omóplatos hasta la mitad de la espalda), así como el área del cuello debajo de la extremidad anterior derecha y el cuero cabelludo.
- Coloque la rata en el área quirúrgica y aplique puralube (lágrimas artificiales) en los ojos. Inyecte un volumen de peso corporal de carprofeno (analgésico) por vía subcutánea (s.c.) a través de la piel de la parte superior de la espalda, luego inyecte 5 ml de solución de Ringer lactato s.c. a través de la piel de la espalda baja.
- Desinfecte todos los sitios quirúrgicos humedeciendo un trozo de gasa estéril con betadine y limpiándolo en el área quirúrgica afeitada con un movimiento circular. Luego repita el proceso con etanol al 70%. Repita este ciclo alterno tres veces.
- Anestesiar completamente a las ratas con anestesia de elección basada en pautas institucionales. Una opción es clorhidrato de ketamina (87,5-100 mg/kg, m.i.) y clorhidrato de xilazina (5 mg/kg, m.i.). Asegúrese de que la rata esté completamente anestesiada comprobando la falta de un reflejo de pellizco del dedo del pie.
- Realizar la implantación de catéter intravenoso de acuerdo con protocolos previamente publicados 4,10.
NOTA: No se utiliza un paño quirúrgico durante esta cirugía para evitar la irritación durante la implantación del catéter. Esterilice todos los instrumentos y equipos antes de usarlos. Use guantes estériles y cámbielos si entra en contacto alguna superficie no estéril. - Inmediatamente después de los implantes del catéter, asegure a la rata en un marco estereotáxico para realizar inyecciones de AAV.
- Administrar una inyección subcutánea (s.c) de lidocaína al 2% (0.2-0.3 ml) en el cuero cabelludo como anestésico local.
NOTA: No se utiliza anestesia local durante la implantación del catéter intravenoso para evitar alteraciones en los resultados quirúrgicos. - Conecte una cánula de inyección de acero inoxidable calibre 26 a una jeringa Hamilton llena de 1 μL de solución AAV concentrada: AAV5-hSyn-tdTomato o AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
NOTA: oChIEF es una variante de la opsina canalrodopsina sensible a la luz azul (ChR2), que puede responder a una amplia gama de frecuencias 8,11, y por lo tanto tiene utilidad para los experimentos LTD de baja frecuencia discutidos en este protocolo, pero también para experimentos LTP de alta frecuencia (no discutidos aquí). La construcción oChIEF fue donada por el Dr. Roger Tsien y procesada para su envasado y purificación por el Duke Viral Vector Core. Se necesitan al menos 3-4 semanas entre el día de la inyección y el día de la inducción de LTD para permitir una expresión óptima del virus en los terminales del axón MGN.
PRECAUCIÓN: En general, el AAV se considera un organismo de nivel de bioseguridad 1 (BSL-1), con bajo riesgo de autoinfección a menos que se use un virus auxiliar en su producción. Su uso requiere la aprobación de IACUC y se debe usar el EPP adecuado en todo momento de acuerdo con las pautas institucionales para limitar la exposición innecesaria. - Usando un bisturí, haga una incisión de 0,5 mm desde la parte frontal hacia la parte posterior del cráneo y retire el tejido suprayacente para exponer la superficie del cráneo.
- Nivelar la cabeza de la rata en el eje anterior/posterior y cero coordenadas estereotáxicas a bregma.
- Perfore tres pequeños agujeros a través del cráneo con una herramienta Dremel equipada con una pequeña broca. Use un destornillador para montar firmemente los tornillos de acero inoxidable (M2x4 965-A2) en su lugar.
NOTA: Los tornillos son necesarios para la unión adecuada del cemento dental y la creación de tapas de cabeza resistentes y duraderas. La posición de los tornillos debe extenderse a través del eje anterior-posterior del cráneo y lejos del sitio de inyección de AAV. - Perforar agujeros bilaterales para inyección de AAV basados en las coordenadas del Atlas Cerebral de Rata (Watson y Paxinos)12 para la porción medial del núcleo geniculado medial (MGN); en mm de bregma, AP: -5.4; ML: ±3,0; DV: -6.6. Baje lentamente las cánulas de inyección (4 mm/min) hasta colocarlas en el MGN. Inyecte la solución concentrada de AAV a una velocidad de 0,1 μL/min.
- Deje la cánula de inyección en su lugar durante 5 minutos después de que se completen las infusiones para permitir la difusión lejos de la cánula y luego retire lentamente la cánula del cerebro.
- Administrar una inyección subcutánea (s.c) de lidocaína al 2% (0.2-0.3 ml) en el cuero cabelludo como anestésico local.
- Inmediatamente después de las inyecciones de virus, continúe implantando fibras ópticas 4,9 dirigidas a terminales MGN-LA.
- Utilice una herramienta Dremel para perforar agujeros bilaterales para implantes de fibra óptica dirigidos a la amígdala lateral (en mm de bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
- Use fórceps para agarrar la virola del implante de fibra óptica y fijarla a los adaptadores estereotáxicos para que se mantengan firmemente en su lugar.
- Baje lentamente las fibras a una velocidad de 2 mm/min, hasta que la punta de la fibra se asiente en la porción dorsal del LA (DV: -7.9 mm).
- Asegure las virolas al cráneo primero con una capa delgada de adhesivo instantáneo Loctite seguido de cemento dental y virolas de cubierta con fundas de virola de 1,25 mm de diámetro y cubiertas antipolvo.
NOTA: La elección del adhesivo para asegurar las virolas al cráneo debe ser aprobada por el comité local o institucional de cuidado y uso de animales. Loctite se utiliza para este estudio para asegurar de manera confiable las virolas al cráneo después de prueba y error con múltiples adhesivos; sin embargo, se pueden considerar las alternativas disponibles.
- Después de los procedimientos quirúrgicos, aloje ratas individualmente y proporcione acceso gratuito a alimentos y agua. Proporcionar atención postoperatoria consistente con las pautas institucionales. Enjuague los catéteres diariamente con solución salina que contenga gentamicina (5 mg/ml) y heparina (30 USP/ml) para mantener la permeabilidad. Al menos 5 días después de la cirugía y 24 h antes del inicio de los experimentos conductuales, los alimentos restringen a las ratas a ~ 90% de su peso de alimentación libre.
3. Autoadministración de cocaína de roedores y extinción de palanca instrumental
NOTA: Todos los procedimientos conductuales se llevan a cabo en cámaras de acondicionamiento operante estándar, equipadas con dos palancas retráctiles en una pared, una luz de estímulo sobre cada palanca, un generador de tonos, una luz de la casa y una bomba de infusión.
- Someter a las ratas a sesiones diarias de entrenamiento de autoadministración de 1 hora de cocaína (2 mg / ml) bajo un programa de refuerzo FR1.
- Coloque a las ratas en la cámara operante todos los días y permita que las ratas presionen la palanca. Una presión en la "palanca activa" designada (contrapesada a través de las palancas izquierda y derecha) da como resultado una infusión de cocaína (1,0 mg / kg / infusión) y una presentación de 10 s de una señal compuesta de luz y tono. Una pulsación en la "palanca inactiva" designada no tiene efectos programados.
- Continuar los experimentos de autoadministración durante al menos 10 días y hasta que las ratas ganen con éxito al menos 8 infusiones / día durante 3 días consecutivos. Si no se alcanzan los criterios de adquisición para el día 20, se excluye del estudio.
- Después de que los criterios de adquisición se cumplan con éxito, someta a las ratas a sesiones de extinción instrumental de 1 h durante 6-10 días.
- Coloque a las ratas en cámaras operantes y permita que las ratas presionen libremente. Sin embargo, las respuestas tanto en las palancas activas como en las inactivas no tienen consecuencias programadas.
- Haga que las ratas continúen la extinción instrumental diariamente hasta que ocurra un promedio de < 25 prensas de palanca durante dos días consecutivos.
4. Inducción optogenética in vivo de LTD
NOTA: Los experimentos de inhibición optogenética tienen lugar 24 h después del último día de extinción instrumental.
- Conecte los cables de conexión a un diodo láser azul de 473 nm a través de una junta giratoria suspendida sobre una jaula de alojamiento de roedores limpia y estándar con la cubierta retirada. Esta configuración permite que los roedores se muevan libremente alrededor de la jaula durante la estimulación optogenética.
- Encienda el diodo láser de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento y conéctelo a un generador de impulsos. Ajuste la configuración, de modo que cuando se encienda, la rata reciba 900 pulsos de luz de 2 ms a 1 Hz.
PRECAUCIÓN: Se debe usar protección ocular adecuada en todo momento mientras se opera el láser. - Mida la intensidad de la luz a través del cable de conexión con un sensor de luz. Ajuste la intensidad del láser para que la salida de luz a través del cable de conexión sea ~ 5-7 mW.
- Coloque a las ratas en una jaula de alojamiento limpia. Retire las cubiertas antipolvo y las mangas de virola, exponiendo las virolas. Conecte los cables de conexión bilateralmente a los implantes de fibra óptica. Permita que las ratas exploren el medio ambiente durante 3 minutos antes de la inducción de LTD.
- Encienda el generador de pulsos para iniciar la estimulación optogenética.
NOTA: Aunque es poco probable, si la rata experimenta alguna reacción adversa a la estimulación, el experimento se termina inmediatamente y las ratas son sacrificadas adecuadamente según las pautas institucionales. - Después de la inducción de LTD, mantenga a las ratas en la jaula durante 3 minutos y luego vuelva a colocarlas en sus jaulas domésticas.
- Para experimentos de control, use el mismo procedimiento de estimulación en ratas que expresan el virus de control AAV5-tdTomato. Para experimentos simulados, conecte un cable de conexión a la fibra óptica de las ratas que expresan el virus AAV5-oChIEF, pero no se administra estimulación durante una sesión de 15 minutos.
5. Probar el efecto de la estimulación optogenética en la búsqueda de cocaína inducida por señales
- 24 h después de las estimulaciones optogenéticas in vivo, coloque a las ratas de nuevo en cámaras de condicionamiento operantes. Las ratas son sometidas a una sesión de reincorporación inducida por señales estándar de 1 hora para evaluar el comportamiento de búsqueda de cocaína.
NOTA: Durante el restablecimiento inducido por la señal, una respuesta en la palanca activa produce una presentación de 10-s de la señal asociada a la cocaína, pero no infusiones de cocaína. - Realizar una segunda prueba de restablecimiento al menos 1 semana después de la primera prueba para determinar si la inducción optogenética de LTD resulta en una supresión a largo plazo de la búsqueda de cocaína
6. Tinción, fluorescencia e imágenes para la verificación histológica de la expresión viral y la colocación de la fibra óptica
- Hacer 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y paraformaldehído al 4% (PFA). Almacene ambas soluciones en hielo. El volumen total dependerá del número de ratas en el estudio (~ 100 ml de PBS y 200 ml de PFA se utilizarán por rata).
PRECAUCIÓN: El PFA es un químico tóxico y carcinógeno conocido. Tenga el cuidado adecuado para evitar la inhalación, así como el contacto con la piel. Su uso y eliminación deben estar de acuerdo con las directrices institucionales, incluido el uso de EPP adecuado y una campana de flujo químico. - Instale la bomba peristáltica a un caudal de 20 mL/min. Llene la tubería de la bomba con 1x PBS. Coloque una aguja roma de calibre 20 en el extremo del tubo.
- Anestesiar profundamente a las ratas con pentobarbital sódico (100 mg/kg, i.p.). Confirme la profundidad de la anestesia por falta de respuesta al pellizco del dedo del pie antes de continuar.
NOTA: El pentobarbital sódico se utiliza ya que la perfusión es un procedimiento terminal. - Use tijeras quirúrgicas para abrir la cavidad abdominal de la rata debajo del diafragma. Corte a través de la caja torácica rostralmente a lo largo de los bordes laterales para exponer el corazón de la rata. Use hemostático para sujetar la porción rostral de la caja torácica lejos del corazón. Cortar cualquier tejido graso suprayacente que rodea el corazón.
- Inserte la aguja embotada a través del ventrículo izquierdo y hasta la aorta. Corte un pequeño orificio en la aurícula derecha para drenar la solución a medida que regresa al corazón.
- Perfundir cada rata con 1x PBS durante 5 min seguido de 4% PFA, pH 7.4 durante 10 min.
- Decapitar a la rata, extraer el cerebro y posfijarlo en PFA al 4% durante 24 h. Luego transfiera el cerebro a una solución de sacarosa al 30% durante 2-3 días.
- Sección de cerebros a 50 μm usando un criostato.
- Monte todas las rodajas que contengan LA o MGN en portaobjetos de vidrio y cubreobjetos.
- Cortes de imágenes utilizando un microscopio epifluorescente para verificar la expresión de AAV-oChIEF-tdTomato en el MGN y sus proyecciones al LA, así como la colocación de la fibra óptica por encima del LA.
7. Perfusión y preparación de corte cerebral agudo para experimentos de electrofisiología
NOTA: Los experimentos electrofisiológicos se realizan en un subconjunto de animales para validar el éxito de in vivo LTD.
- Preparar soluciones electrofisiológicas utilizando los reactivos enumerados en las Tablas 1-3 4,13. Ajustar el pH de todas las soluciones a 7,4 con HCl y ajustar la osmolaridad a 300-310 mOsm/kgH2O. Preparar las soluciones frescas antes de los experimentos y almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 semana. Sature todas las soluciones con carbógeno (95% O 2/5% CO2) en todo momento durante el uso.
- Usando isoflurano de acuerdo con las pautas locales o institucionales de cuidado y uso de animales, anestesiar profundamente a la rata en una cámara de eutanasia cerrada. Confirme que el animal está completamente anestesiado a través del reflejo de pellizco del dedo del pie.
- Llene un vaso de precipitados pequeño con 50 ml de solución de corte helada. Llene el tubo de la bomba peristáltica con solución y ajuste el caudal a 20 ml / min. Coloque una aguja roma de calibre 20 en el extremo del tubo.
- Abrir la cavidad abdominal (ver pasos 6.4 y 6.5) y perfundir brevemente la rata con solución cortante (máximo 1-2 min).
- Después de la perfusión, decapitar inmediatamente a la rata. Extraer el cerebro y colocarlo en un vaso de precipitados pequeño lleno de solución de corte a 4 °C durante 30 s-1 min.
- Transfiera cerebros con una espátula y fíjelos rápidamente a la cámara de un vibratomo. Retire la pia con pinzas finas. Llenar la cámara con una solución de corte a 4 °C y preparar cortes coronales agudos (250 μm de espesor) de la amígdala a una velocidad de 0,37 mm/seg y una frecuencia de 70 Hz.
- A medida que se obtienen las rodajas, colocar cada una en una cámara de retención llena de solución de corte e incubar a 37 °C durante 10-12 min. Se pueden obtener alrededor de 5-7 rebanadas que contienen el LA por animal.
- Transfiera las rodajas a un vaso de precipitados de solución de retención a temperatura ambiente (RT) y deje que se recuperen durante >30 minutos antes de la experimentación.
NOTA: Las rodajas generalmente permanecen saludables mientras se mantienen en solución de retención durante 4-6 h. Debido a la naturaleza fluorescente del AAV, las rebanadas se mantienen en condiciones de poca luz.
8. Registros electrofisiológicos ex vivo
- Preparar soluciones intracelulares utilizando los reactivos enumerados en las Tablas 4-5.
NOTA: Las soluciones intracelulares deben prepararse antes de los experimentos y pueden almacenarse a largo plazo (3-12 meses) a -80 °C o a corto plazo (1-2 meses) a -20 °C. Las soluciones tienen un pH ajustado a 7,3 (con CsOH para la solución intracelular basada en Cs y con KOH para la solución intracelular basada en K). Ajustar a una osmolaridad final de 290-300 mOsm/kgH2O. - Preparar una solución madre de picrotoxina de 500 mM disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO).
NOTA: Las cepas de piperotoxinas se alícotizan y almacenan a -20 °C. El día de su utilización, las alícuotas se descongelan y se añaden a la solución de registro hasta una concentración final de 100 μM.
PRECAUCIÓN: La piperotoxina es un antagonista no competitivo de los receptoresGABA A , por lo que la infusión de picrotoxina tiene un efecto estimulante. Es severamente tóxico por ingestión oral o absorción de la piel. Se debe usar el EPP adecuado en todo momento cuando se trabaja con picrotoxina. - Transfiera los cortes a un microscopio vertical diseñado para experimentos de electrofisiología.
- Durante los experimentos, el baño perfunde continuamente las rodajas con una solución de grabación que se calienta a 31-33 °C.
- Magnifica el LA usando un objetivo 4x. Identifique las neuronas principales por morfología con una lente de inmersión en agua 40x.
- Utilice una pipeta de vidrio (3-5 MΩ) llena con una solución intracelular basada en Cs (para experimentos de pinza de voltaje) o una solución intracelular basada en K (para experimentos de pinza de corriente) para obtener registros de pinza de parche de células enteras.
- Identificar proyecciones axonales de MGN infectadas con AAV bajo fluorescencia (utilizando un filtro RFP). Estimule las proyecciones utilizando un láser DPSS de luz azul (473 nm) conectado a un generador de pulsos.
PRECAUCIÓN: Para limitar la exposición al láser, la luz láser colimada se acopla a un puerto fluorescente en el microscopio y se enfoca en el corte a través del objetivo.
NOTA: En el modo de pinza de voltaje, las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSC) se evocan ópticamente a 0.1 Hz. Las neuronas que reciben entradas de neuronas MGN infectadas con AAV exhibirán EPSC confiables. - Para inducir LTD ex vivo , en modo de pinza actual, registre una línea de base estable de potenciales postsinápticos excitatorios (EPSP) durante al menos 10 min. A continuación, proporcione 900 pulsos de 2 ms de luz de 473 nm a una frecuencia de 1 Hz (tiempo total = 15 min). A continuación, grabe continuamente EPSP a 0,1 Hz durante ≥60 min.
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Representative Results
En la Figura 1 se muestra una línea de tiempo que describe el orden de los experimentos. A lo largo de los experimentos conductuales, el número de infusiones de cocaína, así como el número de respuestas realizadas en la palanca activa sirve como una medida de la intensidad del comportamiento de búsqueda de cocaína. Durante los primeros días de autoadministración de cocaína, el número de respuestas activas debe aumentar gradualmente a lo largo de cada día de adquisición, antes de estabilizarse durante la segunda semana. Por el contrario, las respuestas de palanca inactivas deben permanecer bajas durante todo el experimento (Figura 2A). En el primer día de extinción instrumental, generalmente hay un aumento en el número de respuestas de palanca activas, ya que la ausencia inesperada de cocaína resulta en la escalada del comportamiento de búsqueda de cocaína. Sin embargo, esta respuesta disminuirá gradualmente con sesiones posteriores a medida que las ratas aprendan la nueva contingencia, lo que resultará en un número bajo y estable de respuestas de palanca activa dentro de 6-10 d (Figura 2B). Las ratas que no alcanzan los criterios de adquisición especificados en las fases de autoadministración o extinción instrumental del experimento se eliminan del estudio, y los datos no se incluyen en el análisis final.
Después de la extinción instrumental, la reexposición a señales asociadas a la cocaína restablece el comportamiento de búsqueda de cocaína, lo que resulta en un aumento en el número de respuestas de palanca activas. Este aumento se observa en ambos grupos de experimentos de control: ratas que fueron inyectadas con virus que carecían de oChIEF (control AAV) y ratas que no recibieron estimulación láser (control SHAM; Figura 3A) Sin embargo, la LTD optogenéticain vivo de los terminales MGN-LA causó una reducción en la posterior búsqueda de cocaína inducida por señales. 24 h después de la inducción optogenética de LTD, el número de prensas de palanca activas se redujo significativamente en relación con los controles AAV y los controles SHAM (Figura 3A). Este bajo nivel de respuesta se mantuvo durante una prueba de restablecimiento posterior 7 días después (realizada en un subconjunto de ratas) (Figura 3B), lo que indica una reducción persistente en la búsqueda de cocaína motivada por señales a través de múltiples pruebas de restablecimiento.
Los registros electrofisiológicos ex vivo de animales expuestos a estimulación óptica confirmaron que la atenuación en la reincorporación se debía, al menos en parte, a una modulación de la plasticidad sináptica de MGN-LA. Esto se evidenció por una disminución en la amplitud EPSC evocada ópticamente en las neuronas LA después de la exposición a LTD óptica (Figura 4A). Esta atenuación en la amplitud de EPSC fue específica para las neuronas que recibieron estimulación óptica, ya que la amplitud de EPSC permaneció sin cambios en los controles SHAM. Además, LTD no pudo generarse en cortes de ratas que ya habían recibido estimulación óptica in vivo, pero se evocó de manera confiable en neuronas de ratas que se sometieron a estimulación SSIMULADA, como lo demuestra una reducción sostenida en la pendiente de elevación de EPSP (Figura 4B). Por lo tanto, la estimulación óptica in vivo parece ocluir una mayor inducción de LTD en corte. Durante la grabación, es importante medir la resistencia en serie a lo largo de la duración de la grabación para garantizar el mantenimiento de la salud del parche. Las células con un cambio en la resistencia en serie superior al 20% no se aceptan para el análisis de datos. Esto es especialmente importante para los experimentos LTD que duran >60 minutos, ya que los cambios en la resistencia en serie pueden influir en la dinámica del receptor y del canal. Para garantizar que los aferentes estimulados durante los registros electrofisiológicos se originen en el MGN, es importante recolectar cortes a través de la extensión del tálamo. Esto sirve como validación de que los cuerpos celulares del MGN expresan fluorescentemente AAV. Además de la confirmación visual, también es necesaria la validación funcional. En condiciones de pinza actual, las neuronas MGN infectadas con AAV-oChIEF disparan potenciales de acción en respuesta a frecuencias altas y bajas de estimulación de luz de 473 nm (Figura 4C).
Todos los resultados conductuales se consideraron provisionales hasta que se verificó histológicamente la expresión viral y los implantes de fibra óptica y se confirmó la colocación adecuada (Figura 5). La falta de expresión de AAV en el MGN o LA y / o aquellos en los que las fibras ópticas no se colocaron correctamente dentro del LA dorsal se excluyeron del análisis experimental, pero en algunos casos pueden incluirse como un control anatómico negativo.
Figura 1: Cronología del procedimiento experimental. Un resumen de los pasos críticos del protocolo, incluido el curso de tiempo secuencial y la duración de cada fase experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Adquisición y extinción de la autoadministración de cocaína. (A) Los animales exhiben un número creciente de infusiones de cocaína y respuestas de palanca activa a través de la adquisición, y un bajo nivel de respuestas de palanca inactivas. (B) Después de un impulso inicial en el prensado de la palanca en el día 1 de la extinción, los animales disminuyen la respuesta en las palancas activas e inactivas a un nivel bajo y estable. Barras de error, media ±SEM. Esta cifra ha sido modificada de Rich et al. 20194. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La LTD optogenética in vivo atenúa la reincorporación inducida por la señal. (A) Optical LTD causa una reducción significativa en las prensas de palanca activas durante el restablecimiento en relación con los animales que recibieron virus de control o estimulación de control SHAM. ANOVA bidireccional, efecto principal del grupo (F(2,27) = 7,04, P = 0,004) y una interacción del grupo x día (F(2,27) = 8,08, P = 0,002); Análisis post hoc de Bonferroni: ***p < .001. (B) 7 días después, las ratas se sometieron a una segunda prueba de restablecimiento, revelando una reducción significativa en el prensado de palanca activa en animales que previamente se sometieron a MGN-LA LTD en relación con los controles simulados. ANOVA bidireccional, efecto principal del grupo (F(1,32) = 5,04, P = 0,032), interacción significativa (F(1,32) = 7,69, P = 0,009); Análisis post hoc de Bonferroni, **p < .01. Barras de error, media ±SEM, n en barras, número de ratas. Esta cifra ha sido modificada de Rich et al. 20194. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Validación funcional de la estimulación optogenética de baja frecuencia in vivo (A) In vivo dual hemisphere LTD de sinapsis MGN-LA atenúa la amplitud EPSC en relación con los controles SHAM (prueba t no pareada, t (10) = 2.73, * P = .021). Recuadro: Trazas EPSC promedio de muestra evocadas a Erev-70 mV. Barras de escala: 50 ms, 200 pA, n en barras, número de ratas (neuronas). (B) La inducción óptica in vivo de LTD ocluye ex vivo LTD. 24 h después de la inducción in vivo de LTD, se prepararon cortes de amígdala y se aplicó el mismo protocolo de estimulación. La pendiente de elevación de EPSP en los terminales MGN-LA se redujo mediante estimulación óptica ex vivo en neuronas de animales que habían recibido estimulación SHAM in vivo, pero no en neuronas de animales que habían recibido in vivo optical LTD. n en cursiva, número de neuronas. (C) Muestrear los registros actuales de pinzas de neuronas MGN infectadas con AAV-oChIEF. Los potenciales de acción fueron provocados por la estimulación de luz azul (5-100 Hz). Barras de escala: 100 ms, 40 mV. Barras de error, media ±SEM. Esta cifra ha sido modificada de Rich et al. 20194. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Verificación histológica de la expresión viral y la colocación de fibras ópticas. (A ) Imágenes microscópicas representativas que muestran la expresión de DAPI y AAV-oChIEF-tdTomato en LA (izquierda) y MGN (derecha). Barra de escala: 2 mm. ( B ) Esquema que muestra la inyección de AAV-oChIEF-tdTomato y en toda la extensión anterior-posterior del LA (izquierda) y MGN (derecha), y colocaciones de fibra óptica en el LA. El sombreado rojo oscuro muestra la representación de la propagación del virus más pequeña aceptable, y el sombreado rosa claro muestra la representación de la propagación aceptable más grande. Los círculos azules corresponden a la colocación exitosa de fibra óptica en ambos hemisferios. Los círculos negros corresponden a la colocación exitosa de fibra óptica en un solo hemisferio. La "X" negra corresponde a la colocación fallida de la fibra. Para ser incluidas en el análisis final, las ratas requirieron la expresión viral de doble hemisferio en el LA, así como la colocación exitosa de fibras. Las coordenadas están en mm, posteriores a bregma. Esta cifra ha sido modificada de Rich et al. 20194. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Químico | milímetro | MW | g/1000 ml |
| N-metil-D-glucamina | 92 | 195.215 | 17.96 |
| Cloruro de potasio | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Fosfato de sodio monobásico | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bicarbonato de sodio | 30 | 84.01 | 2.52 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glucosa | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Ascorbato de sodio | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Tiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Piruvato de sodio | 3 | 110 | 0.33 |
| Sulfato de magnesio | 10 | Utilice 5,0 ml de stock de 2,0 m | |
| Cloruro de calcio | 0.5 | Utilice 250 μL de material de 2,0 m | |
| 1. Para 1 L de solución, añadir sales en el orden indicado a 850 mL ddH2O | |||
| 2. pH con HCl concentrado a 7.3-7.4 (NMDG hace una solución básica) | |||
| 3. Oxigenar durante 5-10 min y luego añadir MgSO4 y CaCl2 | |||
| 4. Llevar la voluta final a 1 L conddH2Oy comprobar el pH final | |||
| 5. Compruebe la osmolaridad con el osmómetro y ajuste a 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabla 1: Lista de ingredientes para solución de corte extracelular. Ingredientes e instrucciones utilizados para la preparación de la solución de corte extracelular a base de NMDG.
| Químico | milímetro | MW | g/1000 ml |
| N-metil-D-glucamina | 86 | 195.215 | 5.03 |
| Cloruro de potasio | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Fosfato de sodio monobásico | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bicarbonato de sodio | 35 | 84.01 | 2.94 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glucosa | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Ascorbato de sodio | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Tiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Piruvato de sodio | 3 | 110 | 0.33 |
| Sulfato de magnesio | 1 | Utilice 500 μL de material de 2,0 m | |
| Cloruro de calcio | 2 | Utilice 1000 μL de material de 2,0 m | |
| 1. Para 1 L de solución, añadir sales en el orden indicado a 850 mL ddH2O | |||
| 2. pH con 1 N HCl o KOH a 7.3-7.4 | |||
| 3. Oxigenar durante 5-10 min y luego añadir MgSO4 y CaCl2 | |||
| 4. Llevar la voluta final a 1 L conddH2Oy comprobar el pH final | |||
| 5. Compruebe la osmolaridad con el osmómetro y ajuste a 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabla 2: Lista de ingredientes para la solución de retención extracelular. Ingredientes e instrucciones utilizados para la preparación de la solución de retención extracelular.
| Químico | milímetro | MW | g/1000 ml |
| N-metil-D-glucamina | 119 | 195.215 | 6.95 |
| Cloruro de potasio | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Fosfato de sodio monobásico | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bicarbonato de sodio | 26 | 84.01 | 2.18 |
| HEPES | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-glucosa | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| Sulfato de magnesio | 1 | Utilice 500 μL de material de 2,0 m | |
| Cloruro de calcio | 2 | Utilice 1000 μL de material de 2,0 m | |
| 1. Para 1 L de solución, añadir sales en el orden indicado a 850 mL ddH2O | |||
| 2. pH con 1 N HCl o KOH a 7.3-7.4 | |||
| 3. Oxigenar durante 5-10 min y luego añadir MgSO4 y CaCl2 | |||
| 4. Llevar la voluta final a 1 L conddH2Oy comprobar el pH final | |||
| 5. Compruebe la osmolaridad con el osmómetro y ajuste a 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabla 3: Lista de ingredientes para la solución de grabación extracelular. Ingredientes e instrucciones utilizados para la preparación de la solución de registro extracelular.
| Químico | milímetro | MW | mg/50 ml |
| Metanosulfonato de cesio | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| Cloruro de cesio | 15 | 168.36 | 126.3 |
| Cesio-EGTA | 0.4 | Añadir 80 μL de 250 mM Cs-EGTA | |
| Cloruro de té | 5 | 165.705 | 41.4 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-BR | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-glutatión | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Fosfocreatina de sodio | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. Comience con 40-45 ml de HPLC gradoH2O | |||
| 2. Mantenga la fosfocreatina, ATP y GTP en hielo en todo momento. | |||
| 3. Agregue los ingredientes en el orden indicado en la tabla | |||
| 4. pH a 7.3 con CsOH (aproximadamente 200 μL de 2 M CsOH) | |||
| 5. Use el osmómetro para verificar la osmolaridad. | |||
| 6. Agregue H2O de grado HPLC a una osmolaridad final de aproximadamente 285-290 mOsm / kg H2O | |||
| 7. Preparar alícuotas de 500-1000 μL y conservar a -80 °C o -20 °C | |||
Tabla 4: Lista de ingredientes para la solución electrofisiológica intracelular de metanosulfonato de cesio. Ingredientes e instrucciones utilizados para la preparación de la solución intracelular de metanosulfonato de cesio.
| Químico | milímetro | MW | mg/50 ml |
| Gluconato de potasio | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| Cloruro de potasio | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| Cloruro de sodio | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-BAPTA | 0.1 | Añadir 80 μL de K-BAPTA | |
| HEPES | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-glutatión | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Fosfocreatina de sodio | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| Tris-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. Comience con 40-45 ml de HPLC gradoH2O | |||
| 2. Mantenga la fosfocreatina, ATP y GTP en hielo en todo momento. | |||
| 3. Agregue los ingredientes en el orden indicado en la tabla | |||
| 4. pH a 7.3 con KOH (aproximadamente 200 μL de 2 M KOH) | |||
| 5. Use el osmómetro para verificar la osmolaridad. | |||
| 6. Agregue H2O de grado HPLC a una osmolaridad final de aproximadamente 285-290 mOsm / kg H2O | |||
| 7. Preparar alícuotas de 500-1000 μL y conservar a -80 °C o -20 °C | |||
Tabla 5: Lista de ingredientes para la solución electrofisiológica intracelular de gluconato de potasio. Ingredientes e instrucciones utilizados para la preparación de la solución intracelular de gluconato de potasio.
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Discussion
Como se describió anteriormente, hay varios pasos críticos que son importantes para lograr los resultados experimentales adecuados. Es probable que el protocolo solo sea efectivo en animales que adquieran adecuadamente la autoadministración de cocaína, y hasta la fecha, solo se ha probado utilizando los parámetros descritos anteriormente. Es posible que la dosis de cocaína, el programa de refuerzo y los parámetros de señal puedan modificarse con probablemente poco efecto sobre los resultados conductuales, con la excepción de que un programa de refuerzo de segundo orden puede conducir a la búsqueda de cocaína independiente de la amígdala que podría reducir la eficacia del procedimiento, aunque esto no se ha probado directamente14 . Hay varios puntos a lo largo del protocolo donde validar la correcta construcción y funcionamiento de las fibras ópticas, ayudará a garantizar una estimulación óptica exitosa. Es necesario puntuar adecuadamente las virolas para evitar la pérdida de la tapa de la cabeza y pulir las fibras ópticas, y probar que la pérdida de salida de luz a través de los implantes no supere el 30%9. Además, los parámetros de estimulación láser son consideraciones importantes. El láser debe funcionar a una potencia relativamente baja (5-7 mW). La estimulación sostenida de baja frecuencia se utiliza para inducir LTD, y esto se puede validar funcionalmente midiendo la fuerza sináptica de MGN-LA con registros electrofisiológicos. Finalmente, los resultados indicaron una reducción significativa en la reincorporación inducida por la señal con un n final de 10 animales por grupo, sin embargo, los experimentadores deben anticipar comenzar con un n más grande, ya que es probable que algunos animales deban ser excluidos del análisis final. Es crucial verificar la colocación anatómica adecuada y la expresión de virus y fibras ópticas, y utilizar solo datos de animales en los que se haya verificado la histología.
A pesar del fuerte efecto conductual en la búsqueda de cocaína observado con este protocolo, hay varias limitaciones que deben considerarse. Por un lado, el método solo se ha probado en ratas que fueron entrenadas con una sola señal audiovisual combinada con cocaína. No está claro qué sucedería en un escenario donde múltiples señales diferentes estuvieran condicionadas, lo que sería una representación más precisa de la adicción humana, por lo que múltiples estímulos ambientales se asocian altamente con el consumo de drogas15,16,17. La evidencia de nuestro laboratorio indica que la capacidad de LTD optogenética para reducir la búsqueda de fármacos se debe a una disminución en la fuerza sináptica que debilita los recuerdos asociados con la señal de fármacos. Sin embargo, no está claro hasta qué punto los recuerdos neutrales o que no están asociados con la autoadministración de cocaína podrían verse afectados por este protocolo. Además, mientras que el método sólo afecta la fuerza sináptica en un circuito, otros circuitos también pueden ser importantes para codificar la memoria y/o conducir el comportamiento de búsqueda de cocaína18,19,20. Finalmente, debe tenerse en cuenta que LTD solo se puede inducir en sinapsis donde el virus se expresa suficientemente, probablemente dejando algunas conexiones sinápticas no afectadas por el protocolo de estimulación, lo que potencialmente limita el impacto conductual. Además, la evidencia sugiere que solo pequeños conjuntos de neuronas y sinapsis están involucrados en la codificación de una memoria particular, dando crédito a la idea de que la inducción LTD dentro de toda una región del cerebro no es la mejor estrategia para efectuar un cambio de comportamiento, mientras que existen otros enfoques para dirigirse específicamente a poblaciones de neuronas activas en señal o contextualmente21, 22. A pesar de esto, el protocolo es efectivo para atenuar la búsqueda de drogas motivada por señales, probablemente porque la estimulación óptica de baja frecuencia limita la inducción LTD a las sinapsis que previamente han sido potenciadas por repetidos emparejamientos cocaína-señal4.
Este protocolo proporciona un avance significativo a los estudios optogenéticos conductuales más comúnmente utilizados donde la actividad de las neuronas se activa o inhibe mientras el animal está realizando el comportamiento en tiempo real19,23. En cambio, la optogenética se utiliza aquí como una herramienta neuromoduladora para revertir la plasticidad inducida por la cocaína. Una ventaja de este método es que la manipulación optogenética es independiente de la prueba de comportamiento, de modo que los posibles efectos de confusión de la optogenética (por ejemplo, efectos de circuito local, período refractario después de la estimulación de la luz, efectos de estimulación antidrómica, etc. 24 no debe afectar los resultados, aumentando así la confianza de que el mecanismo neuronal hipotético está mediando cambios en el comportamiento. Por lo tanto, este método se puede utilizar en una serie de aplicaciones que investigan cómo la plasticidad sináptica, particularmente un aumento en la fuerza sináptica como ocurre con LTP, se relaciona con cambios en el comportamiento. Enfoques similares también podrían ser relevantes para la aplicación clínica de tecnologías de estimulación neural donde las conexiones anormales en el cerebro que impulsan el comportamiento disfuncional pueden ser reguladas a la baja. Del mismo modo, debido a que la construcción viral oChIEF responde a estimulaciones de baja y alta frecuencia, existen aplicaciones potenciales a estos métodos más allá del alcance de los experimentos descritos. Por ejemplo, la LTP inducida optogenéticamente puede ser beneficiosa para revertir los déficits en la plasticidad encontrados en una amplia gama de trastornos neurodegenerativos y del desarrollo neurológico25. Además, la plasticidad bidireccional en las sinapsis MGN-LA también ha sido directamente relacionada con la regulación de comportamientos relevantes para los trastornos asociados al miedo8.
Modular los circuitos neuronales específicos que apoyan los comportamientos motivados por las drogas es esencial para establecer la abstinencia a largo plazo del consumo de drogas. Este protocolo utiliza nuevos avances en optogenética in vivo para revertir la plasticidad de un circuito neuronal preciso que se fortalece con la autoadministración repetida de cocaína en presencia de señales ambientales. El resultado de esta neuromodulación específica es una menor probabilidad de que las reexposiciones posteriores a las señales desencadenen una respuesta de búsqueda de cocaína, lo que puede tener implicaciones importantes para el desarrollo de futuras terapias para los trastornos por uso de sustancias.
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Disclosures
Nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el apoyo de las subvenciones de USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) y el Departamento de Salud de Pensilvania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
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