Summary
Il presente protocollo descrive un metodo per estrarre vescicole extracellulari dal sangue periferico e dai tessuti solidi con successiva profilazione degli antigeni di superficie e dei carichi proteici.
Abstract
Le vescicole extracellulari circolanti e residenti nei tessuti (EV) rappresentano obiettivi promettenti come nuovi biomarcatori teranostici ed emergono come attori importanti nel mantenimento dell'omeostasi dell'organismo e nella progressione di un ampio spettro di malattie. Mentre la ricerca attuale si concentra sulla caratterizzazione degli esosomi endogeni di origine endosomiale, le microvescicole che sbiancano dalla membrana plasmatica hanno guadagnato crescente attenzione nella salute e nella malattia, che sono caratterizzate da un'abbondanza di molecole superficiali che ricapitolano la firma della membrana delle cellule madri. Qui viene presentata una procedura riproducibile basata sulla centrifugazione differenziale per estrarre e caratterizzare le EV dal plasma e dai tessuti solidi, come l'osso. Il protocollo descrive inoltre la successiva profilazione degli antigeni di superficie e dei carichi proteici delle EV, che sono quindi tracciabili per le loro derivazioni e identificati con componenti correlate alla funzione potenziale. Questo metodo sarà utile per l'analisi correlata, funzionale e meccanicistica delle EV in studi biologici, fisiologici e patologici.
Introduction
Le vescicole extracellulari (EV) sono state proposte per definire strutture extracellulari a doppio strato lipidico rilasciate dalle cellule1, che svolgono ruoli importanti in vari eventi fisiologici e patologici2. Le EV rilasciate da cellule sane possono essere ampiamente suddivise in due categorie principali, vale a dire esosomi (o piccole EV) formati attraverso una via di traffico endocitico intracellulare3 e microvescicole (o grandi EV) sviluppate dal germogliamento verso l'esterno della membrana plasmatica della cellula4. Mentre molti studi si concentrano sulla funzione delle EV raccolte da cellule in coltura in vitro5, le EV derivate dalla circolazione o dai tessuti sono più complesse ed eterogenee, che hanno il vantaggio di riflettere il vero stato dell'organismo in vivo6. Inoltre, quasi tutti i tipi di tessuti possono produrre EV in vivo , e questi EV possono agire come messaggeri all'interno del tessuto o essere trasferiti da vari fluidi corporei, in particolare il sangue periferico, per facilitare la comunicazione sistemica7. Anche i veicoli elettrici nella circolazione e nei tessuti sono bersagli per la diagnosi e il trattamento delle malattie8.
Mentre gli esosomi sono stati intensamente studiati negli ultimi anni, le microvescicole hanno anche importanti funzioni biologiche, che possono essere facilmente estratte senza ultracentrifugazione, promuovendo così la ricerca di base e clinica9. In particolare, un problema critico per quanto riguarda le EV isolate dalla circolazione e dai tessuti è che derivano da diversi tipi di cellule10. Poiché le microvescicole sono eliminate dalla membrana plasmatica e caratterizzate da un'abbondanza di molecole della superficie cellulare9, è possibile utilizzare marcatori della membrana cellulare madre per identificare l'origine cellulare di questi EV. In particolare, la tecnica di citometria a flusso (FC) può essere applicata per rilevare marcatori di membrana. Inoltre, i ricercatori possono isolare i veicoli elettrici e fare ulteriori analisi basate sui carichi funzionali.
Il presente protocollo fornisce una procedura completa per l'estrazione e la caratterizzazione delle EV da campioni in vivo. Gli EV sono isolati tramite centrifugazione differenziale e la caratterizzazione dei veicoli elettrici include l'identificazione morfologica tramite analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM), analisi dell'origine tramite FC e analisi del carico proteico tramite western blot. Il plasma sanguigno e l'osso mascellare dei topi sono usati come rappresentanti. I ricercatori possono fare riferimento a questo protocollo per i veicoli elettrici da altre fonti e apportare le modifiche corrispondenti.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della quarta università medica militare e le linee guida ARRIVE. Per il presente studio, sono stati utilizzati topi C57Bl / 6 di 8 settimane (nessuna preferenza per femmine o maschi). Le fasi coinvolte nell'isolamento delle EV plasmatiche e tissutali sono illustrate nella Figura 1. Il plasma è preso come rappresentante per descrivere la procedura di isolamento EV dai fluidi corporei. L'osso mascellare viene preso come rappresentante per spiegare la procedura di isolamento EV dai tessuti solidi.
1. Preparazione dei campioni di plasma e osso mascellare
- Preparare i campioni di plasma seguendo i passaggi seguenti.
- Determinare il peso corporeo del mouse utilizzando una bilancia da laboratorio standard.
- Aggiungere 20 μL, 2 mg/ml di eparina in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e utilizzare il dispositivo miscelatore (vedere Tabella dei materiali) per lasciare che l'eparina si attacchi alla parete del tubo.
NOTA: I tubi anticoagulanti possono anche essere utilizzati direttamente per raccogliere il sangue. - Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital sodico (vedere Tabella dei materiali). Afferrare il collo del mouse con il pollice e l'indice, quindi fissare la coda e la zampa posteriore sinistra con il mignolo e iniettare il pentobarbital sodico con una siringa per iniezione da 1 mL dopo aver esposto la pancia.
- Confermare che il topo sia correttamente anestetizzato in base all'assenza di riflesso corneale e reazione degli arti quando il poggiapiedi viene pizzicato.
- Rasare i capelli sul viso e le ciglia degli occhi con le forbici curve.
- Afferrare la pelle del collo del topo e premere la pelle intorno agli occhi verso la parte posteriore del collo in modo che il bulbo oculare sporga. Utilizzare una pinzetta oftalmica per bloccare rapidamente il bulbo oculare e raccogliere il deflusso di sangue con le provette da centrifuga da 1,5 ml preparate al punto 1.1.2. Sacrifica il topo dislocando la vertebra cervicale.
ATTENZIONE: Fai attenzione ai peli e alle ciglia perché potrebbero causare emolisi. - Capovolgere delicatamente il tubo più volte per prevenire la coagulazione del sangue.
ATTENZIONE: Capovolgere il tubo il prima possibile. - Centrifugare il campione di sangue per 15 minuti a 1.200 x g a 4 °C.
- Trasferire con cautela il surnatante in provette da centrifuga nuove e pulite da 1,5 ml e utilizzare immediatamente il campione di plasma o conservarlo a 4 °C per alcune ore.
- Diluire il surnatante con un volume uguale di 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e mescolare bene.
NOTA: il protocollo fornito sopra per raccogliere il plasma è fatale. Il sangue può anche essere raccolto attraverso la puntura della vena succlavia11 senza sacrificare il topo.
- Preparare i campioni di osso mascellare seguendo i passaggi seguenti.
- Isolare l'osso mascellare con pinzette oftalmiche e forbici e lavarli con PBS per eliminare i tessuti molli con una pinzetta.
- Mettere l'osso mascellare in provette da centrifuga da 1,5 ml e tagliare l'osso in piccoli pezzi (la dimensione deve essere inferiore a 1 mm di diametro) con le forbici. Aggiungere una certa quantità di Liberase (5 μg/ml, vedere Tabella dei materiali) per coprire il tessuto (di solito 1 mL per campioni ossei di un topo di 8 settimane), quindi incubare per 30 minuti a 37 °C.
- Centrifugare il campione a 800 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Trasferire con cautela il surnatante con una pipetta in provette da centrifuga nuove e pulite da 1,5 ml.
2. Estrazione dei veicoli elettrici
- Centrifugare i campioni (preparati nelle fasi 1.1.10 e 1.2.4) per 15 minuti a 2.500 x g (4 °C) per rimuovere i detriti di grandi cellule e le piastrine rimanenti.
- Trasferire con cautela i surnatanti in provette da centrifuga nuove e pulite da 1,5 ml e centrifugare per 30 minuti a 16.800 x g (4 °C).
NOTA: La velocità di centrifugazione può essere impostata su oltre 10.000 x g per estrarre EV12. Maggiore è la velocità della centrifuga, maggiore è la quantità di veicoli elettrici che può essere ottenuta. Poiché il limite di velocità della centrifuga che abbiamo utilizzato è 16.800 x g (vedi Tabella dei materiali), abbiamo scelto questa velocità in questo protocollo. - Scartare il surnatante e risospendere i pellet in ogni tubo con 1 mL di PBS. Centrifugare per 30 minuti a 16.800 x g (4 °C).
- Scartare il surnatante e risospendere i pellet in ogni tubo con 50 μL di PBS. Conservare questi campioni a 4 °C solo per meno di 24 ore, o preferibilmente utilizzare immediatamente per le seguenti analisi (fasi 3-5).
ATTENZIONE: Lo stoccaggio a -80 °C è inaccettabile, in quanto ciò ridurrebbe la concentrazione di veicoli elettrici e aumenterà le dimensioni delle particelle dei veicoli elettrici13, influenzando così la seguente analisi dei veicoli elettrici.
3. Identificazione morfologica dei veicoli elettrici
- Eseguire l'analisi NTA.
- In base alla quantità di EV (approssimativamente giudicata dalle dimensioni dei pellet, le particelle di plasma da 50 μL sono il minimo), trasferire 5-50 μL di risospensione (fase 2.4), diluire in 10 mL di soluzione tampone (PBS filtrato con filtro da 0,22 μm) e mescolare sufficientemente con 1 mL di punte di micro pipettatore. Utilizzare questa sospensione finale per la misurazione delle particelle.
- Utilizzare una siringa sterile da 1 mL per iniettare almeno 5 mL di acqua distillata con una velocità moderata e costante fino a quando il numero di particelle visualizzate sull'interfaccia di rilevamento è inferiore a cinque.
NOTA: Dopo aver iniettato 1 mL di acqua distillata attraverso l'intero canale, il numero di particelle viene visualizzato direttamente sull'interfaccia di rilevamento. Se il numero è ancora superiore a cinque, continuare a iniettare 1 mL di acqua distillata fino a quando i criteri non sono soddisfatti. - Ricostituire 1 μL di soluzione di taratura in 1 mL di acqua distillata per generare una soluzione primaria, quindi prelevare 100 μL della soluzione primaria in 25 mL di acqua distillata per preparare una soluzione madre standard (1:250.000). Conservare questo reagente di lavoro a 4 °C per 1 settimana.
- Calibrare lo strumento NTA con la soluzione madre standard (punto 3.1.3). Iniettare 1-5 mL della soluzione di calibrazione di lavoro con una siringa sterile da 1 mL per lavare il canale della macchina fino a quando il numero di particelle visualizzate sull'interfaccia di rilevamento è compreso tra 50-400 (preferibilmente circa 300). Eseguire il programma di calibrazione.
- Ripetere il punto 3.1.2 per lavare il canale della macchina prima di ogni misurazione del campione.
- Utilizzare una siringa sterile da 1 mL per iniettare almeno 2 mL di soluzione tampone per lavare il canale della macchina a velocità costante fino a quando il numero di particelle visualizzate sull'interfaccia di rilevamento è inferiore a 10.
- Iniettare 1 mL del campione EV preparato al punto 3.1.1 con una velocità moderata e costante (la velocità consigliata è 0,5-1 mL/s).
NOTA: la concentrazione ottimale di particelle fa sì che il numero di particelle visualizzate sull'interfaccia di rilevamento sia compreso tra 50 e 400, preferibilmente intorno a 300. Se il numero di particelle è troppo elevato, ripetere il punto 3.1.2 per lavare immediatamente il canale della macchina per evitare la ritenzione di particelle sulla parete del canale e regolare la concentrazione del campione EV con il punto 3.1.1, quindi ripetere dal punto 3.1.5. - Condurre l'analisi delle particelle e generare i rapporti di analisi secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Se il campione è prezioso, pompare il campione EV con la siringa da 1 mL e raccoglierli in provette da centrifuga da 1,5 ml. Ripetere il passaggio 2.2 per estrarre i veicoli elettrici.
- Dopo aver rilevato tutti i campioni, iniettare almeno 2 mL di soluzione tampone nel canale della macchina e quindi iniettare almeno 5 mL di acqua distillata fino a quando il numero di particelle visualizzate sull'interfaccia di rilevamento è inferiore a cinque.
- Utilizzare una siringa sterile da 5 mL per iniettare almeno 10 mL di aria a velocità costante (la velocità consigliata è 1 mL/s) per rimuovere l'acqua nel canale.
- Eseguire l'analisi TEM.
NOTA: eseguire i seguenti passaggi con nuove sospensioni EV. La griglia del microscopio elettronico rivestita di carbonio formvar ha due lati, con il lato di lavoro luminoso nelle griglie centrali. Il volume minimo di plasma per estrarre gli EV per la procedura riportata di seguito è di 50 μL.- Mescolare il campione EV (fase 2.4) con un volume uguale di paraformaldeide (PFA) al 4%. Depositare 4 μL di EV su una griglia e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Mettere quattro gocce di PBS (una goccia equivale a 50 μL) su un foglio di pellicola di polietilene (vedi Tabella dei materiali). Trasferire le griglie con pinzette microscopiche pulite e lavare il lato di lavoro della griglia in PBS da una goccia all'altra.
- Utilizzare carta da filtro per rimuovere PBS aggiuntivo rimasto nelle griglie.
- Incubare il lato di lavoro della griglia in acido fosfotungstico all'1% (vedi Tabella dei materiali) per 2 minuti, quindi ripetere il punto 3.2.2.
ATTENZIONE: Poiché l'acido fosfotungstico è velenoso, questa procedura deve essere utilizzata nella cappa aspirante e l'acido fosfotungstico ridondante deve essere specificamente riciclato piuttosto che scartato direttamente. - Mettere le griglie a faccia in su in un piatto da 10 cm coperto con carta da filtro. Le griglie possono essere conservate presso RT per diversi anni.
- Osservare le griglie al microscopio elettronico seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Per garantire il rispetto delle singole particelle, è necessario regolare la concentrazione dei veicoli elettrici e la sospensione deve essere libera senza evidenti torbidità. Prima di cadere, il campione dovrebbe essere ben miscelato. Le analisi rappresentative di TEM e NTA sono mostrate nella Figura 2.
4. Analisi dell'origine dei veicoli elettrici
NOTA: L'identificazione dell'origine cellulare delle EV richiede l'applicazione di anticorpi per i tipici marcatori della membrana cellulare. Il volume plasmatico minimo per estrarre le EV per la procedura riportata di seguito è di 300 μL. Sulla base delle strutture lipidiche a doppio strato delle EV, è possibile utilizzare il colorante di membrana per contrassegnarle. Per i campioni di plasma sanguigno, CD18 per i linfociti14 viene scelto per la rappresentazione. Per i campioni ossei mascellari, viene selezionato come esempio il recettore associato agli osteoclasti (OSCAR) per gli osteoclasti15 . Prima della FC, assicurarsi che il citometro a flusso sia adattato alla misurazione degli EV16, poiché il limite inferiore delle dimensioni è ampiamente diverso tra citometri a flusso distinti.
- Risospendere i campioni (fase 2.4) con 500 μL di PBS e trasferire 50 μL in una nuova e pulita provetta da centrifuga da 1,5 mL come controllo in bianco (tubo A) e altri 50 μL in una nuova e pulita provetta da centrifuga da 1,5 mL come semplice provetta di colorazione per FITC (tubo B). Aggiungere 0,5 μL di colorante di membrana al tubo primario per la colorazione della membrana. Incubare per 5 minuti a RT.
- Centrifugare il tubo primario per 30 minuti a 16.800 x g (4 °C). Scartare il surnatante e risospendere i pellet con 200 μL di PBS.
- Dividere ogni campione da 50 μL in quattro provette da centrifuga da 1,5 mL per semplici tubi di colorazione per PE (tubo C), colorazione con marcatori superficiali (tubo D) e controlli secondari solo anticorpali (tubo E).
- Aggiungere separatamente l'anticorpo primario di OSCAR nei campioni di EV ossea e l'anticorpo CD18 nei campioni di EV plasmatica (vedere Tabella dei materiali) al tubo B (fase 4.1) e al tubo D (punto 4.3) separatamente (diluito a 1:100). Incubare per 1 h a 4 °C.
- Centrifugare le provette per 30 minuti a 16.800 x g (4 °C). Scartare il surnatante, risospendere i pellet con 500 μL di PBS, quindi centrifugare nuovamente per 30 minuti a 16.800 x g (4 °C) per rimuovere gli anticorpi primari extra.
- Scartare il surnatante e risospendere i pellet con 50 μL di PBS, seguiti dall'aggiunta di anticorpi secondari coniugati con FITC (vedi Tabella dei materiali), rispettivamente (diluiti a 1:200) (tubo E). Aggiungere gli stessi anticorpi secondari al tubo B (punto 4.1) e al tubo D (punto 4.3). Incubare tutti i tubi per 1 ora, a 4 °C al buio.
NOTA: Gli anticorpi di etichettatura coniugati a fluorescenza diretta possono anche essere utilizzati per elaborare la rilevazione FC con controlli isotipi appropriati. - Diluire una goccia di sospensione di perline di dimensioni 0,2, 0,5 e 1 μm (vedere la tabella dei materiali) rispettivamente in 1 mL di PBS ed eseguire prima ciascuna perlina di dimensioni per assicurarsi del gate scelto per i veicoli elettrici. Impostare la soglia del citometro a flusso per cercare le perle e la popolazione EV utilizzando un appropriato forward scatter (FSC) e side scatter (SSC).
- Impostare la condizione terminale come calcolo di 100.000 particelle colorate con membrana. Analizzare il campione tramite un citometro a flusso secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 3.
NOTA: le apparecchiature NTA con canali di fluorescenza possono essere utilizzate anche per l'analisi dell'origine e la preparazione del campione è la stessa di FC.
- Impostare la condizione terminale come calcolo di 100.000 particelle colorate con membrana. Analizzare il campione tramite un citometro a flusso secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 3.
5. Analisi del contenuto proteico delle EV
NOTA: L'analisi del contenuto proteico all'interno delle EV viene eseguita tramite western blot. Ad esempio, le EV plasmatiche e ossee sono state selezionate per analizzare la 6-fosfogluconato deidrogenasi (PGD) e la piruvato chinasi M2 (PKM2) per lo stato metabolico. Golgin84 (l'organello del Golgi) è stato usato come controllo negativo e Flotillin (proteina di membrana), Caveolina (proteina integrale delle caveole) e β-actina (il citoscheletro)17 sono stati usati come controllo positivo nelle EV rispetto ai campioni cellulari. Mitofilin e α-Actinin-4 sono stati scelti come marcatori EV di grandi dimensioni, mentre CD9 e CD81 sono stati scelti come marcatori EV piccoli per dimostrare le sottopopolazioni EV18. Apoa1 è stato selezionato come marcatore di lipoparticle plasmatico19. Per i rispettivi dettagli sul reagente, vedere la Tabella dei materiali.
- Risospendere i pellet (fase 2.4) in 50 μL di tampone di lisi RIPA e incubare per 30 minuti su ghiaccio.
- Quantificare le concentrazioni proteiche di tutti i campioni nella micropiastra a 96 pozzetti mediante il saggio della proteina BCA seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
- Diluire i 2 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA) con lo 0,9% di soluzione salina normale (NS) (contenente 0,9% (p/v) di cloruro di sodio) in 0,5 mg/ml. Aggiungere 0,5 mg/ml di BSA e 0,9% di NS in tre pozzetti duplicati con determinati volumi, come mostrato nella Tabella 1.
- Eliminare 2 μL dei campioni (fase 5.1) e aggiungere 18 μL di NS in tre pozzetti duplicati separatamente.
- Preparare una soluzione di lavoro mescolando il reagente BCA A con il reagente B (50:1 Reagente A:B). Aggiungere 200 μL della soluzione di lavoro a ciascun pozzetto e agitare delicatamente per 30 s.
- Incubare la micropiastra a 96 pozzetti per 20-25 minuti a 37 °C.
- Misurare l'OD a 596 nm con lo spettrofotometro (vedere Tabella dei materiali).
- Esportare i dati.
- Disegna una curva standard e calcola la concentrazione proteica dei campioni.
- In base ai risultati, diluire i campioni a 1 μg/μL con lo 0,9% di NS e 5x SDS-PAGE buffer di caricamento (250 mM Tris· HCl, pH 6,8, 10% SDS, 30% (v/v) glicerolo, 10 mM DTT, 0,05% (p/v) blu di bromofenolo, vedi tabella dei materiali). Sigillare ermeticamente i tubi con la pellicola e riscaldare per 5 minuti a 100 °C.
- Caricare i campioni e la scala proteica in una concentrazione gradiente del 4%-20% Hepes-Tris gel (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Scegliere la percentuale di gel in base al peso molecolare delle proteine di interesse. - Eseguire il gel nel tampone corrente a 80 V fino a quando le proteine formano una linea, quindi passare a 120 V per 1 ora fino a quando il colorante di carico è sul fondo del gel.
NOTA: Il tempo di funzionamento può variare a seconda dell'apparecchiatura utilizzata o del tipo e della concentrazione del gel. - Trasferire il gel sulla membrana del fluoruro di polivinilidene (PVDF) (vedi Tabella dei materiali), pre-incubato in alcool metilico per 20 s. Utilizzare un sistema di trasferimento a umido per trasferire per 1 ora a 200 mA.
ATTENZIONE: Assicurarsi che non vi sia alcuna bolla all'interno del sistema di trasferimento e mantenere umida la membrana PVDF.
NOTA: Il tempo di trasferimento può variare in base al peso molecolare della proteina bersaglio; 1 KD di solito richiede 1 min. - Preparare un tampone bloccante BSA al 5% aggiungendo 2,5 g di BSA (vedere la tabella dei materiali) in 50 mL di interpolazione salina tamponata Tris (TBST) (2 mL di Tween aggiunto in 2 L di soluzione PBS) in una provetta da centrifuga da 50 ml. Agitare fino a quando la polvere è sciolta. Bloccare le membrane in questo tampone per 2 ore a RT con agitazione.
- Incubare le membrane con anticorpi primari specifici diluiti con TBST in concentrazione adeguata (Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flottiglia-1, 1:1000; Caveolina-1, 1:1000; PGD, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-actina, 1:3000) durante la notte a 4 °C.
- Lavare le membrane nel tampone di lavaggio (2 mL di Tween aggiunti in 2 L di soluzione PBS) quattro volte (15 minuti ogni volta) e incubare le membrane con gli anticorpi secondari adatti a 1:4000 per 1 h a RT con agitazione.
- Lavare le membrane nel tampone di lavaggio quattro volte (15 minuti ogni volta) e visualizzare le membrane utilizzando il kit di chemiluminescenza e un sistema di imaging in gel (vedere la tabella dei materiali).
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Representative Results
Secondo il flusso di lavoro sperimentale, le EV possono essere estratte dal sangue periferico e dai tessuti solidi (Figura 1). L'osso mascellare di un topo di 8 settimane è di circa 0,1 ± 0,05 g e circa 300 μL di plasma possono essere raccolti dal topo. Seguendo le fasi del protocollo, è possibile raccogliere rispettivamente 0,3 mg e 3 μg di EV. Come analizzato da TEM e NTA, le caratteristiche morfologiche tipiche delle EV sono vescicole rotonde a membrana a forma di coppa con un diametro compreso tra 50 e 300 nm (Figura 2). FC può rilevare gli EV marcati con colorante a membrana sotto controlli utili e l'analisi FC mostra le percentuali di specifici marcatori di membrana espressi sugli EV che implicano la loro origine dalle cellule madri (Figura 3). L'analisi Western blot mostra l'espressione di PGD e PKM2, rispettivamente, come rappresentativo del contenuto proteico nelle EV plasmatiche e nelle EV ossee, indicando lo stato metabolico (Figura 4). L'espressione negativa di Golgin84 nelle EV è stata rilevata anche con la presenza di Mitofilina, α-Actinin-4, Flotillin-1, Caveolin-1 e β-actina, che è comunemente arricchita in grandi EV derivate dalla membrana plasmatica (microvescicole). Il piccolo marcatore EV CD9 può anche essere rilevato, mentre l'espressione di CD81 è bassa o assente, con una mancanza di Apoa1 esistente nelle EV plasmatiche (Figura 4).
Figura 1: Illustrazione del protocollo per estrarre le EV. (A) Le fasi per estrarre le EV del plasma sanguigno periferico con centrifugazione differenziale. (B) Le fasi per estrarre i veicoli elettrici tissutali con centrifugazione differenziale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Identificazione morfologica dei veicoli elettrici. (A) Immagine rappresentativa del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) che mostra la morfologia dei veicoli elettrici. Barra di scala = 200 nm. (B) Le immagini rappresentative dell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e i risultati della quantificazione mostrano la distribuzione dimensionale e il numero di particelle dei veicoli elettrici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Analisi dell'origine dei veicoli elettrici . (A) I diversi insiemi di tubi con diversi controlli dell'esperimento. (B) La distribuzione delle perle di dimensioni 1 μm, 0,5 μm e 0,2 μm mostrata nel grafico a scatted. (C) Grafici di densità rappresentativi che mostrano PBS (tubo A), la colorazione semplice dei veicoli elettrici (tubo B), la colorazione semplice del colorante a membrana (tubo C) e la doppia colorazione dei campioni di EV (tubo D). (D) Analisi citometrica a flusso della percentuale di EV CD18 positive nelle EV del plasma sanguigno in rosso rispetto al controllo degli anticorpi secondari solo in nero. (E) Analisi citometrica a flusso della percentuale di EV OSCAR positive da campioni ossei in rosso rispetto al controllo anticorpale secondario solo in nero. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi del contenuto proteico delle EV. (A) Immagini rappresentative di EV plasmatiche che mostrano la presenza di 6-fosfogluconato deidrogenasi (PGD) e mitofilina, α-actinina-4, CD9, flottiglia-1, caveolina-1 e β-actina nelle EV plasmatiche e l'espressione negativa di CD81, Golgin84 e Apoa1. (B) Immagini rappresentative di EV western blot of bone che mostrano la presenza di piruvato chinasi M2 (PKM2) e Mitofilin, α-Actinin-4, CD9, CD81, Flotillin-1, Caveolin-1 e β-actina nelle EV ossee e l'espressione negativa di Golgin84. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Numero | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| BSA (μL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| NS (μL) | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |
Tabella 1: Soluzione di lavoro standard del saggio BCA. Aggiungere 0,5 mg/ml di BSA e 0,9% di NS in tre pozzetti duplicati, come mostrato nella tabella.
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Discussion
Quando si studiano le caratteristiche, il destino e la funzione dei veicoli elettrici, è fondamentale isolare i veicoli elettrici con alta resa e bassa contaminazione. Esistono vari metodi per estrarre EV, come la centrifugazione a gradiente di densità (DGC), la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e i saggi di immunocattura 4,20. Qui è stato utilizzato uno dei metodi più comunemente usati, la centrifugazione differenziale; i vantaggi di questo sono che non richiede tempo, genera un alto rendimento di EV con facile isolamento da campioni limitati e la possibilità di modificare il metodo in base alla fonte di campionamento utilizzata. Per analizzare la funzione delle EV circolanti, è meglio scegliere il plasma sanguigno, che può riflettere meglio lo stato reale delle EV in vivo, piuttosto che il siero. Questo perché molte EV derivate dalle piastrine saranno rilasciate durante il processo di formazione del coagulo per la raccolta del siero21, mentre le piastrine vengono rimosse tramite centrifugazione prima dell'isolamento delle EV dal plasma22. Va notato che la scelta dell'anticoagulazione per l'isolamento plasmatico EV è ancora controversa. Il meccanismo anticoagulante dell'eparina è più strettamente correlato alla fisiologia; i veicoli elettrici isolati potrebbero quindi riflettere maggiormente lo stato in vivo. Va detto che l'eparina causerà letture PCR false negative e bloccherà l'assorbimento di EV da parte delle cellule23,24. Anche altri reagenti anticoagulanti, come l'EDTA o il citrato di sodio, hanno le loro carenze, compresa la biotossicità, che influenzano le proprietà chimiche del plasma e delle piastrine. Collettivamente, date le informazioni di cui sopra, l'eparina è selezionata in questo studio. Per rimuovere le piastrine, i campioni sono stati centrifugati alla velocità di 2.500 x g prima di 16.800 x g, che potrebbe rimuovere alcuni EV di grandi dimensioni. Inoltre, considerando che molti EV all'interno del plasma viscoso si attaccano alle piastrine e vengono rimossi, si suggerisce di diluire il plasma con un volume uguale di PBS prima di rimuovere le piastrine attraverso la centrifugazione per migliorare la resa delle EV. Da notare, è meglio usare un gradiente di saccarosio con ultracentrifugazione per purificare gli EV per rimuovere le contaminazioni proteiche solubili, come i polimeri proteici21.
Ad oggi, i metodi comuni per caratterizzare i veicoli elettrici includono NTA, TEM, FC16 e western blot, tra gli altri25. Inoltre, a causa dell'alterazione della morfologia e della quantità di EV dopo essere stati ripristinati in diverse condizioni13, suggeriamo di elaborare il rilevamento il prima possibile dopo l'estrazione dei EV. Inoltre, Görgens et al. hanno raccomandato di utilizzare PBS integrato con albumina umana e trealosio (PBS-HAT) per una migliore conservazione rispetto al PBS26 puro. L'identificazione morfologica dei veicoli elettrici tramite NTA e TEM deve essere eseguita immediatamente dopo la procedura di estrazione, altrimenti la forma dei veicoli elettrici potrebbe cambiare27. Inoltre, Cryo-EM può essere utilizzato28 per l'osservazione morfologica avanzata delle EV, che ha il vantaggio di preservare meglio la forma con una risoluzione più elevata. Oltre a NTA, la concentrazione di particelle può anche essere quantificata da FC con l'aiuto di una quantità nota di perline di conteggio29, ma questo metodo non è molto stabile e la sensibilità alle piccole particelle è bassa per FC. Inoltre, a causa del rilevamento di sciami di piccole particelle con FC30, è meglio utilizzare NTA per la determinazione delle dimensioni. Allo stesso modo, l'origine delle EV può anche essere analizzata da NTA con filtri a fluorescenza. Rispetto alla FC, NTA è più sensibile alle particelle più piccole e ha il potenziale vantaggio di riciclare il campione per altri esperimenti. Un vantaggio dell'uso di FC è che i sottotipi specifici di EV possono essere arricchiti con anticorpi di membrana coniugati al fluorocromo28. Inoltre, la funzione di specifici antigeni di superficie può essere studiata attraverso esperimenti di perdita di funzione, come l'uso di anticorpi neutralizzanti28. In alternativa, l'1% di Triton X-100 può essere utilizzato per distruggere la zattera lipidica della membrana EV, quindi come controllo per rilevare i segnali di membrana31. Inoltre, i ricercatori possono utilizzare le caratteristiche specifiche della membrana per creare vettori di farmaci mirati32.
Western blot è ampiamente utilizzato per analizzare il contenuto proteico nelle EV. Diversi marcatori come Mitofilin, caveolina e α-Actinin-418 sono stati raccomandati come candidati per identificare grandi EV in studi recenti; CD9 è arricchito in piccoli EV piuttosto che in grandi EV, e CD81, CD63 e Syntenin-1 sono ampiamente abbondanti in piccoli EV18. Per quanto riguarda i risultati del Western blot, marcatori come Mitofilin e CD9 sono variabili in diverse condizioni animali. Si può presumere che i veicoli elettrici isolati rappresentino una popolazione mista, in cui i grandi veicoli elettrici sono una sottopopolazione principale. Per verificare la purezza delle EV, si suggerisce di aggiungere come controllo negativo la rilevazione di organelli/proteine nucleari, come Lamin B o Golgin84. Per quanto riguarda le EV plasmatiche, secondo i nostri risultati, l'Apoa1 che rappresenta le lipoparticelle non è arricchito nelle EV raccolte. Una limitazione di questo metodo è che è difficile distinguere le proteine sulla superficie da quelle all'interno della vescicola. Pertanto, il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) può essere applicato per l'analisi delle proteine di membrana come esperimenti supplementari. Inoltre, con lo sviluppo del sequenziamento ad alto rendimento, i ricercatori possono sfruttare la mappatura proteomica33 per analizzare la composizione proteica delle EV, con le proteine bersaglio che devono anche essere verificate dal western blot.
In sintesi, questo studio fornisce un protocollo fattibile per isolare e caratterizzare le EV circolatorie e tissutali, compresa un'analisi delle loro fonti cellulari e del contenuto proteico, che aiuta a stabilire una base per ulteriori esperimenti funzionali.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 e 81930025) e della China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 e BX20190380). Siamo grati per l'assistenza del National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
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