Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לחילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מהדם ההיקפי ומרקמות מוצקות עם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) במחזור הדם ושוכנות רקמות מייצגות מטרות מבטיחות כסמנים ביולוגיים תרנוסטיים חדשים, והן מתגלות כשחקנים חשובים בשמירה על הומאוסטזיס אורגניזם והתקדמות של קשת רחבה של מחלות. בעוד המחקר הנוכחי מתמקד באפיון של אקסוזומים אנדוגניים עם מקור אנדוזומלי, microvesicles blebbing מן קרום פלזמה זכו לתשומת לב גוברת בבריאות וחולי, אשר מתאפיינים על ידי שפע של מולקולות פני השטח לשחזר את חתימת הממברנה של תאי הורה. כאן מוצג הליך הניתן לשחזור המבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית לחילוץ ואפיון כלי רכב חשמליים מהפלזמה ומרקמות מוצקות, כגון העצם. הפרוטוקול מתאר גם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים של כלי רכב חשמליים, אשר ניתן לעקוב אחר נגזרותיהם ומזוהים עם רכיבים הקשורים לתפקוד פוטנציאלי. שיטה זו תהיה שימושית לניתוח קורלטיבי, פונקציונלי ומכניסטי של כלי רכב חשמליים במחקרים ביולוגיים, פיזיולוגיים ופתולוגיים.
Introduction
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הוצעו כדי להגדיר מבנים חוץ-תאיים מוקפים דו-שכבתיים של שומנים בתאים1, הממלאים תפקידים חשובים באירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים2. ניתן לחלק באופן כללי כלי רכב חשמליים המשוחררים על ידי תאים בריאים לשתי קטגוריות עיקריות: אקסוזומים (או כלי רכב חשמליים קטנים) הנוצרים באמצעות מסלול סחר אנדוציטי תוך-תאי3 ומיקרו-שלפוחיות (או EV גדולות) המתפתחות על ידי הניצנים החיצוניים של קרום הפלזמה של תא4. בעוד שמחקרים רבים מתמקדים בתפקוד של כלי רכב חשמליים שנאספו מתאים בתרבית במבחנה5, כלי רכב חשמליים שמקורם במחזור הדם או ברקמות מורכבים והטרוגניים יותר, שיש להם יתרון בכך שהם משקפים את המצב האמיתי של האורגניזם in vivo6. יתר על כן, כמעט כל סוגי הרקמות יכולים לייצר EVs in vivo , ורכבים חשמליים אלה יכולים לפעול כשליחים בתוך הרקמה או להיות מועברים על ידי נוזלי גוף שונים, במיוחד הדם ההיקפי, כדי להקל על תקשורת מערכתית7. כלי רכב חשמליים במחזור הדם וברקמות הם גם מטרות לאבחון מחלות ולטיפול בהן8.
בעוד האקסוזומים נחקרו באופן אינטנסיבי בשנים האחרונות, למיקרו-שלפוחיות יש גם תפקידים ביולוגיים חשובים, אותם ניתן לחלץ בקלות ללא אולטרה-צנטריפוגה, ובכך לקדם מחקר בסיסי וקליני9. יש לציין כי סוגיה קריטית בנוגע לרכבים חשמליים המבודדים ממחזור הדם ומהרקמות היא שהם נגזרים מסוגי תאים שונים10. מאחר שמיקרו-שלפוחיות מובלות מממברנת הפלזמה ומוצגות על ידי שפע של מולקולות פני התא9, שימוש בסמנים של קרום תא האב כדי לזהות את המקור התאי של כלי רכב חשמליים אלה הוא אפשרי. באופן ספציפי, ניתן ליישם את טכניקת ציטומטריית הזרימה (FC) כדי לזהות סמני ממברנה. יתר על כן, החוקרים יכולים לבודד את כלי הרכב החשמליים ולבצע ניתוחים נוספים המבוססים על המטענים הפונקציונליים.
הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך יסודי לחילוץ ואפיון כלי רכב חשמליים מדגימות in vivo. כלי הרכב החשמליים מבודדים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית, ואפיון כלי הרכב החשמליים כולל זיהוי מורפולוגי באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), ניתוח מקור באמצעות FC וניתוח מטעני חלבונים באמצעות כתם מערבי. פלסמת הדם והעצם המקסימלית של עכברים משמשים כנציגים. חוקרים יכולים להתייחס לפרוטוקול זה עבור כלי רכב חשמליים ממקורות אחרים ולבצע שינויים מתאימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית הרביעית והנחיות ARRIVE. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57Bl/6 בני 8 שבועות (ללא העדפה לנקבות או לזכרים). השלבים הכרוכים בבידוד פלזמה ורקמות חשמליות מודגמות באיור 1. הפלזמה נלקחת כנציג כדי לתאר את הליך בידוד EV מנוזלי הגוף. העצם המקסילרית נלקחת כנציג כדי להסביר את הליך בידוד EV מהרקמות המוצקות.
1. הכנת הפלזמה ודגימות העצם המקסילריות
- הכינו את דגימות הפלזמה לפי השלבים הבאים.
- קבע את משקל הגוף של העכבר באמצעות איזון מעבדה סטנדרטי.
- מוסיפים 20 μL, 2 מ"ג/מ"ל הפרין לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ומשתמשים במכשיר המיקסר (ראו טבלת חומרים) כדי לאפשר להפרין להיצמד לדופן הצינור.
הערה: צינורות נוגדי קרישה יכולים לשמש גם ישירות כדי לאסוף את הדם. - להרדים את העכבר על ידי הזרקה intraperitoneal של 50 מ"ג / ק"ג של נתרן pentobarbital (ראה טבלה של חומרים). תפוס את צוואר העכבר עם האגודל והאצבע, ולאחר מכן תקן את הזנב ואת הרגל האחורית השמאלית עם האצבע הקטנה והזריק את נתרן pentobarbital עם מזרק הזרקת 1 מ"ל לאחר חשיפת הבטן.
- ודא כי העכבר מורדם כראוי בהתבסס על היעדר רפלקס הקרנית ותגובת הגפיים כאשר כרית כף הרגל צובטת.
- לגלח את השיער על הפנים ואת הריסים של העיניים עם מספריים מעוקלים.
- תפוס את עור הצוואר של העכבר ולחץ את העור סביב העיניים לחלק האחורי של הצוואר כך גלגל העין בולט. השתמש פינצטה אופתלמית במהירות להדק את גלגל העין, ולאסוף את זרימת הדם עם צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל מוכן בשלב 1.1.2. להקריב את העכבר על ידי נקע החוליה הצווארית.
זהירות: היזהר עם השערות והריסים כי הם עלולים לגרום להמוליזה. - הפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים כדי למנוע קרישת דם.
אזהרה: הפוך את הצינור בהקדם האפשרי. - צנטריפוגה את דגימת הדם במשך 15 דקות ב 1,200 x גרם ב 4 ° C.
- העבירו בזהירות את הסופרנאטנט לצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל חדשים ונקיים, והשתמשו מיד בדגימת הפלזמה או אחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C למשך מספר שעות.
- לדלל את supernatant עם נפח שווה של 1x פוספט-buffered מלוחים (PBS) ולערבב היטב.
הערה: הפרוטוקול שסופק לעיל לאיסוף הפלזמה הוא קטלני. הדם יכול להיאסף גם דרך ניקוב ורידים subclavian11 מבלי להקריב את העכבר.
- הכינו את דגימות העצם המקסילריות לפי השלבים הבאים.
- בודדו את העצם המקסימלית עם פינצטה ומספריים ושטפו אותם עם PBS כדי להיפטר מרקמות רכות עם פינצטה.
- שים את העצם המקסילרית לתוך צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל לחתוך את העצם לחתיכות קטנות (גודל חייב להיות פחות מ 1 מ"מ קוטר) עם מספריים. הוסף כמות מסוימת של ליבראז (5 מיקרוגרם / מ"ל, ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את הרקמה (בדרך כלל 1 מ"ל עבור דגימות עצם מעכבר בן 8 שבועות), ולאחר מכן לדגור במשך 30 דקות ב 37 ° C.
- צנטריפוגה את הדגימה ב 800 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים בזהירות את הסופרנאטנט עם פיפטה לצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל חדשים ונקיים.
2. חילוץ כלי רכב חשמליים
- צנטריפוגות הדגימות (שהוכנו בשלב 1.1.10 ושלב 1.2.4) למשך 15 דקות במהירות של 2,500 x גרם (4 מעלות צלזיוס) כדי להסיר פסולת תאים גדולים וטסיות דם שנותרו.
- העבירו בזהירות את הסופרנאטנטים לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגות 1.5 מ"ל חדשים ונקיים למשך 30 דקות במהירות של 16,800 x גרם (4°C).
הערה: ניתן להגדיר את מהירות הצנטריפוגה ליותר מ-10,000 x גרם כדי לחלץ כלי רכב חשמליים12. ככל שמהירות הצנטריפוגה גבוהה יותר, כך ניתן להשיג כמות גדולה יותר של כלי רכב חשמליים. מכיוון שהמהירות המותרת של הצנטריפוגה בה השתמשנו היא 16,800 x גרם (ראה טבלת חומרים), בחרנו במהירות זו בפרוטוקול זה. - השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הכדוריות בכל צינור עם 1 מ"ל PBS. צנטריפוגה למשך 30 דקות במהירות של 16,800 x גרם (4°C).
- השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הכדוריות בכל צינור עם 50 מיקרוליטר של PBS. אחסנו דגימות אלה בטמפרטורה של 4°C למשך פחות מ-24 שעות בלבד, או עדיף להשתמש בהן מיד לניתוחים הבאים (שלבים 3-5).
זהירות: אחסון בטמפרטורה של -80°C אינו מקובל, מכיוון שהדבר יפחית את ריכוז כלי הרכב החשמליים ויגדיל את גודל החלקיקים של כלי רכב חשמליים13, ובכך ישפיע על הניתוח הבא של כלי רכב חשמליים.
3. זיהוי מורפולוגי של כלי רכב חשמליים
- ביצוע ניתוח נת"ע.
- על פי כמות EVs (נשפט בערך על ידי גודל של כדורים, החלקיקים של פלזמה 50 μL הם המינימום), להעביר 5-50 μL של השעיה (שלב 2.4), לדלל 10 מ"ל של פתרון חיץ (PBS מסונן עם מסנן 0.22 מיקרומטר), ולערבב עם 1 מ"ל מיקרו פיפטור קצוות מספיק. השתמש בתרחיף סופי זה למדידת חלקיקים.
- השתמש מזרק סטרילי 1 מ"ל כדי להזריק לפחות 5 מ"ל של מים מזוקקים במהירות מתונה וקבועה עד שמספר החלקיקים המוצגים בממשק הזיהוי קטן מחמישה.
הערה: לאחר הזרקת 1 מ"ל מים מזוקקים דרך כל התעלה, מספר החלקיקים מוצג ישירות בממשק האיתור. אם המספר עדיין מעל חמישה, המשיכו להזריק 1 מ"ל מים מזוקקים עד לעמידה בקריטריונים. - צור מחדש 1 μL של תמיסת כיול ב 1 מ"ל של מים מזוקקים כדי ליצור תמיסה ראשונית, ולאחר מכן לקחת 100 μL של התמיסה הראשונית ל 25 מ"ל של מים מזוקקים כדי להכין פתרון מלאי סטנדרטי (1:250,000). אחסן מגיב עובד זה ב 4 °C למשך שבוע אחד.
- כיול מכשיר נת"ע עם פתרון המלאי הסטנדרטי (שלב 3.1.3). הזריקו 1-5 מ"ל של תמיסת כיול העבודה עם מזרק סטרילי של 1 מ"ל כדי לשטוף את תעלת המכונה עד שמספר החלקיקים המוצגים בממשק הגילוי הוא בין 50-400 (רצוי בסביבות 300). הפעל את תוכנית הכיול.
- חזור על שלב 3.1.2 כדי לשטוף את ערוץ ההתקן לפני כל מדידת דגימה.
- השתמש במזרק סטרילי של 1 מ"ל כדי להזריק לפחות 2 מ"ל של תמיסת חיץ כדי לשטוף את תעלת המכונה במהירות קבועה עד שמספר החלקיקים המוצגים בממשק הזיהוי קטן מ- 10.
- הזריקו 1 מ"ל של דגימת EV שהוכנה בשלב 3.1.1 במהירות בינונית וקבועה (המהירות המומלצת היא 0.5-1 מ"ל/שנייה).
הערה: ריכוז החלקיקים האופטימלי הוא שמספר החלקיקים המוצגים בממשק הגילוי נע בין 50-400, רצוי בסביבות 300. אם מספר החלקיקים גבוה מדי, חזור על שלב 3.1.2 כדי לשטוף את תעלת המכונה באופן מיידי כדי למנוע שימור חלקיקים בדופן התעלה וכוונן את ריכוז דגימת הרכב החשמלי בשלב 3.1.1, ולאחר מכן חזור על שלב 3.1.5. - לבצע את ניתוח החלקיקים ולהפיק את דוחות הניתוח בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
- אם הדגימה יקרה, שאבו בחזרה את דגימת הרכב החשמלי עם מזרק 1 מ"ל ואספו אותם בצינורות צנטריפוגות של 1.5 מ"ל. חזור על שלב 2.2 כדי לחלץ את כלי הרכב החשמליים.
- לאחר איתור כל הדגימות, הזריקו לפחות 2 מ"ל של תמיסת חיץ לתעלת המכונה ולאחר מכן הזריקו לפחות 5 מ"ל מים מזוקקים עד שמספר החלקיקים המוצגים בממשק הגילוי קטן מחמישה.
- השתמש מזרק סטרילי 5 מ"ל כדי להזריק לפחות 10 מ"ל אוויר במהירות קבועה (המהירות המומלצת היא 1 מ"ל / שנייה) כדי להסיר את המים בתעלה.
- בצע ניתוח TEM.
הערה: בצע את השלבים הבאים עם מתלים חדשים של EV. לרשת מיקרוסקופ אלקטרונים מצופה פחמן יש שני צדדים, כאשר צד העבודה זוהר ברשתות המרכזיות. הנפח המינימלי של פלזמה כדי לחלץ את EVs עבור ההליך להלן הוא 50 μL.- ערבבו את דגימת הרכב החשמלי (שלב 2.4) עם נפח שווה של 4% פרפורמלדהיד (PFA). יש להפקיד 4 מיקרוליטר של כלי הרכב החשמליים ברשת אחת ולדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- שים ארבע טיפות של PBS (טיפה אחת שווה ל 50 μL) על גיליון של סרט פוליאתילן (ראה טבלה של חומרים). העבירו את הרשתות בפינצטה מיקרוסקופית נקייה ושטפו את צד העבודה של הרשת ב-PBS מטיפה אחת לאחרת.
- השתמש בניירות סינון כדי להסיר PBS מיותרים שנותרו ברשתות.
- דגור על צד העבודה של הרשת לתוך חומצה פוספוטונגסטית 1% (ראה טבלת חומרים) במשך 2 דקות ולאחר מכן חזור על שלב 3.2.2.
זהירות: מכיוון שחומצה פוספוטונגסטית היא רעילה, יש להפעיל הליך זה במכסה האדים, וחומצה פוספוטונגסטית עודפת צריכה להיות ממוחזרת באופן ספציפי ולא להשליך אותה ישירות. - הניחו את הרשתות עם הפנים כלפי מעלה בכלי בקוטר 10 ס"מ מכוסה בניירות פילטר. ניתן לאחסן את הרשתות ב- RT למשך מספר שנים.
- התבונן ברשתות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
הערה: כדי להבטיח שהחלקיקים הבודדים נצפים, יש לכוונן את ריכוז כלי הרכב החשמליים, והמתלים צריכים להיות ברורים ללא עכירות ברורה. לפני השחרור, המדגם צריך להיות מעורב היטב. הניתוחים המייצגים של TEM ונת"ע מוצגים באיור 2.
4. ניתוח מקור של כלי רכב חשמליים
הערה: זיהוי המקור התאי של כלי רכב חשמליים דורש שימוש בנוגדנים לסמנים טיפוסיים של קרום התא. נפח הפלזמה המינימלי לחילוץ כלי הרכב החשמליים בהליך הבא הוא 300 μL. בהתבסס על המבנים הדו-שכבתיים השומניים של כלי רכב חשמליים, ניתן להשתמש בצבע הממברנה כדי לסמן אותם. עבור דגימות פלסמה בדם, CD18 עבור לימפוציטים14 נבחר לייצוג. עבור דגימות עצם מקסילריות, קולטן הקשור לאוסטאוקלסטים (OSCAR) עבור אוסטאוקלסטים15 נבחר כדוגמה. לפני FC, ודא שציטומטר הזרימה מותאם למדידה של EVs16, מכיוון שמגבלת הגודל הנמוכה שונה במידה רבה בין ציטומטרים שונים של זרימה.
- השהה מחדש דגימות (שלב 2.4) עם 500 μL של PBS והעבר 50 μL לתוך צינור צנטריפוגה חדש ונקי 1.5 מ"ל כבקרה ריקה (צינור A) ועוד 50 μL לתוך צינור צנטריפוגה חדש ונקי 1.5 מ"ל כצינור צביעה פשוט עבור FITC (צינור B). הוסף 0.5 μL של צבע ממברנה לצינור הראשי לצביעת הממברנה. לדגור במשך 5 דקות ב RT.
- צנטריפוגה הצינור הראשי למשך 30 דקות ב 16,800 x גרם (4 ° C). השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הכדוריות עם 200 מיקרוליטר של PBS.
- חלק כל דגימה של 50 μL לארבע צינורות צנטריפוגות של 1.5 מ"ל עבור צינורות צביעה פשוטים עבור PE (צינור C), צביעת סמן פני השטח (צינור D) ובקרות נוגדנים משניות בלבד (צינור E).
- הוסף את הנוגדן העיקרי של OSCAR בדגימות עצם EV וכן נוגדן CD18 בדגימות פלזמה EV (ראה טבלת חומרים) לצינור B (שלב 4.1) ולצינור D (שלב 4.3) בנפרד (מדולל ב-1:100). לדגור במשך 1 שעה ב 4 °C.
- צנטריפוגה את הצינורות במשך 30 דקות ב 16,800 x גרם (4 ° C). השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הכדוריות עם 500 מיקרוליטר של PBS, ואז צנטריפוגה שוב למשך 30 דקות בטמפרטורה של 16,800 x גרם (4 מעלות צלזיוס) כדי להסיר את הנוגדנים הראשוניים הנוספים.
- יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הכדוריות עם 50 μL של PBS, ולאחר מכן להוסיף נוגדנים משניים מצומדים FITC (ראה טבלת חומרים), בהתאמה (מדולל ב 1:200) (צינור E). הוסף את אותם נוגדנים משניים לצינור B (שלב 4.1) ולצינור D (שלב 4.3). לדגור על כל הצינורות במשך 1 שעות, ב 4 ° C בחושך.
הערה: ניתן להשתמש בנוגדני תיוג מצומדים פלואורסצנטיים ישירים גם כדי לעבד את זיהוי FC עם בקרות איזוטיפ מתאימות. - דללו טיפה אחת של חרוזים בגודל 0.2, 0.5 ו-1 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) בהתאמה ל-1 מ"ל של PBS, והריצו תחילה כל גודל חרוזים כדי לוודא את השער שנבחר לרכבים חשמליים. הגדר את סף ציטומטר הזרימה כדי לחפש את אוכלוסיית החרוזים והרכב החשמלי באמצעות פיזור קדמי מתאים (FSC) ופיזור צדדי (SSC).
- הגדר את המצב הסופי כחישוב 100,000 חלקיקים צבועים בקרום. נתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה לפי הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). התוצאות המייצגות מוצגות באיור 3.
הערה: ציוד נת"ע עם תעלות פלואורסצנטיות יכול לשמש גם לניתוח מקור, והכנת הדגימה זהה ל- FC.
- הגדר את המצב הסופי כחישוב 100,000 חלקיקים צבועים בקרום. נתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה לפי הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). התוצאות המייצגות מוצגות באיור 3.
5. ניתוח תכולת חלבון של כלי רכב חשמליים
הערה: ניתוח תכולת החלבון בתוך כלי רכב חשמליים מתבצע באמצעות כתם מערבי. לדוגמה, הפלזמה והעצם נבחרו לנתח 6-phosphogluconate dehydrogenase (PGD) ו pyruvate kinase M2 (PKM2) עבור מצב מטבולי. Golgin84 (אברון גולג'י) שימש כבקרה שלילית, ו-Flotillin (חלבון ממברנה), Caveolin (חלבון אינטגרלי של caveolae) ו-β-actin (השלד הציטושל)17 שימשו כבקרה חיובית ברכבים חשמליים בהשוואה לדגימות תאים. מיטופילין ו-α-Actinin-4 נבחרו כסמנים גדולים של EV, בעוד CD9 ו-CD81 נבחרו כסמנים קטנים של EV כדי להדגים את תת-אוכלוסיות הרכב החשמלי18. Apoa1 נבחר כסמן חלקיקי פלזמה19. לקבלת פרטי המגיב המתאים, ראה טבלת חומרים.
- יש להשהות מחדש את הכדוריות (שלב 2.4) ב-50 מיקרוליטר של חיץ RIPA lysis, ולדגור במשך 30 דקות על קרח.
- כמת את ריכוזי החלבון של כל הדגימות במיקרו-צלחת של 96 בארות על ידי בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
- לדלל את 2 מ"ג / מ"ל של אלבומין בסרום בקר (BSA) עם 0.9% של מלוחים נורמליים (NS) (המכיל 0.9% (w / v) של נתרן כלורי) לתוך 0.5 מ"ג / מ"ל. הוסף את 0.5 מ"ג/מ"ל של BSA ו-0.9% של NS לשלוש בארות משוכפלות עם נפחים מסוימים, כפי שמוצג בטבלה 1.
- זרוק 2 μL של הדגימות (שלב 5.1) והוסף 18 μL של NS לשלוש בארות משוכפלות בנפרד.
- הכן פתרון עבודה על-ידי ערבוב מגיב BCA A עם מגיב B (מגיב 50:1 A:B). הוסף 200 μL של תמיסת העבודה לכל באר ונער בעדינות במשך 30 שניות.
- לדגור את microplate 96-באר במשך 20-25 דקות ב 37 ° C.
- מדוד את OD ב- 596 ננומטר באמצעות הספקטרופוטומטר (ראה טבלת חומרים).
- יצא את הנתונים.
- ציירו עקומה סטנדרטית וחשבו את ריכוז החלבון של הדגימות.
- על פי התוצאות, דללו את הדגימות ל-1 מיקרוגרם/μL עם 0.9% NS ומאגר טעינה 5x SDS-PAGE (250 mM Tris· HCl, pH 6.8, 10% SDS, 30% (v/v) גליצרול, 10 mM DTT, 0.05% (עם v) Bromophenol כחול, ראה טבלה של חומרים). אטמו את הצינורות בסרט בחוזקה וחממו למשך 5 דקות ב-100°C.
- יש להעמיס את הדגימות ואת סולם החלבונים לריכוז מדורג של 4%-20% ג'ל Hepes-Tris (ראו טבלת חומרים).
הערה: בחר את אחוז הג'ל בהתאם למשקל המולקולרי של החלבונים המעניינים. - הפעל את הג'ל במאגר הריצה ב 80 V עד שהחלבונים יוצרים קו, ולאחר מכן עבור ל 120 V למשך שעה אחת עד שצבע ההעמסה נמצא בתחתית הג'ל.
הערה: זמן הפעולה עשוי להשתנות בהתאם לציוד המשמש או לסוג וריכוז הג'ל. - מעבירים את הג'ל לקרום הפוליווינילידן פלואוריד (PVDF) (ראו טבלת חומרים), מודגר מראש במתיל אלכוהול למשך 20 שניות. השתמש במערכת העברה רטובה כדי להעביר במשך שעה אחת ב 200 mA.
התראה: ודא שאין בועה בתוך מערכת ההעברה ושמור על קרום PVDF רטוב.
הערה: זמן ההעברה עשוי להשתנות בהתאם למשקל המולקולרי של חלבון היעד; 1 KD בדרך כלל צריך 1 דקה. - הכן חיץ חוסם BSA של 5% על-ידי הוספת 2.5 גרם BSA (ראה טבלת חומרים) ב-50 מ"ל של תמיסת מלח-טווין חוצצת טריס (TBST) (2 מ"ל של טווין שנוסף ב-2 ליטר של תמיסת PBS) לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. יש להתסיס עד להמסת האבקה. חסום את הממברנות במאגר זה למשך שעתיים ב- RT עם תסיסה.
- לדגור על הממברנות עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים המדוללים ב-TBST לריכוז תקין (מיטופילין, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; גולגין84, 1:1000; פלוטילין-1, 1:1000; Caveolin-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-אקטין 1:3000) לילה ב 4 °C (75 °F).
- שטפו את הקרומים במאגר הכביסה (2 מ"ל של טווין שנוספו ב-2 ליטר של תמיסת PBS) ארבע פעמים (15 דקות בכל פעם), ודגרו על הקרומים עם הנוגדנים המשניים המתאימים בשעה 1:4000 למשך שעה אחת ב-RT עם תסיסה.
- שטפו את הקרומים במאגר הכביסה ארבע פעמים (15 דקות בכל פעם), ודלמו את הממברנות באמצעות ערכת Chemiluminescence ומערכת דימות ג'ל (ראו טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהתאם לתהליך העבודה הניסיוני, ניתן לחלץ כלי רכב חשמליים מהדם ההיקפי ומהרקמות המוצקות (איור 1). העצם המקסימלית של עכבר בגיל 8 שבועות היא כ 0.1 ± 0.05 גרם, וכ 300 μL של פלזמה ניתן לאסוף מהעכבר. בעקבות שלבי הפרוטוקול, ניתן לאסוף 0.3 מ"ג ו-3 מיקרוגרם של כלי רכב חשמליים, בהתאמה. כפי שנותחו על-ידי TEM ו-NTA, המאפיינים המורפולוגיים האופייניים של כלי רכב חשמליים הם שלפוחיות קרום עגולות בצורת גביע בקוטר שנע בין 50 ל-300 ננומטר (איור 2). FC יכול לזהות את כלי הרכב החשמליים המסומנים בצבע הממברנה תחת בקרות שימושיות, וניתוח FC מראה את האחוזים של סמני ממברנה ספציפיים המבוטאים בכלי רכב חשמליים שמרמזים על מקורם בתאי אב (איור 3). ניתוח כתמים מערביים מראה את הביטוי של PGD ו-PKM2, בהתאמה, כמייצג של תכולת החלבונים ב-EV פלזמה וב-EV עצם, מה שמצביע על המצב המטבולי (איור 4). ביטוי שלילי של Golgin84 בכלי רכב חשמליים מזוהה גם עם נוכחות מיטופילין, α-Actinin-4, Flotillin-1, Caveolin-1 ו-β-actin, אשר מועשר בדרך כלל ב-EV גדולים (microvesicles) שמקורם בקרום פלזמה. ניתן לזהות גם את סמן ה-EV הקטן CD9, בעוד שביטוי CD81 נמוך או נעדר, עם היעדר קיום Apoa1 בפלזמה EVs (איור 4).
איור 1: איור של פרוטוקול חילוץ כלי רכב חשמליים. (A) השלבים לחילוץ כלי רכב חשמליים היקפיים מפלזמת הדם באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. (B) השלבים לחילוץ רקמה EV עם צנטריפוגה דיפרנציאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זיהוי מורפולוגי של כלי רכב חשמליים. (A) תמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים ייצוגי (TEM) המציגה את המורפולוגיה של כלי רכב חשמליים. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. (B) תמונות ותוצאות כימות מייצגות של מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) מציגות את התפלגות הגודל ומספר החלקיקים של כלי רכב חשמליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח מקור של כלי רכב חשמליים . (A) קבוצות שונות של צינורות עם בקרות שונות של הניסוי. (B) ההתפלגות של חרוזים בגודל 1 מיקרומטר, 0.5 מיקרומטר ו-0.2 מיקרומטר מוצגת בגרף המפוזר. (C) גרפים של צפיפות מייצגת המראים PBS (צינור A), צביעה פשוטה של כלי רכב חשמליים (צינור B), צביעה פשוטה של צבע ממברנה (צינור C) וצביעה כפולה של דגימות EV (צינור D). (D) ניתוח ציטומטרי זרימה של אחוז כלי הרכב החשמליים החיוביים ל-CD18 ב-EV פלסמה בדם באדום בהשוואה לבקרת נוגדנים משנית רק בשחור. (E) ניתוח ציטומטרי זרימה של אחוז כלי הרכב החשמליים החיוביים ל-OSCAR מדגימות עצם באדום בהשוואה לבקרת נוגדנים משנית רק בשחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח תכולת חלבונים של כלי רכב חשמליים. (A) כתם מערבי מייצג של תמונות פלזמה EV המראות נוכחות של 6-phosphogluconate dehydrogenase (PGD) ומיטופילין, α-Actinin-4, CD9, Flotillin-1, Caveolin-1 ו-β-actin ב-EV פלזמה והביטוי השלילי של CD81, Golgin84 ו-Apoa1. (B) כתם מערבי מייצג של תמונות EV עצם המראות נוכחות של פירובט קינאז M2 (PKM2) ומיטופילין, α-Actinin-4, CD9, CD81, Flotillin-1, Caveolin-1 ו-β-actin ב-EV עצם והביטוי השלילי של Golgin84. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מספר | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| BSA (μL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| NS (μL) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
טבלה 1: פתרון עבודה סטנדרטי של בדיקת BCA. הוסף את 0.5 מ"ג / מ"ל של BSA ו -0.9% של NS לשלוש בארות כפולות, כפי שמוצג בטבלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאשר בוחנים את התכונות, הגורל והתפקוד של כלי רכב חשמליים, חיוני לבודד כלי רכב חשמליים עם תפוקה גבוהה וזיהום נמוך. קיימות שיטות שונות לחילוץ כלי רכב חשמליים, כגון צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC), כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) ומבחני לכידת חיסון 4,20. כאן נעשה שימוש באחת השיטות הנפוצות ביותר, צנטריפוגה דיפרנציאלית; היתרונות של זה הם שזה לא לוקח זמן, זה מייצר תפוקה גבוהה של כלי רכב חשמליים עם בידוד קל מדגימות מוגבלות, ואת היכולת לשנות את השיטה על בסיס מקור הדגימה בשימוש. כדי לנתח את הפונקציה של כלי רכב חשמליים במחזור, עדיף לבחור את פלסמת הדם, שיכולה לשקף טוב יותר את המצב האמיתי של כלי רכב חשמליים in vivo, ולא את הסרום. הסיבה לכך היא שכלי רכב חשמליים רבים שמקורם בטסיות ישתחררו בתהליך היווצרות הקריש לאיסוף נסיוב21, בעוד שטסיות הדם יוסרו באמצעות צנטריפוגה לפני בידוד כלי הרכב החשמליים מפלסמה22. יש לציין כי הבחירה של נוגדי קרישה עבור בידוד פלזמה EV עדיין שנוי במחלוקת. מנגנון נוגדי הקרישה של הפרין קשור יותר לפיזיולוגיה; לפיכך, כלי הרכב החשמליים המבודדים עשויים לשקף יותר את מצב ה-in vivo. יש לציין כי הפרין יגרום לקריאות PCR שליליות כוזבות ויחסום ספיגת EV על ידי תאים23,24. ריאגנטים נוגדי קרישה אחרים, כגון EDTA או ציטראט נתרן, יש גם מחסור שלהם, כולל biotoxicity, המשפיעים על התכונות הכימיות של פלזמה טסיות. באופן קולקטיבי, בהתחשב במידע לעיל, הפרין נבחר במחקר זה. כדי להסיר את טסיות הדם, הדגימות עברו צנטריפוגה במהירות של 2,500 x גרם לפני 16,800 x g, מה שעשוי להסיר כמה כלי רכב חשמליים גדולים. בנוסף, בהתחשב בכך שכלי רכב חשמליים רבים בתוך הפלזמה הצמיגה יתחברו לטסיות הדם ויוסרו, מומלץ לדלל את הפלזמה בנפח שווה של PBS לפני הסרת טסיות הדם באמצעות צנטריפוגה כדי לשפר את התפוקה של כלי רכב חשמליים. יש לציין כי עדיף להשתמש בשיפוע סוכרוז עם אולטרה-צנטריפוגה כדי לטהר את כלי הרכב החשמליים כדי להסיר את זיהומי החלבונים המסיסים, כגון פולימרים חלבוניים21.
נכון להיום, השיטות הנפוצות לאפיון כלי רכב חשמליים כוללות בין היתר את NTA, TEM, FC16 ו-Western Blot. בנוסף, בשל השינוי במורפולוגיה ובכמות כלי הרכב החשמליים לאחר ששוחזרו בתנאים שונים13, אנו מציעים לעבד את הגילוי בהקדם האפשרי לאחר חילוץ כלי הרכב החשמליים. חוץ מזה, גורגנס ואחרים המליצו להשתמש ב-PBS בתוספת אלבומין אנושי וטרהלוז (PBS-HAT) לשימור טוב יותר מאשר PBS26 טהור. זיהוי מורפולוגי של כלי רכב חשמליים באמצעות נת"ע ו-TEM חייב להתבצע מיד לאחר הליך החילוץ, אחרת צורת הרכב החשמלי עשויה להשתנות27. יתר על כן, Cryo-EM יכול לשמש28 לתצפית מורפולוגית מתקדמת של EVs, אשר יש את היתרונות של שימור טוב יותר של הצורה עם רזולוציה גבוהה יותר. מלבד נת"ע, ריכוז החלקיקים ניתן לכימות גם על ידי FC בעזרת כמות ידועה של ספירת חרוזים29, אך שיטה זו אינה יציבה במיוחד, והרגישות לחלקיקים קטנים נמוכה עבור FC. יתר על כן, בגלל גילוי נחיל של חלקיקים קטנים עם FC30, עדיף להשתמש בנת"ע לקביעת גודל. באופן דומה, גם את מקורם של כלי הרכב החשמליים יכולה נת"ע לנתח באמצעות מסנני פלואורסצנטיות. בהשוואה ל-FC, נת"ע רגישה יותר לחלקיקים קטנים יותר ויש לה יתרון פוטנציאלי של מיחזור הדגימה לניסויים אחרים. יתרון אחד בשימוש ב-FC הוא שניתן להעשיר את תת-הסוגים הספציפיים של כלי רכב חשמליים בנוגדנים מצומדים פלואורוכרום28. כמו כן, ניתן לחקור את תפקודם של אנטיגנים ספציפיים על פני השטח באמצעות ניסויי אובדן תפקוד, כגון שימוש בנוגדנים מנטרלים28. לחלופין, 1% Triton X-100 יכול לשמש כדי להרוס את רפסודת השומנים של קרום EVs, ובכך כבקרה לגילוי אותות ממברנה31. יתר על כן, חוקרים יכולים להשתמש במאפייני הממברנה הספציפיים כדי ליצור נשאי תרופות ממוקדים32.
כתם מערבי נמצא בשימוש נרחב לניתוח תכולת החלבון ברכב חשמלי. מספר סמנים כגון מיטופילין, קאוולין ו-α-Actinin-418 הומלצו כמועמדים לזיהוי כלי רכב חשמליים גדולים במחקרים אחרונים; CD9 מועשר בכלי רכב חשמליים קטנים ולא ברכבים חשמליים גדולים, ו-CD81, CD63 ו-Syntenin-1 נמצאים בשפע בכלי רכב חשמליים קטנים18. באשר לתוצאות הכתם המערבי, סמנים כגון מיטופילין ו- CD9 משתנים בתנאים שונים של בעלי חיים. ניתן להניח כי כלי הרכב החשמליים המבודדים מייצגים אוכלוסייה מעורבת, שבה כלי רכב חשמליים גדולים הם תת-אוכלוסייה אחת גדולה. כדי לוודא את טוהר כלי הרכב החשמליים, מוצע להוסיף זיהוי של אברונים/חלבונים גרעיניים, כגון Lamin B או Golgin84, כבקרה שלילית. באשר לפלזמה חשמלית, על פי התוצאות שלנו, Apoa1 המייצג lipoparticles אינו מועשר ברכבים החשמליים שנאספו. מגבלה אחת של שיטה זו היא שקשה להבחין בין החלבונים שעל פני השטח לבין החלבונים שבתוך השלפוחית. לכן, ניתן ליישם בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) לניתוח חלבון ממברנה כניסויים משלימים. יתר על כן, עם הפיתוח של ריצוף בתפוקה גבוהה, חוקרים יכולים לנצל מיפוי פרוטאומי33 כדי לנתח את הרכב החלבונים של EVs, כאשר חלבוני המטרה צריכים גם להיות מאומתים על ידי כתם מערבי.
לסיכום, מחקר זה מספק פרוטוקול ישים לבידוד ואפיון כלי דם ורקמות חשמליות, כולל ניתוח מקורות התא ותכולת החלבונים שלהם, מה שמסייע לבסס בסיס לניסויים פונקציונליים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000974, 81870796, 82170988 ו- 81930025) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2019M663986 ו- BX20190380). אנו אסירי תודה על הסיוע של המרכז הלאומי להדגמת הוראה ניסויית לרפואה בסיסית (AMFU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
- Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
- Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
- In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T.
- Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
- Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
- Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
- Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
- Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
- Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
- Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
- Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
- Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
- Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
