Summary
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für einen Multicopy-Suppressor-Gen-Screen in Schizosaccharomyces pombe. Dieser Bildschirm verwendet eine genomweite Plasmidbibliothek, um Suppressorklone eines Funktionsverlust-Phänotyps zu identifizieren, der mit einem Abfragemutantenstamm assoziiert ist. Neuartige genetische Suppressoren der ell1-Nullmutante wurden mit diesem Screen identifiziert.
Abstract
Die Identifizierung genetischer Interaktionen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Funktionen von Genen zu entschlüsseln, indem Einblicke in ihre funktionellen Beziehungen zu anderen Genen und die Organisation biologischer Wege und Prozesse gegeben werden. Obwohl die meisten genetischen Screens ursprünglich in Saccharomyces cerevisiae entwickelt wurden, wurde von Schizosaccharomyces pombe eine ergänzende Plattform für die Durchführung dieser genetischen Screens bereitgestellt. Einer der häufigsten Ansätze zur Identifizierung genetischer Interaktionen ist die Überexpression von Klonen aus einer genomweiten Plasmidbibliothek mit hoher Kopienzahl in einer Funktionsverlustmutante, gefolgt von der Auswahl von Klonen, die den mutierten Phänotyp unterdrücken.
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Durchführung dieses auf "Multicopy Suppression" basierenden genetischen Screenings in S. pombe. Dieser Screen hat dazu beigetragen, Multicopy-Suppressoren des genotoxischen stresssensitiven Phänotyps zu identifizieren, die mit dem Fehlen des Ell1-Transkriptionsverlängerungsfaktors in S. pombe assoziiert sind. Das Screening wurde durch Transformation des Abfrage-ell1-Nullmutantenstamms mit einer S. pombe cDNA-Plasmidbibliothek mit hoher Kopienzahl und Auswahl der Suppressoren auf EMM2-Platten initiiert, die 4-Nitrochinolin-1-oxid (4-NQO), eine genotoxische stressinduzierende Verbindung, enthielten. Anschließend wurde Plasmid aus zwei in die engere Wahl gezogenen Suppressorkolonien isoliert und durch Restriktionsenzyme verdaut, um die Insert-DNA freizusetzen. Plasmide, die ein DNA-Fragment freisetzen, wurden in den ell1-Deletionsstamm retransformiert, um die Fähigkeit dieser Suppressorplasmidklone zu bestätigen, das Wachstum der ell1-Deletionsmutante in Gegenwart von 4-NQO und anderen genotoxischen Verbindungen wiederherzustellen. Die Plasmide, die eine Rettung des Deletionsphänotyps zeigten, wurden sequenziert, um die Gene zu identifizieren, die für die Unterdrückung des ell1-deletionsassoziierten genotoxischen stresssensitiven Phänotyps verantwortlich sind.
Introduction
Netzwerke genetischer Interaktionen liefern funktionelle Informationen über Gene und beschreiben Signalwege und biologische Prozesse, an denen diese Gene in vivo beteiligt sein können. Darüber hinaus können sie auch Einblicke geben, wie verschiedene Gene miteinander interagieren, was zu einem spezifischen Phänotyp 1,2,3 führt. Im Laufe der Jahre wurden eine Vielzahl von genetischen Screens von Forschern entwickelt, um grundlegende biologische Fragen zu beantworten und menschliche Krankheiten zu untersuchen. Screens zur Identifizierung genetischer Interaktionen können auf verschiedene Arten durchgeführt werden. Genetische Interaktionen, die in verschiedenen genetischen Screens identifiziert wurden, können unterschiedliche mechanistische Beziehungen zwischen Genen darstellen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass ein gemeinsamer Satz genetischer Interaktionen von Genen geteilt wird, die Proteine kodieren, die zum gleichen Signalweg oder Komplex gehören 4,5. So können genetische Interaktionsnetzwerke verwendet werden, um die funktionelle Organisation in einer Zelle zu etablieren, wobei Gene, die die ähnlichsten Profile teilen, zum gleichen Komplex oder Signalweg gehören, diejenigen Gene, die etwas weniger ähnliche Profile teilen, zum gleichen biologischen Prozess gehören und jene Gene, die überlappende, aber vielfältigere Profile aufweisen, Mitglieder widerspiegeln, die zum gleichen zellulären Kompartimentgehören 6.
Genetische Interaktionsscreens auf der Grundlage von Dosisunterdrückung ("High-Copy- oder Multicopy-Suppression") sind einer der am häufigsten verwendeten Ansätze. Diese Screens können durchgeführt werden, indem ein Abfragemutantenstamm mit einer Genom- oder cDNA-Bibliothek mit hoher Kopienzahl transformiert wird, gefolgt von geeigneten Assays/Selektionstechniken zur Identifizierung unterdrückender oder verstärkender genetischer Interaktionen 7,8,9. Um eine umfassende genomweite Abdeckung zu gewährleisten, wurden diese Screens auch durchgeführt, indem ein spezifisches Gen von Interesse in einer Sammlung genomweiter Funktionsverlust-Mutanten überexprimiert oder eine Plasmid-kodierte Genom- oder cDNA-Bibliothek mit hoher Kopienzahl in einer Funktionsverlust-Abfragemutante 9,10,11,12,13,14,15 überexprimiert wurde. . Die Multicopy-Strategie könnte auch mit einem dominanten/Überexpression-Ansatz unter Verwendung eines regierbaren Promotors funktionieren.
Die Hauptvorteile der Verwendung von suppressorbasierten Screens bestehen darin, dass die Unterdrückung eines bereits bestehenden Phänotyps in einem mutierten Stamm durch ein anderes Gen eine genetische Beziehung zwischen diesen beiden Genprodukten herstellt, die mit anderen Ansätzen möglicherweise nicht nachgewiesen wurde. Zweitens wurde beobachtet, dass das Vorhandensein einer bereits bestehenden Mutation einen bestimmten Signalweg sensibilisiert, so dass zusätzliche Komponenten dieses Signalwegs durch die Isolierung von Suppressoren identifiziert werden können, die möglicherweise nicht durch direktere genetische Selektionen identifiziert wurden. Darüber hinaus kann dieser Bildschirm verwendet werden, um Suppressoren zu identifizieren, die unterschiedliche Unterdrückungsmechanismen aufweisen16. Suppressor-Interaktionen treten normalerweise zwischen Genen auf, die funktionell verwandt sind und verwendet werden können, um Hierarchien in Signalwegen aufzuklären. Der genaue zugrunde liegende Mechanismus der Unterdrückung kann sich aufgrund mehrerer Faktoren unterscheiden, einschließlich der Art der im Bildschirm verwendeten Abfragemutante, der experimentellen Bedingungen und des Niveaus der Genexpression. Einer der häufigsten Mechanismen zur Unterdrückung der Dosierung betrifft Gene, die Produkte kodieren, die im selben Komplex oder parallel im selben zellulären / biologischen Prozess zusammenarbeiten. Die Ergebnisse solcher Screens in einfacheren Modellorganismen wie Hefe können auf höhere eukaryotische Organismen ausgedehnt werden, da die meisten grundlegenden biologischen Wege und Prozesse im Laufe der Evolution erhalten bleiben.
Diese genetischen Screens können auch auf verschiedene Arten modifiziert werden, um verschiedene biologische Fragen zu beantworten. So können beispielsweise orthologe Gene aus verschiedenen Organismen identifiziert werden, die den Phänotyp des Abfragemutantenstamms unterdrücken können. Es wurde auch verwendet, um potenzielle Resistenzmechanismen abzugrenzen und Proteinziele von neuartigen antibakteriellen17,18-, antimykotischen19,20-, antiparasitären 21- und Krebs-22-Verbindungen zu bestimmen. Dieser Bildschirm wurde auch genutzt, um Suppressoren der Aktivität von Arzneimitteln zu identifizieren, deren Wirkmechanismus nicht bekannt ist. Somit können diese Multicopy-Suppressor-Screens prinzipiell optimiert und in einer Vielzahl von Anwendungen in unterschiedlichen Organismen eingesetzt werden. Obwohl die meisten genetischen Screens, die von Hefeforschern verwendet werden, ursprünglich in S. cerevisiae entwickelt wurden, hat sich S. pombe als komplementäres Modellsystem für die Durchführung verschiedener genetischer Screens und Assays herauskristallisiert23. Darüber hinaus zeigen genomische Organisation und biologische Prozesse in S. pombe, wie das Vorkommen von Introns in mehr Genen, die Komplexität der Ursprünge der DNA-Replikation, die Zentromerstruktur, die Organisation des Zellzyklus und das Vorhandensein der RNAi-Maschinerie, eine größere Ähnlichkeit zwischen S. pombe und höheren Eukaryoten23,24, was die Bedeutung der Entwicklung und Verwendung genetischer Werkzeuge in S. pombe unterstreicht.
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Identifizierung genetischer Interaktoren basierend auf der "Dosisunterdrückung" eines mutierten Phänotyps mit Funktionsverlust in S. pombe. Die Grundlage dieses Protokolls ist, dass es eine schnelle und effiziente Methode ist, eine cDNA-Bibliothek zu screenen, die Wildtyp-Gene entweder auf einem Multicopy-Plasmid und/oder von einem starken Promotor überexprimiert. Dieses Protokoll besteht aus vier Hauptschritten: Transformation der Bibliothek in einen Abfragemutantenstamm, Auswahl von Plasmidklonen, die den gewünschten Phänotyp des Abfragemutantenstamms unterdrücken, Abrufen der Plasmide aus diesen Suppressorklonen und Identifizierung des Gens, das für die Unterdrückung des Phänotyps verantwortlich ist. Wie bei jeder Methode, die auf der Auswahl und Identifizierung von cDNAs aus einer Bibliothek basiert, hängt der Erfolg des Bildschirms von der Verwendung einer qualitativ hochwertigen und hochkomplexen Bibliothek ab, da der Bildschirm nur die cDNA-Klone abrufen kann, die in der Bibliothek vorhanden sind.
Mit diesem Protokoll ist es uns gelungen, zwei neuartige Suppressoren des genotoxischen stresssensitiven Phänotyps der Abfrage-Nullmutante S. pombe ell1 zu identifizieren. Die ELL-Familie (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) von Transkriptions-Elongationsfaktoren unterdrückt das vorübergehende Pausieren der RNA-Polymerase II auf DNA-Vorlagen in biochemischen In-vitro-Assays und ist in verschiedenen Organismen konserviert, von der Spalthefe bis zum Menschen25. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass eine S. pombe ell1-Nullmutante genotoxische Stressempfindlichkeit in Gegenwart von 4-Nitrochinolin-1-oxid (4-NQO) und Methylmethansulfonat (MMS) zeigt26. Daher transformierten wir eine S. pombe-Plasmid-kodierte Multicopy-cDNA-Bibliothek in die Abfrage S. pombe ell1 Nullmutante und identifizierten zwei mutmaßliche Klone, die die Fähigkeit zeigten, die genotoxische Stressempfindlichkeit der S. pombe ell1-Nullmutante in Gegenwart von 4-NQO, einer Verbindung, die DNA-Läsionen induziert, zu unterdrücken. Die anschließende Sequenzierung des in den Plasmidklonen vorhandenen Inserts ergab, dass die Gene, die für rax2+ und osh6+ kodieren, für die Unterdrückung der genotoxischen Stressempfindlichkeit der ell1-Nullmutante verantwortlich waren, wenn sie in der ell1-Nullmutante überexprimiert wurden.
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Protocol
1. Transformation der cDNA-Bibliothek in den Abfrage-S. pombe-Mutantenstamm zum Screening auf Multicopy-Suppressoren
ANMERKUNG: Die Standard-Lithium-Acetat-Methode27 wurde befolgt, um die S. pombe cDNA-Bibliothek mit einigen Modifikationen in den Abfragestamm S. pombe ell1Δ umzuwandeln:
- Der Stamm S. pombe ell1Δ züchtet bei 32 °C auf einer YE-Mediumplatte (Tabelle 1), ergänzt mit je 225 μg/ml Adenin, Leucin und Uracil. Beimpfen Sie eine Schleife voller Inokulum des ell1Δ-Stamms von der obigen Platte in 15-20 ml YE-Medium, ergänzt mit je 225 μg / ml Adenin, Leucin und Uracil. Über Nacht bei 32 °C unter Schütteln (200-250 U/min) inkubieren.
- Am nächsten Tag wird die Übernachtkultur in 100 ml frischem YE-Medium mit den gewünschten Zusätzen auf einen OD von 600 nm (optische Dichte bei 600 nm) von 0,3 verdünnt und bei 32 °C mit Schütteln bei 200-250 U/min inkubiert, bis der OD600 nm die Mid-Log-Phase erreicht.
- Teilen Sie die 100-ml-Kultur in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen, gefolgt von einer Zentrifugation bei Raumtemperatur für 10 min bei 4.000 × g.
- Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet mit 1 ml sterilem Wasser, d. h. resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml sterilem Wasser und zentrifugieren Sie bei 4.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Der Überstand ist zu verwerfen und jedes Zellpellet mit 1 ml 1x LiAc-TE (100 mM Lithiumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) Lösung wie in Schritt 1.4 beschrieben zu waschen.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 250 μL 1x LiAc-TE. Verwenden Sie diese S. pombe-kompetenten Zellen (500 μL) für die Transformation mit der interessierenden DNA. 125 μL der kompetenten Zellen in vier verschiedene sterile Mikrozentrifugenröhrchen für nachfolgende Transformationsschritte überführen.
- Kochen Sie Träger-DNA aus Lachshoden oder Heringssperma für 1 min und legen Sie sie sofort auf Eis. Für jede Transformation werden 10 μL 10 mg/ml denaturierte, einzelsträngige Träger-DNA in das Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 125 μL der kompetenten Zellen enthält, gefolgt von einem vorsichtigen Mischen mit einer Mikropipettenspitze. Anschließend werden 50 μg der S. pombe cDNA-Bibliothek in das zuständige Zellträger-DNA-Gemisch-enthaltende Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.
- Die Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren und dann 260 μL Polyethylenglykol-Lithiumacetat-Lösung (40% [w/v] PEG 4.000, 100 mM Lithiumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) in die Röhrchen geben und vorsichtig mit Hilfe einer Mikropipettenspitze mischen.
- Die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Transformationsgemisch 2 h lang bei 32 °C ohne Schütteln inkubieren. 43 μL vorgewärmtes Dimethylsulfoxid (DMSO) in das Mikrozentrifugenröhrchen geben und vorsichtig mischen. Anschließend werden die Röhren 5 min lang einem Hitzeschock bei 42 °C ausgesetzt.
- Pelletieren Sie die Zellen bei 4.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und entfernen Sie die restliche PEG-LiAc-TE-Lösung mit Hilfe einer Mikropipettenspitze.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL sterilem Wasser und Platte auf einer EMM2 (Tabelle 1) Platte (150 mm) mit den erforderlichen Ergänzungen und 0,2 μg / ml 4-NQO.
- Inkubieren Sie die Platten bei 32 °C für 5-6 Tage, damit Kolonien auf den Platten erscheinen können. Streifen Sie die erhaltenen Kolonien auf derselben Medienplatte in Gegenwart von 0,2 μg / ml 4-NQO und verwenden Sie sie für das weitere Screening.
- Verwenden Sie für ein Bibliothekstransformationsexperiment 500 μL kompetente Zellen (125 μL kompetente Zellen x 4 Mikrozentrifugenröhrchen) für die Transformation, wie in den Schritten 1.8 bis 1.14 oben beschrieben.
- Als Kontrolle Platte 1/10 der Transformationsmischung auf einer EMM2-Platte (150 mm) mit erforderlichen Ergänzungen, aber ohne 4-NQO, um die Gesamtzahl der Bibliotheksklone zu berechnen, die nach Transformation der Bibliothek erhalten wurden, und Screening für die Isolierungder Suppressorklone.
2. Testen und validieren Sie die Rettung/Unterdrückung des Phänotyps, der mit dem Abfragemutantenstamm verbunden ist, durch den mutmaßlichen Suppressor
HINWEIS: Stresspunkt-Assays wurden wie unten beschrieben durchgeführt, um die Rettung/Unterdrückung der ell1-deletionsassoziierten 4-NQO-Stressempfindlichkeit durch den/die mutmaßlichen Suppressor(en) zu testen und zu validieren.
- Fügen Sie 100-200 μL steriles Wasser in jede der verschiedenen Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu.
- Wählen Sie eine kleine Menge Inokulum aus jeder der verschiedenen Kolonien, die nach der cDNA-Bibliothekstransformation auf der Platte mit 4-NQO erhalten wurden, mit einem sterilen Zahnstocher oder einer 20-200 μL Mikropipettenspitze. Geben Sie das Inokulum aus jeder der verschiedenen Kolonien in separate unabhängige Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die 100-200 μL steriles Wasser enthalten. Gründlich mischen.
- Spot 3 μL der Zellsuspension aus jeder Vertiefung auf EMM2-Agarplatten, die Adenin (225 μg/ml) und Uracil (225 μg/ml) enthalten, aber Leucin fehlen (der wählbare auxotrophe Marker, der auf dem Plasmidvektor vorhanden ist, der für den Aufbau der in dieser Arbeit verwendeten Bibliothek verwendet wird). Fügen Sie den Platten nach Bedarf geeignete Konzentrationen von 4-NQO hinzu.
- Inkubieren Sie die Platten bei 32 °C für 3-4 Tage, damit die Zellen wachsen können. Identifizieren Sie die Kolonien, die Wachstum in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von 4-NQO als mutmaßliche Suppressoren zeigen.
- Um die Suppressoren weiter zu validieren, züchten Sie die ausgewählten Suppressoren zusammen mit geeigneten Kontrollstämmen über Nacht bei 32 °C mit Schütteln (200-250 U/min) in EMM2-Medium, das jeweils 225 μg/ml Adenin und Uracil enthält, aber Leucin fehlt.
- Am nächsten Tag verdünnen Sie die Zellen auf einen OD 600 nm von 0,3 in frischem EMM2-Medium und züchten sie bei 32 °C mit Schütteln bis zur Mitte der Log-Phase (ca.OD 600 nm von 0,6-0,8).
- Geeignete serielle Verdünnungen (1:10 oder 1:5) von Kulturen auf EMM2-Platten mit erforderlichen Ergänzungen, die entweder 0,4 μM 4-NQO oder 0,01% MMS enthalten. Zur Kontrolle erkennen Sie die Stämme auf einer EMM2-Platte mit den erforderlichen Ergänzungen, aber ohne DNA-schädigendes Mittel.
- Inkubieren Sie die Platten bei 32 °C für 3-5 Tage, um das Wachstum zu überwachen.
HINWEIS: Geeignete Assays basierend auf dem Phänotyp, der mit dem Abfragemutantenstamm assoziiert ist, sollten verwendet werden, um die Rettung oder Unterdrückung des Phänotyps zu testen. Wenn beispielsweise Suppressoren eines kälteempfindlichen Phänotyps eines Abfragemutantenstamms identifiziert werden müssen, würde der Assay zum Testen und Validieren der Suppressorklone die Züchtung von Transformanten bei niedrigen Temperaturen beinhalten. - Erkennen Sie die mutierten Stämme, die mit einem interessierenden Gen in voller Länge (in diesem Fall Spell1 ) oder einem leeren Vektor als positive bzw. negative Kontrollen zusammen mit den Bibliothekstransformanten transformiert wurden.
3. Isolierung des Plasmids aus den Klonen der S. pombe-Suppressoren
ANMERKUNG: Die Plasmidisolierung aus S. pombe wurde nach dem in Fission yeast: a laboratory manual28 beschriebenen Protokoll mit einigen Änderungen durchgeführt.
- Beimpfen Sie eine einzelne Hefekolonie in EMM2-Medium, das 225 μg/ml Adenin und Uracil enthält, und lassen Sie die Zellen über Nacht bei 32 °C mit Schütteln bei 200-250 U/min wachsen. Am nächsten Tag ernten Sie 5 AD-Zellen (d.h. 10 ml Kultur von AD 0,5) durch Zentrifugieren für 2 min bei 4.000 × g bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,2 ml Lysepuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) und 1 mM Na2EDTA).
- 0,2 ml Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und 0,3 g säuregewaschene Glasperlen in das Mikrozentrifugenröhrchen geben. Das Mikrozentrifugenröhrchen 2 min bei 4 °C vorstrecken und 1 min auf Eis inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt 6x.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 × g für 15 min bei Raumtemperatur. Die obere wässrige Schicht wird in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 200 μL Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) hinzugefügt.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 × g für 10 min. Die obere wässrige Schicht in ein frisches Röhrchen geben und zwei Volumina 100% Ethanol (~ 400 μL) und 1/10 Volumen Natriumacetat (3 M, pH 5,8) (~ 20 μL) in das Röhrchen geben. Das Mikrozentrifugenröhrchen 1 h lang bei -70 °C inkubieren.
- Die DNA wird durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 15 min bei 4 °C gefällt und der Überstand entfernt. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 70% Ethanol (~ 500 μL) und halten Sie es bei Raumtemperatur, um es an der Luft zu trocknen.
- Resuspendieren Sie die DNA in 20 μL sterilem Wasser. Verwenden Sie 2-5 μL Plasmid-DNA für die Transformation kompetenter E. coli-Zellen.
HINWEIS: Plasmid kann auch aus Hefezellen unter Verwendung eines der kommerziell erhältlichen Hefeplasmid-Isolierungskits isoliert werden.
4. Identifizierung des vom Suppressorklon kodierten Gens
- Die isolierten Hefeplasmide werden unter Verwendung des Standardprotokolls29 in E. coli Top10-Stamm [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] umgewandelt und die Zellen mit den erforderlichen Antibiotika auf LB (Luria Broth) -Platten verteilt.
- Isolieren Sie das/die Plasmid(e) aus E. coli-Transformanten unter Verwendung des alkalischen Standard-Lyseprotokolls29 und befolgen Sie die entsprechenden Kombinationen von Restriktionsenzymen, um die Freisetzung des DNA-Fragments durch Restriktionsaufschluss zu überprüfen.
HINWEIS: Suppressorplasmid 84 wurde mit Bam HI-Restriktionsenzym und Suppressorplasmid 104 mit PstI / BamHI-Restriktionsenzymen verdaut. - Retransformieren Sie die Plasmide, die eine Insertfreisetzung nach Restriktionsaufschluss im ell1 Δ-Stamm zeigen, um ihre Fähigkeit zu überprüfen, den genotoxischen stresssensitiven Phänotyp des ell1Δ-Stammes zu retten.
- Wählen Sie die Plasmidklone aus, die eine Unterdrückung der genotoxischen Stressempfindlichkeit zeigen, und sequenzieren Sie das in diesen Plasmidklonen vorhandene DNA-Fragment mit vektorspezifischen Vorwärts- und Rückwärtsprimern.
HINWEIS: In dieser Studie wurde der adh1-Promotor-spezifische universelle Vorwärtsprimer (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3') verwendet30. - Um das für die Unterdrückung verantwortliche Gen zu identifizieren, richten Sie die Sequenz aus, die mit NCBI-Nukleotidblast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) oder Pombase-Sequenz-Alignment-Tool (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core) erhalten wurde. Wählen Sie die Sequenz aus, die die maximale Ausrichtung zeigt, und identifizieren Sie sie als das Gen für das Multicopy-Suppressorplasmid.
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Representative Results
Screening auf Multicopy-Suppressor(s) der ell1-deletionsassoziierten genotoxischen Stresssensitivität bei S. pombe
Wir führten das genetische Screening unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls durch, um Multicopy-Suppressoren des Funktionsverlust-Phänotyps des Abfrage-ell1-Deletionsmutantenstamms zu identifizieren. Die wachstumsbedingte Sensitivität des ell1-Deletionsstamms, die in Gegenwart des genotoxischen 4-NQO-Wirkstoffs beobachtet wurde, wurde als Funktionsverlust-Phänotyp zur Auswahl für Multicopy-Suppressoren übernommen. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des genetischen Screens. Zu Beginn des Screens wurde zunächst die genotoxische Stresssensitivität der ell1-Deletionsmutante (h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1 Δ :: kanMX6) in Bezug auf ihren isogenen Wildtyp-Stamm (h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) in Gegenwart von 4-NQO bestätigt (Abbildung 2A). Anschließend wurde die Abfrage S. pombe ell1 null mutant mit einer High-Copy-Number S. pombe cDNA-Bibliothek transformiert, um diejenigen Plasmidklone auszuwählen, die die 4-NQO-Wachstumssensitivität der ell1-Nullmutante unterdrücken/retten konnten. Diese Bibliothek enthält ~6 × 105 S. pombe cDNA-Fragmente, die im pLEV3 S. pombe-Überexpressionsvektor unter der Kontrolle des adh1-Promotors 30 kloniert wurden. Als Kontrolle wurde 1/10 der Transformationsmischung auch auf EMM2-Platten ohne 4-NQO plattiert, um die Gesamtzahl der rekombinanten Klone zu berechnen, die nach der Transformation der Bibliothek erhalten wurden, ein Hinweis auf die Abdeckung der Bibliothek, und auf Isolierung der Suppressorklone untersucht. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da das Screening von weniger Klonen die Möglichkeit verringert, die Klone des Suppressors zu identifizieren.
Abbildung 2B zeigt repräsentative Bilder der Kontroll- und 4-NQO-haltigen Platten. Wie in der Abbildung gezeigt, wird eine große Anzahl von Kolonien auf der Kontrollplatte ohne 4-NQO erhalten, was eine gute Abdeckung der Bibliothek zeigt. Wie erwartet, wurden weniger Transformanten auf der 4-NQO-Platte erhalten, da diese Transformanten wahrscheinlich die mutmaßlichen Suppressoren der 4-NQO-Empfindlichkeit der ell1-Nullmutante darstellen. Als nächstes wurden die verschiedenen transformierenden Kolonien, die auf EMM2-Platten mit 0,2 μM 4-NQO erhalten wurden, weiter gestreift oder auf EMM2-Platten mit 0,2 μM 4-NQO gefleckt, um die Fähigkeit dieser Transformanten zu bestätigen, in Gegenwart von 4-NQO zu wachsen. Es wurde beobachtet, dass 620 transformierende Kolonien auf 0,2 μM 4-NQO-haltigen EMM2-Platten wachsen konnten.
Validierung der Fähigkeit der mutmaßlichen Suppressorklone, das Wachstum der ell1-Deletionsmutante unter genotoxischen Stressbedingungen wiederherzustellen
Um die mutmaßlichen Suppressoren zu bestätigen, ist es wichtig, die Rettung des gewünschten Phänotyps unter höheren Stringenzbedingungen zu testen, wie in der schematischen Darstellung gezeigt (Abbildung 3A). Daher wurden die 620 in die engere Wahl gezogenen Transformanten auf EMM2-Platten mit 0,4 μM 4-NQO entdeckt. Wie in Abbildung 3B zu sehen ist, zeigten nur 74 Transformanten ein Wachstum bei 0,4 μM 4-NQO. Anschließend wurden diese 74 Transformanten auf EMM2-Platten entdeckt, die 0,8 μM 4-NQO enthielten, und es wurde beobachtet, dass nur 16 ein Wachstum in Gegenwart von 0,8 μM 4-NQO zeigten (Abbildung 3C). Um diese Beobachtungen weiter zu bestätigen, wurden diese 16 Transformanten auf EMM2-Platten mit erforderlichen Ergänzungen entdeckt, die entweder 0,8 μM 4-NQO oder kein 4-NQO (Kontrolle) enthielten, zusammen mit der ell1-Deletionsmutante, die mit leerem Vektor transformiert wurde. Die Ergebnisse dieser Spotting-Assays zeigten, dass der mit leerem Vektor transformierte ell1-Deletionsstamm sowie alle 16 Transformanten wie erwartet Wachstum auf der Platte ohne 4-NQO zeigten. Während die ell1-Deletionsmutante, die nur den leeren Vektor enthielt, bei 0,8 μM 4-NQO kein Wachstum zeigte, zeigten sechs Transformanten ein Wachstum bei 0,8 μM 4-NQO (Abbildung 3D), was darauf hindeutet, dass die in ihnen vorhandenen Bibliotheksklone die Fähigkeit hatten, den genotoxischen Stressphänotyp der ell1-Nullmutante zu unterdrücken.
Identifizierung des Gens, das vom Suppressorklon kodiert wird
Als nächstes wählten wir 02 genetische Suppressoren des ell1-Deletionsstamms, sup 84 und sup 104, aus, die eine vollständige Unterdrückung der ell1-assoziierten Wachstumssensitivität in Gegenwart von 4-NQO zeigten. Die Bibliotheksplasmidklone wurden aus diesen beiden Hefesuppressoren isoliert und in kompetente E. coli-Zellen umgewandelt. Anschließend wurde Plasmid aus E. coli-Zellen unter Verwendung der Standardprotokolle31 isoliert. Die beiden isolierten Plasmide, die als 84 und 104 markiert waren, wurden einem Restriktionsaufschluss unterzogen, der das Vorhandensein von etwa 1.000 bp bzw. 800 bp DNA-Fragmenten ergab (Abbildung 4A, B). Um die Ergebnisse dieses Suppressor-Screens weiter zu validieren, wurden diese Plasmide in die ell1-Deletionsmutante retransformiert und überprüft, ob sie das Wachstum der ell1-Nullmutante in Gegenwart von 4-NQO wiederherstellen konnten. Die Stress-Spot-Assays zeigten, dass die Suppressorplasmid-Klone bei der Wiedereinführung in die ell1-Nullmutante zu einer Unterdrückung der 4-NQO-assoziierten Wachstumssensitivität führten, was darauf hindeutet, dass die Suppression plasmidabhängig war (Abbildung 4C). Darüber hinaus entschieden wir uns zu bestimmen, ob diese Suppressorklone auch die wachstumsbedingte Empfindlichkeit des ell1-Deletionsstamms in Gegenwart einer anderen DNA-schädigenden Verbindung, MMS, unterdrücken können. Die Spot-Assays zeigten, dass die Transformation der Suppressorplasmidklone in die ell1-Nullmutante zu mehr Wachstum auf MMS-haltigem Medium führte als die Transformation der ell1-Deletionsmutante mit leerem Vektor, was darauf hindeutet, dass diese Plasmidklone die genotoxische Stressempfindlichkeit der ell1-Deletionsmutante in Gegenwart beider genotoxischer Wirkstoffe unterdrücken könnten. d. h. 4-NQO und MMS (Abbildung 4D).
Um das in diesen Suppressorplasmidklonen vorhandene Gen zu identifizieren, wurde anschließend eine Sequenzierung des DNA-Fragments unter Verwendung des adh1-Promotor-spezifischen universellen Vorwärtsprimers30 durchgeführt. Die erhaltene Nukleotidsequenz wurde mit dem Tool "BLAST at Ensembl" auf der PomBase-Website (https://www.pombase.org) durchsucht, das zeigte, dass die beiden Plasmidklone 84 und 104 die Gene rax2+ bzw. osh6+ enthielten, was den Nachweis lieferte, dass Rax2 und Osh6 für die Unterdrückung des genotoxischen stresssensitiven Phänotyps verantwortlich waren, der mit dem Fehlen von ell1+ in S. pombe einhergeht. . Das Wissen über die Funktionen dieser beiden Proteine in S. pombe ist begrenzt. Es wurde gezeigt, dass Rax2 die Lokalisation von For3p reguliert, um die Zellpolarität während des vegetativen Wachstums in S. pombe32 zu kontrollieren. Osh6 ist ein Lipidtransportprotein, das zur Familie der Oxysterol-bindenden proteinverwandten Proteine gehört. Es ist am Transport von Phosphatidylserin aus dem endoplasmatischen Retikulum zur Plasmamembran33 beteiligt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des genetischen Multicopy-Suppressor-Screens. Dieses Protokoll besteht aus vier Hauptschritten: Transformation der Bibliothek in einen Abfragemutantenstamm, Auswahl von Plasmidklonen, die den gewünschten Phänotyp des Abfragemutantenstamms unterdrücken, Abrufen der Plasmide aus diesen Suppressorklonen und Identifizierung des Gens, das für die Unterdrückung des Phänotyps verantwortlich ist. Abkürzung: 4-NQO = 4-Nitrochinolin-1-oxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Screening auf Multicopy-Suppressor(s) der ell1-deletionsassoziierten genotoxischen Stresssensitivität in S. pombe. (A) Stress-Spot-Assay, der die 4-NQO-Sensitivität des ell1-gelöschten S. pombe-Stammes im Vergleich zu seinem isogenen Wildtyp-Stamm zeigt. Serielle Verdünnungen (1:10) geeigneter Stämme wurden auf EMM2-Medium nachgewiesen, das jeweils 225 μg/ml Adenin, Leucin und Uracil mit oder ohne (Kontroll-)0,4 μM 4-NQO enthielt. Die Platten wurden dann für 3-5 Tage bei 32 °C inkubiert. (B) Eine cDNA-Bibliothek mit hoher Kopienzahl wurde in ell1-gelöschten S. pombe-Stamm transformiert, und transformierte Kolonien wurden auf EMM2-Medium ohne Leucin, aber mit 0,2 μM 4-NQO plattiert. Ein kleines Aliquot des Transformationsgemisches wurde auch auf EMM2-Platten ohne 4-NQO als Kontrolle plattiert. Die Platten wurden 5-6 Tage bei 32 °C inkubiert und fotografiert. Abbildung B zeigt ein repräsentatives Bild dieser Platten. Abkürzung: 4-NQO = 4-Nitrochinolin-1-oxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Validierung der Fähigkeit mutmaßlicher Suppressorklone, die genotoxische Stressempfindlichkeit der ell1-Deletionsmutante zu unterdrücken. (A) Eine schematische Darstellung des Screenings der Bibliothekstransformanten durch Testen der Unterdrückung des gewünschten Phänotyps. Das Wachstum von 620 Transformanten wurde auf steigende Konzentrationen von 4-NQO getestet, indem verschiedene Transformatoren auf EMM2-Platten ohne Leucin nachgewiesen wurden, die entweder (B) 0,4 μM 4-NQO oder (C) 0,8 μM 4-NQO enthielten. Die Platten wurden 5-6 Tage bei 32 °C inkubiert und fotografiert. Repräsentative Bilder von Platten wurden gezeigt. (D) Sechzehn Transformanten, die Wachstum auf 0,8 μM 4-NQO zeigten, wurden auf EMM2-Platten ohne Leucin entdeckt, die entweder 0,8 μM 4-NQO enthielten oder kein 4-NQO enthielten (Kontrolle), zusammen mit dem ell1-Deletionsstamm, der mit leerem Vektor transformiert wurde. Die Platten wurden 5-6 Tage bei 32 °C inkubiert und fotografiert. Nur sechs Kolonien zeigten die Fähigkeit, die ell1-Deletionsassoziierte genotoxische Stressempfindlichkeit zu retten. Abkürzung: 4-NQO = 4-Nitrochinolin-1-oxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Identifizierung der Suppressorplasmid-Klone. Agarose-Gel-Bilder von (A) Restriktionsverdauung von Suppressorplasmid 84 mit BamHI-Restriktionsenzym gaben einen Insert von ~ 1 kb frei. (B) Suppressorplasmid 104, das mit PstI / BamHI-Restriktionsenzymen aufgeschlossen wurde, setzte einen Insert von ~ 800 bp frei. (C) 1:10 seriell verdünnte ell1-Nullmutante, transformiert mit Plasmiden, sup 84 oder sup 104, wurden auf EMM2-Platten ohne Leucin entdeckt, die entweder 0,4 μM 4-NQO oder (D) 0,01% MMS enthielten. In Kontrollplatten wurde kein DNA-schädigendes Mittel zugesetzt. Die Platten wurden 4-5 Tage bei 32 °C inkubiert und fotografiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Zusammensetzung der Medien für das Wachstum von S. pombe. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Hefen wurden häufig verwendet, um die grundlegenden biologischen Prozesse und Wege zu untersuchen, die evolutionär in eukaryotischen Organismen konserviert sind. Die Verfügbarkeit genetischer und genomischer Werkzeuge sowie ihre Zugänglichkeit für verschiedene biochemische, genetische und molekulare Verfahren machen Hefen zu einem ausgezeichneten Modellorganismus für die genetische Forschung34,35,36. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene genetische Screens von Hefeforschern entworfen, um genetische Interaktionen zu identifizieren, die Aufschluss über die Funktionen einzelner Gene sowie die Wege und biologischen Prozesse geben würden, an denen sie beteiligt sein könnten10,11,17,37. Einer der häufigsten und nützlichen Screens zur Identifizierung genetischer Interaktionen ist als "Multicopy- oder High-Copy-Number-Suppression" bekannt.
Dieser Bildschirm erfordert einen oder mehrere Abfrage-Mutantenstämme, die einen Funktionsverlust-Phänotyp aufweisen, gefolgt von der Transformation dieser mutierten Abfragestämme mit einer Genom- oder cDNA-Bibliothek mit hoher Kopienzahl. Anschließend werden die erhaltenen Transformanten gescreent, um diejenigen Gene zu identifizieren, die, wenn sie überexprimiert werden, den Phänotyp unterdrücken, der mit dem/den Abfragemutantenstamm(en) assoziiert ist. Diese Art der genetischen Interaktion zwischen dem spezifischen mutierten Stamm und den Genen, die in den Klonen der Plasmidbibliothek vorhanden sind, führt zur Isolierung und Identifizierung von Genprodukten, die wahrscheinlich auf demselben Weg wirken oder denselben biologischen Prozess beeinflussen4. Somit liefert dieser Bildschirm Einblicke in die Funktionen der interessierenden Gene und ihre funktionelle Organisation in Signalwegen und biologischen Prozessen in vivo. Traditionell wurde dieser Bildschirm ausgiebig in S. cerevisiae 38,39,40,41,42 verwendet.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein einfaches und unkompliziertes Protokoll zur Durchführung eines genetischen Screenings zur Mehrfachunterdrückung in S. pombe zu beschreiben. Wir führten das Screening mit einem S. pombe-Stamm durch, der eine Deletion des ell1-Transkriptionsverlängerungsfaktors trug. ELL ist eine Familie von Transkriptionsdehnungsfaktoren, die in einer Vielzahl von Organismen vorkommen, von der Spalthefe bis zum Menschen. Die Funktionen von Ell1 beginnen erst, in S. pombe verstanden zu werden. Frühere Arbeiten hatten die Rolle von Ell1 für ein optimales Wachstum unter normalen Wachstumsbedingungen und für das Überleben unter genotoxischen Stressbedingungen hervorgehoben26. Wir haben das Multicopy-Suppressor-Screening als einen der Ansätze eingesetzt, um den molekularen Mechanismus aufzudecken, der der Rolle von Ell1 bei der genotoxischen Stressempfindlichkeit in S. pombe26 zugrunde liegt. Eine Multicopy-Plasmid-kodierte S. pombe cDNA-Bibliothek wurde in die S. pombe ell1-Nullmutante umgewandelt, die eine Empfindlichkeit gegenüber 4-NQO aufweist. Anschließend wurden diejenigen Transformanten ausgewählt, die in Gegenwart von 4-NQO wachsen konnten.
Die Isolierung von Plasmiden aus diesen Transformanten und die Sequenzierung der in diesen Plasmiden vorhandenen Inserts führten zur Identifizierung von zwei neuen genetischen Interaktoren von ell1+ in S. pombe, rax2+ und osh6+. Eine frühere Studie mit einem ähnlichen genetischen Screening in S. pombe hat auch das Anti-Silencing-Protein epe1+ als Multikopie-Suppressor der ell1-Deletions-assoziierten Phänotypen43 identifiziert. Wir haben diese Methode auch verwendet, um die Multicopy-Suppressoren der nicht-essentiellen Rpb9-Untereinheit der S. pombe-RNA-Polymerase II zu identifizieren (unveröffentlichte Beobachtungen). Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse den Nutzen des genetischen Multicopy-Suppressor-Screening-Ansatzes als Methode zur Identifizierung mutmaßlicher Gene / Proteine, die eine genetische Interaktion mit einem gewünschten Gen von Interesse aufweisen, und klären die Funktion, Wege und Prozesse auf, an denen das interessierende Gen beteiligt sein könnte.
Um den in dieser Arbeit beschriebenen Bildschirm zu verwenden, ist es wichtig, zuerst einen Abfragemutantenstamm zu haben, der einen eindeutigen Phänotyp aufweist, der mit der Mutation assoziiert ist, der verwendet werden kann, um die Multicopy-Suppressoren zu isolieren. Darüber hinaus hängt der Erfolg dieses Screens von der Verfügbarkeit einer qualitativ hochwertigen und guten repräsentativen Bibliothek ab, die Klone enthält, die die maximale Anzahl von Wildtyp-Genen oder die entsprechenden cDNAs repräsentieren. Traditionell wurden sowohl genomische als auch cDNA-Bibliotheken in diesen Screens verwendet, aber cDNA-Bibliotheken haben den Vorteil, dass sie aus mRNAs hergestellt werden, die in der Zelle / im Organismus exprimiert werden. Darüber hinaus ist eine hohe Effizienz seiner Umwandlung in die Hefezellen für den Erfolg des Screens unerlässlich, da es wichtig ist, eine große Anzahl von Transformatoren zu screenen, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, Suppressoren zu identifizieren. Wenn nach der Transformation der Bibliothek in den Abfragemutantenstamm unter Verwendung des Lithiumacetat-Protokolls weniger Transformanten auf der Steuerplatte erhalten werden, kann die Bibliothek durch Elektroporation transformiert werden.
Es ist auch ratsam, das Transformationsprotokoll zuerst mit einem anderen Plasmid zu standardisieren, bevor die Bibliothek transformiert wird. Andernfalls führt dies unnötigerweise zum Verlust der Bibliothek. Das hier beschriebene Protokoll verwendet 4-NQO-Sensitivität als mutierten Phänotyp, aber geeignete Screening-Methoden / Assays sollten für die Auswahl von Suppressoren basierend auf dem spezifischen Mutantenphänotyp von Interesse entwickelt werden. Wenn keine oder nur sehr wenige Transformanten auf der Platte erhalten werden, um nach der Transformation der Bibliothek in den Abfragemutantenstamm für Suppressoren auszuwählen, sollten nach Möglichkeit weniger strenge Bedingungen / Assays verwendet werden, wenn die Bibliothek plattiert wird, um nach Suppressoren auszuwählen, um so viele genetische Suppressoren wie möglich zu erkennen, bevor diese unter Bedingungen mit hoher Strenge bestätigt werden. Zusätzlich zum Restriktionsaufschluss, um das Vorhandensein des Inserts in den identifizierten Suppressorplasmidklonen zu testen, kann die PCR mit vektorspezifischen Primern verwendet werden, um das gewünschte DNA-Fragment zu amplifizieren. Alternativ können die Suppressorplasmidklone direkt zur Sequenzierung gegeben werden, wodurch die Notwendigkeit eines Restriktionsaufschlusses oder einer PCR vermieden wird.
Dieser Screen kann auch für andere Hefen als S. cerevisiae und S . pombe übernommen werden, wenn ein genetisches Toolkit in Bezug auf geeignete mutierte Stämme, Plasmide und Promotorkonstrukte verfügbar ist, das die Überexpression von Genen erleichtern und die Rettung des mutierten Phänotyps in der Wirtshefezelle ermöglichen würde. Darüber hinaus kann dieses Screening mit der Verfügbarkeit genomweiter Ressourcen, einschließlich der Sammlung genomweiter Deletionsmutanten44 und Überexpressionsbibliotheken37, auch durch Transformation eines oder weniger Abfrageplasmide in eine systematische Anordnung von Hefemutantenstammsammlungen oder durch Transformation eines systematischen Arrays von Überexpressionsplasmidsammlungen in einen oder wenige mutierte Abfragestämme45 durchgeführt werden. . Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz eindeutig auf eine Vielzahl von experimentellen Fragestellungen in verschiedenen Organismen verallgemeinert werden kann.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium des Department of Biotechnology, Government of India (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) an Nimisha Sharma. Die Autoren danken Prof. Charles Hoffman (Boston College, USA) für die Schenkung der S. pombe cDNA-Bibliothek und Prof. Susan Forsburg für die Hefeplasmide.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-NQO | Sigma | N8141 | |
| Acetic Acid, glacial | Sigma | 1371301000 | |
| Adenine Sulphate | Himedia | GRM033 | |
| Agar | Himedia | GRM026 | |
| Agarose | Lonza | 50004L | |
| Ammonium Chloride | Himedia | MB054 | |
| BamHI | Fermentas | ER0051 | |
| Biotin | Himedia | RM095 | |
| Boric Acid | Himedia | MB007 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C4901 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma | C0549 | |
| Citric Acid | Himedia | RM1023 | |
| Disodium hydrogen phospahte anhydrous | Himedia | GRM3960 | |
| single stranded DNA from Salmon testes | Sigma | D7656 | |
| EDTA disodium | Sigma | 324503 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Himedia | RM6353 | |
| Glucose | Amresco | 188 | |
| Ionositol | Himedia | GRM102 | |
| Isopropanol | Qualigen | Q26897 | |
| Leucine | Himedia | GRM054 | |
| Lithium Acetatae | Sigma | 517992 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Himedia | MB040 | |
| Molybdic Acid | Himedia | RM690 | |
| Nicotinic Acid | Himedia | CMS177 | |
| PEG, MW 4000 | Sigma | 81240 | |
| Pentothinic Acid | Himedia | TC159 | |
| Phenol | Himedia | MB082 | |
| Plasmid Extraction Kit | Qiagen | 27104 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Potassium hydrogen Pthallate | Merc | DDD7D670815 | |
| Potassium iodide | Himedia | RM1086 | |
| RNAse | Fermentas | EN0531 | |
| SDS | Himedia | GRM205 | |
| Sodium Hydroxide | Himedia | GRM1183 | |
| Sodium Sulphate | Himedia | RM1037 | |
| Tris free Base | Himedia | MB209 | |
| Uracil | Himedia | GRM264 | |
| Yeast Extract Powder | Himedia | RM668 | |
| Zinc Sulphate Heptahydrate | Merc | DJ9D692580 |
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