Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/63967
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University
* These authors contributed equally

Summary

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Abstract

Genetik etkileşimlerin tanımlanması, diğer genlerle olan işlevsel ilişkileri ve biyolojik yollar ve süreçler halinde organizasyonları hakkında fikir vererek genlerin işlevlerini deşifre etmek için güçlü bir araçtır. Genetik ekranların çoğunluğu başlangıçta Saccharomyces cerevisiae'de geliştirilmiş olmasına rağmen, bu genetik ekranların gerçekleştirilmesi için tamamlayıcı bir platform Schizosaccharomyces pombe tarafından sağlanmıştır. Genetik etkileşimleri tanımlamak için kullanılan yaygın yaklaşımlardan biri, fonksiyon kaybı mutantında genom çapında, yüksek kopya numaralı plazmid kütüphanesinden klonların aşırı ekspresyonu, ardından mutant fenotipini baskılayan klonların seçilmesidir.

Bu yazıda S. pombe'de bu 'çoklu kopya baskılama' tabanlı genetik taramanın gerçekleştirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Bu ekran, S. pombe'de Ell1 transkripsiyon uzama faktörünün yokluğu ile ilişkili genotoksik strese duyarlı fenotipin çoklu kopya baskılayıcılarının tanımlanmasına yardımcı olmuştur. Ekran, sorgu ell1 null mutant suşunun yüksek kopya numaralı S. pombe cDNA plazmid kütüphanesi ile dönüştürülmesi ve genotoksik strese neden olan bir bileşik olan 4-nitrokinolin 1-oksit (4-NQO) içeren EMM2 plakaları üzerindeki baskılayıcıların seçilmesiyle başlatıldı. Daha sonra, plazmid iki kısa listeye alınmış baskılayıcı koloniden izole edildi ve ekleme DNA'sını serbest bırakmak için kısıtlama enzimleri tarafından sindirildi. Bir insert DNA fragmanını serbest bırakan plazmidler, bu baskılayıcı plazmid klonlarının 4-NQO ve diğer genotoksik bileşiklerin varlığında ell1 delesyon mutantının büyümesini geri kazanma yeteneğini doğrulamak için ell1 delesyon suşuna yeniden dönüştürüldü. Delesyon fenotipinin kurtarıldığını gösteren plazmidler, ell1 delesyonla ilişkili genotoksik strese duyarlı fenotipin baskılanmasından sorumlu gen (ler) i tanımlamak için sıralandı.

Introduction

Genetik etkileşim ağları, genler hakkında fonksiyonel bilgi sağlar ve bu genlerin in vivo olarak dahil olabileceği yolları ve biyolojik süreçleri tanımlar. Ek olarak, farklı genlerin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğine dair içgörüler sağlayabilirler ve bu da spesifik bir fenotip 1,2,3 ile sonuçlanır. Yıllar geçtikçe, araştırmacılar tarafından temel biyolojik soruları cevaplamak ve insan hastalıklarını incelemek için çeşitli genetik ekranlar tasarlanmıştır. Genetik etkileşimlerin tanımlanması için ekranlar çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir. Farklı genetik ekranlarda tanımlanan genetik etkileşimler, genler arasındaki farklı mekanik ilişkileri temsil edebilir. Ayrıca, çalışmalar, ortak bir genetik etkileşimler kümesinin, aynı yola veya komplekse ait proteinleri kodlayan genler tarafından paylaşıldığını ortaya koymuştur 4,5. Bu nedenle, genetik etkileşim ağları, bir hücredeki işlevsel organizasyonu kurmak için kullanılabilir; burada en benzer profilleri paylaşan genler aynı komplekse veya yola aittir, biraz daha az benzer profilleri paylaşan genler aynı biyolojik sürece aittir ve örtüşen ancak daha çeşitli profiller sergileyen genler aynı hücresel bölmeye ait üyeleri yansıtır6.

Dozaj baskılamaya dayalı genetik etkileşim ekranları ('yüksek kopya veya çoklu kopya supresyonu') yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardan biridir. Bu ekranlar, bir sorgu mutant suşunu yüksek kopya numaralı genomik veya cDNA kütüphanesi ile dönüştürerek, ardından genetik etkileşimleri baskılayan veya geliştirentanımlamak için uygun tahliller / seçim teknikleri ile gerçekleştirilebilir 7,8,9. Genom çapında kapsamlı bir kapsama alanı sağlamak için, bu ekranlar aynı zamanda genom çapında fonksiyon kaybı mutantı koleksiyonunda belirli bir genin aşırı eksprese edilmesiyle veya fonksiyon kaybı sorgusu mutantı 9,10,11,12,13,14,15 yüksek kopya numaralı plazmid kodlu genomik veya cDNA kütüphanesinin aşırı eksprese edilmesiyle gerçekleştirilmiştir. . Çok kopyalı strateji, düzenlenebilir bir destekleyiciyi kullanarak baskın / aşırı ifade yaklaşımı kullanarak da çalışabilir.

Baskılayıcı bazlı ekranların kullanılmasının temel avantajları, mutant bir suştaki önceden var olan bir fenotipin başka bir gen tarafından bastırılmasının, bu iki gen ürünü arasında başka yaklaşımlar kullanılarak gösterilemeyen genetik bir ilişki kurmasıdır. İkincisi, önceden var olan bir mutasyonun varlığının belirli bir yolu hassaslaştırdığı ve bu yolun ek bileşenlerinin, daha doğrudan genetik seleksiyonlarla tanımlanmamış olabilecek baskılayıcıların izolasyonu ile tanımlanmasına izin verdiği gözlenmiştir. Ayrıca, bu ekran farklı bastırma mekanizmalarına sahip baskılayıcıları tanımlamak için kullanılabilir16. Baskılayıcı etkileşimler genellikle işlevsel olarak ilişkili genler arasında meydana gelir ve yollardaki hiyerarşileri aydınlatmak için kullanılabilir. Baskılamanın tam altında yatan mekanizma, ekranda kullanılan sorgu mutantının türü, deneysel koşullar ve gen ekspresyon seviyesi gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak farklılık gösterebilir. Yaygın dozaj bastırma mekanizmalarından biri, aynı komplekste veya aynı hücresel/biyolojik süreçte paralel olarak işlev gören ürünleri kodlayan genleri içerir. Maya gibi daha basit model organizmalardaki bu tür ekranların sonuçları, en temel biyolojik yollar ve süreçler evrim boyunca korunduğundan, daha yüksek ökaryotik organizmalara genişletilebilir.

Bu genetik ekranlar, farklı biyolojik soruları cevaplamak için çeşitli şekillerde de değiştirilebilir. Örneğin, sorgu mutant suşunun fenotipini baskılayabilen farklı organizmalardan gelen ortolog genler tanımlanabilir. Ayrıca, potansiyel direnç mekanizmalarını tanımlamak ve yeni antibakteriyel17,18, antifungal 19,20, antiparaziter21 veantikanser 22 bileşiklerinin protein hedeflerini belirlemek için kullanılmıştır. Bu ekran ayrıca, etki mekanizması bilinmeyen farmasötik ilaçların aktivitesinin baskılayıcılarını tanımlamak için de kullanılmıştır. Bu nedenle, prensip olarak, bu çoklu kopya bastırıcı ekranlar optimize edilebilir ve farklı organizmalardaki çeşitli uygulamalarda kullanılabilir. Maya araştırmacıları tarafından kullanılan genetik ekranların çoğu başlangıçta S. cerevisiae'de geliştirilmiş olmasına rağmen, S. pombe çeşitli genetik taramalar ve tahliller23 yapmak için tamamlayıcı bir model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Dahası, S. pombe'deki genomik organizasyon ve biyolojik süreçler, örneğin daha fazla gende intronların oluşumu, DNA replikasyonunun kökenlerinin karmaşıklığı, sentromer yapısı, hücre döngüsünün organizasyonu ve RNAi makinesinin varlığı, S. pombe ve daha yüksek ökaryotlar23,24 arasında daha fazla benzerlik göstererek, S. pombe'de genetik araçların tasarlanmasının ve kullanılmasının önemini vurgulamaktadır.

Bu yazıda, S. pombe'deki fonksiyon kaybı mutant fenotipinin 'dozaj baskılanmasına' dayanan genetik interaktörlerin tanımlanması için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokolün temeli, çok kopyalı bir plazmid üzerinde ve / veya güçlü bir promotörden vahşi tip genleri aşırı eksprese eden bir cDNA kütüphanesini taramanın hızlı ve etkili bir yöntem olmasıdır. Bu protokolün dört ana adımı vardır: kütüphanenin bir sorgu mutant suşuna dönüştürülmesi, sorgu mutant suşunun istenen fenotipini baskılayan plazmid klonlarının seçimi, plazmidlerin bu baskılayıcı klonlardan alınması ve fenotipin baskılanmasından sorumlu genin tanımlanması. Bir kütüphaneden cDNA'ların seçilmesine ve tanımlanmasına dayanan herhangi bir yöntem için geçerli olduğu gibi, ekranın başarısı yüksek kaliteli ve yüksek karmaşıklıklı bir kütüphane kullanılmasına bağlıdır, çünkü ekran yalnızca kütüphanede bulunan cDNA klonlarını alabilir.

Bu protokolü kullanarak, S. pombe ell1 null mutant sorgusunun genotoksik strese duyarlı fenotipinin iki yeni baskılayıcısını başarıyla tanımladık. Transkripsiyon uzama faktörlerinin ELL (Onbir Ondokuz Lizin Bakımından Zengin Lösemi) ailesi, in vitro biyokimyasal tahlillerde DNA şablonlarında RNA polimeraz II'nin geçici duraklamasını baskılar ve fisyon mayasından insanlara kadar çeşitli organizmalarda korunur25. Daha önceki çalışmalar, bir S. pombe ell1 null mutantının, 4-nitrokinolin 1-oksit (4-NQO) ve metil metansülfonat (MMS) 26 varlığında genotoksik stres duyarlılığı gösterdiğine dair kanıtlar sağlamıştır. Bu nedenle, bir S. pombe plazmid kodlu multicopy cDNA kütüphanesini sorgu S. pombe ell1 null mutantına dönüştürdük ve DNA lezyonlarını indükleyen bir bileşik olan 4-NQO varlığında S. pombe ell1 null mutantının genotoksik stres duyarlılığını bastırma yeteneğini sergileyen iki varsayılan klon tanımladık. Plazmid klonlarında bulunan ekin daha sonraki dizilimi, rax2 + ve osh6 + kodlayan genlerin, ell1 null mutantında aşırı eksprese edildiğinde ell1 null mutantın genotoksik stres duyarlılığını baskılamaktan sorumlu olduğunu tespit etti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cDNA kütüphanesinin sorgu S. pombe mutant suşuna dönüştürülmesi ve çoklu kopya baskılayıcıların taranması

NOT: S. pombe cDNA kütüphanesini birkaç değişiklikle sorgu S. pombe ell1 Δ suşunadönüştürmek için Standart Lityum-Asetat yöntemi27 izlenmiştir:

  1. S. pombe ell1 Δ suşunu32 ° C'de her biri 225 μg / mL adenin, lösin ve urasil ile desteklenmiş bir YE orta (Tablo 1) plaka üzerinde büyütün. Yukarıdaki plakadan ell1Δ suşu inokulumunun inokulumuyla dolu bir ilmeği, her biri 225 μg / mL adenin, lösin ve urasil ile desteklenmiş 15-20 mL YE ortamında aşılayın. Gece boyunca 32 ° C'de sallanarak (200-250 rpm) inkübe edin.
  2. Ertesi gün, gece kültürünü 100 mL taze YE ortamında istenen takviyelerle 0,3 OD 600 nm'ye (600 nm'de optik yoğunluk) seyreltin ve OD600 nm orta kütük fazına ulaşana kadar200-250 rpm'de sallayarak 32 ° C'de inkübe edin.
  3. 100 mL kültürü iki adet 50 mL santrifüj tüpüne bölün, ardından oda sıcaklığında 4.000 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleme yapın.
  4. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL steril suyla yıkayın, yani hücreleri 1 mL steril suda yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4.000 × g'de santrifüj yapın.
  5. Süpernatantı atın ve her hücre peletini adım 1.4'te açıklandığı gibi 1 mL 1x LiAc-TE (100 mM lityum asetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) çözeltisi ile yıkayın.
  6. Süpernatantı çıkarın ve her hücre peletini 250 μL 1x LiAc-TE'de yeniden askıya alın. Bu S. pombe yetkin hücrelerini (500 μL) ilgilenilen DNA ile dönüşüm için kullanın. Sonraki dönüşüm adımları için yetkin hücrelerin 125 μL'sini dört farklı steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  7. Somon testislerinden veya ringa balığı spermlerinden taşıyıcı DNA'yı 1 dakika kaynatın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Her transformasyon için, yetkin hücrelerin 125 μL'sini içeren mikrosantrifüj tüpüne 10 μL 10 mg / mL denatüre, tek sarmallı taşıyıcı DNA'yı ekleyin, ardından bir mikropipet ucu kullanılarak nazik bir şekilde karıştırılır. Daha sonra, yetkili hücreler-taşıyıcı DNA karışımı içeren mikrosantrifüj tüpüne 50 μg S. pombe cDNA kütüphanesi ekleyin.
  8. Mikrosantrifüj tüplerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından tüplere 260 μL polietilen glikol-lityum asetat çözeltisi (% 40 [w/v] PEG 4.000, 100 mM lityum asetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) ekleyin ve bir mikropipet ucu yardımıyla yavaşça karıştırın.
  9. Transformasyon karışımını içeren mikrosantrifüj tüplerini 32 °C'de sallanmadan 2 saat boyunca inkübe edin. Mikrosantrifüj tüpüne 43 μL önceden ısıtılmış dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve yavaşça karıştırın. Daha sonra, tüpleri 5 dakika boyunca 42 ° C'de ısı şokuna maruz bırakın.
  10. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4.000 × g'da toplayın. Süpernatantı atın ve artık PEG-LiAc-TE çözeltisini bir mikropipet ucu yardımıyla çıkarın.
  11. Hücreleri 100 μL steril su ve plaka içinde bir EMM2 (Tablo 1) plaka (150 mm) üzerinde gerekli takviyeler ve 0.2 μg / mL 4-NQO ile yeniden askıya alın.
  12. Kolonilerin plakalarda görünmesine izin vermek için plakaları 5-6 gün boyunca 32 ° C'de inkübe edin. Elde edilen kolonileri aynı orta plaka üzerinde 0.2 μg / mL 4-NQO varlığında çizin ve daha fazla tarama için kullanın.
  13. Bir kütüphane dönüşüm deneyi için, yukarıdaki 1.8 ila 1.14. adımlarda açıklandığı gibi transformasyon için 500 μL yetkin hücre (125 μL yetkin hücre x 4 mikrosantrifüj tüpü) kullanın.
  14. Bir kontrol olarak, kütüphanenin dönüştürülmesinden sonra elde edilen kütüphane klonlarının toplam sayısını hesaplamak ve baskılayıcı klonların izolasyonu için tarama yapmak için gerekli takviyelerle bir EMM2 plakası (150 mm) üzerindeki dönüşüm karışımının 1 /10'uncu plakası, ancak 4-NQO'dan yoksundur.

2. Sorgu mutant suşu ile ilişkili fenotipin varsayılan baskılayıcı tarafından kurtarılmasını/bastırılmasını test edin ve doğrulayın

NOT: Stres noktası testleri, ell1 delesyonla ilişkili 4-NQO stres duyarlılığının varsayılan baskılayıcı (lar) tarafından kurtarılmasını / bastırılmasını test etmek ve doğrulamak için aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir.

  1. Steril 96 delikli bir mikrotitre plakasının farklı kuyularının her birine 100-200 μL steril su ekleyin.
  2. Steril bir kürdan veya 20-200 μL mikropipet ucu kullanarak 4-NQO içeren plakada cDNA kütüphanesi dönüşümünden sonra elde edilen farklı kolonilerin her birinden az miktarda inokülum seçin. Farklı kolonilerin her birinden inokulumu, 100-200 μL steril su içeren mikrotiter plakasının ayrı bağımsız kuyucuklarına ekleyin. İyice karıştırın.
  3. Her bir kuyucuktan adenin (225 μg / mL) ve urasil (225 μg / mL) içeren ancak lösin içermeyen EMM2 agar plakalarına hücre süspansiyonunun 3 μL'sini (bu çalışmada kullanılan kütüphanenin yapımında kullanılan plazmid vektöründe bulunan seçilebilir auxotrophic marker) noktalayın. Plakalara uygun konsantrasyonlarda 4-NQO ekleyin.
  4. Hücrelerin büyümesine izin vermek için plakaları 3-4 gün boyunca 32 ° C'de inkübe edin. Farklı konsantrasyonlarda 4-NQO varlığında büyüme gösteren kolonileri varsayılan baskılayıcılar olarak tanımlayın.
  5. Baskılayıcıları daha da doğrulamak için, seçilen baskılayıcıları, her biri 225 μg / mL adenin ve urasil içeren ancak lösin içermeyen EMM2 ortamında sallama (200-250 rpm) ile gece boyunca 32 ° C'de uygun kontrol suşlarıyla birlikte büyütün.
  6. Ertesi gün, hücreleri taze EMM2 ortamındaOD 600 nm 0.3'e kadar seyreltin ve orta log fazına kadar sallayarak 32 ° C'de büyütün (yaklaşık OD600 nm 0.6-0.8).
  7. EMM2 plakalarındaki kültürlerin uygun seri seyreltmelerini (1:10 veya 1:5), 0.4 μM 4-NQO veya% 0.01 MMS içeren gerekli takviyelerle tespit edin. Kontrol için, gerekli takviyelerle bir EMM2 plakasındaki suşları tespit edin, ancak DNA'ya zarar veren herhangi bir ajandan yoksundur.
  8. Büyümeyi izlemek için plakaları 3-5 gün boyunca 32 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Fenotipin kurtarılmasını veya baskılanmasını test etmek için sorgu mutant suşu ile ilişkili fenotipe dayalı uygun testler kullanılmalıdır. Örneğin, bir sorgu mutant suşunun soğuğa duyarlı bir fenotipinin baskılayıcılarının tanımlanması gerekiyorsa, baskılayıcı klonların test edilmesi ve doğrulanması için yapılan tahlil, düşük sıcaklıkta büyüyen dönüştürücüleri içerecektir.
  9. Tam uzunlukta ilgi geni (bu durumda Spell1 ) veya boş vektör ile dönüştürülen mutant suşları, kütüphane dönüştürücüleri ile birlikte sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak tespit edin.

3. Plazmidin S. pombe baskılayıcı klonlarından izolasyonu

NOT: S. pombe'den plazmid izolasyonu, Fisyon mayasında açıklanan protokol izlenerek gerçekleştirildi: birkaç modifikasyon içeren bir laboratuvar el kitabı28 .

  1. EMM2 ortamında 225 μg / mL adenin ve urasil içeren tek bir maya kolonisini aşılayın ve hücreleri gece boyunca 32 ° C'de 200-250 rpm'de sallayarak büyütün. Ertesi gün, oda sıcaklığında 4.000 × g'da 2 dakika santrifüj yaparak 5 O.D. hücresini (yani, 10 mL O.D. 0.5 kültürü) hasat edin.
  2. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 0.2 mL lizis tamponunda (% 2 Triton X-100,% 1 SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8.0) ve 1 mM Na2EDTA) yeniden askıya alın.
  3. Mikrosantrifüj tüpüne 0.2 mL fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) ve 0.3 g asitle yıkanmış cam boncuk ekleyin. Mikrosantrifüj tüpünü 4 ° C'de 2 dakika boyunca vorteks yapın ve 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu adımı 6 kat yineleyin.
  4. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüj yapın. Üst sulu tabakayı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 200 μL fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) ekleyin.
  5. Tüpü 10.000 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst sulu tabakayı taze bir tüpe aktarın ve tüpe iki hacim% 100 etanol (~ 400 μL) ve 1/10 hacim sodyum asetat (3 M, pH 5.8) (~ 20 μL) ekleyin. Mikrosantrifüj tüpünü 1 saat boyunca -70 °C inkübe edin.
  6. DNA'yı 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10.000 × g'de santrifüjleme ile çökeltin ve süpernatanı çıkarın. DNA peletini% 70 etanol (~ 500 μL) ile yıkayın ve hava kuruması için oda sıcaklığında tutun.
  7. DNA'yı 20 μL steril suda yeniden askıya alın. Yetkin E. coli hücrelerinin transformasyonu için 2-5 μL plazmid DNA'sı kullanın.
    NOT: Plazmid, ticari olarak temin edilebilen maya plazmid izolasyon kitlerinden herhangi biri kullanılarak maya hücrelerinden de izole edilebilir.

4. Baskılayıcı klon tarafından kodlanan genin tanımlanması

  1. Standart protokol 29'u kullanarak izole edilmiş maya plazmidlerini E. coli Top10 suşuna [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] 'ye dönüştürün ve hücreleri LB (Luria Broth) plakalarına gerekli antibiyotiklerle yayın.
  2. Standart alkali lizis protokolü29'u kullanarak plazmidleri E. coli transformanlarından izole edin ve kısıtlama sindirimi ile insert DNA fragmanının salınımını kontrol etmek için uygun kısıtlama enzim kombinasyonlarını izleyin.
    NOT: Suppressor plazmid 84 Bam HI restriksiyon enzimi ile, Suppressor plazmid 104 ise PstI/BamHI restriksiyon enzimleri ile sindirildi.
  3. Ell1Δsuşunda kısıtlama sindiriminden sonra kesici uç salınımını gösteren plazmidleri, ell1Δ suşunun genotoksik strese duyarlı fenotipini kurtarma yeteneklerini kontrol etmek için yeniden dönüştürün.
  4. Genotoksik stres duyarlılığının baskılandığını gösteren plazmid klonlarını seçin ve vektöre özgü ileri ve geri primerler kullanarak bu plazmid klonlarında bulunan DNA fragmanını sıralayın.
    NOT: Bu çalışmada adh1 promotöre özgü üniversal ileri astar (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30 kullanılmıştır.
  5. Baskılamadan sorumlu geni tanımlamak için, NCBI nükleotid patlaması (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) veya Pombase dizi hizalama aracı (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core) kullanılarak elde edilen diziyi hizalayın. Maksimum hizalamayı gösteren diziyi seçin ve çok kopyalı baskılayıcı plazmidin geni olarak tanımlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

S. pombe'de ell1 delesyonla ilişkili genotoksik stres duyarlılığının multikopya baskılayıcılarının taranması
Genetik ekranı, sorgu ell1 delesyon mutant suşunun fonksiyon kaybı fenotipinin çoklu kopya baskılayıcılarını tanımlamak için yukarıda açıklanan protokolü kullanarak gerçekleştirdik. 4-NQO genotoksik ajan varlığında gözlenen ell1 delesyon suşunun büyümeye bağlı duyarlılığı, multikopya baskılayıcıları seçmek için fonksiyon kaybı fenotipi olarak benimsenmiştir. Şekil 1, genetik ekranın şematik bir temsilini göstermektedir. Taramaya başlamak için, ell1 delesyon mutantının (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1Δ :: kanMX6) genotoksik stres duyarlılığı ilk olarak 4-NQO varlığında izojenik vahşi tip suşu (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) ile ilgili olarak doğrulanmıştır (Şekil 2A). Daha sonra, S. pombe ell1 null mutant sorgusu, ell1 null mutantının 4-NQO büyümesiyle ilgili duyarlılığını bastırabilecek / kurtarabilecek plazmid klonlarını seçmek için yüksek kopya numaralı bir S. pombe cDNA kütüphanesi ile dönüştürüldü. Bu kütüphane, adh1 promotörü 30'un kontrolü altında pLEV3 S. pombe aşırı ekspresyon vektöründe klonlanmış ~6 ×10 5S. pombe cDNA fragmanı içerir. Bir kontrol olarak, dönüşüm karışımının 1 / 10'u, kütüphanenin transformasyonundan sonra elde edilen toplam rekombinant klon sayısını hesaplamak için 4-NQO'dan yoksun EMM2 plakaları üzerine kaplandı, kütüphanenin kapsamının bir göstergesi ve baskılayıcı klonların izolasyonu için tarandı. Bu çok önemlidir, çünkü daha az klonun taranması, baskılayıcı klonların tanımlanması olasılığını azaltacaktır. 

Şekil 2B, kontrolün temsili görüntülerini ve 4-NQO içeren plakaları göstermektedir. Şekilde gösterildiği gibi, kütüphanenin iyi bir kapsama alanını gösteren 4-NQO'dan yoksun kontrol plakasında çok sayıda koloni elde edilmiştir. Beklendiği gibi, 4-NQO plakasında daha az dönüştürücü elde edildi, çünkü bu dönüştürücüler muhtemelen ell1 null mutantın 4-NQO duyarlılığının varsayılan baskılayıcılarını temsil ediyor. Daha sonra, 0.2 μM 4-NQO içeren EMM2 plakalarında elde edilen farklı dönüştürücü koloniler, bu dönüştürücülerin 4-NQO varlığında büyüme yeteneğini doğrulamak için 0.2 μM 4-NQO içeren EMM2 plakalarında daha da çizilmiş veya tespit edilmiştir. 620 dönüştürücü koloninin 0.2 μM 4-NQO içeren EMM2 plakaları üzerinde büyüyebildiği gözlendi.

Sözde baskılayıcı klonların genotoksik stres koşulları altında ell1 delesyon mutantının büyümesini geri kazanma yeteneğinin doğrulanması
Varsayılan baskılayıcıları doğrulamak için, şematik gösterimde gösterildiği gibi istenen fenotipin kurtarılmasını daha yüksek sıkılık koşulları altında test etmek önemlidir (Şekil 3A). Bu nedenle, kısa listeye alınan 620 transformant, 0.4 μM 4-NQO ile EMM2 plakalarında tespit edildi. Şekil 3B'de görülebileceği gibi, sadece 74 dönüştürücü 0.4 μM 4-NQO'da büyüme göstermiştir. Daha sonra, bu 74 dönüştürücü, 0.8 μM 4-NQO içeren EMM2 plakalarında tespit edildi ve sadece 16'sının 0.8 μM 4-NQO varlığında büyüme gösterdiği gözlendi (Şekil 3C). Bu gözlemleri daha da doğrulamak için, bu 16 dönüştürücü, 0.8 μM 4-NQO içeren veya 4-NQO (kontrol) içermeyen gerekli takviyelerle EMM2 plakalarında tespit edildi ve ell1 silme mutantı boş vektörle dönüştürüldü. Bu lekelenme tahlillerinin sonuçları, beklendiği gibi, ell1 delesyon suşunun boş vektörle dönüştürülmesinin yanı sıra 16 dönüştürücünün tümünün, 4-NQO'dan yoksun plakada büyüme gösterdiğini ortaya koydu. Buna karşılık, sadece boş vektörü içeren ell1 delesyon mutantı 0.8 μM 4-NQO'da büyüme göstermezken, altı dönüştürücü 0.8 μM 4-NQO'da büyüme sergiledi (Şekil 3D), bu da içlerinde bulunan kütüphane klonlarının ell1 null mutantının genotoksik stres fenotipini bastırma yeteneğine sahip olduğunu düşündürmektedir.

Baskılayıcı klon tarafından kodlanan genin tanımlanması
Daha sonra, ell1 delesyon suşunun 02 genetik baskılayıcısını, sup 84 ve sup 104'ü seçtik ve 4-NQO varlığında ell1 ile ilişkili büyüme duyarlılığının tamamen baskılandığını gösterdik. Kütüphane plazmid klonları bu iki maya baskılayıcıdan izole edildi ve yetkin E. coli hücrelerine dönüştürüldü. Daha sonra, plazmid standart protokoller31 kullanılarak E. coli hücrelerinden izole edildi. 84 ve 104 olarak etiketlenen iki izole plazmid, sırasıyla yaklaşık 1.000 bp ve 800 bp insert DNA fragmanlarının varlığını ortaya çıkaran kısıtlama sindirimine tabi tutuldu (Şekil 4A, B). Bu baskılayıcı ekranın sonuçlarını daha da doğrulamak için, bu plazmidler ell1 silme mutantına yeniden dönüştürüldü ve 4-NQO varlığında ell1 null mutantının büyümesini geri yükleyip yükleyemeyecekleri kontrol edildi. Stres noktası testleri, baskılayıcı plazmid klonlarının, ell1 null mutantına yeniden sokulduğunda 4-NQO ile ilişkili büyüme duyarlılığının baskılanmasıyla sonuçlandığını ve baskılanmanın plazmid bağımlı olduğunu düşündürdüğünü ortaya koymuştur (Şekil 4C). Ayrıca, bu baskılayıcı klonların, başka bir DNA hasarına neden olan bileşik olan MMS'in varlığında ell1 delesyon suşunun büyüme ile ilgili duyarlılığını da baskılayıp baskılayamayacağını belirlemeye karar verdik. Nokta testleri, baskılayıcı plazmid klonlarının ell1 null mutantına dönüşümünün, MMS içeren ortamda, ell1 delesyon mutantının boş vektörle transformasyonundan daha fazla büyüme ile sonuçlandığını gösterdi ve bu plazmid klonlarının, her iki genotoksik ajanın varlığında ell1 delesyon mutantının genotoksik stres duyarlılığını baskılayabileceğini gösterdi. yani, 4-NQO ve MMS (Şekil 4D).

Daha sonra, bu baskılayıcı plazmid klonlarında bulunan geni tanımlamak için, adh1 promotöre özgü evrensel ileri primer30 kullanılarak ekleme DNA fragmanının dizilimi gerçekleştirildi. Elde edilen nükleotid dizisi, PomBase web sitesinde (https://www.pombase.org) bulunan 'BLAST at Ensembl' aracı kullanılarak araştırıldı ve bu da iki plazmid klonu 84 ve 104'ün sırasıyla rax2 + ve osh6 + genleri içerdiğini ortaya koydu ve Rax2 ve Osh6'nın S. pombe'de ell1 + yokluğu ile ilişkili genotoksik strese duyarlı fenotipin baskılanmasından sorumlu olduğuna dair kanıt sağladı. . Her iki proteinin de S. pombe'deki işlevleri hakkında bilgi sınırlıdır. Rax2'nin, S. pombe32'de vejetatif büyüme sırasında hücre polaritesini kontrol etmek için For3p'nin lokalizasyonunu düzenlediği gösterilmiştir. Osh6, oksisterol bağlayıcı proteinle ilişkili protein ailesine ait bir lipit taşıma proteinidir. Fosfatidilserinin endoplazmik retikulumdan plazma zarınataşınmasında rol oynar 33.

Figure 1
Şekil 1: Genetik multikopya baskılayıcı ekranının şematik gösterimi. Bu protokolün dört ana adımı vardır: kütüphanenin bir sorgu mutant suşuna dönüştürülmesi, sorgu mutant suşunun istenen fenotipini baskılayan plazmid klonlarının seçimi, plazmidlerin bu baskılayıcı klonlardan alınması ve fenotipin baskılanmasından sorumlu genin tanımlanması. Kısaltma: 4-NQO = 4-nitrokinolin 1-oksit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: S. pombe'de ell1 delesyonla ilişkili genotoksik stres duyarlılığının multikopya baskılayıcılarının taranması. (A) İzojenik vahşi tip suşuna kıyasla ell1-silinmiş S. pombe suşunun 4-NQO duyarlılığını gösteren stres noktası testi. Uygun suşların seri dilüsyonları (1:10), her biri 225 μg / mL adenin, lösin ve urasil içeren EMM2 ortamında, 0.4 μM 4-NQO ile veya (kontrol) olmadan tespit edildi. Plakalar daha sonra 32 ° C'de 3-5 gün boyunca inkübe edildi. (B) Yüksek kopya numaralı bir cDNA kütüphanesi, ell1-silinmiş S. pombe suşunda dönüştürüldü ve dönüştürülmüş koloniler, lösin içermeyen ancak 0.2 μM 4-NQO içeren EMM2 ortamında kaplandı. Transformasyon karışımının küçük bir aliquot'u da kontrol olarak 4-NQO'dan yoksun EMM2 plakaları üzerine kaplandı. Plakalar 5-6 gün boyunca 32 ° C'de inkübe edildi ve fotoğraflandı. Panel B, bu plakaların temsili bir görüntüsünü gösterir. Kısaltma: 4-NQO = 4-nitrokinolin 1-oksit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Sözde baskılayıcı klonların, ell1 delesyon mutantının genotoksik stres duyarlılığını baskılama yeteneğinin doğrulanması. (A) İstenilen fenotipin baskılanmasını test ederek kütüphane dönüştürücülerinin taranmasının şematik bir temsili. 620 transformantın büyümesi, lösin içermeyen ve (B) 0.4 μM 4-NQO veya (C) 0.8 μM 4-NQO içeren EMM2 plakalarında farklı transformantlar tespit edilerek artan 4-NQO konsantrasyonlarında test edildi. Plakalar 5-6 gün boyunca 32 ° C'de inkübe edildi ve fotoğraflandı. Plakaların temsili görüntüleri gösterilmiştir. (D) 0.8 μM 4-NQO üzerinde büyüme gösteren on altı transformant, lösin içermeyen ancak 0.8 μM 4-NQO içeren veya 4-NQO (kontrol) içermeyen EMM2 plakalarında boş vektörle dönüştürülen ell1 delesyon suşu ile birlikte tespit edildi. Plakalar 5-6 gün boyunca 32 ° C'de inkübe edildi ve fotoğraflandı. Sadece altı koloni, ell1 delesyon ile ilişkili genotoksik stres duyarlılığını kurtarma yeteneğini sergiledi. Kısaltma: 4-NQO = 4-nitrokinolin 1-oksit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Baskılayıcı plazmid klonlarının tanımlanması. BamHI kısıtlama enzimi ile baskılayıcı plazmid 84'ün (A) restriksiyon sindiriminin agaroz jel görüntüleri, ~ 1 kb'lik bir ek açığa çıkardı. (B) PstI / BamHI kısıtlama enzimleri ile sindirilen baskılayıcı plazmid 104, ~ 800 bp'lik bir ek açığa çıkardı. (C) 1:10 seri olarak seyreltilmiş ell1 null mutant, plazmidlerle dönüştürülmüş, sup 84 veya sup 104, lösten yoksun ve 0.4 μM 4-NQO veya (D)% 0.01 MMS içeren EMM2 plakalarında tespit edildi. Kontrol plakalarında, DNA'ya zarar veren bir ajan eklenmedi. Plakalar 4-5 gün boyunca 32 ° C'de inkübe edildi ve fotoğraflandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: S. pombe'nin büyümesi için ortamın bileşimi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mayalar, ökaryotik organizmalar arasında evrimsel olarak korunan temel biyolojik süreçleri ve yolları araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Genetik ve genomik araçların mevcudiyeti ve çeşitli biyokimyasal, genetik ve moleküler prosedürlere uygunlukları, mayaları genetik araştırmalar için mükemmel bir model organizma haline getirmektedir34,35,36. Yıllar geçtikçe, maya araştırmacıları tarafından, bireysel genlerin işlevlerine ışık tutacak genetik etkileşimlerin yanı sıra bunların dahil olabileceği yollar ve biyolojik süreçler10,11,17,37 arasında ışık tutacak genetik etkileşimleri tanımlamak için çeşitli genetik ekranlar tasarlanmıştır. Genetik etkileşimleri tanımlamak için yaygın ve kullanışlı ekranlardan biri 'çoklu kopya veya yüksek kopya sayısı baskılanması' olarak bilinir.

Bu ekran, fonksiyon kaybı fenotipi sergileyen bir sorgu mutant suşu (lar) ı ve ardından bu mutant sorgu suşlarının yüksek kopya numaralı genomik veya cDNA kitaplığı ile dönüştürülmesini gerektirir. Daha sonra, elde edilen dönüştürücüler, aşırı eksprese edildiğinde, sorgu mutant suşu (lar) ile ilişkili fenotipi baskılayan genleri tanımlamak için taranır. Plazmid kütüphanesi klonlarında bulunan spesifik mutant suş ve gen (ler) arasındaki bu tür genetik etkileşim, aynı yolda hareket etmesi veya aynı biyolojik süreci etkilemesi muhtemel gen ürünlerinin izolasyonu ve tanımlanması ile sonuçlanır4. Böylece, bu ekran, ilgilenilen genlerin işlevleri ve bunların in vivo olarak yollara ve biyolojik süreçlere fonksiyonel organizasyonlarına dair içgörüler sağlar. Geleneksel olarak, bu ekran S. cerevisiae38,39,40,41,42'de yaygın olarak kullanılmıştır.

Bu çalışmanın amacı, S. pombe'de çok kopyalı bir bastırma genetik taraması gerçekleştirmek için basit ve anlaşılır bir protokolü tanımlamaktır. Ekranı, ell1 transkripsiyon uzama faktörünün silinmesini taşıyan bir S. pombe suşu kullanarak gerçekleştirdik. ELL, fisyon mayasından insanlara kadar çok çeşitli organizmalarda bulunan bir transkripsiyon uzama faktörleri ailesidir. Ell1'in fonksiyonları S. pombe'de daha yeni anlaşılmaya başlanmıştır. Daha önceki çalışmalar, Ell1'in normal büyüme koşulları sırasında optimal büyümede ve genotoksik stres koşulları sırasında hayatta kalmadaki rolünü vurgulamıştı26. Multikopya baskılayıcı taramasını, S. pombe26'da genotoksik stres duyarlılığında Ell1'in rolünün altında yatan moleküler mekanizmayı ortaya çıkarmak için yaklaşımlardan biri olarak kullandık. Çok kopyalı plazmid kodlu bir S. pombe cDNA kütüphanesi, 4-NQO'ya duyarlılık gösteren S. pombe ell1 null mutantına dönüştürüldü. Daha sonra, 4-NQO varlığında büyüyebilecek dönüştürücüler seçildi.

Plazmidlerin bu dönüştürücülerden izole edilmesi ve bu plazmidlerde bulunan eklerin sıralanması, S. pombe, rax2 + ve osh6 + 'da ell1 + 'nın iki yeni genetik interaktörünün tanımlanmasına yol açmıştır. S. pombe'de benzer bir genetik tarama kullanan önceki bir çalışma, susturma önleyici protein olan epe1 +'yı, ell1 delesyonla ilişkili fenotiplerin43'ünün çoklu kopya baskılayıcısı olarak tanımlamıştır. Bu yöntemi, S. pombe RNA polimeraz II'nin esansiyel olmayan Rpb9 alt biriminin (yayınlanmamış gözlemler) çoklu kopya baskılayıcılarını tanımlamada da kullandık. Toplu olarak, bu sonuçlar, genetik multikopya baskılayıcı tarama yaklaşımının, istenen bir ilgi geni ile genetik etkileşim sergileyen varsayılan genleri / proteinleri tanımlamak, ilgilenilen genin dahil olabileceği işlevi, yolları ve süreçleri aydınlatmak için bir yöntem olarak yararlılığını doğrulamaktadır.

Bu çalışmada açıklanan ekranı kullanmak için, öncelikle mutasyonla ilişkili açık bir fenotip sergileyen ve çok kopyalı baskılayıcıları izole etmek için kullanılabilecek bir sorgu mutant suşuna sahip olmak önemlidir. Dahası, bu ekranın başarısı, maksimum sayıda vahşi tip geni veya bunlara karşılık gelen cDNA'ları temsil eden klonları içeren yüksek kaliteli ve iyi bir temsili kütüphanenin mevcudiyetine bağlı olacaktır. Geleneksel olarak, bu ekranlarda hem genomik hem de cDNA kütüphaneleri kullanılmıştır, ancak cDNA kütüphaneleri hücrede / organizmada eksprese edilen mRNA'lardan yapılma avantajına sahiptir. Ayrıca, maya hücrelerine dönüşümünün yüksek bir verimliliği, ekranın başarısı için zorunludur, çünkü çok sayıda dönüştürücüyü taramak önemlidir, bu da baskılayıcıları tanımlama olasılığını arttırır. Kütüphanenin lityum asetat protokolü kullanılarak sorgu mutant suşuna dönüştürülmesinden sonra kontrol plakasında daha az dönüştürücü elde edilirse, kütüphaneyi dönüştürmek için elektroporasyon kullanılabilir.

Ayrıca, kütüphaneyi dönüştürmeden önce dönüşüm protokolünü başka bir plazmidle standartlaştırmanız önerilir. Aksi takdirde gereksiz yere kütüphanenin kaybolmasına neden olacaktır. Burada açıklanan protokol, mutant fenotip olarak 4-NQO duyarlılığını kullanır, ancak ilgilenilen spesifik mutant fenotipine dayalı baskılayıcıların seçimi için uygun tarama yöntemleri / tahlilleri tasarlanmalıdır. Kütüphanenin sorgu mutant suşuna dönüştürülmesinden sonra baskılayıcıları seçmek için plakada hiç veya çok az dönüştürücü elde edilmezse, mümkünse, yüksek sıkılık koşulları altındakileri onaylamadan önce mümkün olduğunca çok sayıda genetik baskılayıcıyı tespit etmek için bastırıcıları seçmek üzere kütüphaneyi kaplarken daha az katı koşullar / tahliller kullanılmalıdır. Tanımlanan baskılayıcı plazmid klonlarında kesici ucun varlığını test etmek için kısıtlama sindirimi kullanmanın yanı sıra, vektöre özgü primerler kullanan PCR, istenen kesici uç DNA fragmanını yükseltmek için kullanılabilir. Alternatif olarak, baskılayıcı plazmid klonları doğrudan dizileme için verilebilir, bu da kısıtlama sindirimine veya PCR'ye ihtiyaç duymaz.

Bu ekran, S. cerevisiae ve S. pombe dışındaki mayalar için, uygun mutant suşlar, plazmidler ve promotör yapılara ilişkin genetik bir alet kiti mevcutsa, genlerin aşırı ekspresyonunu kolaylaştıracak ve konakçı maya hücresinde bulunan mutant fenotipin kurtarılmasına izin verecek şekilde benimsenebilir. Ayrıca, genom çapında delesyon mutantlarının toplanması44 ve aşırı ekspresyon kütüphaneleri37 dahil olmak üzere genom çapında kaynakların mevcudiyeti ile, bu ekran bir veya birkaç sorgu plazmidinin sistematik bir maya mutant suşu toplama dizisine dönüştürülmesiyle veya sistematik bir aşırı ekspresyon plazmid toplama dizisinin bir veya birkaç mutant sorgu suşuna dönüştürülmesiyle de gerçekleştirilebilir45 . Sonuç olarak, bu yaklaşım farklı organizmalardaki çok çeşitli deneysel sorulara açıkça genellenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü'nden bir araştırma hibesi ile finanse edilmiştir (Hibe No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) Nimisha Sharma'ya. Yazarlar, S. pombe cDNA kütüphanesinin hediyesi için Prof. Charles Hoffman'a (Boston College, ABD) ve maya plazmidleri için Prof. Susan Forsburg'a teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-NQO Sigma N8141
Acetic Acid, glacial Sigma 1371301000
Adenine Sulphate Himedia GRM033
Agar Himedia GRM026
Agarose Lonza 50004L
Ammonium Chloride Himedia MB054
BamHI Fermentas ER0051
Biotin Himedia RM095
Boric Acid Himedia MB007
Calcium Chloride  Sigma C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma C0549
Citric Acid Himedia RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous Himedia GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes Sigma D7656
EDTA disodium Sigma 324503
Ferric Chloride Hexahydrate Himedia RM6353
Glucose Amresco 188
Ionositol Himedia GRM102
Isopropanol Qualigen Q26897
Leucine Himedia GRM054
Lithium Acetatae Sigma 517992
Magnesium Chloride Hexahydrate Himedia MB040
Molybdic Acid Himedia RM690
Nicotinic Acid Himedia CMS177
PEG, MW 4000 Sigma 81240
Pentothinic Acid Himedia TC159
Phenol Himedia MB082
Plasmid Extraction Kit Qiagen 27104
Potassium Chloride Sigma P9541
Potassium hydrogen Pthallate Merc DDD7D670815
Potassium iodide Himedia RM1086
RNAse Fermentas EN0531
SDS Himedia GRM205
Sodium Hydroxide Himedia GRM1183
Sodium Sulphate Himedia RM1037
Tris free Base Himedia MB209
Uracil Himedia GRM264
Yeast Extract Powder Himedia RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate Merc DJ9D692580

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
  2. Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
  3. Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712 (2015).
  4. Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).
  6. Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).
  7. Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
  8. Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
  9. Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840 (2018).
  10. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  11. Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
  12. Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
  13. Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  14. Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
  15. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  16. Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
  17. Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
  18. Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
  19. Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
  20. Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
  21. Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
  22. Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
  23. Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
  24. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  25. Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
  26. Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).
  27. Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969 (2016).
  28. Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. Fission yeast: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932 (2006).
  30. Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090 (2006).
  32. Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
  33. Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601 (2021).
  34. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).
  35. Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
  36. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  37. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  38. Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
  39. Melnykov, A. V., Elson, E. L. MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444 (2019).
  40. Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
  41. Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
  42. Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
  43. Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
  44. Kim, D. -U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
  45. Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).

Tags

Biyoloji Sayı 187 Genetik tarama Multicopy suppressors Schizosaccharomyces pombe Ell1 Gen Regülasyonu Transkripsiyon uzaması
<em>Şizosakkaromices pombe'de</em> Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D.,… More

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D., Sharma, N. Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe. J. Vis. Exp. (187), e63967, doi:10.3791/63967 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter