Summary
Dette arbejde beskriver en protokol for en multikopi suppressor genetisk skærm i Schizosaccharomyces pombe. Denne skærm bruger et genom-dækkende plasmidbibliotek til at identificere suppressorklon (er) af en funktionstabsfænotype forbundet med en forespørgselsmutantstamme. Nye genetiske suppressorer af ell1 null mutant blev identificeret ved hjælp af denne skærm.
Abstract
Identifikation af genetiske interaktioner er et kraftfuldt værktøj til at dechiffrere genets funktioner ved at give indsigt i deres funktionelle forhold til andre gener og organisering i biologiske veje og processer. Selvom størstedelen af de genetiske skærme oprindeligt blev udviklet i Saccharomyces cerevisiae, er en komplementær platform til udførelse af disse genetiske screeninger blevet leveret af Schizosaccharomyces pombe. En af de almindelige tilgange, der bruges til at identificere genetiske interaktioner, er ved overekspression af kloner fra et genomdækkende, højkopi-talplasmidbibliotek i en funktionstabsmutant efterfulgt af udvælgelse af kloner, der undertrykker den mutante fænotype.
Dette papir beskriver en protokol til udførelse af denne 'multicopy suppression'-baserede genetiske skærm i S. pombe. Denne skærm har hjulpet med at identificere multikopiundertrykkere af den genotoksiske stressfølsomme fænotype forbundet med fraværet af Ell1-transkriptionsforlængelsesfaktoren i S. pombe. Skærmen blev initieret ved transformation af forespørgsels-ell1-nulmutantstammen med et højkopinummer S. pombe cDNA-plasmidbibliotek og udvælgelse af suppressorerne på EMM2-plader indeholdende 4-nitroquinolin 1-oxid (4-NQO), en genotoksisk stressinducerende forbindelse. Derefter blev plasmid isoleret fra to shortlistede suppressorkolonier og fordøjet af restriktionsenzymer for at frigive insert-DNA'et. Plasmider frigiver et insert DNA-fragment blev retransformeret til ell1-deletionsstammen for at bekræfte disse suppressorplasmidkloners evne til at genoprette væksten af ell1-deletionsmutanten i nærværelse af 4-NQO og andre genotoksiske forbindelser. De plasmider, der viste en redning af deletionsfænotypen, blev sekventeret for at identificere det eller de gener, der er ansvarlige for undertrykkelsen af ell1-deletionsassocierede genotoksiske stressfølsomme fænotyper.
Introduction
Netværk af genetiske interaktioner giver funktionel information om gener og afgrænser veje og biologiske processer, som disse gener kan være involveret i in vivo. Derudover kan de også give indsigt i, hvordan forskellige gener interagerer med hinanden, hvilket resulterer i en specifik fænotype 1,2,3. I årenes løb er en række genetiske skærme blevet designet af forskere til at besvare grundlæggende biologiske spørgsmål og studere menneskelige sygdomme. Skærme til identifikation af genetiske interaktioner kan udføres på flere måder. Genetiske interaktioner identificeret i forskellige genetiske skærme kan repræsentere forskellige mekanistiske forhold mellem gener. Desuden har undersøgelser afsløret, at et fælles sæt genetiske interaktioner deles af gener, der koder for proteiner, der tilhører samme vej eller kompleks 4,5. Således kan genetiske interaktionsnetværk bruges til at etablere den funktionelle organisation i en celle, hvor gener, der deler de mest lignende profiler, tilhører det samme kompleks eller den samme vej, de gener, der deler noget mindre lignende profiler, tilhører den samme biologiske proces, og de gener, der udviser overlappende, men mere forskelligartede profiler, afspejler medlemmer, der tilhører det samme cellulære rum6.
Genetiske interaktionsskærme baseret på doseringsundertrykkelse ('high-copy eller multicopy suppression') er en af de almindeligt anvendte tilgange. Disse skærme kan udføres ved at transformere en forespørgselsmutantstamme med et genomisk eller cDNA-bibliotek med højt kopinummer efterfulgt af passende assays / udvælgelsesteknikker til at identificere undertrykkelse eller forbedring af genetiske interaktioner 7,8,9. For at sikre en omfattende genomdækkende dækning er disse screeninger også blevet udført ved at overudtrykke et specifikt gen af interesse i en samling af genom-dækkende tab-af-funktionsmutant eller ved at overudtrykke et plasmidkodet genomisk eller cDNA-bibliotek med højt kopinummer i en funktionstabsforespørgselsmutant 9,10,11,12,13,14,15 . Multicopy-strategien kunne også fungere ved hjælp af en dominerende / overudtrykstilgang ved hjælp af en regulerelig promotor.
De vigtigste fordele ved at bruge suppressorbaserede skærme er, at undertrykkelse af en allerede eksisterende fænotype i en mutant stamme af et andet gen etablerer et genetisk forhold mellem disse to genprodukter, som måske ikke er blevet demonstreret ved hjælp af andre tilgange. For det andet er det blevet observeret, at tilstedeværelsen af en allerede eksisterende mutation sensibiliserer en bestemt vej, hvilket gør det muligt at identificere yderligere komponenter i denne vej ved isolering af suppressorer, som muligvis ikke er blevet identificeret ved mere direkte genetiske udvælgelser. Desuden kan denne skærm bruges til at identificere suppressorer, der har forskellige undertrykkelsesmekanismer16. Suppressorinteraktioner forekommer normalt mellem gener, der er funktionelt relaterede og kan bruges til at belyse hierarkier i veje. Den nøjagtige underliggende undertrykkelsesmekanisme kan variere baseret på flere faktorer, herunder typen af forespørgselsmutant, der anvendes på skærmen, eksperimentelle betingelser og niveauet af genekspression. En af de almindelige doseringsundertrykkelsesmekanismer involverer gener, der koder for produkter, der fungerer sammen i samme kompleks eller parallelt i den samme cellulære / biologiske proces. Resultaterne af sådanne skærme i enklere modelorganismer som gær kan udvides til højere eukaryote organismer, da de fleste grundlæggende biologiske veje og processer bevares på tværs af evolutionen.
Disse genetiske skærme kan også ændres på flere måder for at besvare forskellige biologiske spørgsmål. For eksempel kan ortologe gener fra forskellige organismer, der kan undertrykke fænotypen af forespørgselsmutantstammen, identificeres. Det er også blevet brugt til at afgrænse potentielle resistensmekanismer og bestemme proteinmål for nye antibakterielle17,18, svampedræbende19,20, antiparasitiske 21 og anticancer 22 forbindelser. Denne skærm er også blevet udnyttet til at identificere suppressorer af aktiviteten af farmaceutiske lægemidler, hvis virkningsmekanisme ikke er kendt. Således kan disse multikopi-suppressorskærme i princippet optimeres og bruges i en række applikationer i forskellige organismer. Selvom de fleste af de genetiske skærme, der anvendes af gærforskere, oprindeligt er udviklet i S. cerevisiae, er S. pombe opstået som et komplementært modelsystem til udførelse af forskellige genetiske skærme og assays23. Desuden viser genomisk organisation og biologiske processer i S. pombe, såsom forekomst af introns i flere gener, kompleksitet af oprindelsen af DNA-replikation, centromerstruktur, organisering af cellecyklussen og tilstedeværelsen af RNAi-maskineriet, større lighed mellem S. pombe og højere eukaryoter23,24, hvilket understreger vigtigheden af at designe og bruge genetiske værktøjer i S. pombe.
Dette papir beskriver en protokol til identifikation af genetiske interactors baseret på 'doseringsundertrykkelse' af en funktionstabsmutant fænotype i S. pombe. Grundlaget for denne protokol er, at det er en hurtig og effektiv metode til at screene et cDNA-bibliotek, der overudtrykker vildtypegener enten på et multikopiplasmid og / eller fra en stærk promotor. Denne protokol har fire hovedtrin: omdannelse af biblioteket til en forespørgselsmutantstamme, udvælgelse af plasmidkloner, der undertrykker den ønskede fænotype af forespørgselsmutantstammen, hentning af plasmidet (e) fra disse suppressorkloner og identifikation af genet, der er ansvarlig for undertrykkelsen af fænotypen. Som det er tilfældet for enhver metode baseret på udvælgelse og identifikation af cDNA'er fra et bibliotek, afhænger skærmens succes af at bruge et bibliotek af høj kvalitet og høj kompleksitet, da skærmen kun kan hente de cDNA-kloner, der er til stede i biblioteket.
Ved hjælp af denne protokol har vi med succes identificeret to nye suppressorer af den genotoksiske stressfølsomme fænotype af forespørgslen S. pombe ell1 null mutant. ELL -familien (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) af transkriptionsforlængelsesfaktorer undertrykker forbigående pause af RNA-polymerase II på DNA-skabeloner i in vitro biokemiske assays og bevares på tværs af forskellige organismer, fra fissionsgær til mennesker25. Tidligere arbejde har vist bevis for, at en S. pombe ell1 null mutant viser genotoksisk stressfølsomhed i nærvær af 4-nitroquinolin 1-oxid (4-NQO) og methylmethanesulfonat (MMS)26. Derfor omdannede vi et S. pombe plasmidkodet multicopy cDNA-bibliotek til forespørgslen S. pombe ell1 null mutant og identificerede to formodede kloner, der udviste evnen til at undertrykke den genotoksiske stressfølsomhed af S. pombe ell1 null mutant i nærværelse af 4-NQO, en forbindelse, der inducerer DNA-læsioner. Efterfølgende sekventering af insertet i plasmidklonerne identificerede, at generne, der koder for rax2+ og osh6+, var ansvarlige for at undertrykke den genotoksiske stressfølsomhed af ell1 null mutant, når den blev overudtrykt i ell1 null-mutanten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transformation af cDNA-biblioteket til forespørgslen S. pombe mutant stamme til screening for multicopy suppressors
BEMÆRK: Standard lithium-acetatmetoden27 blev fulgt for at omdanne S. pombe cDNA-biblioteket til forespørgslen S. pombe ell1Δ-stammen med et par ændringer:
- S. pombe ell1Δ-stammen vokser ved 32 °C på en YE-medium (tabel 1) plade suppleret med 225 μg/ml hver af adenin, leucin og uracil. Podet en løkke fuld af inokulum af ell1Δ stamme fra ovenstående plade i 15-20 ml YE medium suppleret med 225 μg / ml hver af adenin, leucin og uracil. Inkuber det natten over ved 32 ° C med omrystning (200-250 o / min).
- Næste dag fortyndes natten over i 100 ml frisk YE medium med de ønskede kosttilskud til en OD 600 nm (optisk tæthed ved 600 nm) på 0,3 og inkuberes ved 32 ° C med omrystning ved 200-250 o / min, indtil OD600 nm når midten af logfasen.
- Opdel 100 ml kulturen i to 50 ml centrifugerør efterfulgt af centrifugering ved stuetemperatur i 10 minutter ved 4.000 × g.
- Supernatanten kasseres, og cellepelleten vaskes med 1 ml sterilt vand, dvs. cellerne resuspenderes i 1 ml sterilt vand og centrifugeres ved 4.000 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, og hver cellepellet vaskes med 1 ml 1x LiAc-TE (100 mM lithiumacetat, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7,5) opløsning som beskrevet i trin 1.4.
- Supernatanten fjernes, og hver cellepellet gensuspenderes i 250 μL 1x LiAc-TE. Brug disse S. pombe kompetente celler (500 μL) til transformation med DNA af interesse. Overfør 125 μL af de kompetente celler til fire forskellige sterile mikrocentrifugerør til efterfølgende transformationstrin.
- Kog bærer-DNA fra laksetestikler eller sildesæd i 1 min og læg straks på is. For hver transformation tilsættes 10 μL 10 mg/ml denatureret, enkeltstrenget bærer-DNA til mikrocentrifugerøret indeholdende 125 μL af de kompetente celler efterfulgt af skånsom blanding ved hjælp af en mikropipettespids. Derefter tilsættes 50 μg af S. pombe cDNA-biblioteket til det kompetente cellebærer-DNA-blandingsholdige mikrocentrifugerør.
- Inkuber mikrocentrifugerørene ved stuetemperatur i 10 min, og tilsæt derefter 260 μL polyethylenglycol-lithiumacetatopløsning (40% [w/v] PEG 4.000, 100 mM lithiumacetat, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7,5) til rørene og bland forsigtigt ved hjælp af en mikropipettespids.
- De mikrocentrifugerør, der indeholder omdannelsesblandingen, inkuberes ved 32 °C i 2 timer uden at ryste. Der tilsættes 43 μL forvarmet dimethylsulfoxid (DMSO) til mikrocentrifugerøret og blandes forsigtigt. Udsæt derefter rørene for varmechok ved 42 °C i 5 min.
- Pellet cellerne ved 4.000 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten, og fjern den resterende PEG-LiAc-TE-opløsning ved hjælp af en mikropipettespids.
- Resuspender cellerne i 100 μL sterilt vand og plade på en EMM2 (tabel 1) plade (150 mm) med nødvendige kosttilskud og 0,2 μg / ml 4-NQO.
- Pladerne inkuberes ved 32 °C i 5-6 dage, så kolonierne kan vises på pladerne. Stribe de opnåede kolonier på samme mediumplade i nærværelse af 0,2 μg / ml 4-NQO og brug til yderligere screening.
- For et bibliotekstransformationseksperiment skal du bruge 500 μL kompetente celler (125 μL kompetente celler x 4 mikrocentrifugerør) til transformation som beskrevet i trin 1.8 til 1.14 ovenfor.
- Som en kontrol, plade 1/10 af transformationsblandingen på en EMM2-plade (150 mm) med nødvendige kosttilskud, men mangler 4-NQO, for at beregne det samlede antal bibliotekskloner opnået efter transformation af biblioteket og skærm for isoleringaf suppressorklonerne.
2. Test og valider redning/undertrykkelse af fænotypen forbundet med forespørgselsmutantstammen af den formodede suppressor
BEMÆRK: Stresspletanalyser blev udført som beskrevet nedenfor for at teste og validere redning / undertrykkelse af ell1-deletionsassocieret 4-NQO-stressfølsomhed af den formodede suppressor (er).
- Tilsæt 100-200 μL sterilt vand i hver af de forskellige brønde i en steril 96-brønds mikrotiterplade.
- Pluk en lille mængde podekultur fra hver af de forskellige kolonier opnået efter cDNA-bibliotekstransformation på pladen indeholdende 4-NQO ved hjælp af en steril tandstikker eller en 20-200 μL mikropipettespids. Tilsæt podemuskulaturen fra hver af de forskellige kolonier i separate uafhængige brønde af mikrotiterpladen indeholdende 100-200 μL sterilt vand. Bland grundigt.
- Spot 3 μL af cellesuspensionen fra hver brønd på EMM2 agarplader indeholdende adenin (225 μg/ml) og uracil (225 μg/ml), men mangler leucin (den valgbare auxotrofiske markør, der findes på plasmidvektoren, der anvendes til konstruktion af det bibliotek, der anvendes i dette arbejde). Tilsæt passende koncentrationer af 4-NQO til pladerne efter behov.
- Inkuber pladerne ved 32 °C i 3-4 dage for at lade cellerne vokse. Identificer de kolonier, der viser vækst i tilstedeværelsen af forskellige koncentrationer af 4-NQO som formodede suppressorer.
- For yderligere at validere suppressorerne skal de udvalgte suppressorer vokse sammen med passende kontrolstammer natten over ved 32 ° C med omrystning (200-250 o / min) i EMM2-medium indeholdende 225 μg / ml hver af adenin og uracil, men mangler leucin.
- Næste dag fortyndes cellerne til en OD 600 nm på 0,3 i frisk EMM2-medium og vokser dem ved 32 ° C med omrystning indtil midten af logfasen (ca.OD 600 nm på 0,6-0,8).
- Spot passende serielle fortyndinger (1:10 eller 1:5) af kulturer på EMM2-plader med nødvendige kosttilskud indeholdende enten 0,4 μM 4-NQO eller 0,01% MMS. For kontrol skal du se stammerne på en EMM2-plade med nødvendige kosttilskud, men mangler noget DNA-skadeligt middel.
- Inkuber pladerne ved 32 °C i 3-5 dage for at overvåge væksten.
BEMÆRK: Egnede assays baseret på fænotypen forbundet med forespørgselsmutantstammen skal bruges til at teste redning eller undertrykkelse af fænotypen. For eksempel, hvis suppressorer af en koldfølsom fænotype af en forespørgselsmutantstamme skal identificeres, vil analysen til test og validering af suppressorklonerne involvere voksende transformanter ved lav temperatur. - Spot de mutante stammer transformeret med fuld længde gen af interesse (Spell1 i dette tilfælde) eller tom vektor som henholdsvis positive og negative kontroller sammen med bibliotekets transformanter.
3. Isolering af plasmidet fra S. pombe-suppressorklonerne
BEMÆRK: Plasmidisolering fra S. pombe blev udført ved at følge protokollen beskrevet i Fissionsgær: en laboratoriemanual28 med nogle få ændringer.
- Pod en enkelt gærkoloni i EMM2-medium indeholdende 225 μg / ml adenin og uracil og dyrk cellerne natten over ved 32 ° C med omrystning ved 200-250 o / min. Næste dag høstes 5 O.D. celler (dvs. 10 ml kultur af O.D. 0,5) ved centrifugering i 2 minutter ved 4.000 × g ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og cellepelleten gensuspenderes i 0,2 ml lysisbuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) og 1 mM Na2EDTA).
- Tilsæt 0,2 ml phenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1) og 0,3 g syrevaskede glasperler til mikrocentrifugerøret. Hvirvel mikrocentrifugerøret i 2 min ved 4 °C og inkuberes på is i 1 min. Gentag dette trin 6x.
- Centrifuger røret ved 10.000 × g i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør det øvre vandige lag til et frisk mikrocentrifugerør og tilsæt 200 μL phenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1).
- Centrifuger røret ved 10.000 × g i 10 min. Overfør det øvre vandige lag til et frisk rør og tilsæt to volumener 100% ethanol (~ 400 μL) og 1/10 volumen natriumacetat (3 M, pH 5,8) (~ 20 μL) til røret. Mikrocentrifugerøret -70 °C inkuberes i 1 time.
- Dna'et udfældes ved centrifugering ved 10.000 × g i 15 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes. Vask DNA-pelleten med 70% ethanol (~ 500 μL) og hold den ved stuetemperatur til lufttørre.
- Dna'et genudsættes i 20 μL sterilt vand. Brug 2-5 μL plasmid-DNA til transformation af kompetente E. coli-celler.
BEMÆRK: Plasmid kan også isoleres fra gærceller ved hjælp af et hvilket som helst af de kommercielt tilgængelige gærplasmidisoleringssæt.
4. Identifikation af genet kodet af suppressorklonen
- Omdan de isolerede gærplasmider til E. coli Top10 stamme [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] ved hjælp af standardprotokollen29 og spred cellerne på LB (Luria Broth) plader med nødvendige antibiotika.
- Plasmi(erne) isoleres fra E. coli-transformanter ved hjælp af standard alkalisk lyseprotokol29, og følg de relevante kombinationer af restriktionsenzymer for at kontrollere, om insert-DNA-fragmentet frigives ved restriktionsfordøjelse.
BEMÆRK: Suppressor plasmid 84 blev fordøjet med Bam HI restriktionsenzym, og Suppressor plasmid 104 blev fordøjet med PstI / BamHI restriktionsenzymer. - Retransform plasmiderne, der viser insertfrigivelse efter restriktionsfordøjelse i ell1 Δ-stammen for at kontrollere deres evne til at redde den genotoksiske stressfølsomme fænotype af ell1Δ-stammen.
- Vælg plasmidklonerne, der viser undertrykkelse af den genotoksiske stressfølsomhed, og sekventer insert-DNA-fragmentet, der er til stede i disse plasmidkloner ved hjælp af vektorspecifikke fremad- og omvendte primere.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev den adh1-promotorspecifikke universelle fremadgående primer (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3') anvendt30. - For at identificere det gen, der er ansvarlig for undertrykkelsen, justeres sekvensen opnået ved hjælp af NCBI-nukleotidblast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) eller Pombase-sekvensjusteringsværktøj (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Vælg sekvensen, der viser maksimal justering, og identificer den som genet for multikopi-suppressorplasmidet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Screening for multikopi-suppressor(er) af ell1-deletionsassocieret genotoksisk stressfølsomhed hos S. pombe
Vi udførte den genetiske skærm ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor for at identificere multikopi-suppressorer af funktionstabsfænotypen af forespørgsels-ell1-sletningsmutantstammen. Den vækstrelaterede følsomhed af ell1-deletionsstammen, der blev observeret i nærværelse af det 4-NQO genotoksiske middel, blev vedtaget som funktionstabsfænotype for at vælge for multikopi-suppressorer. Figur 1 viser en skematisk gengivelse af den genetiske skærm. For at starte skærmen blev den genotoksiske stressfølsomhed for ell1-deletionsmutanten (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1Δ :: kanMX6) først bekræftet med hensyn til dens isogene vildtypestamme (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) i nærværelse af 4-NQO (figur 2A). Efterfølgende blev forespørgslen S. pombe ell1 null mutant transformeret med et højkopinummer S. pombe cDNA-bibliotek for at vælge for de plasmidkloner, der kunne undertrykke / redde den 4-NQO vækstrelaterede følsomhed af ell1 null-mutanten. Dette bibliotek indeholder ~ 6 × 105 S. pombe cDNA-fragmenter klonet i pLEV3 S. pombe overekspressionsvektoren under kontrol af adh1-promotoren 30. Som en kontrol blev 1/10 af transformationsblandingen også belagt på EMM2-plader, der manglede 4-NQO for at beregne det samlede antal rekombinante kloner opnået efter transformation af biblioteket, en indikation af bibliotekets dækning og screenet for isoleringaf suppressorklonerne. Dette er kritisk, da screening af færre kloner vil reducere muligheden for at identificere suppressorklonerne.
Figur 2B viser repræsentative billeder af betjeningsanordningen og 4-NQO-holdige plader. Som vist på figuren opnås et stort antal kolonier på kontrolpladen, der mangler 4-NQO, der viser en god dækning af biblioteket. Som forventet blev der opnået færre transformanter på 4-NQO-pladen, da disse transformanter sandsynligvis repræsenterer de formodede suppressorer af 4-NQO-følsomheden af ell1-nulmutanten . Dernæst blev de forskellige transformante kolonier opnået på EMM2-plader indeholdende 0,2 μM 4-NQO yderligere stribet eller plettet på EMM2-plader indeholdende 0,2 μM 4-NQO for at bekræfte disse transformanters evne til at vokse i nærværelse af 4-NQO. Det blev observeret, at 620 transformante kolonier var i stand til at vokse på 0,2 μM 4-NQO-holdige EMM2-plader.
Validering af de formodede suppressorkloners evne til at genoprette væksten af ell1-deletionsmutant under genotoksiske stressforhold
For at bekræfte de formodede suppressorer er det vigtigt at teste redningen af den ønskede fænotype under højere strenghedsbetingelser som vist i den skematiske repræsentation (figur 3A). Derfor blev de 620 shortlistede transformanter spottet på EMM2-plader med 0,4 μM 4-NQO. Som det fremgår af figur 3B, viste kun 74 transformanter vækst ved 0,4 μM 4-NQO. Efterfølgende blev disse 74 transformanter spottet på EMM2-plader indeholdende 0,8 μM 4-NQO, og det blev observeret, at kun 16 viste vækst i nærvær af 0,8 μM 4-NQO (figur 3C). For yderligere at bekræfte disse observationer blev disse 16 transformanter set på EMM2-plader med nødvendige kosttilskud, der indeholdt enten 0,8 μM 4-NQO eller ingen 4-NQO (kontrol) sammen med ell1-deletionsmutanten transformeret med tom vektor. Resultaterne af disse spotting-assays afslørede, at ell1-deletionsstammen transformeret med tom vektor samt alle de 16 transformanter som forventet viste vækst på pladen, der manglede 4-NQO. Til sammenligning, mens ell1-deletionsmutanten, der kun indeholdt den tomme vektor, ikke viste nogen vækst ved 0,8 μM 4-NQO, udviste seks transformanter vækst ved 0,8 μM 4-NQO (figur 3D), hvilket tyder på, at biblioteksklonen (e), der var til stede i dem, havde evnen til at undertrykke den genotoksiske stressfænotype af ell1 null-mutanten.
Identifikation af genet kodet af suppressorklonen
Vi valgte derefter 02 genetiske suppressorer af ell1-deletionsstammen, sup 84 og sup 104, hvilket viser fuldstændig undertrykkelse af den ell1-associerede vækstfølsomhed i nærværelse af 4-NQO. Bibliotekets plasmidklon (r) blev isoleret fra disse to gærundertrykkere og omdannet til kompetente E. coli-celler. Derefter blev plasmid isoleret fra E. coli-celler ved anvendelse af standardprotokoller31. De to isolerede plasmider, mærket som 84 og 104, blev udsat for restriktionsfordøjelse, som afslørede tilstedeværelsen af henholdsvis ca. 1.000 bp og 800 bp indsæt DNA-fragmenter (figur 4A, B). For yderligere at validere resultaterne af denne suppressorskærm blev disse plasmider omdannet til ell1-sletningsmutanten og kontrolleret, om de kunne genoprette væksten af ell1-nulmutanten i nærværelse af 4-NQO. Stresspletanalyserne afslørede, at suppressorplasmidklonerne resulterede i undertrykkelse af den 4-NQO-associerede vækstfølsomhed, når de blev genindført i ell1-nulmutanten, hvilket tyder på, at undertrykkelsen var plasmidafhængig (figur 4C). Desuden besluttede vi at afgøre, om disse suppressorkloner også kunne undertrykke den vækstrelaterede følsomhed af ell1-deletionsstammen i nærværelse af en anden DNA-skadefremkaldende forbindelse, MMS. Spotanalyserne viste, at transformation af suppressorplasmidklonerne til ell1-nulmutanten resulterede i mere vækst på MMS-holdigt medium end transformation af ell1-deletionsmutanten med tom vektor, hvilket indikerer, at disse plasmidkloner kunne undertrykke den genotoksiske stressfølsomhed for ell1-deletionsmutanten i nærværelse af begge genotoksiske midler, dvs. 4-NQO og MMS (figur 4D).
For at identificere genet til stede i disse suppressorplasmidkloner blev sekventering af insert-DNA-fragmentet derefter udført ved anvendelse af den adh1-promotorspecifikke universelle fremadgående primer30. Den opnåede nukleotidsekvens blev søgt ved hjælp af 'BLAST at Ensembl' -værktøjet, der var tilgængeligt på PomBase-webstedet (https://www.pombase.org), som afslørede, at de to plasmidkloner 84 og 104 indeholdt henholdsvis rax2+ og osh6+ gener, hvilket gav bevis for, at Rax2 og Osh6 var ansvarlige for at undertrykke den genotoksiske stressfølsomme fænotype forbundet med fravær af ell1+ i S. pombe . Viden om funktionerne af begge disse proteiner i S. pombe er begrænset. Rax2 har vist sig at regulere lokaliseringen af For3p for at kontrollere cellepolariteten under vegetativ vækst i S. pombe32. Osh6 er et lipidtransportprotein, der tilhører den oxysterolbindende proteinrelaterede proteinfamilie. Det er involveret i transporten af phosphatidylserin fra det endoplasmatiske retikulum til plasmamembranen33.
Figur 1: Skematisk repræsentation af den genetiske multikopi-suppressorskærm. Denne protokol har fire hovedtrin: omdannelse af biblioteket til en forespørgselsmutantstamme, udvælgelse af plasmidkloner, der undertrykker den ønskede fænotype af forespørgselsmutantstammen, hentning af plasmidet (e) fra disse suppressorkloner og identifikation af genet, der er ansvarlig for undertrykkelsen af fænotypen. Forkortelse: 4-NQO = 4-nitroquinolin 1-oxid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Screening for multikopi-suppressor(er) af ell1-deletionsassocieret genotoksisk stressfølsomhed hos S. pombe. (A) Stresspletanalyse, der viser 4-NQO-følsomhed af ell1-slettet S. pombe-stamme sammenlignet med dens isogene vildtypestamme. Serielle fortyndinger (1:10) af passende stammer blev spottet på EMM2-medium indeholdende 225 μg/ml hver af adenin, leucin og uracil med eller uden (kontrol) 0,4 μM 4-NQO. Pladerne blev derefter inkuberet i 3-5 dage ved 32 °C. (B) Et cDNA-bibliotek med højt kopinummer blev omdannet i ell1-slettet S. pombe-stamme , og transformerede kolonier blev belagt på EMM2-medium, der manglede leucin, men indeholdt 0,2 μM 4-NQO. En lille aliquot af transformationsblandingen blev også belagt på EMM2-plader, der manglede 4-NQO, som en kontrol. Pladerne blev inkuberet ved 32 °C i 5-6 dage og fotograferet. Panel B viser et repræsentativt billede af disse plader. Forkortelse: 4-NQO = 4-nitroquinolin 1-oxid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Validering af formodede suppressorkloners evne til at undertrykke den genotoksiske stressfølsomhed af ell1-deletionsmutanten. (A) En skematisk repræsentation af screeningen af bibliotekstransformanterne ved at teste undertrykkelse af den ønskede fænotype. Vækst på 620 transformanter blev testet på stigende koncentrationer af 4-NQO ved at spotte forskellige transformanter på EMM2-plader, der manglede leucin og indeholdt enten (B) 0,4 μM 4-NQO eller (C) 0,8 μM 4-NQO. Pladerne blev inkuberet ved 32 °C i 5-6 dage og fotograferet. Der er vist repræsentative billeder af plader. (D) Seksten transformanter, der viste vækst på 0,8 μM 4-NQO, blev set på EMM2-plader, der manglede leucin, men indeholdt enten 0,8 μM 4-NQO eller ikke indeholdt 4-NQO (kontrol) sammen med ell1-sletningsstammen transformeret med tom vektor. Pladerne blev inkuberet ved 32 °C i 5-6 dage og fotograferet. Kun seks kolonier udviste evnen til at redde ell1-deletion associeret genotoksisk stressfølsomhed. Forkortelse: 4-NQO = 4-nitroquinolin 1-oxid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Identifikation af suppressorplasmidklonerne. Agarosegelbilleder af (A) restriktionsfordøjelse af suppressorplasmid 84 med BamHI-restriktionsenzym frigav en indsats på ~ 1 kb. (B) Suppressorplasmid 104 fordøjet med PstI / BamHI-restriktionsenzymer frigav en indsats på ~ 800 bp. (C) 1:10 serielt fortyndet ell1 nullmutant transformeret med plasmider, sup 84 eller sup 104, blev spottet på EMM2-plader, der manglede leucin og indeholdt enten 0,4 μM 4-NQO eller (D) 0,01% MMS. I kontrolplader blev der ikke tilsat noget DNA-skadeligt middel. Pladerne blev inkuberet ved 32 °C i 4-5 dage og fotograferet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Sammensætning af medier til vækst af S. pombe. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gær er blevet brugt i vid udstrækning til at undersøge de grundlæggende biologiske processer og veje, der evolutionært bevares på tværs af eukaryote organismer. Tilgængeligheden af genetiske og genomiske værktøjer sammen med deres modtagelighed for forskellige biokemiske, genetiske og molekylære procedurer gør gær til en fremragende modelorganisme til genetisk forskning34,35,36. I årenes løb er forskellige genetiske skærme blevet designet af gærforskere til at identificere genetiske interaktioner, der ville kaste lys over funktionerne i individuelle gener samt de veje og biologiske processer, hvor de kan være involveret 10,11,17,37. En af de almindelige og nyttige skærme til at identificere genetiske interaktioner er kendt som 'multicopy eller high copy number suppression'.
Denne skærm kræver en eller flere forespørgselsmutantstammer, der udviser en funktionstabsfænotype, efterfulgt af transformation af denne mutantforespørgselsstamme (r) med et genomisk eller cDNA-bibliotek med højt kopinummer. Derefter screenes de opnåede transformanter for at identificere de gener, som, når de overudtrykkes, undertrykker fænotypen forbundet med forespørgselsmutantstammen (e). Denne type genetisk interaktion mellem den specifikke mutante stamme og gen(er), der findes i plasmidbiblioteksklonerne, resulterer i isolering og identifikation af genprodukter, der sandsynligvis vil virke i samme vej eller påvirke den samme biologiske proces4. Således giver denne skærm indsigt i funktionerne i genet (e) af interesse og deres funktionelle organisation i veje og biologiske processer in vivo. Traditionelt er denne skærm blevet brugt i vid udstrækning i S. cerevisiae 38,39,40,41,42.
Målet med dette arbejde er at beskrive en enkel og ligetil protokol for udførelse af en multikopi undertrykkelse genetisk skærm i S. pombe. Vi udførte skærmen ved hjælp af en S. pombe-stamme, der bar en sletning af ell1-transkriptionsforlængelsesfaktoren. ELL er en familie af transkriptionsforlængelsesfaktorer, som er til stede i en lang række organismer, fra fissionsgær til mennesker. Funktionerne i Ell1 er først begyndt at blive forstået i S. pombe. Tidligere arbejde havde fremhævet Ell1's rolle i optimal vækst under normale vækstbetingelser og i overlevelse under genotoksiske stressforhold26. Vi har anvendt multikopi-suppressorscreeningen som en af tilgangene til at afdække den molekylære mekanisme, der ligger til grund for Ell1's rolle i genotoksisk stressfølsomhed i S. pombe26. Et multicopy plasmid-kodet S. pombe cDNA-bibliotek blev omdannet til S. pombe ell1 null-mutanten, der udviser følsomhed over for 4-NQO. Derefter blev de transformanter, der kunne vokse i nærværelse af 4-NQO, valgt.
Isolering af plasmider fra disse transformanter og sekventering af indsatser til stede i disse plasmider førte til identifikation af to nye genetiske interactors af ell1+ i S. pombe, rax2+ og osh6+. En tidligere undersøgelse ved hjælp af en lignende genetisk skærm i S. pombe har også identificeret anti-hæmmende protein, epe1+, som en multikopi suppressor af ell1 deletion-associerede fænotyper43. Vi har også brugt denne metode til at identificere multikopiundertrykkerne af den ikke-essentielle Rpb9-underenhed af S. pombe RNA-polymerase II (upublicerede observationer). Samlet validerer disse resultater nytten af den genetiske multikopi-suppressorscreeningsmetode som en metode til at identificere formodede gener / proteiner, der udviser genetisk interaktion med et ønsket gen af interesse, hvilket belyser funktionen, veje og processer, hvor genet af interesse kan være involveret.
For at bruge den skærm, der er beskrevet i dette arbejde, er det vigtigt først at have en forespørgselsmutantstamme, der udviser en klar fænotype forbundet med mutationen, som kan bruges til at isolere multikopiundertrykkeren (e). Desuden vil denne skærms succes afhænge af tilgængeligheden af et godt repræsentativt bibliotek af høj kvalitet, der indeholder kloner, der repræsenterer det maksimale antal vildtypegener eller deres tilsvarende cDNA'er. Traditionelt er både genomiske og cDNA-biblioteker blevet brugt i disse skærme, men cDNA-biblioteker har den fordel, at de er lavet af mRNA'er udtrykt i cellen / organismen. Desuden er en høj effektivitet af dens omdannelse til gærcellerne afgørende for skærmens succes, fordi det er vigtigt at screene et stort antal transformanter, hvilket øger sandsynligheden for at identificere suppressorer. Hvis der opnås færre transformanter på kontrolpladen efter omdannelse af biblioteket til forespørgselsmutantstammen ved hjælp af lithiumacetatprotokollen, kan elektroporation bruges til at omdanne biblioteket.
Det er også tilrådeligt først at standardisere transformationsprotokollen med et andet plasmid, før biblioteket omdannes. Ellers vil det unødigt resultere i tab af biblioteket. Den her beskrevne protokol anvender 4-NQO-følsomhed som mutantfænotype, men egnede screeningsmetoder/-analyser bør udformes til udvælgelse af suppressorer baseret på den specifikke mutante fænotype af interesse. Hvis der ikke opnås nogen eller meget få transformanter på pladen for at vælge for suppressorer efter omdannelse af biblioteket til forespørgselsmutantstammen, skal der, hvis det er muligt, anvendes mindre strenge betingelser / assays ved plettering af biblioteket for at vælge for suppressorer for at detektere så mange genetiske suppressorer som muligt, før de bekræftes under strenge betingelser. Ud over at bruge restriktionsfordøjelse til at teste for tilstedeværelsen af indsatsen i de identificerede suppressorplasmidkloner, kan PCR ved hjælp af vektorspecifikke primere bruges til at amplificere det ønskede insert-DNA-fragment. Alternativt kan suppressorplasmidklonerne gives direkte til sekventering, hvilket undgår behovet for restriktionsfordøjelse eller PCR.
Denne skærm kan også anvendes til andre gær end S. cerevisiae og S . pombe , hvis der findes et genetisk værktøjssæt med hensyn til passende mutantstammer, plasmider og promotorkonstruktioner, der vil lette overekspression af gener, hvilket gør det muligt at redde mutant fænotype, der er til stede i værtsgærcellen. Med tilgængeligheden af genomdækkende ressourcer, herunder indsamling af genom-dækkende deletionsmutanter44 og overekspressionsbiblioteker37, kan denne skærm også udføres ved transformation af en eller nogle få forespørgselsplasmider til et systematisk array af gærmutantstammeindsamling eller ved omdannelse af et systematisk array af overekspressionsplasmidindsamling til en eller nogle få mutantforespørgselsstammer45 . Afslutningsvis kan denne tilgang klart generaliseres til en lang række eksperimentelle spørgsmål i forskellige organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af et forskningstilskud fra Institut for Bioteknologi, Indiens regering (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) til Nimisha Sharma. Forfatterne takker prof. Charles Hoffman (Boston College, USA) for gaven af S. pombe cDNA-biblioteket og prof. Susan Forsburg for gærplasmiderne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-NQO | Sigma | N8141 | |
| Acetic Acid, glacial | Sigma | 1371301000 | |
| Adenine Sulphate | Himedia | GRM033 | |
| Agar | Himedia | GRM026 | |
| Agarose | Lonza | 50004L | |
| Ammonium Chloride | Himedia | MB054 | |
| BamHI | Fermentas | ER0051 | |
| Biotin | Himedia | RM095 | |
| Boric Acid | Himedia | MB007 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C4901 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma | C0549 | |
| Citric Acid | Himedia | RM1023 | |
| Disodium hydrogen phospahte anhydrous | Himedia | GRM3960 | |
| single stranded DNA from Salmon testes | Sigma | D7656 | |
| EDTA disodium | Sigma | 324503 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Himedia | RM6353 | |
| Glucose | Amresco | 188 | |
| Ionositol | Himedia | GRM102 | |
| Isopropanol | Qualigen | Q26897 | |
| Leucine | Himedia | GRM054 | |
| Lithium Acetatae | Sigma | 517992 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Himedia | MB040 | |
| Molybdic Acid | Himedia | RM690 | |
| Nicotinic Acid | Himedia | CMS177 | |
| PEG, MW 4000 | Sigma | 81240 | |
| Pentothinic Acid | Himedia | TC159 | |
| Phenol | Himedia | MB082 | |
| Plasmid Extraction Kit | Qiagen | 27104 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Potassium hydrogen Pthallate | Merc | DDD7D670815 | |
| Potassium iodide | Himedia | RM1086 | |
| RNAse | Fermentas | EN0531 | |
| SDS | Himedia | GRM205 | |
| Sodium Hydroxide | Himedia | GRM1183 | |
| Sodium Sulphate | Himedia | RM1037 | |
| Tris free Base | Himedia | MB209 | |
| Uracil | Himedia | GRM264 | |
| Yeast Extract Powder | Himedia | RM668 | |
| Zinc Sulphate Heptahydrate | Merc | DJ9D692580 |
References
- Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
- Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
- Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712 (2015).
- Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).
- Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).
- Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
- Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
- Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840 (2018).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
- Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
- Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
- Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
- Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
- Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
- Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
- Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
- Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
- Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
- Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
- Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
- Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
- Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
- Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
- Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).
- Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969 (2016).
- Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. Fission yeast: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932 (2006).
- Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090 (2006).
- Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
- Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601 (2021).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).
- Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
- Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
- Melnykov, A. V., Elson, E. L. MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444 (2019).
- Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
- Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
- Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
- Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
- Kim, D. -U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
- Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).
