Summary
Metodene beskrevet her skisserer en prosedyre som brukes til å optogenetisk reversere kokainindusert plastisitet i en atferdsmessig relevant krets hos rotter. Vedvarende lavfrekvent optisk stimulering av thalamo-amygdala-synapser induserer langvarig depresjon (LTD). In vivo optogenetisk indusert LTD hos kokain-erfarne rotter resulterte i påfølgende demping av signalmotivert narkotikasøking.
Abstract
Denne protokollen viser trinnene som trengs for å bruke optogenetiske verktøy for å reversere kokainindusert plastisitet ved thalamo-amygdala-kretser for å redusere påfølgende kokainsøkende atferd hos rotter. I vår forskning hadde vi funnet ut at når rotter selvadministrerer intravenøs kokain parret med et audiovisuelt signal, blir synapser dannet ved innganger fra den mediale genikulate kjernen i thalamus (MGN) på hovedneuroner i lateral amygdala (LA) sterkere etter hvert som cue-kokainforeningen læres. Vi hadde en hypotese om at reversering av den kokaininduserte plastisiteten i disse synapsene ville redusere den kokainsøkende atferden. For å oppnå denne typen nevromodulering in vivo, ønsket vi å indusere synaptisk langvarig depresjon (LTD), noe som reduserer styrken til MGN-LA-synapser. Til dette formål brukte vi optogenetikk, som tillater nevromodulering av hjernekretser ved hjelp av lys. Den eksitatoriske opsin oChiEF ble uttrykt på presynaptiske MGN-terminaler i LA ved å infusere en AAV inneholdende oChiEF i MGN. Optiske fibre ble deretter implantert i LA og 473 nm laserlys ble pulsert med en frekvens på 1 Hz i 15 minutter for å indusere LTD og reversere kokainindusert plastisitet. Denne manipulasjonen fører til en langvarig reduksjon i evnen til signaler forbundet med kokain til å indusere narkotikasøkende handlinger.
Introduction
Stoffmisbruk er et svært alvorlig folkehelseproblem i USA og over hele verden. Til tross for flere tiår med intens forskning, er det svært få effektive terapeutiske alternativer 1,2. Et stort tilbakeslag for behandlingen er det faktum at kronisk narkotikabruk genererer langsiktige assosiative minner mellom miljømessige signaler og stoffet selv. Reeksponering for narkotikarelaterte signaler driver fysiologiske og atferdsmessige responser som motiverer fortsatt narkotikabruk og tilbakefall3. En ny terapeutisk strategi er å vedta minnebaserte behandlinger som tar sikte på å manipulere kretsene som er involvert i regulering av narkotika-cue-foreninger. Nylig ble det observert at synapser i lateral amygdala (LA), spesielt de som oppstår fra thalamus mediale geniculate nucleus (MGN), styrkes av gjentatt cue-assosiert kokain selvadministrasjon, og at denne potensieringen kan støtte kokainsøkende atferd 4,5. Derfor ble det foreslått at cue-indusert gjenoppretting kunne dempes ved å reversere plastisiteten ved MGN-LA-synapser.
Evnen til å presist målrette den synaptiske plastisiteten til en bestemt hjernekrets har vært en stor utfordring for feltet. Tradisjonelle farmakologiske verktøy har hatt en viss suksess i å redusere tilbakefallsatferd, men er begrenset av manglende evne til å manipulere individuelle synapser. Den nylige utviklingen av in vivo optogenetikk har imidlertid gitt verktøyene som trengs for å overvinne disse begrensningene og kontrollere nevrale veier med tidsmessig og romlig presisjon 6,7,8. Ved å uttrykke lysfølsomme opsiner i en bestemt hjernekrets, kan laserlys deretter brukes til å aktivere eller hemme kretsen. Frekvensavhengig optisk stimulering kan brukes til å spesifikt manipulere den synaptiske plastisiteten til kretsen i et dyr som oppfører seg.
Dette manuskriptet skisserer prosedyren som er tatt for å manipulere den atferdsmessig relevante MGN-LA-kretsen ved bruk av in vivo optogenetikk. Først ble eksitatorisk opsin oChIEF uttrykt i MGN og optiske fibre ble bilateralt implantert i LA. Dyr ble deretter trent til å selvadministrere kokain på en køavhengig måte, noe som forsterker MGN-LA-banen. Deretter ble vedvarende, lavfrekvent stimulering med 473 nm laserlys brukt til å produsere kretsspesifikk LTD. Reversering av plastisiteten indusert av kokainbruk genererte en langvarig reduksjon i signalenes evne til å utløse handlinger som er forbundet med narkotikasøkende atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene beskrevet i denne protokollen var i samsvar med retningslinjene fastsatt av National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals og ble godkjent av University of Pittsburghs institusjonelle dyrepleie- og brukskomité. Alle prosedyrer ble utført med voksne, naive Sprague-Dawley-rotter som veide 275-325 g ved ankomst.
1. Konstruksjon av optiske fiberimplantater og patchkabler
- Forbered optiske fiberimplantater etter tidligere publiserte protokoller9. Eksperimenter beskrevet i denne protokollen brukte 200 μm kjernefiber (0,5 NA) og Ø1,25 mm Multimode LC/PC Keramisk ferrule, Ø230 μm hullstørrelse.
- Bruk et Dremel-verktøy til å lage mening etter den nederste tredjedelen av en ferrule (nærmest den flate enden av ferrulen). Scoring ferrules hjelper dem å holde seg festet til dental sement, noe som øker sannsynligheten for at de vil forbli sikre gjennom hele omfanget av eksperimentering.
- Bruk wire cutters å kutte ~ 35 mm fiber. Bruk fiberstrippeverktøy til å strippe ~ 25 mm fiber, og la 10 mm være ueksponert.
- Forbered varmeherdbar epoksy i henhold til produsentens instruksjoner. Løs opp 1 g harpikspulver i 100 mg herderforbindelse. Fest en buttet 25-gauge kanyle til en 1 ml sprøyte. Fyll sprøyten med epoksy og fest en buttet 25-gauge nålespiss.
- Bruk en skrue eller klemme for å holde ferrulen sikkert med den flate siden vendt opp og den konvekse siden vendt nedover. Med den epoksyfylte sprøyten, tilsett en dråpe epoksy på den flate siden av ferrulen, med forsiktighet for å tørke overflødig epoksy fra sidene av ferrulen.
- Sett den strippede delen av fiber gjennom ferrule, slik at en ekstra 5 mm strippet fiber eksponeres. Når det gjelder LA-implantater, vil fiberen bli implantert 7,9 mm ventral til bregma, så den eksponerte lengden på ustrippet fiber skal være ~ 13 mm.
- Herd epoksyen med en varmepistol i ca 30-40 s til den blir svart/gul i fargen.
- Score fiberen direkte ved grensesnittet til den konvekse enden av ferrule med diamantkniv og bruk en finger til å trykke fiberen forsiktig av.
- Poler den konvekse enden av ferrulen ved å holde med en hemostat, sørg for å påføre jevnt trykk og lage 20 sirkulære rotasjoner hver på en serie poleringspapir (fra høy klasse til lav klasse; 5, 3, 1, 0,3 μm).
- Fest ustrippet fiber til bordet ved hjelp av tape og score strippet fiber, og la en ekstra 2 mm utover ventralkoordinaten (For LA-implantater er den endelige lengden på fiber ~ 10 mm). Bruk en hemostat til å trekke på ferrule og jevnt bryte fiber der det har blitt scoret. Vær forsiktig så du ikke kutter fiber helt når du scorer, ellers vil kjernen i fiberen bli skadet.
- Bygg patchkabler som er kompatible med optiske fiberimplantater. Spesialdesignede patchkabler ble kjøpt inn (se materialfortegnelse). Alternativt kan patchkabler konstrueres etter tidligere publiserte protokoller9.
MERK: Diameteren og NA til ferrulefiber- og patchkabelfiberen må stemme overens ved koblingskrysset for å forhindre overflødig tap av lys, noe som kan føre til at nevral aktivitet ikke stimuleres tilstrekkelig. - Mål lyseffekten gjennom patchkabelen og optiske fiberimplantater ved å feste patchkabel / optisk fiber til en passende laserlyskilde (473 nm, 1 mW utgang) og måle utgangen med en lyssensor. En vellykket konstruert fiber vil avgi en konsentrisk sirkel av lys og ikke ha mer enn 30% lystap.
2. Gnager intravenøs kateterisering, viruslevering og optisk fiberimplantasjon
- Forbered dyr for kirurgi.
- Fullt bedøve rotter med bedøvelse av valg basert på institusjonelle retningslinjer. Et alternativ er ketaminhydroklorid (87,5-100 mg/kg, i.m.) og xylazinhydroklorid (5 mg/kg, i.m.). Sørg for at rotta er fullt bedøvet ved å sjekke for mangel på tåklemmerefleks.
FORSIKTIG: Ketamin er et kontrollert stoff som må håndteres i henhold til institusjonelle retningslinjer.
MERK: Intramuskulær injeksjon av anestetika brukes i denne studien, da det ga en raskere og mer pålitelig anestesiinduksjon enn intraperitoneal injeksjon. Overvåk kontinuerlig rottens respirasjon og respons og gi termisk støtte gjennom hele operasjonen. - Barber et stort område av rottens rygg (øvre rygg fra like over skulderbladene til midten av ryggen) samt området av nakken under høyre forben og hodebunnen.
- Plasser rotta i operasjonsområdet og påfør puralube (kunstige tårer) på øynene. Injiser et kroppsvektvolum av karprofen (smertestillende) subkutant (s.c.) gjennom huden på øvre del av ryggen, og injiser deretter 5 ml laktert Ringer-oppløsning s.c. gjennom huden på korsryggen.
- Desinfiser alle kirurgiske steder ved å fukte et stykke sterilt gasbind med betadin og tørke det ned det barberte kirurgiske området ved hjelp av en sirkulær bevegelse. Gjenta deretter prosessen med 70% etanol. Gjenta denne vekslende syklusen tre ganger.
- Fullt bedøve rotter med bedøvelse av valg basert på institusjonelle retningslinjer. Et alternativ er ketaminhydroklorid (87,5-100 mg/kg, i.m.) og xylazinhydroklorid (5 mg/kg, i.m.). Sørg for at rotta er fullt bedøvet ved å sjekke for mangel på tåklemmerefleks.
- Utfør intravenøs kateterimplantasjon i henhold til tidligere publiserte protokoller 4,10.
MERK: En kirurgisk drape brukes ikke under denne operasjonen for å unngå irritasjon under kateterimplantasjon. Steriliser alle instrumenter og utstyr før bruk. Bruk sterile hansker og bytt hansker hvis en ikke-steril overflate er i kontakt. - Umiddelbart etter kateterimplantasjoner, fest rotta i en stereotaktisk ramme for å utføre AAV-injeksjoner.
- Lever en subkutan (s.c) injeksjon av 2% lidokain (0,2-0,3 ml) til hodebunnen som lokalbedøvelse.
MERK: Lokalbedøvelse brukes ikke under intravenøs kateterimplantasjon for å unngå endringer i kirurgiske utfall. - Koble en 26-gauge rustfritt stål injeksjonskanyle til en Hamilton sprøyte fylt med 1 μL konsentrert AAV-løsning: enten AAV5-hSyn-tdTomato eller AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
MERK: oChIEF er en variant av blålysfølsom opsin channelrhodopsin (ChR2), som kan reagere på et bredt spekter av frekvenser 8,11, og har derfor nytte for lavfrekvente LTD-eksperimenter diskutert i denne protokollen, men også for høyfrekvente LTP-eksperimenter (ikke diskutert her). Den oChIEF konstruere ble donert av Dr. Roger Tsien og behandlet for emballasje og rensing av Duke Viral Vector Core. Minst 3-4 uker er nødvendig mellom injeksjonsdagen og dagen for LTD-induksjon for å muliggjøre optimal virusekspresjon i MGN-aksonterminaler.
FORSIKTIG: Generelt regnes AAV som en biosikkerhetsnivå 1 (BSL-1) organisme, med lav risiko for selvinfeksjon med mindre et hjelpervirus brukes i produksjonen. Bruken krever IACUC-godkjenning, og riktig PPE må til enhver tid brukes i samsvar med institusjonelle retningslinjer for å begrense unødvendig eksponering. - Bruk en skalpell, gjør et 0,5 mm snitt fra forsiden til baksiden av skallen, og fjern overliggende vev for å avsløre overflaten av skallen.
- Jevn rottehodet i fremre/bakre akse og null stereotaktiske koordinater til bregma.
- Bor tre små hull gjennom hodeskallen ved hjelp av et Dremel-verktøy utstyrt med en liten borkrone. Bruk skrutrekker til å montere skruer i rustfritt stål (M2x4 965-A2) på plass.
MERK: Skruer er nødvendige for riktig binding av dental sement og dannelse av solide, langvarige hodekapsler. Skruenes posisjon skal spres over skalleens fremre bakre akse og vekk fra AAVs injeksjonssted. - Bore bilaterale hull for injeksjon av AAV basert på koordinatene fra Rat Brain Atlas (Watson og Paxinos)12 for den mediale delen av mediale geniculate nucleus (MGN); i mm fra bregma, AP: -5.4; ML: ±3.0; DV: -6,6. Senk kanylene langsomt ned (4 mm/min) til de er plassert i MGN. Injiser konsentrert AAV-oppløsning med en hastighet på 0,1 μl/min.
- La injeksjonskanylen ligge på plass i 5 minutter etter at infusjonene er fullført, slik at kanylen kan diffuderes bort fra kanylen, og trekk deretter kanylen sakte ut av hjernen.
- Lever en subkutan (s.c) injeksjon av 2% lidokain (0,2-0,3 ml) til hodebunnen som lokalbedøvelse.
- Umiddelbart etter virusinjeksjoner, fortsett å implantere optiske fibre 4,9 rettet mot MGN-LA-terminaler.
- Bruk et Dremel-verktøy til å bore bilaterale hull for optiske fiberimplantater rettet mot lateral amygdala (i mm fra bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
- Bruk tang til å ta tak i ferrule av optisk fiber implantat og feste den til stereotaxic adaptere slik at de er sikkert holdt på plass.
- Senk fibrene langsomt med en hastighet på 2 mm/min, til tuppen av fiberen sitter i den dorsale delen av LA (DV: -7,9 mm).
- Fest ferrules til skallen først ved hjelp av et tynt lag Loctite øyeblikkelig lim etterfulgt av dental sement og deksel ferrules med 1,25 mm diameter ferrule hylser og støvdeksler.
MERK: Valget av lim for å feste ferrules til skallen skal godkjennes av den lokale eller institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen. Loctite brukes til denne studien for å sikre ferrules til skallen på en pålitelig måte etter prøving og feiling med flere lim; Tilgjengelige alternativer kan imidlertid vurderes.
- Etter kirurgiske prosedyrer, husrotter individuelt, og gir fri tilgang til mat og vann. Gi postoperativ omsorg i samsvar med institusjonelle retningslinjer. Skyll katetre daglig med saltvann som inneholder gentamicin (5 mg / ml) og heparin (30 USP / ml) for å opprettholde patency. Minst 5 dager etter operasjonen og 24 timer før starten av atferdseksperimenter, begrenser maten rotter til ~ 90% av deres frie fôringsvekt.
3. Gnagerkokain selvadministrasjon og instrumentell spakutryddelse
MERK: Alle atferdsprosedyrer utføres i standard operant kondisjoneringskamre, utstyrt med to uttrekkbare spaker på en vegg, et stimuluslys over hver spak, en tonegenerator, et huslys og en infusjonspumpe.
- Utsette rotter for daglige 1-timers selvadministrasjonsøkter med kokain (2 mg/ml) under en FR1-forsterkningsplan.
- Plasser rotter i operant kammer hver dag og la rotter spakpresse. Et trykk på den angitte "aktive spaken" (motbalansert over venstre og høyre spak) resulterer i en kokaininfusjon (1,0 mg/kg/infusjon) og en 10 s presentasjon av et sammensatt lys og tonesignal. Et trykk på den utpekte "inaktive spaken" har ingen programmerte effekter.
- Fortsett selvadministrasjonseksperimenter i minst 10 timer og til rottene lykkes med å oppnå minst 8 infusjoner/dag over 3 påfølgende dager. Manglende oppnåelse av oppkjøpskriterier innen dag 20 resulterer i eksklusjon fra studien.
- Etter at oppkjøpskriteriene er oppfylt, utsetter rotter til 1 time instrumentelle utryddelsesøkter for 6-10 d.
- Plasser rotter i operant kamre og la rotter fritt presse. Svar på både de aktive og inaktive spakene har imidlertid ingen programmerte konsekvenser.
- La rotter fortsette instrumentell utryddelse daglig til et gjennomsnitt på < 25 spakpresser over to påfølgende dager oppstår.
4. In vivo optogenetisk induksjon av LTD
MERK: Optogenetiske inhiberingseksperimenter finner sted 24 timer etter den siste dagen av instrumentell utryddelse.
- Koble patchledninger til en 473 nm blå laserdiode via et roterende ledd suspendert over et rent, standard gnagerhus med dekselet fjernet. Dette oppsettet gjør at gnagere kan bevege seg fritt rundt buret under den optogenetiske stimuleringen.
- Slå på laserdiode i henhold til bruksanvisningen og koble til en pulsgenerator. Juster innstillingene, slik at rotta vil motta 900 2 ms lyspulser ved 1 Hz når den er slått på.
FORSIKTIG: Riktig øyevern må alltid brukes mens du bruker laser. - Mål lysintensiteten gjennom patchledningen ved hjelp av en lyssensor. Juster intensiteten til laseren slik at lyseffekten gjennom patchkabelen er ~ 5-7 mW.
- Plasser rotter i et rent boligbur. Fjern støvdeksler og ferrulehylser, og utsett ferrules. Koble patchledninger bilateralt til optiske fiberimplantater. La rotter utforske miljøet i 3 minutter før LTD-induksjon.
- Slå på pulsgeneratoren for å starte optogenetisk stimulering.
MERK: Selv om det er usannsynlig, hvis rotte opplever bivirkninger av stimulering, blir forsøket umiddelbart avsluttet, og rotter blir riktig avlivet basert på institusjonelle retningslinjer. - Etter LTD-induksjon, hold rotter i buret i 3 minutter, og plasser deretter tilbake i hjemmeburene.
- For kontrolleksperimenter, bruk samme stimuleringsprosedyre på rotter som uttrykker AAV5-tdTomato-kontrollviruset. For humbugeksperimenter, fest en patchledning til optisk fiber av rotter som uttrykker AAV5-oChIEF-viruset, men ingen stimulering leveres i løpet av en 15 minutters økt.
5. Test effekten av optogenetisk stimulering på køindusert kokainsøking
- 24 timer etter in vivo optogenetiske stimuleringer, plasser rotter tilbake i operant kondisjoneringskamre. Rotter blir utsatt for en 1-timers standard cue-indusert gjenopprettingsøkt for å vurdere kokainsøkende atferd.
MERK: Under cue-indusert gjenoppretting gir en respons på den aktive spaken en 10-s presentasjon av kokain-assosiert signal, men ingen kokaininfusjoner. - Gi en ny gjenopprettingstest minst 1 uke etter den første testen for å avgjøre om optogenetisk LTD-induksjon resulterer i en langvarig undertrykkelse av kokainsøkende
6. Farging, fluorescens og avbildning for histologisk verifisering av viralt uttrykk og plassering av optisk fiber
- Lag 1x fosfatbufret saltvann (PBS) og 4% paraformaldehyd (PFA). Oppbevar begge løsningene på is. Totalt volum vil avhenge av antall rotter i studien (~100 ml PBS og 200 ml PFA vil bli brukt per rotte).
FORSIKTIG: PFA er et giftig kjemikalie og kjent kreftfremkallende middel. Ta vare på å unngå innånding samt kontakt med huden. Bruk og avhending skal være i samsvar med institusjonelle retningslinjer, inkludert bruk av riktig PPE og en kjemisk strømningshette. - Oppsett peristaltisk pumpe med en strømningshastighet på 20 ml / min. Fyll slangen på pumpen med 1x PBS. Fest en stump 20-gauge nål til enden av slangen.
- Dypt bedøve rotter med natriumpentobarbital (100 mg / kg, i.p.). Bekreft dybden av anestesi ved manglende respons på tåklemme før du fortsetter videre.
MERK: Natriumpentobarbital brukes siden perfusjonen er en terminal prosedyre. - Bruk kirurgisk saks til å kutte opp bukhulen til rotta under membranen. Skjær gjennom brystkassen rostralt langs sidekantene for å avsløre rottens hjerte. Bruk hemostat til å klemme rostral delen av ribbe buret vekk fra hjertet. Skjær bort overflødig fettvev som omgir hjertet.
- Stikk den butte nålen gjennom venstre ventrikkel og opp i aorta. Klipp et lite hull i høyre atrium for å drenere løsningen når den vender tilbake til hjertet.
- Perfus hver rotte med 1x PBS i 5 min etterfulgt av 4% PFA, pH 7,4 i 10 minutter.
- Halshugg rotta, trekk ut hjernen og postfiks den i 4% PFA i 24 timer. Overfør deretter hjernen til 30% sukroseløsning for 2-3 d.
- Seksjon hjerner ved 50 μm ved hjelp av en kryostat.
- Monter alle skiver som inneholder LA eller MGN på glassglass og coverslip.
- Bildeskiver ved hjelp av et epifluorescerende mikroskop for å verifisere AAV-oChIEF-tdTomato-uttrykk i MGN og dets projeksjoner til LA, samt plassering av optisk fiber over LA.
7. Perfusjon og akutt hjerneskiveforberedelse for elektrofysiologiske eksperimenter
MERK: Elektrofysiologiske eksperimenter utføres på en delmengde av dyr for å validere suksessen til in vivo LTD.
- Forbered elektrofysiologiske løsninger ved hjelp av reagensene oppført i tabell 1-3 4,13. Juster pH for alle oppløsninger til 7,4 med HCl og juster osmolariteten til 300-310 mOsm/kgH2O. Lag løsninger ferske før eksperimenter og oppbevar ved 4 °C i opptil 1 uke. Mett alle oppløsninger med karbogen (95%O2/5% CO2) til enhver tid under bruk.
- Bruk av isofluran i henhold til lokale eller institusjonelle retningslinjer for dyrepleie og bruk, og bedøv rotta dypt i et lukket eutanasikammer. Bekreft at dyret er fullt bedøvet via tåklemmerefleksen.
- Fyll et lite beger med 50 ml iskald skjæreløsning. Fyll rør av peristaltisk pumpe med oppløsning og juster strømningshastigheten til 20 ml / min. Fest en stump 20-gauge nål til enden av slangen.
- Åpne bukhulen (se trinn 6.4 og 6.5) og perfuser rotte kort med skjæreløsning (maksimalt 1-2 min).
- Etter perfusjon, halshugg rotten umiddelbart. Fjern hjernen og legg den i et lite beger fylt med 4 °C skjæreløsning i 30 s-1 min.
- Overfør hjerner med en spatel og fest dem raskt til kammeret til en vibratom. Fjern piaen med fintang. Fyll kammeret med 4 °C skjæreløsning og lag akutte koronale skiver (250 μm tykke) av amygdala med en hastighet på 0,37 mm/sek og en frekvens på 70 Hz.
- Etter hvert som skiver oppnås, legg hver i et oppbevaringskammer fylt med skjæreoppløsning og inkuber ved 37 ° C i 10-12 minutter. Omtrent 5-7 skiver som inneholder LA kan fås per dyr.
- Overfør skiver til et beger med romtemperatur (RT) holdeløsning og la det komme seg i >30 min før eksperimentering.
MERK: Skiver forblir generelt sunne mens de holdes i holdeløsning i 4-6 timer. På grunn av AAVs fluorescerende natur oppbevares skiver under svake lysforhold.
8. Ex vivo elektrofysiologiske opptak
- Forbered intracellulære løsninger ved hjelp av reagensene oppført i tabell 4-5.
MERK: Intracellulære løsninger bør lages i forkant av eksperimenter og kan lagres langsiktig (3-12 måneder) ved -80 °C eller kortvarig (1-2 måneder) ved -20 °C. Løsningene er pH-justert til 7,3 (med CsOH for Cs-basert intracellulær løsning og med KOH for K-basert intracellulær løsning). Juster til en endelig osmolaritet på 290-300 mOsm/kg H2O. - Tilbered 500 mM picrotoxin stamoppløsning oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO).
MERK: Pikrotoksinbestandene siteres og lagres ved -20 °C. Bruksdagen tines alikoter og tilsettes opptaksoppløsning til en endelig konsentrasjon på 100 μM.
FORSIKTIG: Picrotoxin er en ikke-konkurrerende antagonist av GABAA-reseptorer , så infusjon av picrotoxin har en stimulerende effekt. Det er alvorlig giftig ved oralt inntak eller hudabsorpsjon. Riktig PPE må brukes til enhver tid når du arbeider med pikrotoksin. - Overfør skiver til et stående mikroskop designet for elektrofysiologiske eksperimenter.
- Under forsøk bader du kontinuerlig skiver med opptaksoppløsning som varmes opp til 31-33 °C.
- Forstørr LA ved hjelp av et 4x-mål. Identifiser hovednevroner ved morfologi med en 40x vannnedsenkningslinse.
- Bruk en glasspipette (3-5 MΩ) fylt med enten en Cs-basert intracellulær løsning (for spenningsklemmeeksperimenter) eller en K-basert intracellulær løsning (for nåværende klemmeeksperimenter) for å oppnå helcellepatchklemmeopptak.
- Identifiser AAV-infiserte MGN-aksonale fremspring under fluorescens (ved hjelp av et RFP-filter). Stimuler projeksjoner ved hjelp av en DPSS-laser med blått lys (473 nm) koblet til en pulsgenerator.
FORSIKTIG: For å begrense lasereksponering kobles kollimert laserlys til en fluorescerende port på mikroskopet og fokuseres på skiven gjennom objektivet.
MERK: I spenningsklemmemodus fremkalles eksitatoriske postsynaptiske strømmer (EPSC) optisk ved 0,1 Hz. Nevroner som mottar innganger fra AAV-infiserte MGN-nevroner vil vise pålitelige EPSC-er. - For å indusere ex vivo LTD, i gjeldende klemmemodus, registrer en stabil grunnlinje av eksitatoriske postsynaptiske potensialer (EPSP) i minst 10 minutter. Deretter leverer du 900 2 ms pulser med 473 nm lys med en frekvens på 1 Hz (total tid = 15 min). Deretter registrerer du EPSP-er kontinuerlig ved 0,1 Hz i ≥60 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tidslinje som beskriver rekkefølgen på eksperimenter er vist i figur 1. Gjennom atferdseksperimenter tjener antall kokaininfusjoner samt antall svar på den aktive spaken som et mål på intensiteten av kokainsøkende atferd. I løpet av de første dagene med selvadministrasjon av kokain bør antallet aktive responser øke gradvis for hver dag de anskaffelsesdagene, før antallet tiltak stabiliseres i løpet av den andre uken. Omvendt bør inaktive spakresponser forbli lave gjennom hele eksperimentet (figur 2A). På den første dagen av instrumentell utryddelse er det vanligvis en økning i antall aktive spakresponser, ettersom det uventede fraværet av kokain fører til eskalering av kokainsøkende atferd. Imidlertid vil denne responsen gradvis avta med påfølgende økter etter hvert som rotter lærer den nye beredskapen, noe som resulterer i et lavt og stabilt antall aktive spakresponser innen 6-10 d (figur 2B). Rotter som ikke når de spesifiserte oppkjøpskriteriene i enten selvadministrasjons- eller instrumentutryddelsesfasene av forsøket, fjernes fra studien, og data er ikke inkludert i endelig analyse.
Etter instrumentell utryddelse gjeninnfører gjeneksponering for kokainassosierte signaler kokainsøkende atferd, noe som resulterer i en økning i antall aktive spakresponser. Denne økningen er observert i begge grupper av kontrolleksperimenter: rotter som ble injisert med virus som manglet oChIEF (AAV-kontroll) og rotter som ikke fikk laserstimulering (SHAM-kontroll; Figur 3A) Imidlertid forårsaket in vivo optogenetic LTD av MGN-LA-terminaler en reduksjon i påfølgende køindusert kokainsøking. 24 timer etter optogenetisk LTD-induksjon ble antall aktive spakpresser signifikant redusert i forhold til både AAV-kontroller og SHAM-kontroller (figur 3A). Dette lave responderingsnivået ble opprettholdt under en påfølgende gjenopprettingstest 7 dager senere (utført i en undergruppe av rotter) (figur 3B), noe som indikerer en vedvarende reduksjon i kokainsøk på tvers av flere gjenopprettingstester.
Ex vivo elektrofysiologiske opptak fra dyr utsatt for optisk stimulering bekreftet at dempingen ved gjenoppretting faktisk skyldtes, i det minste delvis, en modulering av MGN-LA synaptisk plastisitet. Dette ble vist ved en reduksjon i optisk fremkalt EPSC-amplitude i LA-nevroner etter eksponering for optisk LTD (figur 4A). Denne dempingen i EPSC-amplitude var spesifikk for nevroner som fikk optisk stimulering, da EPSC-amplitude forble uendret i SHAM-kontroller. I tillegg kunne LTD ikke genereres i skiver fra rotter som allerede hadde mottatt in vivo optisk stimulering, men ble pålitelig fremkalt i nevroner fra rotter som gjennomgikk SHAM-stimulering, som det fremgår av en vedvarende reduksjon i EPSP-stigningshellingen (figur 4B). Optisk stimulering in vivo ser derfor ut til å okkludere ytterligere LTD-induksjon i skive. Under opptak er det viktig å måle seriemotstand gjennom varigheten av opptaket for å sikre den opprettholdte tilstanden til plasteret. Celler med endring i seriemotstand utover 20% aksepteres ikke for dataanalyse. Dette er spesielt viktig for LTD-eksperimenter som varer >60 min, da endringer i seriemotstand kan påvirke reseptor- og kanaldynamikken. For å sikre at afferentene som stimuleres under elektrofysiologiske opptak kommer fra MGN, er det viktig å samle skiver gjennom utbredelsen av thalamus. Dette fungerer som en bekreftelse på at cellelegemene i MGN faktisk fluorescerende uttrykker AAV. I tillegg til visuell bekreftelse er funksjonell validering også nødvendig. Under strøm-klemmeforhold avfyrer AAV-oChIEF-infiserte MGN-nevroner aksjonspotensialer som respons på både høye og lave frekvenser av 473 nm-lysstimulering (figur 4C).
Alle atferdsresultater ble vurdert som foreløpige inntil virusuttrykk og optikusfiberimplantater var histologisk verifisert og riktig plassering ble bekreftet (figur 5). Manglende AAV-ekspresjon i enten MGN eller LA og/eller de der de optiske fibrene ikke var korrekt plassert i dorsale LA ble ekskludert fra eksperimentell analyse, men kan i noen tilfeller inkluderes som negativ anatomisk kontroll.
Figur 1: Tidslinje for eksperimentell prosedyre. En oversikt over protokollens kritiske trinn, inkludert sekvensiell tidsforløp og varighet av hver eksperimentelle fase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Erverv og utryddelse av selvforvaltning av kokain. (A) Dyr har et økende antall kokaininfusjoner og aktive spakresponser på tvers av anskaffelsen, og et lavt nivå av inaktive spakresponser. (B) Etter en innledende økning i spakpressing på dag 1 av utryddelse, reduseres dyrene som reagerer på både aktive og inaktive spaker til et lavt, stabilt nivå. Feilfelt, betyr ±SEM. Denne figuren er modifisert fra Rich et al. 20194. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: In vivo optogenetisk LTD demper cue-indusert gjenoppretting. (A) Optisk LTD forårsaker en signifikant reduksjon i aktive spakpresser under gjenoppretting i forhold til dyr som fikk kontrollvirus eller SHAM-kontrollstimulering. Toveis ANOVA, hovedeffekt av gruppe (F(2,27) = 7,04, P = .004) og en dag x gruppeinteraksjon (F(2,27) = 8,08, P = .002); Bonferronis post hoc-analyse: ***p < .001. (B) 7 dager senere gjennomgikk rotter en ny gjenopprettingstest, som avslørte en signifikant reduksjon i aktiv spakpressing hos dyr som tidligere gjennomgikk MGN-LA LTD i forhold til SHAM-kontroller. Toveis ANOVA, hovedeffekt av gruppe (F(1,32) = 5,04, P = .032), signifikant interaksjon (F(1,32) = 7,69, P = .009); Bonferronis post hoc-analyse, **p < .01. Feilfelt, gjennomsnitt ±SEM, n i stolper, antall rotter. Denne figuren er modifisert fra Rich et al. 20194. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Funksjonell validering av in vivo lavfrekvent optogenetisk stimulering (A) In vivo dual hemisfære LTD av MGN-LA-synapser demper EPSC-amplitude i forhold til SHAM-kontroller (Unpaired t-test, t(10) = 2,73, *P = .021). Innfelt: Eksempel på gjennomsnittlige EPSC-spor fremkalt ved Erev-70 mV. Skalastenger: 50 ms, 200 pA, n i barer, antall rotter (nevroner). (B) In vivo optisk LTD-induksjon okkluderer ex vivo LTD. 24 timer etter in vivo LTD-induksjon ble amygdalaskiver tilberedt og samme stimuleringsprotokoll ble påført. EPSP stigningsskråning ved MGN-LA-terminaler ble redusert ved ex vivo optisk stimulering i nevroner fra dyr som hadde mottatt in vivo SHAM-stimulering, men ikke i nevroner fra dyr som hadde mottatt in vivo optisk LTD. n i kursiv, antall nevroner. (C) Prøve nåværende klemmeopptak fra AAV-oChIEF-infiserte MGN-nevroner. Aksjonspotensialer ble fremkalt ved stimulering av blått lys (5-100 Hz). Vektstenger: 100 ms, 40 mV. Feilfelt, betyr ±SEM. Denne figuren er modifisert fra Rich et al. 20194. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Histologisk verifisering av virusuttrykk og optiske fiberplasseringer. (A ) Representative mikroskopiske bilder som viser DAPI og AAV-oChIEF-tdTomato-uttrykk i LA (venstre) og MGN (høyre). Skalastang: 2 mm. ( B ) Skjematisk visning av injeksjon av AAV-oChIEF-tdTomato og gjennom hele fremre-bakre utstrekning av LA (venstre) og MGN (høyre), og optiske fiberplasseringer i LA. Mørkerød skyggelegging viser representasjon av minste akseptable virusspredning, og lys rosa skyggelegging viser representasjon av største akseptable spredning. Blå sirkler tilsvarer vellykket optisk fiberplassering i begge halvkule. Svarte sirkler tilsvarer vellykket optisk fiberplassering i bare en halvkule. Svart "X" tilsvarer mislykket fiberplassering. For å bli inkludert i den endelige analysen, krevde rotter viral dobbel halvkule uttrykk i LA, samt vellykket plassering av fibre. Koordinater er i mm, posterior fra bregma. Denne figuren er modifisert fra Rich et al. 20194. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kjemisk | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-metyl-D-glukamin | 92 | 195.215 | 17.96 |
| Kaliumklorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumfosfat monobasisk | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natron | 30 | 84.01 | 2.52 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glukose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Natrium Askorbat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Natriumpyruvat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnesiumsulfat | 10 | Bruk 5,0 ml 2,0 m lager | |
| Kalsiumklorid | 0.5 | Bruk 250 μL 2,0 m lager | |
| 1. For 1 liter oppløsning, tilsett salter i rekkefølgen oppført til 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH med konsentrert HCl til 7,3-7,4 (NMDG er en grunnleggende løsning) | |||
| 3. Oksygener i 5-10 minutter og tilsett deretter MgSO4 og CaCl2 | |||
| 4. Ta med siste volutme til 1 L med ddH2O og dobbeltsjekk endelig pH | |||
| 5. Kontroller osmolariteten med osmometer og juster til 300-310 mOsm / kg H2O | |||
Tabell 1: Liste over ingredienser for ekstracellulær skjæreløsning. Ingredienser og instruksjoner som brukes til fremstilling av den NMDG-baserte ekstracellulære skjæreløsningen.
| Kjemisk | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-metyl-D-glukamin | 86 | 195.215 | 5.03 |
| Kaliumklorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumfosfat monobasisk | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natron | 35 | 84.01 | 2.94 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glukose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Natrium Askorbat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Natriumpyruvat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnesiumsulfat | 1 | Bruk 500 μL 2,0 m lager | |
| Kalsiumklorid | 2 | Bruk 1000 μL 2,0 m lager | |
| 1. For 1 liter oppløsning, tilsett salter i rekkefølgen oppført til 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH med 1 N HCl eller KOH til 7,3-7,4 | |||
| 3. Oksygener i 5-10 minutter og tilsett deretter MgSO4 og CaCl2 | |||
| 4. Ta med siste volutme til 1 L med ddH2O og dobbeltsjekk endelig pH | |||
| 5. Kontroller osmolariteten med osmometer og juster til 300-310 mOsm / kg H2O | |||
Tabell 2: Liste over ingredienser for ekstracellulær holdeløsning. Ingredienser og instruksjoner som brukes til fremstilling av den ekstracellulære holdeløsningen.
| Kjemisk | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-metyl-D-glukamin | 119 | 195.215 | 6.95 |
| Kaliumklorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumfosfat monobasisk | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natron | 26 | 84.01 | 2.18 |
| HEPES | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-glukose | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| Magnesiumsulfat | 1 | Bruk 500 μL 2,0 m lager | |
| Kalsiumklorid | 2 | Bruk 1000 μL 2,0 m lager | |
| 1. For 1 liter oppløsning, tilsett salter i rekkefølgen oppført til 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH med 1 N HCl eller KOH til 7,3-7,4 | |||
| 3. Oksygener i 5-10 minutter og tilsett deretter MgSO4 og CaCl2 | |||
| 4. Ta med siste volutme til 1 L med ddH2O og dobbeltsjekk endelig pH | |||
| 5. Kontroller osmolariteten med osmometer og juster til 300-310 mOsm / kg H2O | |||
Tabell 3: Liste over ingredienser til ekstracellulær opptaksløsning. Ingredienser og instruksjoner som brukes til fremstilling av den ekstracellulære opptaksløsningen.
| Kjemisk | Mm | MW | mg/50 ml |
| Cesium metansulfonat | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| Cesiumklorid | 15 | 168.36 | 126.3 |
| Cesium-EGTA | 0.4 | Tilsett 80 μL av 250 mM Cs-EGTA | |
| TE-klorid | 5 | 165.705 | 41.4 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-Br | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-glutation | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Natriumfosfokreatin | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. Start med 40-45 ml HPLC-grad H2O | |||
| 2. Hold fosfokreatin, ATP og GTP på is til enhver tid. | |||
| 3. Tilsett ingredienser i den rekkefølgen som er oppført i tabellen | |||
| 4. pH til 7,3 med CsOH (ca. 200 μL av 2 M CsOH) | |||
| 5. Bruk osmometer for å sjekke osmolaritet. | |||
| 6. Tilsett HPLC-grad H2O til en endelig osmolaritet på ca. 285-290 mOsm/kgH2O | |||
| 7. Tilbered 500-1000 μL alikoter og oppbevar ved -80 °C eller -20 °C | |||
Tabell 4: Liste over ingredienser for cesiummetansulfonat intracellulcellulsiologiløsning. Ingredienser og instruksjoner som brukes til fremstilling av cesiummetansulfonat intracellulær løsning.
| Kjemisk | Mm | MW | mg/50 ml |
| Kaliumglukonat | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| Kaliumklorid | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| Natriumklorid | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-BAPTA | 0.1 | Tilsett 80 μL K-BAPTA | |
| HEPES | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-glutation | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Natriumfosfokreatin | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| Tris-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. Start med 40-45 ml HPLC-grad H2O | |||
| 2. Hold fosfokreatin, ATP og GTP på is til enhver tid. | |||
| 3. Tilsett ingredienser i den rekkefølgen som er oppført i tabellen | |||
| 4. pH til 7,3 med KOH (ca. 200 μL av 2 M KOH) | |||
| 5. Bruk osmometer for å sjekke osmolaritet. | |||
| 6. Tilsett HPLC-grad H2O til en endelig osmolaritet på ca. 285-290 mOsm/kgH2O | |||
| 7. Tilbered 500-1000 μL alikoter og oppbevar ved -80 °C eller -20 °C | |||
Tabell 5: Liste over ingredienser for kaliumglukonat intracellulær elektrofysiologiløsning. Ingredienser og instruksjoner som brukes til fremstilling av kaliumglukonat intracellulær løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som beskrevet ovenfor er det flere kritiske trinn som er viktige for å oppnå de riktige eksperimentelle resultatene. Protokollen vil sannsynligvis bare være effektiv hos dyr som får selvadministrasjon av kokain på riktig måte, og til dags dato har den bare blitt testet ved hjelp av parametrene som er skissert ovenfor. Det er mulig at kokaindosen, tidsplanen for forsterkning og signalparametrene kan modifiseres med sannsynligvis liten effekt på atferdsresultatene, med unntak av at en annenordens forsterkningsplan kan føre til amygdala-uavhengig kokainsøking som kan redusere effekten av prosedyren, selv om dette ikke er direkte testet14 . Det er flere punkter gjennom hele protokollen der validering av riktig konstruksjon og funksjon av optiske fibre vil bidra til å sikre vellykket optisk stimulering. Det er nødvendig å score ferrules riktig for å forhindre tap fra hodehetten og polere optiske fibre, og for å teste at tap av lyseffekt gjennom implantatene ikke overstiger 30%9. I tillegg er laserstimuleringsparametrene viktige hensyn. Laseren bør brukes med relativt lav effekt (5-7 mW). Vedvarende, lavfrekvent stimulering brukes til å indusere LTD, og dette kan funksjonelt valideres ved å måle MGN-LA synaptisk styrke med elektrofysiologiske opptak. Endelig indikerte resultatene en signifikant reduksjon i cue-indusert gjenoppretting med en endelig n på 10 dyr per gruppe, men eksperimenter bør forvente å starte med en større n, da det er sannsynlig at noen dyr må utelukkes fra endelig analyse. Det er avgjørende å verifisere riktig anatomisk plassering og ekspresjon av virus og optiske fibre, og å bare bruke data fra dyr der histologi er verifisert.
Til tross for den robuste atferdseffekten på kokainsøking observert med denne protokollen, er det flere begrensninger som må vurderes. For det første har metoden bare blitt testet på rotter som ble trent med et enkelt audiovisuelt signal sammen med kokain. Det er ikke klart hva som ville skje i et scenario der flere forskjellige signaler ble betinget, noe som ville være en mer nøyaktig representasjon av menneskelig avhengighet, hvorved flere miljøstimuli blir sterkt forbundet med narkotikabruk15,16,17. Bevis fra vårt laboratorium indikerer at evnen til optogenetisk LTD til å redusere narkotikasøkende skyldes en reduksjon i synaptisk styrke som svekker stoff-cue-assosierte minner. Det er imidlertid ikke klart i hvilken grad nøytrale eller minner som ikke er forbundet med selvadministrasjon av kokain, kan bli påvirket av denne protokollen. Videre, mens metoden bare påvirker synaptisk styrke på en krets, kan andre kretser også være viktige for koding av minne og / eller kjøring kokain søker atferd18,19,20. Til slutt bør det bemerkes at LTD bare kan induseres ved synapser der virus er tilstrekkelig uttrykt, noe som sannsynligvis etterlater noen synaptiske forbindelser upåvirket av stimuleringsprotokollen, noe som potensielt begrenser atferdspåvirkning. Videre tyder bevis på at bare små ensembler av nevroner og synapser er involvert i kodingen av et bestemt minne, noe som gir troverdighet til ideen om at LTD-induksjon i en hel hjernegruppe ikke er den beste strategien for å utføre atferdsendring, mens andre tilnærminger eksisterer for å spesifikt målrette cue- eller kontekstuelt aktive populasjoner av nevroner21, 22. Til tross for dette er protokollen effektiv til å dempe signalmotivert narkotikasøking, sannsynligvis fordi lavfrekvent optisk stimulering begrenser LTD-induksjon til synapser som tidligere har blitt forsterket av gjentatte kokain-kø-parringer4.
Denne protokollen gir et betydelig fremskritt til mer brukte optogenetiske atferdsstudier der aktiviteten til nevroner aktiveres eller hemmes mens dyret utfører oppførselen i sanntid19,23. I stedet brukes optogenetikk her som et nevromodulerende verktøy for å reversere kokainindusert plastisitet. En fordel med denne metoden er at den optogenetiske manipulasjonen er uavhengig av atferdstesten, slik at potensielle forstyrrende effekter av optogenetikk (f.eks. Lokale kretseffekter, ildfast periode etter lysstimulering, antidromiske stimuleringseffekter, etc. 24 bør ikke påvirke resultatene, og dermed øke tilliten til at den hypotetiske nevrale mekanismen formidler endringer i atferd. Denne metoden kan derfor brukes i en rekke applikasjoner som undersøker hvordan synaptisk plastisitet, spesielt en økning i synaptisk styrke som forekommer med LTP, relaterer seg til endringer i atferd. Lignende tilnærminger kan også være relevante for klinisk anvendelse av nevrale stimuleringsteknologier der unormale forbindelser i hjernen som driver dysfunksjonell atferd kan nedreguleres. På samme måte, fordi oChIEF-viralkonstruksjonen reagerer på både lav- og høyfrekvente stimuleringer, er det potensielle anvendelser på disse metodene utenfor omfanget av de beskrevne forsøkene. For eksempel kan optogenetisk indusert LTP være gunstig for å reversere underskudd i plastisitet som finnes i et bredt spekter av nevrodegenerative og nevrodevelopmental lidelser25. Videre har toveis plastisitet ved MGN-LA-synapser også vært direkte knyttet til regulering av atferd som er relevant for fryktassosierte lidelser8.
Modulering av de spesifikke nevrale kretsene som støtter narkotikamotivert atferd er avgjørende for å etablere langsiktig avholdenhet fra narkotikabruk. Denne protokollen benytter nye fremskritt innen in vivo optogenetikk for å reversere plastisiteten i en presis nevral krets som styrkes ved gjentatt selvadministrasjon av kokain i nærvær av miljømessige signaler. Resultatet av denne spesifikke nevromoduleringen er en redusert sannsynlighet for at påfølgende køeksponeringer utløser en kokainsøkende respons, noe som kan ha viktige implikasjoner for utviklingen av fremtidige terapier for rusmiddelforstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra USPHS tilskudd K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR), og Pennsylvania Department of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
