Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genetisk skärm för identifiering av multicopy suppressorer i Schizosaccharomyces pombe

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/63967
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University
* These authors contributed equally

Summary

Detta arbete beskriver ett protokoll för en multicopy suppressor genetisk skärm i Schizosaccharomyces pombe. Den här skärmen använder ett genomomfattande plasmidbibliotek för att identifiera suppressorkloner av en fenotyp med förlust av funktion som är associerad med en frågemutantstam. Nya genetiska suppressorer av ell1 null-mutanten identifierades med hjälp av denna skärm.

Abstract

Identifiering av genetiska interaktioner är ett kraftfullt verktyg för att dechiffrera genernas funktioner genom att ge insikter i deras funktionella relationer med andra gener och organisation i biologiska vägar och processer. Även om majoriteten av de genetiska skärmarna ursprungligen utvecklades i Saccharomyces cerevisiae, har en kompletterande plattform för att utföra dessa genetiska skärmar tillhandahållits av Schizosaccharomyces pombe. En av de vanliga metoderna som används för att identifiera genetiska interaktioner är genom överuttryck av kloner från ett genomomfattande, högt kopieringsnummer plasmidbibliotek i en förlust av funktionsmutant, följt av urval av kloner som undertrycker mutantfenotypen.

Detta dokument beskriver ett protokoll för att utföra denna "multicopy suppression" -baserade genetiska skärm i S. pombe. Denna skärm har hjälpt till att identifiera multicopy suppressor (er) av den genotoxiska stresskänsliga fenotypen associerad med frånvaron av Ell1-transkriptionsförlängningsfaktorn i S. pombe. Skärmen initierades genom transformation av frågan ell1 nullmutantstam med ett högt kopieringsnummer S. pombe cDNA-plasmidbibliotek och val av suppressorer på EMM2-plattor innehållande 4-nitrokinolin 1-oxid (4-NQO), en genotoxisk stressinducerande förening. Därefter isolerades plasmid från två kortlistade suppressorkolonier och smältes av restriktionsenzymer för att frigöra insats-DNA. Plasmider som frigör ett INSERT DNA-fragment omvandlades till ell1-deletionsstammen för att bekräfta förmågan hos dessa suppressorplasmidkloner att återställa tillväxten av ell1-deletionsmutanten i närvaro av 4-NQO och andra genotoxiska föreningar. De plasmider som visade en räddning av deletionsfenotypen sekvenserades för att identifiera genen /generna som är ansvariga för undertryckandet av den ell1-deletionsassocierade genotoxiska stresskänsliga fenotypen.

Introduction

Nätverk av genetiska interaktioner ger funktionell information om gener och avgränsar vägar och biologiska processer som dessa gener kan vara involverade i in vivo. Dessutom kan de också ge insikter om hur olika gener interagerar med varandra, vilket resulterar i en specifik fenotyp 1,2,3. Under årens lopp har en mängd olika genetiska skärmar utformats av forskare för att svara på grundläggande biologiska frågor och studera mänskliga sjukdomar. Skärmar för identifiering av genetiska interaktioner kan utföras på flera sätt. Genetiska interaktioner som identifierats i olika genetiska skärmar kan representera distinkta mekanistiska relationer mellan gener. Dessutom har studier visat att en gemensam uppsättning genetiska interaktioner delas av gener som kodar för proteiner som tillhör samma väg eller komplexa 4,5. Således kan genetiska interaktionsnätverk användas för att etablera den funktionella organisationen i en cell, där gener som delar de mest liknande profilerna tillhör samma komplex eller väg, de gener som delar något mindre liknande profiler tillhör samma biologiska process, och de gener som uppvisar överlappande men mer olika profiler återspeglar medlemmar som tillhör samma cellulära fack6.

Genetiska interaktionsskärmar baserade på dosundertryckning ("high-copy or multicopy suppression") är en av de vanligaste metoderna. Dessa skärmar kan utföras genom att transformera en frågemutantstam med ett genomiskt eller cDNA-bibliotek med högt kopieringsnummer, följt av lämpliga analyser/urvalstekniker för att identifiera undertryckande eller förbättrade genetiska interaktioner 7,8,9. För att säkerställa en omfattande genomomfattande täckning har dessa skärmar också utförts genom att överuttrycka en specifik gen av intresse i en samling genomomfattande funktionsförlustmutant eller genom att överuttrycka ett plasmidkodat genomiskt eller cDNA-bibliotek med hög kopieringsnummer i en förlust av funktionsfrågamutant 9,10,11,12,13,14,15 . Multicopy-strategin kan också fungera med en dominerande/överuttrycksmetod med hjälp av en reglerbar promotor.

De främsta fördelarna med att använda suppressorbaserade skärmar är att undertryckande av en redan existerande fenotyp i en mutantstam av en annan gen etablerar ett genetiskt samband mellan dessa två genprodukter som kanske inte har visats med andra metoder. För det andra har det observerats att närvaron av en redan existerande mutation sensibiliserar en viss väg, vilket gör det möjligt att identifiera ytterligare komponenter i den vägen genom isolering av suppressorer, som kanske inte har identifierats genom mer direkta genetiska val. Dessutom kan denna skärm användas för att identifiera suppressorer som har olika mekanismer för undertryckande16. Suppressorinteraktioner uppträder vanligtvis mellan gener som är funktionellt relaterade och kan användas för att belysa hierarkier i vägar. Den exakta underliggande mekanismen för undertryckande kan variera beroende på flera faktorer, inklusive vilken typ av frågemutant som används på skärmen, experimentella förhållanden och nivån på genuttryck. En av de vanliga dosundertryckningsmekanismerna involverar gener som kodar för produkter som fungerar tillsammans i samma komplex eller parallellt i samma cellulära / biologiska process. Resultaten av sådana skärmar i enklare modellorganismer som jäst kan utvidgas till högre eukaryota organismer eftersom de flesta grundläggande biologiska vägar och processer bevaras över evolutionen.

Dessa genetiska skärmar kan också modifieras på flera sätt för att svara på olika biologiska frågor. Till exempel kan ortologa gener från olika organismer som kan undertrycka fenotypen för frågemutantstammen identifieras. Det har också använts för att avgränsa potentiella resistensmekanismer och bestämma proteinmål för nya antibakteriella17,18, svampdödande19,20, antiparasitiska 21 ochanticancer 22 föreningar. Denna skärm har också utnyttjats för att identifiera suppressorer av aktiviteten hos läkemedel vars verkningsmekanism inte är känd. Således kan dessa multicopy suppressor-skärmar i princip optimeras och användas i en mängd olika applikationer i olika organismer. Även om de flesta av de genetiska skärmar som används av jästforskare ursprungligen har utvecklats i S. cerevisiae, har S. pombe framträtt som ett kompletterande modellsystem för att utföra olika genetiska skärmar och analyser23. Dessutom visar genomisk organisation och biologiska processer i S. pombe, såsom förekomst av introner i fler gener, komplexitet av ursprunget till DNA-replikation, centromerstruktur, organisering av cellcykeln och närvaro av RNAi-maskineriet, större likhet mellan S. pombe och högre eukaryoter23,24, vilket understryker vikten av att designa och använda genetiska verktyg i S. pombe.

Detta dokument beskriver ett protokoll för att identifiera genetiska interactmedlemmar baserat på "dosundertryckning" av en förlust av funktion mutant fenotyp i S. pombe. Grunden för detta protokoll är att det är en snabb och effektiv metod att screena ett cDNA-bibliotek som överuttrycker vildtypsgener antingen på en multikopiering av plasmid och/eller från en stark promotor. Detta protokoll har fyra huvudsteg: omvandling av biblioteket till en frågemutantstam, urval av plasmidkloner som undertrycker den önskade fenotypen för frågemutantstammen, hämtning av plasmiden (erna) från dessa suppressorkloner och identifiering av genen som är ansvarig för undertryckandet av fenotypen. Som det är sant för alla metoder som bygger på urval och identifiering av cDNA från ett bibliotek, är skärmens framgång beroende av att man använder ett högkvalitativt och högkomplext bibliotek eftersom skärmen bara kan hämta de cDNA-kloner som finns i biblioteket.

Med hjälp av detta protokoll har vi framgångsrikt identifierat två nya suppressorer av den genotoxiska stresskänsliga fenotypen för frågan S. pombe ell1 null mutant. ELL -familjen (elva nitton lysinrik leukemi) av transkriptionsförlängningsfaktorer undertrycker övergående paus av RNA -polymeras II på DNA -mallar i in vitro biokemiska analyser och bevaras över olika organismer, från fissionsjäst till människor25. Tidigare arbete har gett bevis för att en S. pombe ell1 null-mutant visar genotoxisk stresskänslighet i närvaro av 4-nitrokinolin 1-oxid (4-NQO) och metylmetansulfonat (MMS)26. Därför transformerade vi ett S. pombe plasmidkodat multicopy cDNA-bibliotek till frågan S. pombe ell1 null mutant och identifierade två förmodade kloner som uppvisade förmågan att undertrycka den genotoxiska stresskänsligheten hos S. pombe ell1 null mutant i närvaro av 4-NQO, en förening som inducerar DNA-lesioner. Efterföljande sekvensering av insatsen som finns i plasmidklonerna identifierade att generna som kodar för rax2+ och osh6+ var ansvariga för att undertrycka den genotoxiska stresskänsligheten hos ell1 null-mutanten när den överuttrycktes i ell1-nollmutanten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transformation av cDNA-biblioteket till frågan S. pombe mutantstam för att screena för multicopy suppressors

OBS: Standard litiumacetatmetod27 följdes för att omvandla S. pombe cDNA-biblioteket till frågan S. pombe ell1Δ-stammen med några modifieringar:

  1. Odla S. pombe ell1Δ-stammen vid 32 °C på en YE-mediumplatta (tabell 1) kompletterad med 225 μg/ml vardera av adenin, leucin och uracil. Inokulera en slinga full av inokulum av ell1Δ-stam från ovanstående platta i 15-20 ml YE-medium kompletterat med 225 μg / ml vardera av adenin, leucin och uracil. Inkubera den över natten vid 32 °C med skakning (200-250 rpm).
  2. Nästa dag, späd nattkulturen i 100 ml färskt YE-medium med önskade tillskott till en OD 600 nm (optisk densitet vid 600 nm) på 0,3 och inkubera den vid 32 ° C med skakning vid 200-250 rpm tills OD600 nm når mitten av logfasen.
  3. Dela upp 100 ml kultur i två 50 ml centrifugrör, följt av centrifugering vid rumstemperatur i 10 minuter vid 4 000 × g.
  4. Kassera supernatanten och tvätta cellpelleten med 1 ml sterilt vatten, dvs. återsuspendera cellerna i 1 ml sterilt vatten och centrifugera vid 4 000 × g i 5 minuter vid rumstemperatur.
  5. Kassera supernatanten och tvätta varje cellpellet med 1 ml 1x LiAc-TE (100 mM litiumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) lösning enligt beskrivningen i steg 1.4.
  6. Ta bort supernatanten och återsuspendera varje cellpellet i 250 μl 1x LiAc-TE. Använd dessa S. pombe kompetenta celler (500 μL) för transformation med DNA av intresse. Överför 125 μL av de kompetenta cellerna till fyra olika sterila mikrocentrifugrör för efterföljande transformationssteg.
  7. Koka bärar-DNA från laxtestiklar eller sillsperma i 1 min och lägg omedelbart på is. För varje transformation, tillsätt 10 μl 10 mg/ml denaturerat, enkelsträngat bärar-DNA till mikrocentrifugröret som innehåller 125 μl av de kompetenta cellerna, följt av försiktig blandning med en mikropipettspets. Tillsätt därefter 50 μg av S. pombe cDNA-biblioteket till det kompetenta cellbärar-DNA-blandningsinnehållande mikrocentrifugröret.
  8. Inkubera mikrocentrifugrören vid rumstemperatur i 10 minuter och tillsätt sedan 260 μl polyetylenglykol-litiumacetatlösning (40% [w/v] PEG 4 000, 100 mM litiumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) till rören och blanda försiktigt med hjälp av en mikropipettspets.
  9. Inkubera mikrocentrifugrören som innehåller omvandlingsblandningen vid 32 °C i 2 timmar utan att skaka. Tillsätt 43 μl förvärmd dimetylsulfoxid (DMSO) till mikrocentrifugröret och blanda försiktigt. Därefter utsätt rören för värmechock vid 42 °C i 5 minuter.
  10. Pelletera cellerna vid 4 000 × g i 5 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och ta bort den återstående PEG-LiAc-TE-lösningen med hjälp av en mikropipettspets.
  11. Återsuspendera cellerna i 100 μl sterilt vatten och platta på en EMM2 -platta (tabell 1) (150 mm) med nödvändiga tillskott och 0,2 μg / ml 4-NQO.
  12. Inkubera plattorna vid 32 °C i 5-6 dagar så att kolonier kan dyka upp på plattorna. Stryk de erhållna kolonierna på samma mediumplatta i närvaro av 0,2 μg/ml 4-NQO och använd dem för ytterligare screening.
  13. För ett bibliotekstransformationsexperiment, använd 500 μl kompetenta celler (125 μL kompetenta celler x 4 mikrocentrifugrör) för transformation enligt beskrivningen i steg 1.8 till 1.14 ovan.
  14. Som en kontroll, platta 1/10 av transformationsblandningen på en EMM2-platta (150 mm) med nödvändiga tillskott, men saknar 4-NQO, för att beräkna det totala antalet bibliotekskloner som erhållits efter omvandling av biblioteket och skärm för isoleringav suppressorklonerna.

2. Testa och validera räddning/undertryckande av fenotypen som är associerad med frågemutantstammen av den förmodade suppressorn

OBS: Stresspunktsanalyser utfördes enligt beskrivningen nedan för att testa och validera räddning / undertryckande av ell1-deletionsassocierad 4-NQO-stresskänslighet av den förmodade suppressorn (erna).

  1. Tillsätt 100-200 μL sterilt vatten i var och en av de olika brunnarna i en steril 96-brunns mikrotiterplatta.
  2. Välj en liten mängd inokulum från var och en av de olika kolonierna som erhållits efter cDNA-bibliotekstransformation på plattan innehållande 4-NQO med hjälp av en steril tandpetare eller en 20-200 μL mikropipettspets. Tillsätt inokulum från var och en av de olika kolonierna i separata oberoende brunnar i mikrotiterplattan innehållande 100-200 μL sterilt vatten. Blanda noggrant.
  3. Spot 3 μL av cellsuspensionen från varje brunn på EMM2-agarplattor innehållande adenin (225 μg/ml) och uracil (225 μg/ml) men som saknar leucin (den valbara auxotrofa markören som finns på plasmidvektorn som används för konstruktion av biblioteket som används i detta arbete). Tillsätt lämpliga koncentrationer av 4-NQO till plattorna efter behov.
  4. Inkubera plattorna vid 32 °C i 3-4 dagar så att cellerna kan växa. Identifiera kolonierna som visar tillväxt i närvaro av olika koncentrationer av 4-NQO som förmodade suppressorer.
  5. För att ytterligare validera suppressorerna, odla de valda suppressorerna tillsammans med lämpliga kontrollstammar över natten vid 32 ° C med skakning (200-250 rpm) i EMM2-medium som innehåller 225 μg / ml vardera av adenin och uracil men saknar leucin.
  6. Nästa dag, späd cellerna till en OD 600 nm av 0,3 i färskt EMM2-medium och odla dem vid 32 ° C med skakning fram till mitten av loggfasen (ungefär OD600 nm av 0,6-0,8).
  7. Upptäck lämpliga seriella utspädningar (1:10 eller 1:5) av kulturer på EMM2-plattor med erforderliga tillskott som innehåller antingen 0,4 μM 4-NQO eller 0,01% MMS. För kontroll, upptäck stammarna på en EMM2-platta med nödvändiga tillskott men saknar något DNA-skadligt medel.
  8. Inkubera plattorna vid 32 °C i 3-5 dagar för att övervaka tillväxten.
    OBS: Lämpliga analyser baserade på fenotypen som är associerad med frågemutantstammen bör användas för att testa räddning eller undertryckande av fenotypen. Till exempel, om suppressorer av en kallkänslig fenotyp av en frågemutantstam behöver identifieras, skulle analysen för testning och validering av suppressorklonerna involvera växande transformanter vid låg temperatur.
  9. Upptäck mutantstammarna som transformerats med fullängdsgen av intresse (Spell1 i det här fallet) eller tom vektor som positiva respektive negativa kontroller, tillsammans med bibliotekstransformationerna.

3. Isolering av plasmiden från S. pombe suppressorklonerna

OBS: Plasmidisolering från S. pombe utfördes genom att följa protokollet som beskrivs i Fission yeast: en laboratoriehandbok28 med några modifieringar.

  1. Inokulera en enda jästkoloni i EMM2-medium som innehåller 225 μg/ml adenin och uracil och odla cellerna över natten vid 32 °C med skakning vid 200–250 rpm. Nästa dag, skörda 5 OD-celler (dvs. 10 ml odling av O.D. 0,5) genom att centrifugera i 2 minuter vid 4 000 × g vid rumstemperatur.
  2. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 0,2 ml lysbuffert (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) och 1 mM Na2EDTA).
  3. Tillsätt 0,2 ml fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1) och 0,3 g syratvättade glaspärlor till mikrocentrifugröret. Vörda mikrocentrifugröret i 2 min vid 4 °C och inkubera på is i 1 min. Upprepa detta steg 6x.
  4. Centrifugera röret vid 10 000 × g i 15 minuter vid rumstemperatur. Överför det övre vattenhaltiga skiktet till ett nytt mikrocentrifugrör och tillsätt 200 μl fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1).
  5. Centrifugera röret vid 10 000 × g i 10 minuter. Överför det övre vattenhaltiga skiktet till ett nytt rör och tillsätt två volymer 100% etanol (~ 400 μL) och 1/10 volym natriumacetat (3 M, pH 5,8) (~ 20 μL) till röret. Inkubera mikrocentrifugröret -70 °C i 1 timme.
  6. Fäll ut DNA genom centrifugering vid 10 000 × g i 15 minuter vid 4 °C och avlägsna supernatanten. Tvätta DNA-pelleten med 70% etanol (~ 500 μL) och håll den vid rumstemperatur för att lufttorka.
  7. Återsuspendera DNA i 20 μl sterilt vatten. Använd 2-5 μL plasmid-DNA för transformation av kompetenta E. coli-celler.
    OBS: Plasmid kan också isoleras från jästceller med hjälp av någon av de kommersiellt tillgängliga jästplasmidisoleringssatserna.

4. Identifiering av den gen som kodas av suppressorklonen

  1. Omvandla de isolerade jästplasmiderna till E. coli Top10-stam [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] med hjälp av standardprotokollet29 och sprid cellerna på LB-plattor (Luria Broth) med nödvändiga antibiotika.
  2. Isolera plasmiden/plasmiderna från E. coli-transformanter med hjälp av standardprotokollet för alkalisk lys29 och följ lämpliga kombinationer av restriktionsenzymer för att kontrollera frisättningen av det ingående DNA-fragmentet genom restriktionsuppslutning.
    OBS: Suppressorplasmid 84 smältes med Bam HI-restriktionsenzym och Suppressorplasmid 104 smältes med PstI / BamHI-restriktionsenzymer.
  3. Omtransformera plasmiderna som visar insatsfrisättning efter restriktionsuppslutning i ell1 Δ-stammen för att kontrollera deras förmåga att rädda den genotoxiska stresskänsliga fenotypen hos ell1Δ-stammen.
  4. Välj de plasmidkloner som visar undertryckande av den genotoxiska spänningskänsligheten och sekvensera insats-DNA-fragmentet som finns i dessa plasmidkloner med hjälp av vektorspecifika framåt- och bakåtprimers.
    OBS: I denna studie användes den adh1-promotorspecifika universella framåtprimern (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30.
  5. För att identifiera genen som är ansvarig för undertryckandet, justera sekvensen erhållen med NCBI-nukleotidblast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) eller Pombase-sekvensjusteringsverktyg (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Välj sekvensen som visar maximal justering och identifiera den som genen för multicopy suppressor plasmid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Screening för multikopiering av ell1-deletionsassocierad genotoxisk stresskänslighet i S. pombe
Vi utförde den genetiska skärmen med hjälp av protokollet som beskrivs ovan för att identifiera multikopieringssuppressorer av funktionsförlustfenotypen för frågan ell1 deletionsmutantstam. Den tillväxtrelaterade känsligheten hos ell1-deletionsstammen som observerades i närvaro av det genotoxiska 4-NQO-medlet antogs som förlust av funktionsfenotyp att välja för multikopieringsdämpare. Figur 1 visar en schematisk representation av den genetiska skärmen. För att börja skärmen bekräftades den genotoxiska stresskänsligheten hos ell1-deletionsmutanten (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1Δ :: kanMX6) först med avseende på dess isogena vildtypstam (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) i närvaro av 4-NQO (Figur 2A). Därefter transformerades frågan S. pombe ell1 null mutant med ett högt kopieringsnummer S. pombe cDNA-bibliotek för att välja för de plasmidkloner som kunde undertrycka/rädda den 4-NQO-tillväxtrelaterade känsligheten hos ell1 null-mutanten. Detta bibliotek innehåller ~6 × 105 S. pombe cDNA-fragment klonade i pLEV3 S. pombe-överuttrycksvektorn under kontroll av adh1-promotorn 30. Som en kontroll pläterades också 1/10 av transformationsblandningen på EMM2-plattor som saknade 4-NQO för att beräkna det totala antalet rekombinanta kloner som erhållits efter omvandling av biblioteket, en indikation på bibliotekets täckning och screenades för isoleringav suppressorklonerna. Detta är kritiskt, eftersom screening av färre kloner kommer att minska möjligheten att identifiera suppressorklonerna. 

Figur 2B visar representativa bilder av kontroll- och 4-NQO-innehållande plattor. Som visas i figuren erhålls ett stort antal kolonier på kontrollplattan som saknar 4-NQO som visar en bra täckning av biblioteket. Som förväntat erhölls färre transformanter på 4-NQO-plattan eftersom dessa transformanter sannolikt representerar de förmodade suppressorerna för 4-NQO-känsligheten hos ell1-nollmutanten . Därefter strimlades eller upptäcktes de olika transformantkolonierna som erhölls på EMM2-plattor innehållande 0,2 μM 4-NQO ytterligare på EMM2-plattor innehållande 0,2 μM 4-NQO för att bekräfta förmågan hos dessa transformanter att växa i närvaro av 4-NQO. Det observerades att 620 transformantkolonier kunde växa på 0,2 μM 4-NQO-innehållande EMM2-plattor.

Validering av förmågan hos de förmodade suppressorklonerna att återställa tillväxten av ell1-deletionsmutant under genotoxiska stressförhållanden
För att bekräfta de förmodade suppressorerna är det viktigt att testa räddningen av den önskade fenotypen under högre stränghetsförhållanden som visas i den schematiska representationen (figur 3A). Därför sågs de 620 nominerade transformanterna på EMM2-plattor med 0,4 μM 4-NQO. Som framgår av figur 3B visade endast 74 transformanter tillväxt vid 0,4 μM 4-NQO. Därefter upptäcktes dessa 74 transformanter på EMM2-plattor innehållande 0,8 μM 4-NQO, och det observerades att endast 16 visade tillväxt i närvaro av 0,8 μM 4-NQO (Figur 3C). För att ytterligare bekräfta dessa observationer upptäcktes dessa 16 transformanter på EMM2-plattor med nödvändiga tillskott, innehållande antingen 0,8 μM 4-NQO eller ingen 4-NQO (kontroll), tillsammans med ell1-deletionsmutanten transformerad med tom vektor. Resultaten av dessa spottinganalyser avslöjade att, som förväntat, ell1-deletionsstammen transformerad med tom vektor, liksom alla de 16 transformanterna, visade tillväxt på plattan som saknade 4-NQO. Som jämförelse, medan ell1-deletionsmutanten som endast innehöll den tomma vektorn inte visade någon tillväxt vid 0,8 μM 4-NQO, uppvisade sex transformanter tillväxt vid 0,8 μM 4-NQO (figur 3D), vilket tyder på att biblioteksklonerna som finns i dem hade förmågan att undertrycka den genotoxiska stressfenotypen hos ell1-nollmutanten.

Identifiering av genen som kodas av suppressorklonen
Vi valde därefter 02 genetiska suppressorer av ell1-deletionsstammen, sup 84 och sup 104, vilket visar fullständig undertryckning av den ell1-associerade tillväxtkänsligheten i närvaro av 4-NQO. Bibliotekets plasmidklon(er) isolerades från dessa två jästsuppressorer och omvandlades till kompetenta E. coli-celler. Därefter isolerades plasmid från E. coli-celler med hjälp av standardprotokoll31. De två isolerade plasmiderna, märkta som 84 och 104, utsattes för restriktionssmältning, vilket avslöjade närvaron av cirka 1 000 bp respektive 800 bp infoga DNA-fragment (figur 4A,B). För att ytterligare validera resultaten av denna suppressorskärm omvandlades dessa plasmider till ell1-deletionsmutanten och kontrollerades om de kunde återställa tillväxten av ell1 null-mutanten i närvaro av 4-NQO. Stresspunktsanalyserna avslöjade att suppressorplasmidklonerna resulterade i undertryckandet av den 4-NQO-associerade tillväxtkänsligheten när de återinfördes i ell1-nollmutanten, vilket tyder på att undertryckandet var plasmidberoende (figur 4C). Dessutom bestämde vi oss för att avgöra om dessa suppressorkloner också kunde undertrycka den tillväxtrelaterade känsligheten hos ell1-deletionsstammen i närvaro av en annan DNA-skadeinducerande förening, MMS. Punktanalyserna visade att omvandlingen av suppressorplasmidklonerna till ell1-nollmutanten resulterade i mer tillväxt på MMS-innehållande medium än transformation av ell1-deletionsmutanten med tom vektor, vilket indikerar att dessa plasmidkloner kunde undertrycka den genotoxiska stresskänsligheten hos ell1-deletionsmutanten i närvaro av båda genotoxiska medlen, dvs 4-NQO och MMS (figur 4D).

Därefter, för att identifiera genen som finns i dessa suppressorplasmidkloner, utfördes sekvensering av insats-DNA-fragmentet med användning av adh1-promotorspecifik universell framåtprimer30. Den erhållna nukleotidsekvensen söktes med hjälp av verktyget "BLAST at Ensembl" som finns tillgängligt på PomBase-webbplatsen (https://www.pombase.org), vilket avslöjade att de två plasmidklonerna 84 och 104 innehöll rax2+ respektive osh6+-gener, vilket gav bevis för att Rax2 och Osh6 var ansvariga för att undertrycka den genotoxiska stresskänsliga fenotypen associerad med frånvaro av ell1+ i S. pombe . Kunskapen om funktionerna hos båda dessa proteiner i S. pombe är begränsad. Rax2 har visat sig reglera lokaliseringen av For3p för att kontrollera cellpolariteten under vegetativ tillväxt i S. pombe32. Osh6 är ett lipidtransportprotein som tillhör den oxysterolbindande proteinrelaterade proteinfamiljen. Det är involverat i transporten av fosfatidylserin från endoplasmatisk retikulum till plasmamembranet33.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av den genetiska multikopieringssuppressorskärmen. Detta protokoll har fyra huvudsteg: omvandling av biblioteket till en frågemutantstam, urval av plasmidkloner som undertrycker den önskade fenotypen för frågemutantstammen, hämtning av plasmiden (erna) från dessa suppressorkloner och identifiering av genen som är ansvarig för undertryckandet av fenotypen. Förkortning: 4-NQO = 4-nitrokinolin 1-oxid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Screening för multikopiering av multikopiering av ell1-deletionsassocierad genotoxisk stresskänslighet i S. pombe. (A) Spänningspunktsanalys som visar 4-NQO-känslighet hos ell1-borttagen S. pombe-stam jämfört med dess isogena vildtypstam. Seriella utspädningar (1:10) av lämpliga stammar upptäcktes på EMM2-medium innehållande 225 μg/ml vardera av adenin, leucin och uracil med eller utan (kontroll) 0,4 μM 4-NQO. Plattorna inkuberades sedan i 3-5 dagar vid 32 °C. (B) Ett cDNA-bibliotek med högt kopieringsnummer transformerades i ell1-raderad S. pombe-stam och transformerade kolonier pläterades på EMM2-medium som saknade leucin men innehållande 0,2 μM 4-NQO. En liten alikvot av transformationsblandningen pläterades också på EMM2-plattor som saknade 4-NQO, som en kontroll. Plattorna inkuberades vid 32 °C i 5-6 dagar och fotograferades. Panel B visar en representativ bild av dessa plattor. Förkortning: 4-NQO = 4-nitrokinolin 1-oxid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Validering av förmågan hos förmodade suppressorkloner att undertrycka den genotoxiska stresskänsligheten hos ell1-deletionsmutanten. (A) En schematisk representation av screeningen av bibliotekstransformanterna genom att testa undertryckande av önskad fenotyp. Tillväxt av 620 transformanter testades på ökande koncentrationer av 4-NQO genom att upptäcka olika transformanter på EMM2-plattor som saknade leucin och som innehöll antingen (B) 0,4 μM 4-NQO eller (C) 0,8 μM 4-NQO. Plattorna inkuberades vid 32 °C i 5-6 dagar och fotograferades. Representativa bilder av plattor har visats. (D) Sexton transformanter som visade tillväxt på 0,8 μM 4-NQO sågs på EMM2-plattor som saknade leucin men som innehöll antingen 0,8 μM 4-NQO eller inte innehöll 4-NQO (kontroll), tillsammans med ell1-deletionsstammen transformerad med tom vektor. Plattorna inkuberades vid 32 °C i 5-6 dagar och fotograferades. Endast sex kolonier uppvisade förmågan att rädda ell1-deletionsassocierad-genotoxisk stresskänslighet. Förkortning: 4-NQO = 4-nitrokinolin 1-oxid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Identifiering av suppressorplasmidklonerna. Agarosgelbilder av (A) restriktionssmältning av suppressorplasmid 84 med BamHI-restriktionsenzym frigjorde en insats av ~ 1 kb. (B) Suppressorplasmid 104 smält med PstI / BamHI-restriktionsenzymer släppte en insats på ~ 800 bp. (C) 1:10 seriellt utspädd ell1 nullmutant transformerad med plasmider, sup 84 eller sup 104, upptäcktes på EMM2-plattor som saknade leucin och innehållande antingen 0,4 μM 4-NQO eller (D) 0,01% MMS. I kontrollplattor tillsattes inget DNA-skadligt medel. Plattorna inkuberades vid 32 °C i 4-5 dagar och fotograferades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Sammansättning av medier för tillväxt av S. pombe. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Jäst har använts i stor utsträckning för att undersöka de grundläggande biologiska processerna och vägarna som är evolutionärt bevarade över eukaryota organismer. Tillgången på genetiska och genomiska verktyg tillsammans med deras mottaglighet för olika biokemiska, genetiska och molekylära förfaranden gör jäst till en utmärkt modellorganism för genetisk forskning34,35,36. Under årens lopp har olika genetiska skärmar utformats av jästforskare för att identifiera genetiska interaktioner som skulle belysa funktionerna hos enskilda gener, liksom de vägar och biologiska processer där de kan vara inblandade 10,11,17,37. En av de vanliga och användbara skärmarna för att identifiera genetiska interaktioner är känd som "multicopy eller high copy number suppression".

Den här skärmen kräver en frågemutantstam (er) som uppvisar en fenotyp för funktionsförlust, följt av transformation av denna mutanta frågestam (er) med ett genomiskt eller cDNA-bibliotek med högt kopieringsnummer. Därefter screenas de erhållna transformanterna för att identifiera de gener som när de överuttrycks undertrycker fenotypen som är associerad med frågemutantstammarna. Denna typ av genetisk interaktion mellan den specifika muterade stammen och genen/generna i plasmidbiblioteksklonerna resulterar i isolering och identifiering av genprodukter som sannolikt kommer att verka i samma väg eller påverka samma biologiska process4. Således ger denna skärm insikter i funktionerna hos genen (erna) av intresse och deras funktionella organisation i vägar och biologiska processer in vivo. Traditionellt har denna skärm använts i stor utsträckning i S. cerevisiae 38,39,40,41,42.

Målet med detta arbete är att beskriva ett enkelt och okomplicerat protokoll för att utföra en multicopy suppression genetisk skärm i S. pombe. Vi utförde skärmen med hjälp av en S. pombe-stam som bär en radering av ell1-transkriptionsförlängningsfaktorn. ELL är en familj av transkriptionsförlängningsfaktorer, som finns i ett brett spektrum av organismer, från fissionsjäst till människor. Ell1s funktioner börjar bara förstås i S. pombe. Tidigare arbete hade belyst Ell1s roll i optimal tillväxt under normala tillväxtförhållanden och i överlevnad under genotoxiska stressförhållanden26. Vi har använt multicopy suppressor screening som en av metoderna för att avslöja den molekylära mekanismen som ligger till grund för Ell1s roll i genotoxisk stresskänslighet i S. pombe26. Ett multicopy plasmidkodat S. pombe cDNA-bibliotek omvandlades till S. pombe ell1 null mutant som uppvisar känslighet för 4-NQO. Därefter valdes de transformanter som kunde växa i närvaro av 4-NQO.

Isolering av plasmider från dessa transformanter och sekvensering av insatser som finns i dessa plasmider ledde till identifiering av två nya genetiska interactmedlemmar av ell1+ i S. pombe, rax2+ och osh6+. En tidigare studie med en liknande genetisk skärm i S. pombe har också identifierat det anti-tystande proteinet, epe1+, som en multicopy suppressor av de ell1-deletionsassocierade fenotyperna43. Vi har också använt denna metod för att identifiera multikopieringsdämparna för den icke-väsentliga Rpb9-underenheten av S. pombe RNA-polymeras II (opublicerade observationer). Sammantaget validerar dessa resultat nyttan av den genetiska multicopy suppressor-screeningmetoden som en metod för att identifiera förmodade gener / proteiner som uppvisar genetisk interaktion med en önskad gen av intresse, vilket belyser funktionen, vägarna och processerna där genen av intresse kan vara involverad.

För att använda skärmen som beskrivs i detta arbete är det viktigt att först ha en frågemutantstam som uppvisar en tydlig fenotyp associerad med mutationen, som kan användas för att isolera multicopy-suppressorn (erna). Dessutom kommer framgången för denna skärm att bero på tillgången till ett högkvalitativt och bra representativt bibliotek som innehåller kloner som representerar det maximala antalet vildtypsgener eller deras motsvarande cDNA. Traditionellt har både genomiska och cDNA-bibliotek använts i dessa skärmar, men cDNA-bibliotek har fördelen att de tillverkas av mRNA uttryckta i cellen / organismen. Dessutom är en hög effektivitet av dess omvandling till jästcellerna absolut nödvändig för skärmens framgång eftersom det är viktigt att screena ett stort antal transformanter, vilket ökar sannolikheten för att identifiera suppressorer. Om färre transformanter erhålls på styrplattan efter omvandling av biblioteket till frågemutantstammen med hjälp av litiumacetatprotokollet, kan elektroporation användas för att transformera biblioteket.

Det är också lämpligt att först standardisera transformationsprotokollet med en annan plasmid innan du omvandlar biblioteket. Annars leder det i onödan till att biblioteket går förlorat. Protokollet som beskrivs här använder 4-NQO-känslighet som mutantfenotyp, men lämpliga screeningmetoder / analyser bör utformas för val av suppressorer baserat på den specifika mutantfenotypen av intresse. Om inga eller mycket få transformanter erhålls på plattan för att välja för suppressorer efter omvandling av biblioteket till frågemutantstammen, bör om möjligt mindre stränga villkor/analyser användas vid plätering av biblioteket för att välja för suppressorer för att upptäcka så många genetiska suppressorer som möjligt innan de bekräftas under stränghetsförhållanden. Förutom att använda restriktionsuppslutning för att testa närvaron av insatsen i de identifierade suppressorplasmidklonerna, kan PCR med vektorspecifika primers användas för att förstärka det önskade INSERT-DNA-fragmentet. Alternativt kan suppressorplasmidklonerna ges direkt för sekvensering, vilket undviker behovet av restriktionssmältning eller PCR.

Denna skärm kan också användas för andra jästsvampar än S. cerevisiae och S . pombe om det finns en genetisk verktygssats med avseende på lämpliga muterade stammar, plasmider och promotorkonstruktioner som skulle underlätta överuttryck av gener, vilket möjliggör räddning av mutantfenotyp som finns i värdjästcellen. Dessutom, med tillgången till genomomfattande resurser, inklusive insamling av genomomfattande raderingsmutanter44 och överuttrycksbibliotek37, kan denna skärm också utföras genom omvandling av en eller några frågeplasmider till en systematisk uppsättning jästmutantstamsamling eller genom omvandling av en systematisk uppsättning överuttrycksplasmidsamling till en eller några mutanta frågestammar45 . Sammanfattningsvis kan detta tillvägagångssätt tydligt generaliseras till en mängd olika experimentella frågor i olika organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av ett forskningsanslag från Institutionen för bioteknik, Indiens regering (bidrag nr. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) till Nimisha Sharma. Författarna tackar prof. Charles Hoffman (Boston College, USA) för gåvan av S. pombe cDNA-biblioteket och prof. Susan Forsburg för jästplasmiderna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-NQO Sigma N8141
Acetic Acid, glacial Sigma 1371301000
Adenine Sulphate Himedia GRM033
Agar Himedia GRM026
Agarose Lonza 50004L
Ammonium Chloride Himedia MB054
BamHI Fermentas ER0051
Biotin Himedia RM095
Boric Acid Himedia MB007
Calcium Chloride  Sigma C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma C0549
Citric Acid Himedia RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous Himedia GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes Sigma D7656
EDTA disodium Sigma 324503
Ferric Chloride Hexahydrate Himedia RM6353
Glucose Amresco 188
Ionositol Himedia GRM102
Isopropanol Qualigen Q26897
Leucine Himedia GRM054
Lithium Acetatae Sigma 517992
Magnesium Chloride Hexahydrate Himedia MB040
Molybdic Acid Himedia RM690
Nicotinic Acid Himedia CMS177
PEG, MW 4000 Sigma 81240
Pentothinic Acid Himedia TC159
Phenol Himedia MB082
Plasmid Extraction Kit Qiagen 27104
Potassium Chloride Sigma P9541
Potassium hydrogen Pthallate Merc DDD7D670815
Potassium iodide Himedia RM1086
RNAse Fermentas EN0531
SDS Himedia GRM205
Sodium Hydroxide Himedia GRM1183
Sodium Sulphate Himedia RM1037
Tris free Base Himedia MB209
Uracil Himedia GRM264
Yeast Extract Powder Himedia RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate Merc DJ9D692580

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
  2. Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
  3. Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712 (2015).
  4. Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).
  6. Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).
  7. Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
  8. Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
  9. Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840 (2018).
  10. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  11. Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
  12. Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
  13. Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  14. Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
  15. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  16. Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
  17. Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
  18. Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
  19. Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
  20. Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
  21. Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
  22. Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
  23. Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
  24. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  25. Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
  26. Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).
  27. Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969 (2016).
  28. Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. Fission yeast: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932 (2006).
  30. Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090 (2006).
  32. Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
  33. Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601 (2021).
  34. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).
  35. Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
  36. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  37. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  38. Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
  39. Melnykov, A. V., Elson, E. L. MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444 (2019).
  40. Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
  41. Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
  42. Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
  43. Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
  44. Kim, D. -U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
  45. Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).

Tags

Biologi Utgåva 187 Genetisk skärm Multicopy suppressorer Schizosaccharomyces pombe Ell1 Genreglering Transkriptionsförlängning
Genetisk skärm för identifiering av multicopy suppressorer i <em>Schizosaccharomyces pombe</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D.,… More

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D., Sharma, N. Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe. J. Vis. Exp. (187), e63967, doi:10.3791/63967 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter