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Biology

Dépistage génétique pour l’identification des suppresseurs multicopies chez Schizosaccharomyces pombe

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/63967
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University
* These authors contributed equally

Summary

Ce travail décrit un protocole pour un dépistage génétique suppresseur multicopie chez Schizosaccharomyces pombe. Ce criblage utilise une bibliothèque plasmidique pangénomique pour identifier le(s) clone(s) suppresseur(s) d’un phénotype de perte de fonction associé à une souche mutante de requête. De nouveaux suppresseurs génétiques du mutant nul ell1 ont été identifiés à l’aide de ce criblage.

Abstract

L’identification des interactions génétiques est un outil puissant pour déchiffrer les fonctions des gènes en fournissant des informations sur leurs relations fonctionnelles avec d’autres gènes et leur organisation en voies et processus biologiques. Bien que la majorité des criblages génétiques aient été initialement développés chez Saccharomyces cerevisiae, une plateforme complémentaire pour la réalisation de ces criblages génétiques a été fournie par Schizosaccharomyces pombe. L’une des approches couramment utilisées pour identifier les interactions génétiques consiste à surexprimer des clones d’une bibliothèque plasmidique à haut nombre de copies à l’échelle du génome dans un mutant de perte de fonction, suivie de la sélection de clones qui suppriment le phénotype mutant.

Cet article décrit un protocole pour effectuer ce dépistage génétique basé sur la « suppression multicopie » chez S. pombe. Ce criblage a permis d’identifier le(s) suppresseur(s) multicopie du phénotype génotoxique sensible au stress associé à l’absence du facteur d’élongation de la transcription Ell1 chez S. pombe. Le criblage a été initié par la transformation de la souche mutante nulle ell1 de requête avec une bibliothèque de plasmides d’ADNc S. pombe à nombre élevé de copies et en sélectionnant les suppresseurs sur des plaques EMM2 contenant du 4-nitroquinoléine 1-oxyde (4-NQO), un composé génotoxique induisant le stress. Par la suite, le plasmide a été isolé à partir de deux colonies suppressives présélectionnées et digéré par des enzymes de restriction pour libérer l’ADN de l’insert. Les plasmides libérant un fragment d’ADN inséré ont été retransformés en souche de délétion ell1 pour confirmer la capacité de ces clones plasmidiques suppresseurs à restaurer la croissance du mutant de délétion ell1 en présence de 4-NQO et d’autres composés génotoxiques. Les plasmides montrant un sauvetage du phénotype de délétion ont été séquencés pour identifier le(s) gène(s) responsable(s) de la suppression du phénotype génotoxique sensible au stress associé à la délétion ell1.

Introduction

Les réseaux d’interactions génétiques fournissent des informations fonctionnelles sur les gènes et délimitent les voies et les processus biologiques dans lesquels ces gènes peuvent être impliqués in vivo. En outre, ils peuvent également fournir des informations sur la façon dont différents gènes interagissent les uns avec les autres, ce qui donne un phénotype spécifique 1,2,3. Au fil des ans, divers criblages génétiques ont été conçus par les chercheurs pour répondre à des questions biologiques fondamentales et étudier les maladies humaines. Les cribles pour l’identification des interactions génétiques peuvent être effectués de plusieurs façons. Les interactions génétiques identifiées dans différents criblages génétiques peuvent représenter des relations mécanistes distinctes entre les gènes. De plus, des études ont révélé qu’un ensemble commun d’interactions génétiques est partagé par des gènes qui codent pour des protéines appartenant à la même voie ou complexe 4,5. Ainsi, les réseaux d’interaction génétique peuvent être utilisés pour établir l’organisation fonctionnelle dans une cellule, dans laquelle les gènes partageant les profils les plus similaires appartiennent au même complexe ou voie, les gènes partageant des profils un peu moins similaires appartiennent au même processus biologique, et les gènes présentant des profils qui se chevauchent mais plus divers reflètent des membres appartenant au même compartiment cellulaire6.

Les tests d’interaction génétique basés sur la suppression de la dose (« suppression à haute copie ou à plusieurs copies ») sont l’une des approches couramment utilisées. Ces criblages peuvent être effectués en transformant une souche mutante de requête avec une bibliothèque génomique ou d’ADNc à nombre élevé de copies, suivie de tests / techniques de sélection appropriés pour identifier la suppression ou l’amélioration des interactions génétiques 7,8,9. Pour assurer une couverture complète à l’échelle du génome, ces criblages ont également été effectués en surexprimant un gène spécifique d’intérêt dans une collection de mutants de perte de fonction à l’échelle du génome ou en surexprimant une bibliothèque génomique ou d’ADNc codée par un plasmide à nombre élevé dans une requête mutante de perte de fonction 9,10,11,12,13,14,15 . La stratégie multicopie pourrait également fonctionner en utilisant une approche dominante/surexpression utilisant un promoteur régulatable.

Les principaux avantages de l’utilisation de criblages à base de suppresseurs sont que la suppression d’un phénotype préexistant dans une souche mutante par un autre gène établit une relation génétique entre ces deux produits géniques qui n’a peut-être pas été démontrée par d’autres approches. Deuxièmement, il a été observé que la présence d’une mutation préexistante sensibilise une voie particulière, ce qui permet d’identifier des composants supplémentaires de cette voie par l’isolement de suppresseurs, qui n’ont peut-être pas été identifiés par des sélections génétiques plus directes. De plus, cet écran peut être utilisé pour identifier les suppresseurs qui ont différents mécanismes de suppression16. Les interactions suppressives se produisent généralement entre des gènes qui sont fonctionnellement liés et peuvent être utilisées pour élucider les hiérarchies dans les voies. Le mécanisme sous-jacent exact de suppression peut différer en fonction de plusieurs facteurs, notamment le type de mutant de requête utilisé dans le criblage, les conditions expérimentales et le niveau d’expression des gènes. L’un des mécanismes courants de suppression du dosage implique des gènes codant pour des produits qui fonctionnent ensemble dans le même complexe ou en parallèle dans le même processus cellulaire / biologique. Les résultats de tels criblages dans des organismes modèles plus simples tels que la levure peuvent être étendus à des organismes eucaryotes supérieurs puisque la plupart des voies et processus biologiques fondamentaux sont conservés tout au long de l’évolution.

Ces criblages génétiques peuvent également être modifiés de plusieurs façons pour répondre à différentes questions biologiques. Par exemple, des gènes orthologues de différents organismes qui peuvent supprimer le phénotype de la souche mutante de requête peuvent être identifiés. Il a également été utilisé pour délimiter les mécanismes de résistance potentiels et déterminer les cibles protéiques de nouveaux composés antibactériens17,18, antifongiques19,20, antiparasitaires 21 et anticancéreux 22. Ce criblage a également été exploité pour identifier les suppresseurs de l’activité des médicaments pharmaceutiques dont le mécanisme d’action n’est pas connu. Ainsi, en principe, ces écrans suppresseurs multicopies peuvent être optimisés et utilisés dans une variété d’applications dans différents organismes. Bien que la plupart des dépistages génétiques utilisés par les chercheurs sur les levures aient été initialement développés chez S. cerevisiae, S. pombe est apparu comme un système modèle complémentaire pour la réalisation de divers criblages et dosages génétiques23. De plus, l’organisation génomique et les processus biologiques chez S. pombe, tels que l’apparition d’introns dans un plus grand nombre de gènes, la complexité des origines de la réplication de l’ADN, la structure du centromère, l’organisation du cycle cellulaire et la présence de la machinerie ARNi, montrent une plus grande ressemblance entre S. pombe et les eucaryotes supérieurs23,24, soulignant l’importance de la conception et de l’utilisation d’outils génétiques chez S. pombe.

Cet article décrit un protocole d’identification des interacteurs génétiques basé sur la « suppression de dosage » d’un phénotype mutant de perte de fonction chez S. pombe. La base de ce protocole est qu’il s’agit d’une méthode rapide et efficace pour cribler une banque d’ADNc surexprimant des gènes de type sauvage soit sur un plasmide multicopie et / ou à partir d’un promoteur fort. Ce protocole comporte quatre étapes principales : transformation de la bibliothèque en une souche mutante de requête, sélection de clones plasmidiques qui suppriment le phénotype souhaité de la souche mutante requête, récupération du ou des plasmides de ces clones suppresseurs et identification du gène responsable de la suppression du phénotype. Comme c’est le cas pour toute méthode basée sur la sélection et l’identification d’ADNc à partir d’une bibliothèque, le succès de l’écran dépend de l’utilisation d’une bibliothèque de haute qualité et de haute complexité car l’écran ne peut récupérer que les clones d’ADNc présents dans la bibliothèque.

En utilisant ce protocole, nous avons identifié avec succès deux nouveaux suppresseurs du phénotype génotoxique sensible au stress de la requête S. pombe ell1 null mutant. La famille ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) de facteurs d’élongation de la transcription supprime la pause transitoire de l’ARN polymérase II sur les modèles d’ADN dans les essais biochimiques in vitro et est conservée dans divers organismes, de la levure de fission à l’homme25. Des travaux antérieurs ont fourni des preuves qu’un mutant nul de S. pombe ell1 présente une sensibilité au stress génotoxique en présence de 4-nitroquinoléine 1-oxyde (4-NQO) et de méthanesulfonate de méthyle (MMS)26. Par conséquent, nous avons transformé une bibliothèque d’ADNc multicopie codée par le plasmide de S. pombe en la requête S. pombe ell1 null mutant et identifié deux clones putatifs qui présentaient la capacité de supprimer la sensibilité au stress génotoxique du mutant nul S. pombe ell1 en présence de 4-NQO, un composé qui induit des lésions de l’ADN. Le séquençage ultérieur de l’insert présent dans les clones plasmidiques a permis d’identifier que les gènes codant pour rax2+ et osh6+ étaient responsables de la suppression de la sensibilité au stress génotoxique du mutant nul ell1 lorsqu’il était surexprimé dans le mutant nul ell1.

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Protocol

1. Transformation de la bibliothèque d’ADNc en la souche mutante de S. pombe pour dépister les suppresseurs multicopies

NOTE: La méthode standard de l’acétatede lithium 27 a été suivie pour transformer la bibliothèque d’ADNc de S. pombe en la souche S. pombe ell1Δ avec quelques modifications:

  1. Cultiver la souche S. pombe ell1 Δà 32 °C sur une plaque de milieu YE (tableau 1) additionnée de 225 μg/mL d’adénine, de leucine et d’uracile. Inoculer une boucle pleine d’inoculum de la souche ell1Δ de la plaque ci-dessus dans 15-20 mL de milieu YE complété par 225 μg/mL d’adénine, de leucine et d’uracile. Incuber pendant une nuit à 32 °C en secouant (200-250 tr/min).
  2. Le lendemain, diluer la culture de nuit dans 100 mL de milieu YE frais avec les suppléments désirés à une DO 600 nm (densité optique à 600 nm) de 0,3 et l’incuber à 32 °C en agitant à 200-250 tr/min jusqu’à ce que la DO600 nm atteigne la phase logarithmique moyenne.
  3. Répartir la culture de 100 mL en deux tubes à centrifuger de 50 mL, puis la centrifuger à température ambiante pendant 10 min à 4 000 × g.
  4. Jeter le surnageant et laver la pastille cellulaire avec 1 mL d’eau stérile, c’est-à-dire remettre les cellules en suspension dans 1 mL d’eau stérile et centrifuger à 4 000 × g pendant 5 min à température ambiante.
  5. Jeter le surnageant et laver chaque pastille de cellule avec 1 mL de 1x solution de LiAc-TE (100 mM d’acétate de lithium, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM d’EDTA, pH 7,5) comme décrit à l’étape 1.4.
  6. Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 250 μL de 1x LiAc-TE. Utilisez ces cellules compétentes de S. pombe (500 μL) pour la transformation avec l’ADN d’intérêt. Transférer 125 μL des cellules compétentes dans quatre tubes de microcentrifugation stériles différents pour les étapes de transformation ultérieures.
  7. Faire bouillir l’ADN porteur des testicules de saumon ou du sperme de hareng pendant 1 min et le placer immédiatement sur la glace. Pour chaque transformation, ajouter 10 μL d’ADN porteur simple brin dénaturé à 10 mg/mL dans le tube de microcentrifugation contenant 125 μL des cellules compétentes, puis mélanger doucement à l’aide d’une pointe de micropipette. Par la suite, ajouter 50 μg de la banque d’ADNc de S. pombe au tube de microcentrifugation contenant un mélange d’ADN porteur de cellules compétent.
  8. Incuber les tubes microcentrifugés à température ambiante pendant 10 min, puis ajouter 260 μL de solution de polyéthylèneglycol-acétate de lithium (40 % [p/v] PEG 4 000, acétate de lithium 100 mM, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) dans les tubes et mélanger doucement à l’aide d’un embout de micropipette.
  9. Incuber les tubes de microcentrifugation contenant le mélange de transformation à 32 °C pendant 2 h sans agiter. Ajouter 43 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) préchauffé dans le tube de microcentrifugation et mélanger délicatement. Par la suite, exposer les tubes à un choc thermique à 42 °C pendant 5 min.
  10. Enduire les cellules à 4 000 × g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant et retirez la solution résiduelle de PEG-LiAc-TE à l’aide d’un embout de micropipette.
  11. Remettez les cellules en suspension dans 100 μL d’eau stérile et sur une plaque EMM2 (tableau 1) (150 mm) avec les suppléments requis et 0,2 μg/mL de 4-NQO.
  12. Incuber les plaques à 32 °C pendant 5-6 jours pour permettre aux colonies d’apparaître sur les plaques. Strender les colonies obtenues sur la même plaque moyenne en présence de 0,2 μg/mL de 4-NQO et utiliser pour un criblage plus poussé.
  13. Pour une expérience de transformation de bibliothèque, utiliser 500 μL de cellules compétentes (125 μL de cellules compétentes x 4 tubes de microcentrifugeuse) pour la transformation décrite aux étapes 1.8 à 1.14 ci-dessus.
  14. Comme témoin, plaquer 1/10edu mélange de transformation sur une plaque EMM2 (150 mm) avec les suppléments requis, mais sans 4-NQO, pour calculer le nombre total de clones de bibliothèque obtenus après transformation de la bibliothèque et filtrer l’isolement des clones suppresseurs.

2. Tester et valider le sauvetage/suppression du phénotype associé à la souche mutante de requête par le suppresseur putatif

NOTE: Des tests ponctuels de stress ont été effectués comme décrit ci-dessous pour tester et valider le sauvetage/suppression de la sensibilité au stress 4-NQO associée à la délétion ell1 par le(s) suppresseur(s) putatif(s).

  1. Ajouter 100-200 μL d’eau stérile dans chacun des différents puits d’une plaque de microtitrage stérile de 96 puits.
  2. Prélever une petite quantité d’inoculum dans chacune des différentes colonies obtenues après transformation de la bibliothèque d’ADNc sur la plaque contenant du 4-NQO à l’aide d’un cure-dent stérile ou d’un embout de micropipette de 20 à 200 μL. Ajouter l’inoculum de chacune des différentes colonies dans des puits indépendants séparés de la plaque de microtitrage contenant 100-200 μL d’eau stérile. Mélanger.
  3. Repérez 3 μL de la suspension cellulaire de chaque puits sur des plaques de gélose EMM2 contenant de l’adénine (225 μg/mL) et de l’uracile (225 μg/mL) mais dépourvues de leucine (le marqueur auxotrophe sélectionnable présent sur le vecteur plasmidique utilisé pour la construction de la bibliothèque utilisée dans ce travail). Ajouter les concentrations appropriées de 4-NQO aux plaques, au besoin.
  4. Incuber les plaques à 32 °C pendant 3-4 jours pour permettre aux cellules de se développer. Identifier les colonies qui montrent une croissance en présence de différentes concentrations de 4-NQO comme suppresseurs putatifs.
  5. Pour valider davantage les suppresseurs, cultiver les suppresseurs sélectionnés avec les souches témoins appropriées pendant une nuit à 32 °C avec agitation (200-250 tr/min) dans un milieu EMM2 contenant 225 μg/mL chacun d’adénine et d’uracile mais dépourvus de leucine.
  6. Le lendemain, diluer les cellules à une DO 600 nm de 0,3 dans un milieu EMM2 frais et les faire croître à 32 °C en agitant jusqu’à la phase logarithmique (environ600 nm OD de 0,6-0,8).
  7. Repérer les dilutions en série appropriées (1:10 ou 1:5) des cultures sur des plaques EMM2 avec les suppléments requis contenant 0,4 μM de 4-NQO ou 0,01 % de MMS. Pour le contrôle, repérez les souches sur une plaque EMM2 avec les suppléments nécessaires, mais dépourvue de tout agent endommageant l’ADN.
  8. Incuber les plaques à 32 °C pendant 3 à 5 jours pour surveiller la croissance.
    NOTE: Des tests appropriés basés sur le phénotype associé à la souche mutante de requête doivent être utilisés pour tester le sauvetage ou la suppression du phénotype. Par exemple, si les suppresseurs d’un phénotype sensible au froid d’une souche mutante de requête doivent être identifiés, le test pour tester et valider les clones suppresseurs impliquerait la croissance de transformants à basse température.
  9. Repérez les souches mutantes transformées avec un gène d’intérêt complet (Spell1 dans ce cas) ou un vecteur vide en tant que témoins positifs et négatifs, respectivement, avec les transformants de la bibliothèque.

3. Isolement du plasmide à partir des clones suppresseurs de S. pombe

NOTE: L’isolement plasmidique de S. pombe a été effectué en suivant le protocole décrit dans Fission yeast: a laboratory manual28 avec quelques modifications.

  1. Inoculer une seule colonie de levure dans un milieu EMM2 contenant 225 μg/mL d’adénine et d’uracile et faire croître les cellules pendant une nuit à 32 °C avec agitation à 200-250 rpm. Le lendemain, prélever 5 cellules O.D. (c.-à-d. 10 mL de culture O.D. 0,5) par centrifugation pendant 2 min à 4 000 × g à température ambiante.
  2. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 0,2 mL de tampon de lyse (2 % Triton X-100, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) et 1 mM Na2EDTA).
  3. Ajouter 0,2 mL de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) et 0,3 g de billes de verre lavées à l’acide dans le tube de microcentrifugeuse. Faire tourbillonner le tube de la microcentrifugeuse pendant 2 min à 4 °C et incuber sur la glace pendant 1 min. Répétez cette étape 6x.
  4. Centrifuger le tube à 10 000 × g pendant 15 min à température ambiante. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube microcentrifuge frais et ajouter 200 μL d’alcool phénol:chloroforme:isoamylique (25:24:1).
  5. Centrifuger le tube à 10 000 × g pendant 10 min. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube frais et ajouter deux volumes d’éthanol à 100 % (~400 μL) et 1/10 de volume d’acétate de sodium (3 M, pH 5,8) (~20 μL) dans le tube. Incuber le tube de microcentrifugation à -70 °C pendant 1 h.
  6. Précipiter l’ADN par centrifugation à 10 000 × g pendant 15 min à 4 °C et éliminer le surnageant. Lavez la pastille d’ADN avec de l’éthanol à 70 % (~500 μL) et maintenez-la à température ambiante pour la sécher à l’air.
  7. Remettez l’ADN en suspension dans 20 μL d’eau stérile. Utilisez 2-5 μL d’ADN plasmidique pour la transformation des cellules E. coli compétentes.
    REMARQUE: Le plasmide peut également être isolé à partir de cellules de levure à l’aide de l’un des kits d’isolation plasmidique de levure disponibles dans le commerce.

4. Identification du gène codé par le clone suppresseur

  1. Transformer les plasmides de levure isolés en souche E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] en utilisant le protocole standard29 et étaler les cellules sur des plaques LB (Luria Broth) avec les antibiotiques nécessaires.
  2. Isoler le(s) plasmide(s) des transformateurs E. coli en utilisant le protocole de lyse alcalinestandard 29 et suivre les combinaisons appropriées d’enzymes de restriction pour vérifier la libération du fragment d’ADN inséré par digestion de restriction.
    REMARQUE: Le plasmide suppresseur 84 a été digéré avec l’enzyme de restriction Bam HI, et le plasmide suppresseur 104 a été digéré avec les enzymes de restriction PstI / BamHI.
  3. Retransformer les plasmides présentant une libération d’insert après digestion de restriction dans la souche ell1 Δ pour vérifier leur capacité à sauver le phénotype génotoxique sensible au stress de la souche ell1Δ.
  4. Sélectionner les clones plasmidiques montrant la suppression de la sensibilité au stress génotoxique et séquencer le fragment d’ADN inséré présent dans ces clones plasmidiques à l’aide d’amorces directes et inverses spécifiques au vecteur.
    NOTE: Dans cette étude, l’amorce avant universelle spécifique au promoteur adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3') a été utilisée30.
  5. Pour identifier le gène responsable de la suppression, aligner la séquence obtenue à l’aide de l’explosion nucléotidique NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) ou de l’outil d’alignement de séquence Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Sélectionnez la séquence montrant l’alignement maximal et identifiez-la comme le gène du plasmide suppresseur de multicopie.

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Representative Results

Criblage de suppresseurs multicopies de sensibilité au stress génotoxique associé à la délétion ell1 chez S. pombe
Nous avons effectué le dépistage génétique en utilisant le protocole décrit ci-dessus pour identifier les suppresseurs multicopies du phénotype de perte de fonction de la souche mutante de délétion ell1. La sensibilité liée à la croissance de la souche de délétion ell1 observée en présence de l’agent génotoxique 4-NQO a été adoptée comme phénotype de perte de fonction à sélectionner pour les suppresseurs multicopies. La figure 1 montre une représentation schématique du dépistage génétique. Pour commencer le criblage, la sensibilité au stress génotoxique du mutant de délétion ell1 (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1 Δ :: kanMX6) a d’abord été confirmée par rapport à sa souche isogénique de type sauvage (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) en présence de 4-NQO (Figure 2A). Par la suite, la requête S. pombe ell1 null mutant a été transformée avec une bibliothèque d’ADNc S. pombe à nombre élevé de copies pour sélectionner les clones plasmidiques qui pourraient supprimer/sauver la sensibilité liée à la croissance 4-NQO du mutant nul ell1. Cette bibliothèque contient ~6 × 105 fragments d’ADNc de S. pombe clonés dans le vecteur de surexpression pLEV3 S. pombe sous le contrôle du promoteur adh1 30. En tant que contrôle, 1/10èmedu mélange de transformation a également été plaqué sur des plaques EMM2 dépourvues de 4-NQO pour calculer le nombre total de clones recombinants obtenus après transformation de la bibliothèque, une indication de la couverture de la bibliothèque, et un criblage pour l’isolement des clones suppresseurs. Ceci est essentiel, car le dépistage d’un moins grand nombre de clones réduira la possibilité d’identifier les clones suppresseurs. 

La figure 2B montre des images représentatives des plaques témoins et contenant du 4-NQO. Comme le montre la figure, un grand nombre de colonies sont obtenues sur la plaque de contrôle dépourvue de 4-NQO montrant une bonne couverture de la bibliothèque. Comme prévu, moins de transformants ont été obtenus sur la plaque 4-NQO car ces transformants représentent probablement les suppresseurs putatifs de la sensibilité 4-NQO du mutant nul ell1 . Ensuite, les différentes colonies de transformants obtenues sur des plaques EMM2 contenant 0,2 μM de 4-NQO ont été davantage striées ou tachetées sur des plaques EMM2 contenant 0,2 μM de 4-NQO pour confirmer la capacité de croissance de ces transformants en présence de 4-NQO. Il a été observé que 620 colonies transformantes pouvaient se développer sur des plaques EMM2 contenant 0,2 μM contenant du 4-NQO.

Validation de la capacité des clones suppresseurs putatifs à restaurer la croissance du mutant de délétion ell1 dans des conditions de stress génotoxique
Pour confirmer les suppresseurs putatifs, il est important de tester le sauvetage du phénotype souhaité dans des conditions de rigueur plus élevées, comme le montre la représentation schématique (Figure 3A). Par conséquent, les 620 transformants présélectionnés ont été repérés sur des plaques EMM2 avec 0,4 μM de 4-NQO. Comme on peut le voir à la figure 3B, seuls 74 transformants ont montré une croissance de 0,4 μM 4-NQO. Par la suite, ces 74 transformants ont été repérés sur des plaques EMM2 contenant 0,8 μM de 4-NQO, et il a été observé que seulement 16 présentaient une croissance en présence de 0,8 μM de 4-NQO (Figure 3C). Pour confirmer davantage ces observations, ces 16 transformants ont été repérés sur des plaques EMM2 avec les suppléments requis, contenant soit 0,8 μM 4-NQO ou pas de 4-NQO (témoin), ainsi que le mutant de délétion ell1 transformé avec un vecteur vide. Les résultats de ces tests de repérage ont révélé que, comme prévu, la souche de délétion ell1 transformée avec un vecteur vide, ainsi que les 16 transformants, ont montré une croissance sur la plaque dépourvue de 4-NQO. En comparaison, alors que le mutant de délétion ell1 ne contenant que le vecteur vide n’a montré aucune croissance à 0,8 μM 4-NQO, six transformants ont présenté une croissance à 0,8 μM 4-NQO (Figure 3D), suggérant que le ou les clones de bibliothèque présents en eux avaient la capacité de supprimer le phénotype de stress génotoxique du mutant nul ell1.

Identification du gène codé par le clone suppresseur
Nous avons ensuite sélectionné 02 suppresseurs génétiques de la souche de délétion ell1, sup 84 et sup 104, montrant une suppression complète de la sensibilité de croissance associée à ell1 en présence de 4-NQO. Le ou les clones plasmidiques de la bibliothèque ont été isolés de ces deux suppresseurs de levure et transformés en cellules compétentes d’E. coli. Par la suite, le plasmide a été isolé à partir de cellules E. coli en utilisant les protocoles standard31. Les deux plasmides isolés, marqués 84 et 104, ont été soumis à une digestion de restriction, ce qui a révélé la présence d’environ 1 000 bp et 800 bp insérer des fragments d’ADN, respectivement (Figure 4A, B). Pour valider davantage les résultats de ce criblage suppresseur, ces plasmides ont été retransformés en mutant de délétion ell1 et vérifiés s’ils pouvaient restaurer la croissance du mutant nul ell1 en présence de 4-NQO. Les tests de point de stress ont révélé que les clones plasmidiques suppresseurs entraînaient la suppression de la sensibilité de croissance associée au 4-NQO lorsqu’ils étaient réintroduits dans le mutant nul ell1, suggérant que la suppression dépendait du plasmide (Figure 4C). De plus, nous avons décidé de déterminer si ces clones suppresseurs pouvaient également supprimer la sensibilité liée à la croissance de la souche de délétion ell1 en présence d’un autre composé induisant des dommages à l’ADN, le MMS. Les essais ponctuels ont démontré que la transformation des clones plasmidiques suppresseurs en mutant nul ell1 entraînait une croissance plus importante sur un milieu contenant du MMS que la transformation du mutant de délétion ell1 avec un vecteur vide, ce qui indique que ces clones plasmidiques pouvaient supprimer la sensibilité au stress génotoxique du mutant de délétion ell1 en présence des deux agents génotoxiques, c.-à-d. 4-NQO et MMS (figure 4D).

Ensuite, pour identifier le gène présent dans ces clones plasmidiques suppresseurs, le séquençage du fragment d’ADN inséré a été effectué à l’aide de l’amorce directe universelle spécifique au promoteur adh1 30. La séquence nucléotidique obtenue a été recherchée à l’aide de l’outil « BLAST at Ensembl » disponible sur le site Web PomBase (https://www.pombase.org), qui a révélé que les deux clones plasmidiques 84 et 104 contenaient respectivement les gènes rax2+ et osh6+, fournissant la preuve que Rax2 et Osh6 étaient responsables de la suppression du phénotype génotoxique sensible au stress associé à l’absence d’ell1+ chez S. pombe . Les connaissances sur les fonctions de ces deux protéines chez S. pombe sont limitées. Il a été démontré que Rax2 régule la localisation de For3p pour contrôler la polarité cellulaire pendant la croissance végétative chez S. pombe32. Osh6 est une protéine de transport lipidique qui appartient à la famille des protéines liées à l’oxystérol. Il est impliqué dans le transport de la phosphatidylsérine du réticulum endoplasmique à la membrane plasmique33.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique du criblage suppresseur génétique multicopie. Ce protocole comporte quatre étapes principales : transformation de la bibliothèque en une souche mutante de requête, sélection de clones plasmidiques qui suppriment le phénotype souhaité de la souche mutante requête, récupération du ou des plasmides de ces clones suppresseurs et identification du gène responsable de la suppression du phénotype. Abréviation : 4-NQO = 4-nitroquinoléine 1-oxyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Dépistage des suppresseurs multicopies de la sensibilité au stress génotoxique associée à la délétion ell1 chez S. pombe. (A) Essai ponctuel de stress montrant la sensibilité 4-NQO de la souche S. pombe supprimée ell1 par rapport à sa souche isogénique de type sauvage. Des dilutions en série (1:10) de souches appropriées ont été repérées sur un milieu EMM2 contenant 225 μg/mL chacun d’adénine, de leucine et d’uracile avec ou sans (témoin) 0,4 μM de 4-NQO. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 3 à 5 jours à 32 °C. (B) Une banque d’ADNc à nombre élevé de copies a été transformée dans la souche S. pombe supprimée ell1, et les colonies transformées ont été plaquées sur un milieu EMM2 dépourvu de leucine mais contenant 0,2 μM de 4-NQO. Une petite partie aliquote du mélange de transformation a également été plaquée sur des plaques EMM2 dépourvues de 4-NQO, comme témoin. Les plaques ont été incubées à 32 °C pendant 5-6 jours et photographiées. Le panneau B montre une image représentative de ces plaques. Abréviation : 4-NQO = 4-nitroquinoléine 1-oxyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Validation de la capacité des clones suppresseurs putatifs à supprimer la sensibilité au stress génotoxique du mutant de délétion ell1. (A) Une représentation schématique du criblage des transformants de la bibliothèque en testant la suppression du phénotype souhaité. La croissance de 620 transformants a été testée sur des concentrations croissantes de 4-NQO en repérant différents transformants sur des plaques EMM2 dépourvues de leucine et contenant soit (B) 0,4 μM 4-NQO ou (C) 0,8 μM 4-NQO. Les plaques ont été incubées à 32 °C pendant 5-6 jours et photographiées. Des images représentatives de plaques ont été montrées. (D) Seize transformants qui présentaient une croissance sur 0,8 μM de 4-NQO ont été repérés sur des plaques EMM2 dépourvues de leucine mais contenant soit 0,8 μM de 4-NQO, soit ne contenant pas de 4-NQO (témoin), ainsi que la souche de délétion ell1 transformée avec un vecteur vide. Les plaques ont été incubées à 32 °C pendant 5-6 jours et photographiées. Seules six colonies ont montré la capacité de sauver la sensibilité au stress génotoxique associée à la délétion ell1. Abréviation : 4-NQO = 4-nitroquinoléine 1-oxyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Identification des clones plasmidiques suppresseurs. Les images en gel d’agarose de (A) digestion de restriction du plasmide suppresseur 84 avec l’enzyme de restriction BamHI ont libéré un insert de ~1 kb. (B) Le plasmide suppresseur 104 digéré avec des enzymes de restriction PstI/BamHI a libéré un insert de ~800 bp. (C) 1:10 Ell1 mutant nul dilué en série transformé avec des plasmides, sup 84 ou sup 104, ont été repérés sur des plaques EMM2 dépourvues de leucine et contenant soit 0,4 μM 4-NQO ou (D) 0,01% MMS. Dans les plaques témoins, aucun agent endommageant l’ADN n’a été ajouté. Les plaques ont été incubées à 32 °C pendant 4-5 jours et photographiées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition des milieux pour la croissance de S. pombe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Les levures ont été largement utilisées pour étudier les processus biologiques de base et les voies qui sont conservées au cours de l’évolution dans les organismes eucaryotes. La disponibilité d’outils génétiques et génomiques ainsi que leur aptitude à diverses procédures biochimiques, génétiques et moléculaires font des levures un excellent organisme modèle pour la recherche génétique34,35,36. Au fil des ans, divers criblages génétiques ont été conçus par des chercheurs sur la levure pour identifier les interactions génétiques qui permettraient de faire la lumière sur les fonctions des gènes individuels, ainsi que sur les voies et les processus biologiques dans lesquels ils peuvent être impliqués10,11,17,37. L’un des écrans courants et utiles pour identifier les interactions génétiques est connu sous le nom de « suppression multicopie ou nombre élevé de copies ».

Cet écran nécessite une ou plusieurs souches mutantes de requête présentant un phénotype de perte de fonction, suivies de la transformation de cette ou de ces souches mutantes de requête avec une bibliothèque génomique ou ADNc à nombre élevé de copies. Par la suite, les transformants obtenus sont examinés pour identifier les gènes qui, lorsqu’ils sont surexprimés, suppriment le phénotype associé à la ou aux souches mutantes de requête. Ce type d’interaction génétique entre la souche mutante spécifique et le(s) gène(s) présent(s) dans les clones de la bibliothèque plasmidique aboutit à l’isolement et à l’identification de produits géniques susceptibles d’agir dans la même voie ou d’affecter le même processus biologique4. Ainsi, cet écran donne un aperçu des fonctions du ou des gènes d’intérêt et de leur organisation fonctionnelle en voies et processus biologiques in vivo. Traditionnellement, cet écran a été largement utilisé chez S. cerevisiae 38,39,40,41,42.

Le but du présent travail est de décrire un protocole simple et direct pour effectuer un dépistage génétique de suppression multicopie chez S. pombe. Nous avons réalisé le criblage en utilisant une souche de S. pombe portant une délétion du facteur d’allongement de la transcription ell1. ELL est une famille de facteurs d’élongation de transcription, qui sont présents dans un large éventail d’organismes, de la levure de fission à l’homme. Les fonctions de Ell1 commencent seulement à être comprises chez S. pombe. Des travaux antérieurs avaient mis en évidence le rôle de l’Ell1 dans une croissance optimale dans des conditions de croissance normales et dans la survie dans des conditions de stress génotoxique26. Nous avons utilisé le criblage suppresseur multicopie comme l’une des approches pour découvrir le mécanisme moléculaire sous-jacent au rôle d’Ell1 dans la sensibilité au stress génotoxique chez S. pombe26. Une bibliothèque d’ADNc de S. pombe codée par un plasmide multiple a été transformée en mutant nul S. pombe ell1 qui présente une sensibilité au 4-NQO. Par la suite, les transformants qui pouvaient se développer en présence de 4-NQO ont été sélectionnés.

L’isolement des plasmides de ces transformants et le séquençage des inserts présents dans ces plasmides ont conduit à l’identification de deux nouveaux interacteurs génétiques d’ell1+ chez S. pombe, rax2+ et osh6+. Une étude antérieure utilisant un dépistage génétique similaire chez S. pombe a également identifié la protéine anti-silençage, epe1+, comme un suppresseur multicopie des phénotypes associés à la délétion ell1 43. Nous avons également utilisé cette méthode pour identifier les suppresseurs multicopies de la sous-unité Rpb9 non essentielle de l’ARN polymérase II de S. pombe (observations non publiées). Collectivement, ces résultats valident l’utilité de l’approche de criblage des suppresseurs de multicopie génétique comme méthode pour identifier les gènes / protéines putatifs qui présentent une interaction génétique avec un gène d’intérêt souhaité, en élucidant la fonction, les voies et les processus dans lesquels le gène d’intérêt peut être impliqué.

Pour utiliser l’écran décrit dans ce travail, il est important d’avoir d’abord une souche mutante de requête qui présente un phénotype clair associé à la mutation, qui peut être utilisé pour isoler le(s) suppresseur(s) multicopie(s). De plus, le succès de ce criblage dépendra de la disponibilité d’une bibliothèque de haute qualité et de bonne qualité contenant des clones représentant le nombre maximum de gènes de type sauvage ou leurs ADNc correspondants. Traditionnellement, les banques génomiques et d’ADNc ont été utilisées dans ces criblages, mais les banques d’ADNc ont l’avantage d’être fabriquées à partir d’ARNm exprimés dans la cellule / organisme. De plus, une grande efficacité de sa transformation en cellules de levure est impérative pour le succès du criblage car il est important de cribler un grand nombre de transformants, augmentant ainsi la probabilité d’identifier les suppresseurs. Si moins de transformants sont obtenus sur la plaque de contrôle après transformation de la bibliothèque en souche mutante de requête à l’aide du protocole d’acétate de lithium, l’électroporation peut être utilisée pour transformer la bibliothèque.

Il est également conseillé de standardiser d’abord le protocole de transformation avec un autre plasmide avant de transformer la bibliothèque. Sinon, cela entraînera inutilement la perte de la bibliothèque. Le protocole décrit ici utilise la sensibilité 4-NQO comme phénotype mutant, mais des méthodes / dosages de dépistage appropriés doivent être conçus pour la sélection des suppresseurs en fonction du phénotype mutant spécifique d’intérêt. Si aucun transformant ou très peu de transformants ne sont obtenus sur la plaque à sélectionner pour les suppresseurs après transformation de la bibliothèque en souche mutante de requête, alors, si possible, des conditions/dosages moins stricts doivent être utilisés lors du placage de la bibliothèque pour sélectionner les suppresseurs afin de détecter autant de suppresseurs génétiques que possible avant de confirmer ceux dans des conditions de haute rigueur. En plus d’utiliser la digestion de restriction pour tester la présence de l’insert dans les clones de plasmides suppresseurs identifiés, la PCR utilisant des amorces spécifiques au vecteur peut être utilisée pour amplifier le fragment d’ADN de l’insert souhaité. Alternativement, les clones plasmidiques suppresseurs peuvent être directement administrés pour le séquençage, évitant ainsi le besoin de digestion de restriction ou de PCR.

Ce dépistage peut également être adopté pour les levures autres que S. cerevisiae et S . pombe si une trousse d’outils génétiques concernant les souches mutantes, les plasmides et les constructions de promoteurs appropriés est disponible pour faciliter la surexpression des gènes, permettant le sauvetage du phénotype mutant présent dans la cellule de levure hôte. De plus, avec la disponibilité de ressources à l’échelle du génome, y compris la collection de mutants de délétion à l’échelle du génome44 et les bibliothèques de surexpression37, ce criblage peut également être effectué par transformation d’un ou de quelques plasmides de requête en un réseau systématique de collection de souches mutantes de levure ou par transformation d’un réseau systématique de collection de plasmides de surexpression en une ou quelques souches de requête mutantes45 . En conclusion, cette approche peut être clairement généralisée à une grande variété de questions expérimentales dans différents organismes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par une subvention de recherche du Département de biotechnologie du gouvernement de l’Inde (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) à Nimisha Sharma. Les auteurs remercient le professeur Charles Hoffman (Boston College, États-Unis) pour le don de la bibliothèque d’ADNc de S. pombe et le professeur Susan Forsburg pour les plasmides de levure.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-NQO Sigma N8141
Acetic Acid, glacial Sigma 1371301000
Adenine Sulphate Himedia GRM033
Agar Himedia GRM026
Agarose Lonza 50004L
Ammonium Chloride Himedia MB054
BamHI Fermentas ER0051
Biotin Himedia RM095
Boric Acid Himedia MB007
Calcium Chloride  Sigma C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma C0549
Citric Acid Himedia RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous Himedia GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes Sigma D7656
EDTA disodium Sigma 324503
Ferric Chloride Hexahydrate Himedia RM6353
Glucose Amresco 188
Ionositol Himedia GRM102
Isopropanol Qualigen Q26897
Leucine Himedia GRM054
Lithium Acetatae Sigma 517992
Magnesium Chloride Hexahydrate Himedia MB040
Molybdic Acid Himedia RM690
Nicotinic Acid Himedia CMS177
PEG, MW 4000 Sigma 81240
Pentothinic Acid Himedia TC159
Phenol Himedia MB082
Plasmid Extraction Kit Qiagen 27104
Potassium Chloride Sigma P9541
Potassium hydrogen Pthallate Merc DDD7D670815
Potassium iodide Himedia RM1086
RNAse Fermentas EN0531
SDS Himedia GRM205
Sodium Hydroxide Himedia GRM1183
Sodium Sulphate Himedia RM1037
Tris free Base Himedia MB209
Uracil Himedia GRM264
Yeast Extract Powder Himedia RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate Merc DJ9D692580

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References

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Biologie numéro 187 Criblage génétique Suppresseurs multicopies Schizosaccharomyces pombe Ell1 Régulation génique Allongement de la transcription
Dépistage génétique pour l’identification des suppresseurs multicopies chez <em>Schizosaccharomyces pombe</em>
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Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D., Sharma, N. Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe. J. Vis. Exp. (187), e63967, doi:10.3791/63967 (2022).

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