Summary
본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.
Abstract
순환 및 조직 상주 세포외 소포(EV)는 새로운 테라노스틱 바이오마커로서 유망한 표적을 나타내며 유기체 항상성 유지 및 광범위한 질병의 진행에 중요한 역할을 합니다. 현재 연구는 엔도솜 기원을 가진 내인성 엑소좀의 특성화에 초점을 맞추고 있지만, 원형질막에서 흘러나오는 미세소포는 모세포의 막 시그니처를 요약하는 풍부한 표면 분자를 특징으로 하는 건강과 질병 분야에서 점점 더 주목을 받고 있습니다. 여기서는 혈장 및 뼈와 같은 고형 조직에서 EV를 추출하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 기반으로 재현 가능한 절차가 제시됩니다. 이 프로토콜은 EV의 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링을 추가로 설명하며, 따라서 파생을 추적할 수 있고 잠재적 기능과 관련된 구성 요소로 식별됩니다. 이 방법은 생물학적, 생리학적, 병리학적 연구에서 EV의 상관적, 기능적, 기계론적 분석에 유용할 것입니다.
Introduction
세포외 소포체(EV)는 다양한 생리학적 및 병리학적 사건2에서 중요한 역할을 하는 세포 방출 지질 이중층으로 둘러싸인 세포외 구조1를 정의하기 위해 제안되었다. 건강한 세포에서 방출되는 EV는 크게 두 가지 주요 범주, 즉 세포내 세포내 트래피킹 경로3를 통해 형성된 엑소좀(또는 작은 EV)과 세포의 원형질막4의 바깥쪽 출아에 의해 발달하는 미세소포(또는 대형 EV)로 나눌 수 있다. 많은 연구가 시험관 내에서 배양된 세포에서 채취한 EV의 기능에 초점을 맞추고 있지만5, 순환계나 조직에서 유래한 EV는 더 복잡하고 이질적이어서 생체 내 유기체의 실제 상태를 반영하는 이점이 있다 6. 또한, 거의 모든 종류의 조직이 생체 내에서 EV를 생산할 수 있으며, 이러한 EV는 조직 내에서 메신저 역할을 하거나 다양한 체액, 특히 말초 혈액에 의해 전달되어 전신 통신을 촉진할 수 있다7. 순환계와 조직 속의 전기차는 질병 진단과 치료의 표적이기도 하다8.
최근 몇 년 동안 엑소좀이 집중적으로 연구되고 있는 반면, 마이크로베시클은 또한 중요한 생물학적 기능을 가지고 있어 초원심분리 없이 쉽게 추출할 수 있어 기초 및 임상 연구를 촉진한다9. 특히, 순환계와 조직에서 분리된 EV와 관련된 중요한 문제는 EV가 서로 다른 세포 유형에서 유래한다는 것이다10. 마이크로베지클은 원형질막에서 흘러나오고 풍부한 세포 표면 분자9를 특징으로 하기 때문에, 이들 EV의 세포 기원을 식별하기 위해 모 세포막 마커를 사용하는 것이 가능하다. 특히, 유세포 분석(FC) 기술을 적용하여 멤브레인 마커를 검출할 수 있습니다. 또한 연구원들은 EV를 분리하고 기능성 화물을 기반으로 추가 분석을 수행할 수 있습니다.
본 프로토콜은 생체내 샘플로부터 EV를 추출하고 특성화하기 위한 철저한 절차를 제공한다. EV는 차등 원심분리를 통해 분리되며, EV의 특성화에는 나노입자 추적 분석(NTA) 및 투과 전자 현미경(TEM)을 통한 형태학적 식별, FC를 통한 기원 분석, 웨스턴 블롯을 통한 단백질 화물 분석 이 포함됩니다. 생쥐의 혈장과 상악골이 대표로 사용됩니다. 연구원은 다른 출처의 EV에 대해 이 프로토콜을 참조하고 해당 수정을 수행할 수 있습니다.
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Protocol
동물실험은 제4군의과대학 기관동물관리이용위원회 가이드라인과 ARRIVE 가이드라인에 따라 수행하였다. 본 연구에서는 8주령의 C57Bl/6 마우스(암컷 또는 수컷 모두 선호 없음)를 사용했습니다. 혈장 및 조직 EV를 분리하는 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 플라즈마는 체액으로부터 EV 분리 절차를 설명하기 위해 대표적으로 사용됩니다. 상악골은 고형 조직으로부터 EV 분리 절차를 설명하기 위해 대표적으로 사용됩니다.
1. 혈장 및 상악골 시료의 제조
- 아래 단계에 따라 혈장 샘플을 준비합니다.
- 표준 실험실 저울을 사용하여 마우스의 체중을 결정하십시오.
- 20 μL, 2 mg/mL의 헤파린을 1.5 mL 원심분리기 튜브에 넣고 믹서 장치( 재료 표 참조)를 사용하여 헤파린이 튜브 벽에 부착되도록 합니다.
알림: 항응고 튜브를 사용하여 혈액을 직접 채취할 수도 있습니다. - 펜토바르비탈 나트륨 50mg/kg을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다( 재료 표 참조). 엄지와 집게 손가락으로 쥐의 목을 잡은 후 새끼 손가락으로 꼬리와 왼쪽 뒷다리를 고정하고 배를 노출시킨 후 펜토바르비탈 나트륨을 1mL 주사기로 주입합니다.
- 발바닥을 꼬집었을 때 각막 반사 및 사지 반응이 없는지 마우스가 제대로 마취되었는지 확인합니다.
- 구부러진 가위로 얼굴과 눈의 속눈썹을 면도하십시오.
- 마우스의 목 피부를 잡고 눈 주위의 피부를 목 뒤쪽으로 눌러 안구가 튀어 나오도록합니다. 안과용 핀셋을 사용하여 안구를 빠르게 고정하고 1.1.2단계에서 준비한 1.5mL 원심분리기 튜브로 혈액 유출을 수집합니다. 자궁 경부를 탈구시켜 마우스를 희생하십시오.
주의 : 머리카락과 속눈썹은 용혈을 일으킬 수 있으므로 주의하십시오. - 혈액 응고를 방지하기 위해 튜브를 여러 번 거꾸로 부드럽게 뒤집습니다.
주의 : 가능한 한 빨리 튜브를 거꾸로 뒤집으십시오. - 혈액 샘플을 4°C에서 1,200 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 새롭고 깨끗한 1.5mL 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기고 혈장 샘플을 즉시 사용하거나 4°C에서 몇 시간 동안 보관하십시오.
- 상층액을 같은 부피의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석하고 잘 섞는다.
참고: 혈장을 수집하기 위해 위에 제공된 프로토콜은 치명적입니다. 혈액은 또한 마우스를 희생시키지 않고 쇄골하 정맥 천자(11 )를 통해 수집될 수 있다.
- 아래 단계에 따라 상악골 샘플을 준비합니다.
- 안과 핀셋과 가위로 상악골을 분리하고 PBS로 씻어 핀셋으로 연조직을 제거하십시오.
- 상악골을 1.5mL 원심분리기 튜브에 넣고 가위로 뼈를 작은 조각(직경 1mm 미만이어야 함)으로 자릅니다. 조직을 덮기 위해 일정량의 리베라아제(5μg/mL, 재료 표 참조)를 첨가한 다음(일반적으로 8주령 마우스의 뼈 샘플의 경우 1mL) 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 시료를 4°C에서 10분 동안 800 x g 로 원심분리합니다.
- 피펫으로 상층액을 깨끗하고 깨끗한 새 1.5mL 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
2. 전기차 추출
- 샘플(단계 1.1.10 및 단계 1.2.4에서 제조됨)을 2,500 x g(4°C)에서 15분 동안 원심분리하여 거대 세포 파편 및 잔류 혈소판을 제거하였다.
- 상층액을 새롭고 깨끗한 1.5mL 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기고 16,800 x g (4°C)에서 30분 동안 원심분리기를 사용합니다.
알림: 원심분리 속도는 EV를 추출하기 위해 10,000 x g 이상으로 설정할 수 있습니다12. 원심분리기의 속도가 빠를수록 더 많은 양의 EV를 얻을 수 있습니다. 우리가 사용한 원심분리기의 속도 제한은 16,800 x g ( 재료 표 참조)이기 때문에 이 프로토콜에서 이 속도를 선택했습니다. - 상층액을 버리고 PBS 1mL로 각 튜브에 펠릿을 재현탁합니다. 16,800 x g (4 °C)에서 30분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 50 μL의 PBS로 각 튜브에 펠릿을 재현탁합니다. 이러한 샘플을 4°C에서 24시간 미만 동안만 보관하거나 다음 분석에 즉시 사용하는 것이 좋습니다(3-5단계).
주의: -80°C에서의 보관은 EV의 농도를 감소시키고 EV의 입자 크기를 증가시키므로 허용되지 않습니다.13, 따라서 EV의 다음 분석에 영향을 미칩니다.
3. EV의 형태학적 식별
- NTA 분석을 수행합니다.
- EV의 양에 따라(펠릿의 크기로 대략적으로 판단, 50μL 혈장 입자가 최소임), 5-50μL의 재현탁(단계 2.4)을 옮기고, 10mL의 완충액(PBS는 0.22μm 필터로 여과)에 희석하고, 1mL 마이크로 피펫 팁으로 충분히 혼합합니다. 이 최종 현탁액을 입자 측정에 사용하십시오.
- 멸균 1mL 주사기를 사용하여 검출 인터페이스에 표시된 입자 수가 5개 미만이 될 때까지 최소 5mL의 증류수를 중간 정도의 일정한 속도로 주입합니다.
알림: 전체 채널을 통해 1mL의 증류수를 주입한 후 입자 수가 감지 인터페이스에 직접 표시됩니다. 숫자가 여전히 5를 초과하면 기준이 충족 될 때까지 1mL의 증류수를 계속 주입하십시오. - 보정액 1 μL를 증류수 1 mL에 재구성하여 1차 용액을 생성한 후, 1차 용액 100 μL를 증류수 25 mL에 취하여 표준원액(1:250,000)을 제조한다. 이 작업 시약을 4°C에서 1주일 동안 보관하십시오.
- 표준 원액으로 NTA 기기를 교정합니다(3.1.3단계). 1-5mL의 작동 교정 용액을 1mL 멸균 주사기로 주입하여 검출 인터페이스에 표시되는 입자 수가 50-400개(바람직하게는 약 300개)가 될 때까지 기계 채널을 세척합니다. 보정 프로그램을 실행합니다.
- 각 samp르 측정 전에 3.1.2단계를 반복하여 기계 채널을 세척합니다.
- 멸균 1mL 주사기를 사용하여 최소 2mL의 완충액을 주입하여 검출 인터페이스에 표시되는 입자 수가 10개 미만이 될 때까지 일정한 속도로 기계 채널을 세척합니다.
- EV 1mL 주입amp3.1.1단계에서 준비한 le 적당하고 일정한 속도(권장 속도는 0.5-1mL/s).
알림: 최적의 입자 농도는 감지 인터페이스 범위에 표시되는 입자 수를 50-400, 바람직하게는 약 300으로 만드는 것입니다. 입자 수가 너무 많으면 3.1.2단계를 반복하여 기계 채널을 즉시 세척하여 채널 벽에 입자가 잔류하지 않도록 하고 EV s의 농도를 조정합니다.amp3.1.1단계로 s를 조정한 다음 3.1.5단계부터 반복합니다. - 입자 분석을 수행하고 제조업체의 지침에 따라 분석 보고서를 생성합니다( 재료 표 참조).
- 샘플이 소중한 경우 EV 샘플을 1mL 주사기로 다시 펌핑하고 1.5mL 원심분리기 튜브에 수집합니다. 2.2단계를 반복하여 EV를 추출합니다.
- 모든 샘플을 검출한 후 최소 2mL의 완충액을 기계 채널에 주입한 다음 검출 인터페이스에 표시된 입자 수가 5개 미만이 될 때까지 최소 5mL의 증류수를 주입합니다.
- 멸균 5mL 주사기를 사용하여 일정한 속도(권장 속도는 1mL/s)로 최소 10mL의 공기를 주입하여 채널의 물을 제거합니다.
- TEM 분석을 수행합니다.
알림: 새 EV 서스펜션으로 다음 단계를 수행하십시오. formvar-carbon 코팅 전자 현미경 그리드에는 양면이 있으며 작업면은 중앙 그리드에서 발광합니다. 아래 절차를 위해 EV를 추출하기 위한 혈장의 최소 부피는 50μL입니다.- EV 샘플을 혼합하십시오(2.4단계)와 동일한 부피의 4% 파라포름알데히드(PFA). 하나의 그리드에 4μL의 EV를 증착하고 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다.
- 폴리에틸렌 필름 시트에 PBS 4방울(한 방울은 50μL에 해당)을 넣습니다( 재료 표 참조). 깨끗한 미세 핀셋으로 그리드를 옮기고 PBS에서 그리드의 작업면을 한 방울에서 다른 방울로 씻으십시오.
- 여과지를 사용하여 그리드에 남아 있는 여분의 PBS를 제거합니다.
- 그리드의 작업면을 1 % 포스 포 텅스텐 산 ( 재료 표 참조)으로 2 분 동안 배양 한 다음 3.2.2 단계를 반복하십시오.
주의 : 포스 포 텅스텐 산은 독성이 있기 때문에이 절차는 흄 후드에서 작동해야하며 여분의 포스 포 텅스텐 산은 직접 폐기하지 않고 특별히 재활용해야합니다. - 여과지로 덮인 10cm 접시에 격자를 뒤집어 놓습니다. 그리드는 몇 년 동안 RT에 저장할 수 있습니다.
- 제조업체의 지침에 따라 전자 현미경으로 그리드를 관찰하십시오( 재료 표 참조).
알림: 단일 입자가 관찰되도록 하려면 EV의 농도를 조정해야 하며 현탁액은 명백한 탁도 없이 깨끗해야 합니다. 떨어 뜨리기 전에 샘플을 잘 혼합해야합니다. 대표적인 TEM 및 NTA 분석은 그림 2에 나와 있습니다.
4. 전기차 원산지 분석
참고: EV의 세포 기원을 식별하려면 일반적인 세포막 마커에 대한 항체를 적용해야 합니다. 아래 절차를 위해 EV를 추출하기 위한 최소 혈장 부피는 300μL입니다. EV의 지질 이중층 구조에 따라 멤브레인 염료를 사용하여 표시할 수 있습니다. 혈장 샘플의 경우, 림프구14 에 대한 CD18이 표현을 위해 선택된다. 상악골 샘플의 경우, 파골세포15 에 대한 파골세포 관련 수용체(OSCAR)가 예로 선택됩니다. FC를 사용하기 전에, 유세포 분석기가EVs 16의 측정에 적합한지, 하한 크기 한계가 별개의 유세포 분석기 간에 크게 다르기 때문에 보장해야 한다.
- 500 μL의 PBS로 샘플을 재현탁(단계 2.4)하고 50 μL를 블랭크 대조군으로 새롭고 깨끗한 1.5 mL 원심분리기 튜브에 옮기고(튜브 A) 또 다른 50 μL를 FITC(튜브 B)를 위한 간단한 염색 튜브로 새롭고 깨끗한 1.5 mL 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 멤브레인 염색을 위해 0.5 μL의 멤브레인 염료를 1차 튜브에 추가합니다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 1차 튜브를 16,800 x g (4°C)에서 30분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 200 μL의 PBS로 펠릿을 재현탁한다.
- 각 50μL 샘플을 PE용 단순 염색 튜브(튜브 C), 표면 마커 염색(튜브 D) 및 2차 항체 전용 대조군(튜브 E)을 위한 4개의 1.5mL 원심분리기 튜브로 나눕니다.
- 뼈 EV 샘플에서 OSCAR의 1차 항체와 혈장 EV 샘플의 CD18 항체( 재료 표 참조)를 튜브 B(단계 4.1) 및 튜브 D(단계 4.3)에 별도로 추가합니다(1:100에서 희석). 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 튜브를 16,800 x g (4°C)에서 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠렛을 500 μL의 PBS로 재현탁한 다음 16,800 x g (4°C)에서 30분 동안 다시 원심분리하여 여분의 1차 항체를 제거했습니다.
- 상청액을 버리고 50 μL의 PBS로 펠릿을 재현탁한 다음, FITC-접합된 2차 항체( 재료 표 참조)를 각각 추가(1:200에서 희석)(튜브 E)합니다. 동일한 2차 항체를 튜브 B(단계 4.1)와 튜브 D(단계 4.3)에 추가합니다. 모든 튜브를 어둠 속에서 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.
참고: 직접 형광 결합 표지 항체는 적절한 동형 제어로 FC 검출을 처리하는 데에도 사용할 수 있습니다. - 0.2, 0.5 및 1μm 크기의 비드( 재료 표 참조) 현탁액 한 방울을 각각 PBS 1mL에 희석하고 각 크기 비드를 먼저 실행하여 EV용으로 선택된 게이트를 확인합니다. 적절한 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC)을 사용하여 비드 및 EV 모집단을 검색하기 위해 유세포 분석기의 임계값을 설정합니다.
- 말단 조건을 멤브레인 염색 입자 100,000개 계산으로 설정합니다. 제조업체의 지침에 따라 유세포 분석기를 통해 샘플을 분석합니다( 재료 표 참조). 대표적인 결과를 도 3에 나타내었다.
참고: 형광 채널이 있는 NTA 장비도 원산지 분석에 사용할 수 있으며 샘플 준비는 FC와 동일합니다.
- 말단 조건을 멤브레인 염색 입자 100,000개 계산으로 설정합니다. 제조업체의 지침에 따라 유세포 분석기를 통해 샘플을 분석합니다( 재료 표 참조). 대표적인 결과를 도 3에 나타내었다.
5. EV의 단백질 함량 분석
참고: EV 내 단백질 함량 분석은 웨스턴 블롯을 통해 수행됩니다. 예를 들어, 대사 상태에 대한 6-포스포글루코네이트 탈수소효소(PGD) 및 피루브산 키나아제 M2(PKM2)를 분석하기 위해 혈장 및 뼈 EV를 선택했습니다. Golgin84(골지 소기관)를 음성 대조군으로 사용하였고, Flotillin(막 단백질), Caveolin(카베올라의 통합 단백질) 및 β-액틴(세포골격)17 을 세포 샘플과 비교하여 EV에서 양성 대조군으로 사용했습니다. 미토필린(Mitofilin)과 α-액티닌-4(Actinin-4)는 큰 EV 마커로 선택되었고, CD9와 CD81은 EV 하위 집단을 입증하기 위해 작은 EV 마커로 선택되었다18. Apoa1은 혈장 지질입자 마커19로 선정되었다. 각 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 펠릿(단계 2.4)을 50μL의 RIPA 용해 완충액에 재현탁하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
- 모든 샘플의 단백질 농도를 정량화amp제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석에 의해 96웰 마이크로플레이트에 있습니다( 재료 표 참조).
- 2mg/mL의 소혈청알부민(BSA)을 0.9%의 생리식염수(NS)(0.9%(w/v)의 염화나트륨 함유)를 0.5mg/mL로 희석합니다. 표 0.5와 같이 0.9mg/mL의 BSA와 0.9%의 NS를 특정 부피의 3개의 복제된 웰에 추가합니다.
- 샘플 2μL을 떨어뜨리고(단계 5.1) NS 18μL를 복제된 3개의 웰에 별도로 추가합니다.
- BCA 시약 A와 시약 B(50:1 시약 A:B)를 혼합하여 작업 용액을 준비합니다. 각 웰에 200 μL의 작업 용액을 넣고 30 초 동안 부드럽게 흔든다.
- 96-웰 마이크로플레이트를 37°C에서 20-25분 동안 인큐베이션한다.
- 분광 광도계로 596 nm에서 OD를 측정합니다 ( 재료 표 참조).
- 데이터를 내보냅니다.
- 표준 곡선을 그리고 샘플의 단백질 농도를 계산합니다.
- 결과에 따라 샘플을 1 μg/μL로 희석하고 0.9%의 NS 및 5x SDS-PAGE 로딩 버퍼(250mM Tris· HCl, pH 6.8, 10% SDS, 30%(v/v) 글리세롤, 10mM DTT, 0.05%(w/v) 브로모페놀 블루, 재료 표 참조). 튜브를 필름으로 단단히 밀봉하고 100°C에서 5분 동안 가열합니다.
- 샘플과 단백질 사다리를 4%-20% Hepes-Tris 겔의 그래디언트 농도로 로드합니다( 재료 표 참조).
참고: 관심 있는 단백질의 분자량에 따라 젤 비율을 선택하십시오. - 단백질이 라인을 형성할 때까지 80V에서 실행 버퍼에서 젤을 실행한 다음 로딩 염료가 젤 바닥에 올 때까지 1시간 동안 120V로 전환합니다.
알림: 실행 시간은 사용된 장비 또는 젤의 유형 및 농도에 따라 다를 수 있습니다. - 겔을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인( 재료 표 참조)으로 옮기고 메틸 알코올에서 20초 동안 사전 배양합니다. 습식 이송 시스템을 사용하여 200mA에서 1시간 동안 이송합니다.
주의 : 이송 시스템 내부에 기포가 없는지 확인하고 PVDF 멤브레인을 젖은 상태로 유지하십시오.
참고: 전달 시간은 표적 단백질의 분자량에 따라 달라질 수 있습니다. 1KD는 일반적으로 1분이 필요합니다. - 50mL 원심분리기 튜브에 50mL의 Tris-buffered saline-Tween(TBST)(PBS 용액 2L에 Tween 2mL를 첨가함)에 2.5g의 BSA( 재료 표 참조)를 추가하여 5% BSA 차단 완충액을 준비합니다. 분말이 녹을 때까지 교반하십시오. 교반과 함께 RT에서 2시간 동안 이 완충액의 멤브레인을 차단합니다.
- TBST로 희석된 특정 1차 항체와 함께 적절한 농도로 멤브레인을 배양합니다(Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; 아포아1, 1:1000; 골긴84, 1:1000; 소 함대 -1, 1 : 1000; 카베올린-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-actin, 1:3000)를 4°C에서 하룻밤 동안 처리하였다.
- 세척 완충액(2L의 PBS 용액에 2mL의 트윈 첨가)에서 멤브레인을 4회(매회 15분) 세척하고, 교반과 함께 RT에서 1시간 동안 1:4000에서 적합한 2차 항체와 함께 멤브레인을 인큐베이션합니다.
- 세척 완충액에서 멤브레인을 4회(매회 15분) 세척하고, 화학발광 키트 및 겔 이미징 시스템을 사용하여 멤브레인을 이미지화합니다( 재료 표 참조).
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Representative Results
실험 워크플로에 따라 EV는 말초 혈액 및 고형 조직에서 추출할 수 있습니다(그림 1). 생후 8주령 마우스의 상악골은 약 0.1 ± 0.05 g이며, 마우스로부터 약 300 μL의 혈장을 채취할 수 있다. 프로토콜 단계에 따라 각각 0.3mg 및 3μg의 EV를 수집할 수 있습니다. TEM과 NTA에 의해 분석된 바와 같이, EV의 전형적인 형태학적 특성은 직경이 50-300nm 범위인 둥근 컵 모양의 막 소포입니다(그림 2). FC는 유용한 대조군 하에서 막 염료 표지 EV를 검출할 수 있으며, FC 분석은 모 세포에서 유래했음을 암시하는 EV에서 발현된 특정 막 마커의 백분율을 보여줍니다(그림 3). 웨스턴 블롯 분석은 혈장 EV와 골 EV의 단백질 함량을 대표하는 PGD와 PKM2의 발현을 각각 보여주며, 대사 상태를 나타냅니다(그림 4). EV에서 Golgin84의 음성 발현은 Mitofilin, α-Actinin-4, Flotillin-1, Caveolin-1 및 β-actin의 존재로 검출되며, 이는 일반적으로 원형질막 유래 대형 EV(미세소포)에서 풍부합니다. 작은 EV 마커 CD9도 검출할 수 있지만 CD81 발현은 낮거나 없으며 혈장 EV에는 Apoa1이 존재하지 않습니다(그림 4).
그림 1: EV를 추출하기 위한 프로토콜의 그림. (A) 차등 원심분리를 통해 말초 혈장 EV를 추출하는 단계. (b) 차등 원심분리를 통해 EVs 조직을 추출하는 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: EV의 형태학적 식별 . (A) EV의 형태를 보여주는 대표적인 투과 전자 현미경(TEM) 이미지. 스케일 바 = 200nm. (B) 대표적인 나노입자 추적 분석(NTA) 이미지 및 정량화 결과는 EV의 크기 분포와 입자 수를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: EV의 원산지 분석. (A) 실험의 다른 컨트롤을 가진 다른 튜브 세트. (B) 1 μm, 0.5 μm, 및 0.2 μm 크기의 비드의 분포를 스캣 그래프에 나타내었다. (C) PBS(튜브 A), EV의 단순 염색(튜브 B), 막 염료의 단순 염색(튜브 C) 및 EV 샘플의 이중 염색(튜브 D)을 보여주는 대표 밀도 그래프. (D) 빨간색의 2차 항체 단독 대조군과 비교하여 빨간색의 혈장 EV에서 CD18 양성 EV의 백분율에 대한 유세포 분석. (E) 뼈 샘플에서 OSCAR 양성 EV의 백분율을 빨간색으로 표시하고 2차 항체 단독 대조군(검은색)과 비교하여 유세포 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: EV의 단백질 함량 분석. (A) 혈장 EV에서 6-포스포글루코네이트 탈수소효소(PGD) 및 미토필린, α-액티닌-4, CD9, 플로틸린-1, 카베올린-1 및 β-액틴의 존재와 CD81, Golgin84 및 Apoa1의 음성 발현을 보여주는 혈장 EV 이미지의 대표적인 웨스턴 블롯. (B) 뼈 EV에서 피루브산 키나아제 M2(PKM2) 및 미토필린, α-액티닌-4, CD9, CD81, 플로틸린-1, 카베올린-1 및 β-액틴의 존재와 Golgin84의 음성 발현을 보여주는 뼈 EV 이미지의 대표적인 웨스턴 블롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 수 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| BSA (마이크로리터) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| NS (μL) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
표 1 : BCA 분석의 표준 작업 용액. 표와 같이 BSA 0.5mg/mL와 NS 0.9%를 3개의 중복 웰에 추가합니다.
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Discussion
EV의 특징, 운명 및 기능을 연구할 때 높은 수율과 낮은 오염으로 EV를 분리하는 것이 중요합니다. 밀도 구배 원심분리(DGC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 면역포획 분석(immunocapture assay)과 같은 EV를 추출하기 위한 다양한 방법이 있습니다 4,20. 여기서 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나 인 차등 원심 분리가 사용되었습니다. 이것의 장점은 시간이 많이 걸리지 않고, 제한된 샘플에서 쉽게 분리할 수 있는 높은 수율의 EV를 생성하고, 사용된 샘플 소스를 기반으로 방법을 수정할 수 있다는 것입니다. 순환하는 EV의 기능을 분석하려면 혈청보다 생체 내 EV의 실제 상태를 더 잘 반영할 수 있는 혈장을 선택하는 것이 좋습니다. 이는 많은 혈소판 유래 EV가 혈청 수집을 위한 혈전 형성 과정 동안 방출되는 반면, 혈소판은 혈장(22)으로부터 EV를 분리하기 전에 원심분리를 통해 제거되기 때문입니다. 플라즈마 EV 분리를 위한 항응고제의 선택은 여전히 논란의 여지가 있다는 점에 유의해야 합니다. 헤파린의 항응고제 메커니즘은 생리학과 더 밀접한 관련이 있습니다. 따라서 분리된 EV는 생체 내 상태를 더 잘 반영할 수 있습니다. 헤파린은 위음성 PCR 판독을 유발하고 세포23,24에 의한 EV 흡수를 차단한다는 점을 언급해야 합니다. EDTA 또는 구연산 나트륨과 같은 다른 항응고 시약도 혈장과 혈소판의 화학적 특성에 영향을 미치는 생물학적 독성을 포함하여 부족합니다. 종합적으로, 위의 정보가 주어지면, 헤파린은 본 연구에서 선택된다. 혈소판을 제거하기 위해, 샘플을 16,800 x g 전에 2,500 x g의 속도로 원심분리하였고, 이는 일부 대형 EV를 제거할 수 있다. 또한 점성 혈장 내의 많은 EV가 혈소판에 부착되어 제거된다는 점을 고려하여 EV의 수율을 향상시키기 위해 원심분리를 통해 혈소판을 제거하기 전에 동일한 부피의 PBS로 혈장을 희석하는 것이 좋습니다. 참고로, 단백질 폴리머21과 같은 가용성 단백질 오염을 제거하기 위해 EV를 정제하기 위해 초원심분리와 함께 자당 구배를 사용하는 것이 좋습니다.
현재까지 EV를 특성화하는 일반적인 방법에는 NTA, TEM, FC16 및 웨스턴 블롯25가 포함됩니다. 또한, 다른 조건(13)에서 복원된 후 EV의 형태 및 수량이 변경되기 때문에 EV를 추출한 후 가능한 한 빨리 검출을 처리하는 것이 좋습니다. 게다가, Görgens et al. 순수한 PBS26보다 더 나은 보존을 위해 인간 알부민과 트레할로스(PBS-HAT)가 보충된 PBS를 사용할 것을 권장했습니다. NTA 및 TEM을 통한 EV의 형태학적 식별은 추출 절차 직후에 수행되어야 하며, 그렇지 않으면 EV의 모양이 변경될 수 있습니다27. 또한, Cryo-EM은 EV의 고급 형태학적 관찰에 사용할 수 있으며,이는 더 높은 분해능으로 형태를 더 잘 보존할 수 있는 이점이 있습니다. NTA 외에, 입자의 농도는 또한 공지된 양의 계수 비드(29)의 도움으로 FC에 의해 정량화될 수 있지만, 이 방법은 매우 안정적이지 않고, 작은 입자에 대한 민감도는 FC에 대해 낮다. 또한 FC30을 사용하여 작은 입자를 떼 감지하기 때문에 크기 결정에 NTA를 사용하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, EV의 기원은 형광 필터를 사용하여 NTA로 분석할 수도 있습니다. FC와 비교하여 NTA는 더 작은 입자에 더 민감하며 다른 실험을 위해 샘플을 재활용할 수 있는 잠재적인 이점이 있습니다. FC 사용의 한 가지 이점은 EV의 특정 서브타입이 형광색소 접합 막 항체로 농축될 수 있다는 것이다28. 또한, 특정 표면 항원의 기능은 중화 항체를 사용하는 것과 같은 기능 상실 실험을 통해 연구될 수 있다28. 대안적으로, 1% 트리톤 X-100은 EVs 막의 지질 뗏목을 파괴하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 막 신호(31)를 검출하기 위한 제어로서 사용될 수 있다. 또한, 연구자들은 표적화된 약물 전달체(32)를 생성하기 위해 특정 막 특성을 사용할 수 있다.
웨스턴 블롯은 EV의 단백질 함량을 분석하는 데 광범위하게 사용됩니다. 미토필린(Mitofilin), 카베올린(caveolin) 및 α-액티닌-4(-Actinin-4)와 같은 여러 마커가 최근 연구에서 대형 EV를 식별하기 위한 후보로 권장되었습니다. CD9는 대형 EV보다는 소형 EV에서 풍부하며, CD81, CD63 및 Syntenin-1은 소형 EV에서 광범위하게 풍부하다18. 웨스턴 블롯의 결과에 관해서는, 미토필린 및 CD9와 같은 마커는 상이한 동물 조건에서 가변적이다. 격리된 EV는 혼합 모집단을 대표하며, 여기서 대형 EV는 하나의 주요 하위 모집단이라고 가정할 수 있습니다. EV의 순도를 검증하기 위해 Lamin B 또는 Golgin84와 같은 세포 소기관/핵 단백질의 검출을 음성 대조군으로 추가하는 것이 좋습니다. 플라즈마 EV의 경우, 우리의 결과에 따르면, 지방 입자를 나타내는 Apoa1은 수집 된 EV에서 풍부하지 않습니다. 이 방법의 한 가지 한계는 표면의 단백질과 소포 내의 단백질을 구별하기 어렵다는 것입니다. 따라서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)는 막 단백질 분석에 보조 실험으로 적용될 수 있습니다. 또한, 고처리량 시퀀싱의 개발로 연구자들은 단백질체 매핑(proteomic mapping)33 을 활용하여 EV의 단백질 조성을 분석할 수 있으며, 표적 단백질도 웨스턴 블롯(western blot)으로 검증할 필요가 있습니다.
요약하면, 이 연구는 세포 공급원 및 단백질 함량 분석을 포함하여 순환계 및 조직 EV를 분리하고 특성화하기 위한 실행 가능한 프로토콜을 제공하여 추가 기능 실험을 위한 기반을 구축하는 데 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32000974, 81870796, 82170988 및 81930025)과 중국 박사후 과학 재단 (2019M663986 및 BX20190380)의 보조금으로 지원되었습니다. AMFU (National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine)의 도움에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
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