Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att extrahera extracellulära vesiklar från perifert blod och fast vävnad med efterföljande profilering av ytantigener och proteinlaster.
Abstract
Cirkulerande och vävnadsresidenta extracellulära vesiklar (EV) representerar lovande mål som nya teranostiska biomarkörer, och de framträder som viktiga aktörer i upprätthållandet av organismhomeostas och utvecklingen av ett brett spektrum av sjukdomar. Medan den aktuella forskningen fokuserar på karakterisering av endogena exosomer med endosomalt ursprung, har mikrovesiklar som blåser från plasmamembranet fått ökad uppmärksamhet vid hälsa och sjukdom, som presenteras av ett överflöd av ytmolekyler som rekapitulerar membransignaturen hos moderceller. Här presenteras en reproducerbar procedur baserad på differentiell centrifugering för att extrahera och karakterisera EV från plasma och fasta vävnader, såsom benet. Protokollet beskriver vidare efterföljande profilering av ytantigener och proteinlaster av EV, som därmed är spårbara för sina härledningar och identifierade med komponenter relaterade till potentiell funktion. Denna metod kommer att vara användbar för korrelativ, funktionell och mekanistisk analys av EV i biologiska, fysiologiska och patologiska studier.
Introduction
Extracellulära vesiklar (EV) har föreslagits för att definiera cellfrisatta lipid-dubbelskikt-slutna extracellulära strukturer1, som spelar viktiga roller i olika fysiologiska och patologiska händelser2. EV som frigörs av friska celler kan grovt delas in i två huvudkategorier, nämligen exosomer (eller små EV) bildade genom en intracellulär endocytisk handelsväg3 och mikrovesiklar (eller stora EV) som utvecklas genom den yttre spirande plasmamembranet i cellen4. Medan många studier fokuserar på funktionen hos EV som samlats in från odlade celler in vitro5, är EV som härrör från cirkulationen eller vävnaderna mer komplexa och heterogena, vilket har fördelen att återspegla organismens verkliga tillstånd in vivo6. Dessutom kan nästan alla typer av vävnader producera EV in vivo , och dessa EV kan fungera som budbärare i vävnaden eller överföras av olika kroppsvätskor, särskilt perifert blod, för att underlätta systemisk kommunikation7. EV i cirkulationen och vävnaderna är också mål för sjukdomsdiagnos och behandling8.
Medan exosomer har studerats intensivt under de senaste åren har mikrovesiklar också viktiga biologiska funktioner, som lätt kan extraheras utan ultracentrifugering, vilket främjar grundforskning och klinisk forskning9. En kritisk fråga när det gäller elfordon isolerade från cirkulationen och vävnaderna är att de härrör från olika celltyper10. Eftersom mikrovesiklar blåses från plasmamembranet och presenteras av ett överflöd av cellytemolekyler9, är det möjligt att använda modercellmembranmarkörer för att identifiera det cellulära ursprunget för dessa EV. Specifikt kan flödescytometri (FC) -tekniken tillämpas för att detektera membranmarkörer. Dessutom kan forskare isolera elfordonen och göra ytterligare analyser baserat på de funktionella lasterna.
Detta protokoll tillhandahåller en grundlig procedur för att extrahera och karakterisera EV från in vivo-prover. EV: erna isoleras via differentiell centrifugering, och karakteriseringen av EV inkluderar morfologisk identifiering via nanopartikelspårningsanalys (NTA) och transmissionselektronmikroskopi (TEM), ursprungsanalys via FC och proteinlastanalys via western blot. Blodplasma och maxillärben hos möss används som representanter. Forskare kan hänvisa till detta protokoll för elbilar från andra källor och göra motsvarande ändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsöken utfördes i enlighet med riktlinjerna för institutionell djurvård och användningskommitté vid fjärde militära medicinska universitetet och ARRIVE-riktlinjerna. För den aktuella studien användes 8 veckor gamla C57Bl/6-möss (ingen preferens för varken honor eller hanar). Stegen för att isolera EV i plasma och vävnad illustreras i figur 1. Plasman tas som en representant för att beskriva EV-isoleringsproceduren från kroppsvätskor. Maxillärbenet tas som en representant för att förklara EV-isoleringsproceduren från de fasta vävnaderna.
1. Beredning av plasma och maxillary benprover
- Förbered plasmaproverna enligt stegen nedan.
- Bestäm musens kroppsvikt med hjälp av en standard laboratoriebalans.
- Tillsätt 20 μl, 2 mg/ml heparin till ett 1,5 ml centrifugrör och använd mixeranordningen (se materialtabell) för att låta heparinet fästa vid rörets vägg.
OBS: Antikoagulationsrör kan också användas direkt för att samla blodet. - Bedöva musen genom intraperitoneal injektion av 50 mg/kg pentobarbitalnatrium (se Materialförteckning). Ta tag i musens hals med tummen och pekfingret, fixera sedan svansen och vänster bakben med lillfingret och injicera pentobarbitalnatrium med en 1 ml injektionsspruta efter exponering av magen.
- Bekräfta att musen är ordentligt bedövad baserat på frånvaron av hornhinnereflex och lemreaktion när trampplattan kläms.
- Raka håret i ansiktet och ögonfransarna i ögonen med böjd sax.
- Ta tag i musens nackhud och tryck huden runt ögonen på baksidan av nacken så att ögongloben sticker ut. Använd oftalmisk pincett för att snabbt klämma fast ögongloben och samla utflödet av blod med 1,5 ml centrifugrör beredda i steg 1.1.2. Offra musen genom att förskjuta livmoderhalsen.
VARNING: Var försiktig med hårstrån och ögonfransarna eftersom de kan orsaka hemolys. - Vänd försiktigt röret upp och ner flera gånger för att förhindra blodkoagulering.
VARNING: Vänd röret upp och ner så snart som möjligt. - Centrifugera blodprovet i 15 minuter vid 1 200 x g vid 4 °C.
- Överför försiktigt supernatanten till nya och rena 1,5 ml centrifugrör och använd plasmaprovet omedelbart eller förvara det vid 4 °C i några timmar.
- Späd supernatanten med en lika stor volym 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och blanda väl.
OBS: Protokollet ovan för att samla in plasma är dödligt. Blodet kan också samlas in genom subklavisk venpunktion11 utan att offra musen.
- Förbered maxillära benprover enligt stegen nedan.
- Isolera maxillärbenet med oftalmisk pincett och sax och tvätta dem med PBS för att bli av med mjuka vävnader med pincett.
- Sätt maxillärbenet i 1,5 ml centrifugrör och skär benet i små bitar (storleken måste vara mindre än 1 mm i diameter) med sax. Tillsätt en viss mängd liberas (5 μg/ml, se materialförteckning) för att täcka vävnaden (vanligtvis 1 ml för benprover från en 8 veckor gammal mus) och inkubera sedan i 30 minuter vid 37 °C.
- Centrifugera provet vid 800 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Överför försiktigt supernatanten med en pipett till nya och rena 1,5 ml centrifugrör.
2. Utvinning av elfordon
- Centrifugera proverna (beredda i steg 1.1.10 och steg 1.2.4) i 15 minuter vid 2 500 x g (4 °C) för att avlägsna storcelligt skräp och kvarvarande trombocyter.
- Överför försiktigt supernatanterna till nya och rena 1,5 ml centrifugrör och centrifugera i 30 minuter vid 16 800 x g (4 °C).
OBS: Centrifugeringshastigheten kan ställas in på över 10 000 x g för att extrahera EV12. Ju högre centrifughastighet, desto mer mängd EV kan erhållas. Eftersom hastighetsgränsen för centrifugen vi använde är 16 800 x g (se materialtabell) valde vi denna hastighet i detta protokoll. - Kassera supernatanten och suspendera pelletsen i varje rör med 1 ml PBS. Centrifugera i 30 minuter vid 16 800 x g (4 °C).
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelletsen i varje rör med 50 μl PBS. Förvara dessa prover vid 4 °C i minst 24 timmar, eller använd helst omedelbart för följande analyser (steg 3–5).
VARNING: Lagring vid -80 °C är oacceptabelt, eftersom detta kommer att minska koncentrationen av elfordon och öka partikelstorlekarna i elfordon13, vilket påverkar följande analys av elfordon.
3. Morfologisk identifiering av elfordon
- Utför NTA-analys.
- Beroende på mängden EV (grovt bedömt av pelletsstorleken är partiklarna på 50 μL plasma minsta), överför 5-50 μL resuspension (steg 2.4), späd i 10 ml buffertlösning (PBS filtrerad med 0,22 μm filter) och blanda med 1 ml mikropipettorspetsar tillräckligt. Använd denna slutliga suspension för partikelmätning.
- Använd en steril 1 ml spruta för att injicera minst 5 ml destillerat vatten med måttlig och konstant hastighet tills antalet partiklar som visas på detekteringsgränssnittet är mindre än fem.
OBS: Efter att ha injicerat 1 ml destillerat vatten genom hela kanalen visas antalet partiklar direkt på detekteringsgränssnittet. Om antalet fortfarande är över fem, fortsätt att injicera 1 ml destillerat vatten tills kriterierna är uppfyllda. - Bered 1 μl kalibreringslösning i 1 ml destillerat vatten för att generera en primärlösning och ta sedan 100 μl av primärlösningen till 25 ml destillerat vatten för att bereda en standardstamlösning (1:250 000). Förvara detta arbetsreagens vid 4 °C i 1 vecka.
- Kalibrera NTA-instrumentet med standardstamlösningen (steg 3.1.3). Injicera 1–5 ml av arbetskalibreringslösningen med en 1 ml steril spruta för att spola maskinkanalen tills antalet partiklar som visas på detektionsgränssnittet är mellan 50–400 (helst omkring 300). Kör kalibreringsprogrammet.
- Upprepa steg 3.1.2 för att spola maskinkanalen före varje provmätning.
- Använd en steril 1 ml spruta för att injicera minst 2 ml buffertlösning för att spola maskinkanalen med konstant hastighet tills antalet partiklar som visas i detekteringsgränssnittet är mindre än 10.
- Injicera 1 ml av EV-provet som beretts i steg 3.1.1 med en måttlig och konstant hastighet (den rekommenderade hastigheten är 0,5-1 ml / s).
OBS: Den optimala partikelkoncentrationen gör att antalet partiklar som visas på detektionsgränssnittet varierar från 50-400, helst runt 300. Om antalet partiklar är för högt, upprepa steg 3.1.2 för att spola maskinkanalen omedelbart för att undvika partikelretention vid kanalväggen och justera koncentrationen i EV-provet med steg 3.1.1, upprepa sedan från steg 3.1.5. - Utför partikelanalysen och generera analysrapporterna enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
- Om provet är dyrbart, pumpa tillbaka EV-provet med 1 ml spruta och samla dem i 1,5 ml centrifugrör. Upprepa steg 2.2 för att extrahera elfordonen.
- Efter detektion av alla prover, injicera minst 2 ml buffertlösning i maskinkanalen och injicera sedan minst 5 ml destillerat vatten tills antalet partiklar som visas i detekteringsgränssnittet är mindre än fem.
- Använd en steril 5 ml spruta för att injicera minst 10 ml luft med konstant hastighet (rekommenderad hastighet är 1 ml/s) för att avlägsna vattnet i kanalen.
- Utför TEM-analys.
OBS: Utför följande steg med nya EV-upphängningar. Det formvar-kolbelagda elektronmikroskopnätet har två sidor, där arbetssidan är lysande i mittgallret. Den minsta plasmavolym som extraherar EV för nedanstående procedur är 50 μl.- Blanda EV-provet (steg 2.4) med en lika stor volym 4% paraformaldehyd (PFA). Deponera 4 μL av elfordonen på ett galler och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Lägg fyra droppar PBS (en droppe är lika med 50 μL) på ett ark polyetenfilm (se materialtabell). Överför gallret med ren mikroskopisk pincett och tvätta arbetssidan av gallret i PBS från en droppe till en annan.
- Använd filterpapper för att ta bort extra PBS som fanns kvar i rutnäten.
- Inkubera arbetssidan av gallret till 1 % fosfotungstiksyra (se Materialförteckning) i 2 minuter och upprepa sedan steg 3.2.2.
VARNING: Eftersom fosfotungstiksyra är giftig måste denna procedur användas i dragskåpet och överflödig fosfotungstiksyra måste återvinnas specifikt snarare än kasseras direkt. - Lägg gallren uppåt i en 10 cm skål täckt med filterpapper. Gallren kan lagras på RT i flera år.
- Observera gallren under ett elektronmikroskop enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
OBS: För att säkerställa att de enskilda partiklarna observeras måste koncentrationen av elfordonen justeras och fjädringen måste vara klar utan uppenbar grumlighet. Innan provet tappas ska det blandas väl. De representativa TEM- och NTA-analyserna visas i figur 2.
4. Ursprungsanalys av elfordon
OBS: Identifieringen av EV: s cellulära ursprung kräver applicering av antikroppar för typiska cellmembranmarkörer. Den minsta plasmavolymen för att extrahera EV för nedanstående procedur är 300 μL. Baserat på lipid-dubbelskiktsstrukturerna hos EV kan membranfärg användas för att markera dem. För blodplasmaprover väljs CD18 för lymfocyter14 för representation. För maxillära benprover väljs osteoklastassocierad receptor (OSCAR) för osteoklaster15 som exempel. Innan FC, se till att flödescytometern är anpassad till mätningen av EV16, eftersom den nedre storleksgränsen skiljer sig mycket mellan distinkta flödescytometrar.
- Resuspendera prover (steg 2.4) med 500 μL PBS och överför 50 μL till ett nytt och rent 1,5 ml centrifugrör som ett blindprov (rör A) och ytterligare 50 μL till ett nytt och rent 1,5 ml centrifugrör som ett enkelt färgningsrör för FITC (rör B). Tillsätt 0,5 μL membranfärgämne till primärröret för membranfärgning. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera primärröret i 30 minuter vid 16 800 x g (4 °C). Kassera supernatanten och suspendera pelletsen igen med 200 μl PBS.
- Dela upp varje 50 μl-prov i fyra 1,5 ml centrifugrör för enkla färgningsrör för PE (rör C), ytmarkörfärgning (rör D) och sekundära antikroppskontroller (rör E).
- Lägg till den primära antikroppen av OSCAR i EV-prover med ben samt CD18-antikropp i EV-prover i plasma (se materialtabell) till rör B (steg 4.1) och rör D (steg 4.3) separat (utspätt vid 1:100). Inkubera i 1 timme vid 4 °C.
- Centrifugera rören i 30 minuter vid 16 800 x g (4 °C). Kassera supernatanten, suspendera pelletsen igen med 500 μl PBS och centrifugera sedan igen i 30 minuter vid 16 800 x g (4 °C) för att avlägsna de extra primära antikropparna.
- Kassera supernatanten och suspendera pelletsen igen med 50 μl PBS, följt av tillsats av FITC-konjugerade sekundära antikroppar (se materialtabell) (utspädd vid 1:200) (rör E). Lägg till samma sekundära antikroppar till rör B (steg 4.1) och rör D (steg 4.3). Inkubera alla rör i 1 timme vid 4 °C i mörker.
OBS: Direkta fluorescenskonjugerade märkningsantikroppar kan också användas för att bearbeta FC-detekteringen med korrekta isotypkontroller. - Späd en droppe med 0,2, 0,5 respektive 1 μm stora pärlor (se materialtabell) upphängning till 1 ml PBS och kör pärlorna i varje storlek först för att se till vilken grind som valts för elbilar. Ställ in flödescytometerns tröskelvärde för att söka efter pärlorna och EV-populationen med hjälp av en lämplig framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC).
- Ställ in terminalvillkoret som beräkning av 100 000 membranfärgade partiklar. Analysera provet via en flödescytometer enligt tillverkarens instruktioner (se Materialförteckning). De representativa resultaten visas i figur 3.
OBS: NTA-utrustning med fluorescenskanaler kan också användas för ursprungsanalys, och provberedningen är densamma som FC.
- Ställ in terminalvillkoret som beräkning av 100 000 membranfärgade partiklar. Analysera provet via en flödescytometer enligt tillverkarens instruktioner (se Materialförteckning). De representativa resultaten visas i figur 3.
5. Analys av proteininnehåll i elfordon
OBS: Analysen av proteininnehållet i EV utförs via western blot. Till exempel valdes EV i plasma och ben för att analysera 6-fosfoglukonatdehydrogenas (PGD) och pyruvatkinas M2 (PKM2) för metabolisk status. Golgin84 (Golgi-organellen) användes som en negativ kontroll, och Flotillin (membranprotein), Caveolin (integrerat protein i caveolae) och β-aktin (cytoskelettet)17 användes som en positiv kontroll i EV jämfört med cellprover. Mitofilin och α-Actinin-4 valdes som stora EV-markörer, medan CD9 och CD81 valdes som små EV-markörer för att demonstrera EV-subpopulationerna18. Apoa1 valdes som en plasmalipopartikelmarkör19. För respektive reagensdetaljer, se Materialförteckning.
- Återsuspendera pelletsen (steg 2.4) i 50 μl Ripa-lysbuffert och inkubera i 30 minuter på is.
- Kvantifiera proteinkoncentrationerna för alla prover i mikroplattan med 96 brunnar genom BCA-proteinanalysen enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell).
- Späd 2 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) med 0,9 % normal saltlösning (NS) (innehållande 0,9 % (vikt/volym) natriumklorid) till 0,5 mg/ml. Tillsätt 0,5 mg/ml BSA och 0,9 % NS i tre duplicerade brunnar med vissa volymer, såsom visas i tabell 1.
- Släpp 2 μl av proverna (steg 5.1) och tillsätt 18 μL NS i tre duplicerade brunnar separat.
- Bered en arbetslösning genom att blanda BCA-reagens A med reagens B (50:1 Reagens A:B). Tillsätt 200 μL av arbetslösningen till varje brunn och skaka försiktigt i 30 sekunder.
- Inkubera mikroplattan med 96 brunnar i 20–25 minuter vid 37 °C.
- Mät OD vid 596 nm med spektrofotometern (se materialtabell).
- Exportera data.
- Rita en standardkurva och beräkna proteinkoncentrationen i proverna.
- Enligt resultaten, späd proverna till 1 μg / μL med 0,9% NS och 5x SDS-PAGE laddningsbuffert (250 mM Tris · HCl, pH 6,8, 10% SDS, 30% (v/v) glycerol, 10 mM DTT, 0,05% (w/v) bromfenolblått, se Materialförteckning). Förslut rören med film ordentligt och värm i 5 min vid 100 °C.
- Ladda proverna och proteinstegen i en gradientkoncentration på 4% -20% Hepes-Tris gel (se materialtabell).
OBS: Välj gelprocent enligt molekylvikten för proteinerna av intresse. - Kör gelén i den löpande bufferten vid 80 V tills proteinerna bildar en linje och byt sedan till 120 V i 1 h tills laddningsfärgen är i botten av gelén.
OBS: Körtiden kan variera beroende på vilken utrustning som används eller gelens typ och koncentration. - Överför gelen till polyvinylidenfluoridmembranet (PVDF) (se materialförteckning), förinkuberat i metylalkohol i 20 sekunder. Använd ett våtöverföringssystem för att överföra i 1 timme vid 200 mA.
VARNING: Se till att det inte finns någon bubbla inuti överföringssystemet och håll PVDF-membranet vått.
OBS: Överföringstiden kan variera beroende på målproteinets molekylvikt; 1 KD behöver vanligtvis 1 min. - Bered 5 % BSA-blockerande buffert genom att tillsätta 2,5 g BSA (se materialtabell) i 50 ml Tris-buffrad saltlösning-Tween (TBST) (2 ml Tween tillsatt i 2 L PBS-lösning) i ett 50 ml centrifugrör. Agitera tills pulvret är upplöst. Blockera membranen i denna buffert i 2 timmar vid RT med omrörning.
- Inkubera membranen med specifika primära antikroppar utspädda med TBST till rätt koncentration (Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flottilj-1, 1:1000; Caveolin-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-aktin, 1:3000) över natten vid 4 °C.
- Tvätta membranen i tvättbufferten (2 ml Tween tillsatt i 2 l PBS-lösning) fyra gånger (15 min varje gång) och inkubera membranen med lämpliga sekundära antikroppar vid 1:4000 i 1 h vid RT med omrörning.
- Tvätta membranen i tvättbufferten fyra gånger (15 min varje gång) och avbilda membranen med hjälp av kemiluminiscenssatsen och ett gelavbildningssystem (se materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt det experimentella arbetsflödet kan EV extraheras från perifert blod och fasta vävnader (figur 1). Maxillärbenet hos en mus i åldern 8 veckor är ungefär 0,1 ± 0,05 g och cirka 300 μL plasma kan samlas in från musen. Efter protokollstegen kan 0,3 mg respektive 3 μg EV samlas in. Som analyserats av TEM och NTA är de typiska morfologiska egenskaperna hos EV runda koppformade membranvesiklar med en diameter som sträcker sig från 50-300 nm (figur 2). FC kan detektera membranfärgmärkta EV under användbara kontroller, och FC-analys visar procentandelarna av specifika membranmarkörer uttryckta på EV som antyder deras ursprung från moderceller (figur 3). Western blot-analys visar uttrycket av PGD respektive PKM2 som en representant för proteininnehållet i plasma EV och ben EV, vilket indikerar metabolisk status (figur 4). Negativt uttryck av Golgin84 i EV detekteras också med närvaron av Mitofilin, α-Actinin-4, Flotillin-1, Caveolin-1 och β-aktin, som vanligtvis anrikas i plasmamembranhärledda stora EV (mikrovesiklar). Den lilla EV-markören CD9 kan också detekteras, medan CD81-uttrycket är lågt eller frånvarande, med brist på Apoa1-existens i plasma-EV: erna (figur 4).
Figur 1: Illustration av protokollet för att extrahera EV. (A) Stegen för att extrahera EV i perifer blodplasma med differentialcentrifugering. (B) Stegen för att extrahera vävnads-EV med differentiell centrifugering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologisk identifiering av elfordon . A) Representativ bild av transmissionselektronmikroskop (TEM) som visar EV-fordonens morfologi. Skalstång = 200 nm. (B) Representativa bilder och kvantifieringsresultat för nanopartikelspårningsanalys (NTA) visar storleksfördelningen och partikelantalet för EV. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ursprungsanalys av elfordon . (A) De olika uppsättningarna rör med olika kontroller av experimentet. (B) Fördelningen av pärlorna med storleken 1 μm, 0,5 μm och 0,2 μm visas i det skadade diagrammet. (C) Representativa densitetsdiagram som visar PBS (rör A), enkel färgning av EV (rör B), enkel färgning av membranfärg (rör C) och dubbelfärgning av EV-proverna (rör D). (D) Flödescytometrisk analys av andelen CD18-positiva EV i blodplasma EV i rött jämfört med den sekundära antikroppskontrollen i svart. (E) Flödescytometrisk analys av procentandelen OSCAR-positiva EV från benprover i rött jämfört med den sekundära antikroppskontrollen i svart. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Proteininnehållsanalys av EV. (A) Representativa Western Blot av plasma EV-bilder som visar närvaron av 6-fosfoglukonatdehydrogenas (PGD) och Mitofilin, α-Actinin-4, CD9, Flotillin-1, Caveolin-1 och β-aktin i plasma EV och det negativa uttrycket av CD81, Golgin84 och Apoa1. (B) Representativa västliga EV-bilder av ben som visar närvaron av pyruvatkinas M2 (PKM2) och mitofilin, α-aktinin-4, CD9, CD81, flotillin-1, caveolin-1 och β-aktin i ben-EV och det negativa uttrycket av Golgin84. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Nummer | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| BSA (μL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| NS (μL) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
Tabell 1: Standardarbetslösning för BCA-analys. Tillsätt 0,5 mg/ml BSA och 0,9 % NS i tre duplicerade brunnar, som visas i tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När man studerar elfordonens egenskaper, öde och funktion är det viktigt att isolera elbilar med hög avkastning och låg förorening. Olika metoder finns för att extrahera EV, såsom densitetsgradientcentrifugering (DGC), storleksuteslutningskromatografi (SEC) och immunocapture analyser 4,20. Här användes en av de vanligaste metoderna, differentialcentrifugering; Fördelarna med detta är att det inte är tidskrävande, det genererar ett högt utbyte av EV med enkel isolering från begränsade prover och möjligheten att modifiera metoden baserat på den provkälla som används. För att analysera funktionen hos cirkulerande elbilar är det bättre att välja blodplasma, som bättre kan återspegla EV: s verkliga tillstånd in vivo, snarare än serumet. Detta beror på att många trombocyt-härledda EV kommer att släppas under processen med koagulationsbildning för att samla serum21, medan trombocyter avlägsnas via centrifugering innan EV isoleras från plasma22. Det måste noteras att valet av antikoagulation för plasma EV-isolering fortfarande är kontroversiellt. Den antikoagulerande mekanismen för heparin är närmare relaterad till fysiologi; De elfordon som isolerats kan därför vara mer reflekterande av in vivo-statusen. Det måste nämnas att heparin kommer att orsaka falska negativa PCR-avläsningar och blockera EV-upptag av celler23,24. Andra antikoagulationsreagens, såsom EDTA eller natriumcitrat, har också sina brister, inklusive biotoxicitet, som påverkar de kemiska egenskaperna hos plasma och blodplättar. Sammantaget, givet ovanstående information, väljs heparin i denna studie. För att avlägsna blodplättarna centrifugerades proverna med en hastighet av 2 500 x g före 16 800 x g, vilket kan ta bort några stora EV. Dessutom, med tanke på att många EV i den viskösa plasman kommer att fästa vid blodplättar och tas bort, föreslås det att späda plasman med en lika stor volym PBS innan man tar bort blodplättar genom centrifugering för att förbättra utbytet av EV. Observera att det är bättre att använda en sackarosgradient med ultracentrifugering för att rena EV: erna för att avlägsna de lösliga proteinföroreningarna, såsom proteinpolymerer21.
Hittills inkluderar de vanliga metoderna för att karakterisera elbilar NTA, TEM, FC16 och Western blot, bland annat25. Dessutom, på grund av förändringen av morfologi och kvantitet av EV efter att ha återställts under olika förhållanden13, föreslår vi att detekteringen behandlas så snart som möjligt efter extraktion av EV. Dessutom har Görgens et al. rekommenderat att använda PBS kompletterat med humant albumin och trehalos (PBS-HAT) för bättre konservering än ren PBS26. Morfologisk identifiering av elfordon via NTA och TEM måste utföras omedelbart efter extraktionsproceduren, annars kan formen på elfordon ändras27. Dessutom kan Cryo-EM användas28 för avancerad morfologisk observation av elbilar, vilket har fördelarna med att bättre bevara formen med högre upplösning. Förutom NTA kan koncentrationen av partiklar också kvantifieras med FC med hjälp av en känd mängd räknekulor29, men denna metod är inte särskilt stabil och känsligheten för små partiklar är låg för FC. Dessutom, på grund av svärmdetektering av små partiklar med FC30, är det bättre att använda NTA för storleksbestämningar. På samma sätt kan EV: s ursprung också analyseras av NTA med fluorescensfilter. Jämfört med FC är NTA känsligare för mindre partiklar och har den potentiella fördelen att återvinna provet för andra experiment. En fördel med att använda FC är att de specifika subtyperna av EV kan berikas med fluorkromkonjugerade membranantikroppar28. Dessutom kan funktionen hos specifika ytantigener studeras via förlust-av-funktion-experiment, såsom användning av neutraliserande antikroppar28. Alternativt kan 1% Triton X-100 användas för att förstöra lipidflotten av EV-membran, alltså som en kontroll för detektering av membransignaler31. Dessutom kan forskare använda de specifika membranegenskaperna för att skapa riktade läkemedelsbärare32.
Western blot används i stor utsträckning för att analysera proteininnehållet i elbilar. Flera markörer som Mitofilin, caveolin och α-Actinin-418 har rekommenderats som kandidater för att identifiera stora EV i nyligen genomförda studier; CD9 är berikad i små elbilar snarare än i stora elbilar, och CD81, CD63 och Syntenin-1 är rikligt förekommande i små elbilar18. När det gäller resultaten från Western blot varierar markörer som Mitofilin och CD9 under olika djurförhållanden. Det kan antas att de isolerade elfordonen representerar en blandad population, där stora elfordon är en stor delpopulation. För att verifiera renheten hos EV föreslås att detektion av organell-/kärnproteiner, såsom Lamin B eller Golgin84, tillsätts som negativ kontroll. När det gäller plasma EV, enligt våra resultat, är Apoa1 som representerar lipopartiklar inte anrikad i de insamlade EV: erna. En begränsning med denna metod är att det är svårt att skilja proteinerna på ytan från de i vesikeln. Därför kan enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) tillämpas för membranproteinanalys som kompletterande experiment. Dessutom, med utvecklingen av sekvensering med hög genomströmning, kan forskare dra nytta av proteomisk kartläggning33 för att analysera proteinsammansättningen hos EV, med målproteinerna som också behöver verifieras av western blot.
Sammanfattningsvis ger denna studie ett genomförbart protokoll för att isolera och karakterisera cirkulations- och vävnads-EV, inklusive en analys av deras cellkällor och proteininnehåll, vilket hjälper till att skapa en grund för ytterligare funktionella experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 och 81930025) och China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 och BX20190380). Vi är tacksamma för hjälp från National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
- Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
- Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
- In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T.
- Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
- Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
- Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
- Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
- Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
- Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
- Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
- Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
- Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
- Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
