Summary
ננו-צינוריות מנהור (TNTs) הן בעיקר ננו-צינוריות ממברנת F-actin פתוחות המחברות בין תאים שכנים, ומקלות על תקשורת בין-תאית. המאפיין הבולט המבדיל בין TNTs לבין בליטות תאים אחרות הוא האופי המרחף של הננו-צינוריות בין התאים. כאן, אנו מאפיינים TNTs על ידי בניית תצוגת נפח תלת-ממדית של תמונות z-stack קונפוקליות.
Abstract
תגליות אחרונות גילו כי תאים מבצעים העברה בין-תאית ישירה, ארוכת טווח, באמצעות צינורות אקטין-ממברנה בקנה מידה ננומטרי, כלומר "מנהור ננו-צינוריות" (TNTs). TNTs מוגדרים כהרחבות ממברנה דו-שכבתיות פתוחות ומקיפות שומנים, המתווכות המשכיות בין תאים שכנים בקטרים הנעים בין 50 ננומטר ל-1 מיקרומטר. TNTs הודגמו בתחילה בתאי עצב, אך מחקרים עוקבים חשפו את קיומם של TNTs במספר סוגי תאים ומחלות, כגון מחלות נוירודגנרטיביות, זיהומים ויראליים וסרטן. מספר מחקרים התייחסו לננו-מבנים של ממברנות מצומדות חשמלית בין תאים שכנים כאל מבנים דמויי TNT או TNT.
ההבהרה של אולטרה-מבנה במונחים של המשכיות הממברנה בנקודת הקצה היא מאתגרת מבחינה טכנית. בנוסף, מחקרים על תקשורת בין תאים מאתגרים מבחינת אפיון TNTs בשיטות קונבנציונליות בשל היעדר סמנים ספציפיים. TNTs מוגדרים בעיקר כבליטות ממברנה פתוחות מבוססות F-actin. עם זאת, מגבלה מרכזית אחת היא ש-F-אקטין קיים בכל סוגי הבליטות, מה שמקשה על הבחנה בין TNTs לבליטות אחרות. אחד המאפיינים הבולטים של TNTs מבוססי F-actin הוא שמבנים אלה מרחפים בין שני תאים מבלי לגעת בתת-הסטרטום. לכן, ניתן להבחין בנוחות בין TNTs מוכתמים ב-F-actin לבין בליטות אחרות כגון פילופודיה ונויריטים בהתבסס על ריחופין בין תאים.
לאחרונה הראינו כי הפנמה של עמילואיד-β אוליגומרי 1-42 (oAβ) באמצעות אנדוציטוזה תלוית אקטין מעוררת קינאז-1 מופעל p21 (PAK1), אשר מתווך את היווצרותם של TNTs המכילים F-אקטין יחד עם phospho-PAK1 בין תאי עצבSH-SY5Y. פרוטוקול זה מתווה שיטת ניתוח נפח תלת-ממדית לזיהוי ואפיון TNTs מתמונות z-stack שנלכדו של בליטות ממברנה מוכתמות ב-F-actin ו-phospho-PAK1-immunostained בתאי עצב שטופלו ב-oAβ. יתר על כן, TNTs נבדלים מפיתוח נויריטים וצמיחה עצבית המבוססת על צינורות ממברנה עם F-אקטין ו-β-III טובולין-אימונוסטי.
Introduction
ננו-צינוריות מנהור (TNTs) הן צינורות ממברנה פתוחים מבוססי F-actin, וממלאים תפקיד חיוני בהעברה בין-תאית של מטען ואברונים1. המאפיין הייחודי של TNTs הוא שהם מחברים תאים שכנים ללא כל מגע עם הסובסטרטום; אורכם מעל 10-300 מיקרומטר וקוטרם נע בין 50 ננומטר ל-1 מיקרומטר 2,3. TNTs הם מבנים חולפים, ואורך חייהם נמשך בין מספר דקות למספר שעות. TNTs הודגמו לראשונה בתאי עצב PC121; מאוחר יותר, מחקרים רבים הראו את קיומם במספר סוגי תאים במבחנה וב- in vivo 4,5. מספר מחקרים חשפו את המשמעות הפתולוגית של TNTs במודלים שונים של מחלות, כגון מחלות נוירודגנרטיביות, סרטן וזיהומים נגיפיים 6,7,8.
ההטרוגניות המבנית של TNTs הודגמה על ידי מספר מחקרים במערכות תאיות שונות9. ההבדלים מבוססים על הרכב השלד, מנגנון היווצרותו וסוגי המטעניםשהועברו 10. בראש ובראשונה, המשכיות הממברנה הפתוחה, החיובית ל-F-actin, המרחפת בין שני תאים שכנים ומעבירה אברונים, נחשבת למורכבת מ-TNTs11. עם זאת, חוסר הבהירות או המגוון שנצפה בהיווצרות TNTs מוסיף לקושי בפיתוח סמנים ספציפיים ל- TNT. לפיכך, קשה לזהות מבני TNT בשיטות גילוי קונבנציונליות ולהבחין בננו-צינוריות ממברנה במונחים של בליטות פתוחות וסגורות12. עם זאת, המאפיין של TNTs לרחף כמו בליטות ממברנת F-actin בין שני תאים הוא יחסית קל יותר וניתן יותר לזיהוי באמצעות טכניקות הדמיה קונבנציונליות. בליטות תאיות אחרות המבוססות על אקטין, כגון פילופודיה ופילופודיה גבית, אינן יכולות לרחף בין שני תאים מרוחקים, במיוחד כאשר התאים מקובעים. יש לציין כי נויריטים קרובים, מצומדים חשמלית ומתפתחים מכונים לעתים קרובות מבנים דמויי TNT13.
ידוע כי F-אקטין ממלא תפקיד חשוב בהיווצרות TNT, ומספר מחקרים הראו כי מעכב F-אקטין ציטוכלזין D מעכב את היווצרותם של TNTs14,15. לעומת זאת, למעכבי מיקרוטובולים אין כל השפעה על היווצרות TNT16. בשני העשורים האחרונים ראינו מספר דיווחים על התפקיד המשמעותי ש- TNTs ממלאים בהתפשטות הפתולוגיה והעמידות לגידולים וטיפול17. לכן, יש דרישה בלתי נגמרת לטכניקות טובות יותר לאפיון TNT.
היעדר סמנים ספציפיים של TNTs והגיוון במורפולוגיה ובהרכב הציטוסקטלי מקשים על פיתוח שיטת אפיון ייחודית. מחקרים מסוימים השתמשו בזיהוי תמונה אוטומטי ובטכניקות כימות TNT18,19. עם זאת, ישנם מספר יתרונות של שיטת הניתוח הידנית הנוכחית בנפח תלת-ממדי על פני ניתוח תמונה אוטומטי לזיהוי וכימות של TNTs. לעתים קרובות, עיניים אנושיות מאומנות יכולות לזהות את הננו-מבנים המרחפים האלה בקלות רבה יותר מאשר שיטת זיהוי תמונה אוטומטית. יתר על כן, שיטות זיהוי אוטומטיות עשויות להיות קשות ליישום במעבדות חסרות מומחיות באלגוריתם. השיטה הנוכחית יכולה להיות מאומצת באופן נרחב על ידי חוקרים בשל הדיוק והשכפול שלה.
במחקר שנערך לאחרונה, הראינו כי oAβ מקדם את הביוגנזה של TNTs בתאי עצב באמצעות מנגנון אנדוציטוזה בתיווך PAK1, תלוי אקטין,12. TNTs הנגרמים על-ידי oAβ מבטאים גם PAK1 מופעל (או phospho-PAK1). פיתחנו שיטת שחזור תמונה בתצוגת נפח תלת-ממדית כדי להבחין בין TNTs המושרים על-ידי oAβ, F-actin- ו-phospho-PAK1-immunostained. β-III טובולין חיובי, נוירויטים מתפתחים לעתים קרובות דומים למבנים מרחפים דמויי TNT20. לפיכך, הבחנו עוד יותר בין TNTs מבוססי F-actin לבין נויריטים חיוביים לטובולין β-III ובליטות דמויות TNT אחרות. תמונות תצוגת נפח תלת-ממדיות שימשו לזיהוי TNTs על בסיס המאפיינים שלהם של ריחוף מעל המצע ושמירה על קשר בין שני תאים שכנים. מאמר זה מתאר זיהוי וזיהוי של צינורות ממברנה המכילים אקטין או TNTs באמצעות תמונות z-stack קונפוקליות, ולבסוף, כימות ידני של המבנים שזוהו מתמונות שחזור של תצוגת נפח תלת-ממדית. השיטה המוצגת אינה יכולה להבחין בין TNTs פתוחים תקינים לבין מבנים דמויי TNT קרובים; שיטה זו מסייעת לזהות TNTs בתרבית תאים דו-ממדית במבחנה על מצע שטוח. עם זאת, השיטה קלה ליישום ולהתרבות וניתן להשתמש בה באופן נרחב לכימות מדויק של TNTs מבוססי אקטין בלבד ולהבדילם מנויריטים ומבנים דמויי TNT חיוביים β-טובולין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: תאי SH-SY5Y שגודלו בתרבית במדיית DMEM/F-12 התמינו בחומצה רטינואית של 10 μM במשך 7 ימים וטופלו באוליגומרים של 1 μM oAβ במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (5% CO2). לאחר הטיפול, התאים תוקנו עם התמיסה המקובעת של קרנובסקי והוכתמו פעמיים בנוגדן פוספו-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) ופלואידין קושר F-אקטין. מאוחר יותר, תמונות z-stack קונפוקליות צולמו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. ה-TNTs כומתו על-ידי ספירה ידנית והובלטו בין נוריטים/בליטות תאים אחרות על-ידי בניית תמונות של תצוגת נפח תלת-ממדית וזיהוי המבנים מהמאפיין שלהם של ריחוף בין שני תאים מבלי לגעת בסובסטרטום (איור 1).
1. תרבית תאים והתמיינות
- תרבית את תאי העצב SH-SY5Y במדיה DMEM/F12 (Ham's) ביחס של 1:1 עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% תערובת פניצילין-סטרפטומיצין-נאומיצין (PSN). זרעו את התאים בצלחת הדמיה בקוטר 35 מ"מ עם באר של 14 מ"מ המורכבת מכיסוי #1.5 במרכז המנה המחוברת לתחתית. זרעו את התאים על צלחת ההדמיה בריכוז של 12,000 תאים לס"מ2 ובצעו את הניסויים בטמפרטורה של 60%-70%.
- התמיינות חלקית של התאים באמצעות חומצה רטינואית (RA) של 10 μM מתמיסת מלאי של 100 mM (5 מ"ג של RA ב-15 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד [DMSO]). לאחר מכן, דגירה של התאים במשך 7 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (5% CO2) להתמיינות עם שינוי מדיה כל יומיים.
הערה: היזהר לגבי שמירה על המפגש (60%-70%) של התאים (הן תאים לא מובחנים והן תאים ממוינים חלקית). צפיפות התאים יכולה להשפיע על היווצרות TNTs בין התאים.
2. הכנת אוליגומרים של עמילואיד-β1-42 (oAβ) לטיפול בתאים עצביים
- ממיסים את Aβ 1-42 (1 מ"ג) ב-200 μL של 1,1,1,3,3,3-הקספלואורו-2-פרופנול ומחלקים את התמיסה ל-20 אליקוטים, שכל אחד מהם מכיל 0.05 מ"ג פפטידים. ליופיליזציה ואחסון האליקוטים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
- הכן את תמיסת המלאי (5 mM) של Aβ 1-42 הליופילית ב- DMSO על ידי הוספת 2.2 μL של DMSO ל- 0.05 מ"ג של פפטיד lyophilized. כדי להמיס בזהירות את הפפטידים, מערבבים את התמיסה וסוניקטיים במשך 2 דקות בסוניק אמבט מים.
- לדלל את תמיסת המלאי לריכוז של 100 μM ב-DMEM, pH 7.4 ומערבולת כדי להמיר את הפפטידים למונומרים, ולאחר מכן דגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להשיג אוליגומרים של Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22.
- אפיון oAβ לפני הניסויים כפי שדווח בעבר21,22 על ידי הדמיית מיקרוסקופיית אלקטרונים.
- טפל בתאי SH-SY5Y הממוינים חלקית באמצעות 1 μM oAβ. הסר את המדיום לפני הטיפולים, והוסף DMEM טרי ללא FBS. לאחר שינוי המדיום, הוסף oAβ (100 μM) שהוכן קודם לכן למדיום לריכוז סופי של 1 μM. דגירה על התאים עם 1 μM oAβ במשך 2 שעות ב 37 °C (5% CO2). כלול שליטה שלילית בצורה של תאים לא מטופלים.
3. חיסון של F-אקטין ומופעל-PAK1 לאפיון TNTs
- בצע אימונוסטינינג דיפרנציאלי באמצעות נוגדן phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) ופלוטוקסין פאלוידין קושר F-אקטין.
- שטפו את תאי הביקורת והתאים שטופלו ב-oAβ עם תמיסת מלח (PBS) אחת עם אגירת פוספט למשך 2 x 2 דקות לפני הקיבוע. הכן את התמיסה המקובעת של קרנובסקי באמצעות 2% פורמלין מקובע ו-2.5% גלוטרלדהיד מומס במאגר פוספט 0.1 M, pH 7.2. לאחר מכן, תקן את התאים בצלחת ההדמיה על ידי הוספת התמיסה המקובעת של קרנובסקי (מספיק כדי לכסות את התאים) למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את התאים הקבועים 2 x 2 דקות באמצעות מאגר הדגירה. הכינו את מאגר הדגירה (20x) על ידי המסת 0.1 גרם של סאפונין ב-5 מ"ל של FBS ודללו ל-1x על ידי הוספת 95 מ"ל של PBS אחד.
- לאחר הקיבוע, מוסיפים את הנוגדן הראשון נגד phopho-PAK1 בדילול של 1:250 במאגר הדגירה ודוגרים לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתא לח כהה.
- למחרת, לאחר 24 שעות של דגירה, לשטוף את התאים 2 x 2 דקות עם מאגר הדגירה; לאחר מכן, הוסף נוגדן משני המצומד לאלקסה פלואור 488 (דילול 1:1,000) ופאלוידין 555 (דילול 1:1,000). לדגור על התאים בתא הלח החשוך למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר.
- לאחר הדגירה, לשטוף את התאים 2 x 2 דקות עם מאגר הדגירה. הכתימו את הגרעין על ידי הוספת 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בדילול של 1:2,000 ודגרה למשך 5 דקות עד 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- הכן את מדיום ההרכבה של DABCO באמצעות 25 מ"ג של DABCO ב-90% גליצרול ו-10% PBS אחד. כדי להתמוסס כראוי, התאם את ה- pH ל- 8.6 באמצעות כיתה ספקטרופוטומטרית, דילל HCl (מדולל 1:20 עם מים) ושמור את התמיסה על נדנדה לערבוב.
- כחומר נגד הלבנה, הוסיפו את מדיום ההרכבה של DABCO ישירות על צלחת ההדמיה המכילה את הכיסוי בתחתית. המתן לפחות 1-2 שעות והמשך ישירות לביצוע הדמיה קונפוקלית.
הערה: אין צורך בדבקים כדי לתקן את הכיסויים.
4. אימונוסטינינג של F-אקטין וטובולין β-III כדי להבחין בין TNTs לנוירויטים
- בצע אימונוסטינינג דיפרנציאלי עם נוגדן טובולין β-III ופלוטוקסין פלוידין קושר F-אקטין.
- יש לשטוף את התאים המטופלים ב-oAβ פי 2 עם PBS אחד לפני הוספת הפתרון המקבע של קרנובסקי. לדגור את התאים במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף את התאים 2 x 2 דקות עם חיץ הדגירה.
- לאחר הקיבוע, מוסיפים את הנוגדן כנגד טובולין β-III (TUBb3) בדילול של 1:250 במאגר הדגירה ודוגרים ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא הלח החשוך.
- למחרת, שטפו את התאים עם חיץ הדגירה (2 x 2 דקות), והוסיפו נוגדן משני מצומד לאלקסה פלואור 488 (דילול 1:1,000) ופאלוידין 555 (דילול 1:1,000) יחד לאותה מנה. לאחר מכן, דגרו את התאים למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר בתא הלח והחשוך.
- שטפו את התאים פי 2 עם מאגר הדגירה, והוסיפו DAPI מכתים גרעינית בדילול של 1:2,000 למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- יש להוסיף חומר מונע הלבנה DABCO במדיום הרכבה כאמור לעיל ולהמתין שעתיים לפני ההדמיה.
5. הדמיה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית
- כדי לזהות TNTs, צלם תמונות z-stack של תאים מדוכאי חיסון באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. צלם את התמונות באמצעות המטרה 40x/1.40 Oil DIC עם DAPI, איזותיוציאנט פלואורסצין (FITC) וטטרה-מתילרודמין (TRITC).
- ראשית, בחר את הערוצים על ידי לחיצה על הלייזרים הנדרשים ברצף בחלונות מסלול 1, מסלול 2 ומסלול 3 בתוכנת הקונפוקל. לחץ על האפשרות T-PMT מתחת לחלון Track 1 כדי לצלם את תמונות ניגודיות ההפרעה הדיפרנציאלית (DIC) עם ערוצי פלואורסצנציה.
הערה: תמונות DIC נלכדות על ידי גלאי אחר שכותרתו T-PMT. - בחר את כרטיסיית הרכישה של התוכנה, לחץ על הכרטיסייה Z-stack והמתן לפתיחת חלון. לאחר מכן, לחץ על סריקה חיה כדי למקד את התאים בתחתית המנה. בחרו בתמונה ממוקדת זו כאוסף התמונות הראשון. לאחר מכן, התמקד למעלה כדי לראות את החלק העליון ביותר של התא ובחר אותו כערימה האחרונה. הפסק את הסריקה החיה ולחץ על המספר שליד הכרטיסייה האופטימלית כדי לתקן את גודל הצעד של הערימות. גודל הצעד קובע את מספר הפרוסות ואת המרווחים בהתבסס על עובי התאים.
הערה: גודל הצעד ייבחר על סמך דגימת Nyquist כדי לקחת מספיק פרוסות ולוודא שאין רווחים בין שתי הערימות. דגימת ניקוויסט נקבעת על בסיס המטרה ואורכי הגל של האורות23. - צלם תמונות עוקבות של שלושה ערוצים של DAPI, FITC ו- TRITC עם לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו- 561 ננומטר ולכוד עם זמן שהייה של פיקסלים של 1.02 μs. צלם תמונות בערוץ DIC עם ערוצים פלואורסצנטיים כדי לבחון את גבול התא.
- צלם ערימה של תמונות במידות x: 224.92 μm ו- y: 224.92 μm, כאשר כל פיקסל בגודל 220 ננומטר 2 וקנה מידה z של 415 ננומטר.
- צלם תמונות הלוכדות מספר ערימות z (15-22 ערימות) מהחלק התחתון לחלק העליון של התאים. רכשו לפחות 10 תמונות מהשדה האקראי של צלחת התרבית כדי לקבל סך של ~200-300 תאים.
- נתח את התמונות שצולמו במצב לא מקוון כדי לזהות את ה- TNTs על-ידי ניתוח תצוגת אמצעי אחסון תלת-ממדית
6. ניתוח של תמונות z-stack קונפוקליות לזיהוי וכימות TNTs
- פתח את התמונות הקונפוקליות שנשמרו בתבנית נתונים .czi בתוכנת פיג'י לניתוח.
- בחרו באפשרות Hyperstack כדי לראות כל z-stack וכל ערוץ של התמונה. חפשו את ערימות העל של ערימות z וערוצים, שנפתחות בחלון אחד כפי שמוצג באיור 2. גלול בפסי הגלילה של הערוץ (מסומנים בחצים אדומים וירוקים) וב- z-stack (מסומן על-ידי חצים כחולים) כדי לבחור את הערימה המדויקת של ערוץ מסוים שמעניין אותך.
הערה: בתאים קבועים, כאשר צינורות ה-TNT או הממברנה המרחפים נשארים מעל פני השטח, המבנים אינם נראים בחלקים התחתונים של ערימות z. עם זאת, בתאים קבועים, נויריטים שוכבים על פני השטח וניתנים לזיהוי בחלקים התחתונים של ערימות z (z = 0 עד 2). ראו איור 2 לשלבי הזיהוי. - כפי שמוצג באיור 2, בחרו תחילה את הערוץ המוכתם ב-F-actin (מסומן בחצים אדומים) על-ידי גלילת סרגל הערוצים. לאחר מכן, גלול ידנית את ערימות z (מסומנות על-ידי חצים כחולים) כדי לראות כל ערימה בזו אחר זו. זהה את המבנים המוכתמים ב-F-actin שנראים כמחברים בין תאים, נראים בחלקים התחתונים של ערימות z, והם קרובים לפני השטח של צלחת ההדמיה (z = 2) כנוירויטים (מסומנים על ידי חיצים לבנים).
הערה: רוב הנויריטים קלים לזיהוי מכיוון שהם מופיעים כבליטות מורחבות (מסומנות על ידי חיצים ורודים). - זהה את ה-TNTs, צינורות F-actin-positive, המרחפים מתא לתא, על-ידי גלילת ערימות ה-z לכיוון החלק העליון ( מ-z = 4 באיור 2; מסומן על-ידי חצים צהובים). חפשו נויריטים ליד החלקים התחתונים של ערימות z לכיוון פני השטח ושימו לב שהם מתחילים להיעלם עם גלילה של ערימות z לכיוון החלק העליון ( ב-z = 6 באיור 2; נוריטים אינם נראים בבירור).
- זהה TNTs חיוביים ל-phospho-PAK1 באופן דומה ל-TNTs חיוביים ל-F-actin על-ידי ניתוח האופי המרחף של הצינורות מערימות z. מכיוון שצביעת phospho-PAK1 חלשה יותר מכתמי F-actin, חפשו TNTs מוכתמים ב-phopho-PAK1 ב-z = 4 (נראה קלוש) וב-z = 6 (בולט).
- יתר על כן, התבוננו בתמונות DIC כדי לוודא שמבני TNT המוכתמים ב-F-actin וב-phospho-PAK1 הם צינורות ממברנה בין תאים (איור 3). בנוסף, מזגו ערוצי F-אקטין (אדום) ו-phospho-PAK1 (ירוק) כדי לוודא שה-TNTs שזוהו הם מבנים מוכתמים במשותף של F-actin ו-phospho-PAK1 (איור 3).
- כדי לכמת את ה- TNTs, ספור את מספרי התאים הכוללים ואת מספרי ה- TNTs שזוהו באופן ידני וייצג את המספרים כאחוזים.
- כדי להבחין בין TNTs חיוביים ל-F-אקטין לבין טובולין β-III (TUBb3)-חיובי, דמויי-TNT, מתמונות z-stack, מזגו ערוצי F-actin (אדום) ו-TUBb3 (ירוק) (איור 4). לאחר מכן, נתחו את ערימות ה-z של התמונות הממוזגות.
- חפשו אך ורק TNTs מוכתמים ב-F-אקטין שנראים קלושים ב-z = 3 ובולטים ב-z = 6 ו-z = 9 (חצים צהובים). באופן דומה, זהה F-actin ו- β-III טובולין (TUBb3) צינורות מרחפים חיוביים כפולים, דמויי TNT ב- z = 6 ו- z = 9 (חיצי ציאן). זהה בליטות אחרות של F-actin- ו- β-III מוכתמות בטובולין, שאינן מרחפות מהחלקים התחתונים של ערימות z (חיצים לבנים).
- מדוד את הקוטר של TNTs באמצעות כלי הקו בפיג'י. אמת את קנה המידה על-ידי לחיצה על נתח | קבעו שינוי גודל כך ש"מרחק בפיקסלים" יוגדר אוטומטית מתמונות ה- .czi. מדוד את הקטרים של ה- TNTs במישור xy.
הערה: רוב הקטרים הם בין פיקסל אחד ל-4 פיקסלים (כלומר, 220-880 ננומטר); כל פיקסל הוא 220 ננומטר. ראו איור 5 לסיכום הפרוטוקול לניתוח תמונות קונפוקליות של z-stack.
7.3D שחזור של תמונות z-stack לאפיון TNTs
- השתמש בתוסף מציג אמצעי האחסון בפיג'י, המאפשר שחזור תלת-ממדי והדמיה תלת-ממדית התומכת בסף (איור 6).
- פצלו את תמונות z-stack לערוצים בודדים. לאחר מכן, חתוך את תמונות z-stack של ערוץ יחיד (ערוץ F-actin) כדי להשתמש בתצוגת שחזור תלת-ממדית כדי להדגיש TNTs או נויריטים אחד או שניים בכל פעם. הפעל את תוסף תצוגת עוצמת הקול כדי להציג באופן חזותי תצוגות xy, yz ו- xz.
- הצמידו TNT או נויריט יחיד במישור xy (חיצים לבנים מייצגים נויריטים באיור 6A; חיצים צהובים מייצגים TNTs באיור 6B) וסימנו חתכי צירי xz (אדום) ו-yz (ירוק). שימו לב לנויריטים בתחתית מישור xz במישורי xz ו-yz (חצים לבנים, איור 6A) וב-TNTs בערימות z העליונות (חצים צהובים, איור 6B).
- בחר את ה-TNT או הנויריט הבודדים כדי לשחזר את תצוגת הנפח התלת-ממדית במישור xz (איור 6C, D). בשחזור התלת-ממדי, ראו את הנויריטים בתחתית מישור ה-z (חיצים לבנים, איור 6C) ואת ה-TNTs המופיעים כמבנים מרחפים המחברים בין שני תאים מבלי לגעת במישור ה-z התחתון (חצים צהובים, איור 6D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנו מזהים ומאפיינים TNTs המושרים על-ידי oAβ בתאי עצב SH-SY5Y על-ידי בניית תצוגות נפח תלת-ממדיות מתמונות z-stack קונפוקליות (איור 1). התאים קיבלו כתם חיסוני כפול עם F-אקטין ופוספו-PAK1. תמונות z-stack קונפוקליות של תאים מדוכאי חיסון נותחו כדי לזהות TNTs (איור 2). יתר על כן, תמונות DIC נותחו כדי לאמת שמבני TNT המוכתמים ב-F-actin וב-phospho-PAK1 היו צינורות ממברנה בין תאים (איור 3). יתר על כן, התאים קיבלו כתם חיסוני כפול עם F-אקטין וטובולין β-III (איור 4). צינורות הממברנה החיובית הכפולה דמויי TNT F-actin ו-β-III של טובולין נבדלו מ-TNTs חיוביים ל-F-actin בלבד (איור 4). ה-TNTs שהתבטאו יחד עם phospho-PAK1 (או PAK1 מופעל) ו-F-actin נבדלו מנויריטים/בליטות תאים אחרות על-ידי בניית תמונות של תצוגת נפח תלת-ממדית בהתבסס על המאפיין שלהם של ריחוף בין שני תאים מבלי לגעת בסובסטרטום (איור 6). ה-TNTs שזוהו זוהו באופן ידני, ואחוז ה-TNTs חושב במדויק מתמונות תצוגת אמצעי האחסון התלת-ממדיים. הקוטר והאורך של ה-TNTs נקבעו גם על ידי ניתוח ה-TNTs שזוהו בנפרד.
איור 1: דיאגרמה סכמטית המייצגת את סיכום הפרוטוקול של שיטת הזיהוי של TNTs. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר עבור תמונות מיקרוסקופיה (למעלה); 10 מיקרומטר (תצוגות נפח תלת-ממדיות). קיצורים: oAβ = עמילואיד אוליגומרי-β1-42; PAK1 = קינאז-1 המופעל על-ידי p21. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ניתוח של תמונות z-stack קונפוקליות כדי לזהות ולכמת TNTs. תמונות z-stack קונפוקליות נותחו בתוכנת פיג'י. ערימות יתר של ערימות z וערוצים שנפתחו בחלון יחיד המציג (A) F-actin ו- (B) phospho-PAK1. על ידי גלילת פסי הגלילה של הערוץ (המסומנים בחצים אדומים וירוקים) ו- z-stack (מסומן על ידי חצים כחולים), נותחו הערימות הבודדות של ערוץ עניין מסוים. (A) המבנים המוכתמים ב-F-actin המחברים בין תאים, הנראים בחלקים התחתונים של ערימות z, ונחשבים קרובים לפני השטח של צלחת התמונה (z = 2) זוהו כנוירויטים (מסומנים על ידי חיצים לבנים). לעומת זאת, צינורות מרחפים המחוברים בין תא לתא, הנראים בחלקים גבוהים יותר של ערימות z, זוהו כ-TNTs (מסומנים על ידי חיצים צהובים). (B) באופן דומה זוהו נויריטים מוכתמים בפוספו-PAK1 ו-TNTs. בליטות קצרות חיוביות אחרות של F-actin שאינן מחוברות לתאים שכנים מסומנות על ידי חיצים ורודים. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: TNT = מנהור ננו-צינוריות; PAK1 = קינאז-1 המופעל על-ידי p21. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניתוח של תמונות DIC כדי לאשר את TNTs. (A) תמונות DIC נצפו כדי לוודא שה-TNTs המוכתמים ב-F-actin ו-phospho-PAK1 ובליטות הנויריט אכן היו צינורות ממברנה. (B) בנוסף, ערוצים F-actin (אדום) ו-phospho-PAK1 (ירוק) מוזגו כדי לוודא שה-TNTs שזוהו, המושרים על-ידי oAβ, היו מבנים מוכתמים במשותף של F-actin ו-phospho-PAK1. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: TNT = מנהור ננו-צינוריות; DIC = ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית; PAK1 = קינאז-1 המופעל על-ידי p21. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תמונות z-stack קונפוקליות שנותחו באמצעות תוכנת פיג'י כדי להבחין רק בין TNTs מוכתמים ב-F-אקטין לבין טובולין β-III ו-F-actin עם תעלות מרחפות מוכתמות כפולות דמויות TNT. ראשית, התעלות F-actin (אדום) ו-TUBb3 (ירוק) של ההיפר-סטאקים מוזגו. לאחר מכן, התמונות הממוזגות נפתחו בחלון אחד. על ידי גלילת פסי הגלילה של z-stack, TNTs מוכתמים ב-F-actin זוהו באופן בלעדי; אלה נראו קלושים ב- z = 3 ובלטו ב- z = 6 ו- z = 9 (חצים צהובים, B). באופן דומה, F-actin ו-TUBb3 צינורות מרחפים חיוביים כפולים, דמויי TNT, היו ניתנים לזיהוי ב-z = 6 ו-z = 9 (חיצי ציאן, A). בליטות אחרות של F-actin ו-β-III מוכתמות בטובולין, שאינן מרחפות, זוהו מהחלקים התחתונים של ערימות z (חיצים לבנים). סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: TNTs = מנהור ננו-צינוריות; TUBb3 = טובולין β-III. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: סיכום סכמטי המייצג את הפרוטוקול המפורט לניתוח תמונות קונפוקליות של z-stack. קיצור: TNTs = מנהור ננו-צינוריות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: תצוגת שחזור תלת-ממדית כדי להדגיש TNTs או נוריטים אחד או שניים בכל פעם. תוסף "תצוגת עוצמת הקול" בפיג'י משמש להדמיה של תצוגות xy, yz ו- xz. השחזור התלת-ממדי מראה את הנוריט שוכב בתחתית מישור ה-z (חצים לבנים בלוחות A ו-C), בעוד ש-TNTs מופיעים כמבנים מרחפים המחברים בין שני תאים מבלי לגעת במישור z התחתון (חץ צהוב בלוחות B ו-D). סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצור: TNTs = מנהור ננו-צינוריות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר חוקרים בשני העשורים האחרונים ניסו להבין ולאפיין את המבנה של TNTs18. היעדר סמנים ספציפיים מעכב את ההתקדמות, ויש דרישה גוברת לשיטה נוחה וסטנדרטית שניתן להשתמש בה כדי לזהות, לאפיין ולכמת TNTs. TNTs מוגדרים כצינורות ממברנה מבוססי F-actin המרחפים בין שני תאים. מחקרים הראו כי נויריטים β-טובולין חיוביים, קרובים, מתפתחים, מרחפים בין שני תאים מרוחקים ודומים למבנים דמויי TNT12,13. לכן, TNTs מזוהים ומובחנים מנויריטים ומבנים אחרים דמויי TNT בהתבסס על החיוביות שלהם עבור אקטין בלבד ועל היותם צינורות ממברנה המרחפים בין שני תאים מרוחקים. חוקרים מוצאים לעתים קרובות את זה מאתגר להשיג מבני TNT שלמים במהלך קיבוע לפני הדמיה24. כדי להתגבר על בעיה זו, השתמשנו בפתרון מקבע שונה עם 2.5% גלוטרלדהיד (המקבע של קרנובסקי) כדי לתקן את תאי העצב SH-SY5Y המשמשים בפרוטוקול זה25.
שלב קריטי בכל ניסוי אימונוהיסטוכימיה/אימונוציטוכימיה הוא קיבוע הדגימה, המסתמך על בחירת הגורם המקבע המתאים. קיבוע לא מושלם של הדגימה עלול להוביל לפירוק פרוטאוליטי מהיר של חלבוני המטרה ולהפחתה בפעילות החיסונית הספציפית. פיקסינציה יתר גורמת למיסוך של האפיטופ ולחוסר ודאות בתיוג ספציפי הנגרם על ידי הרקע הלא ספציפי. שיטה, תזמון או משך, טמפרטורה ו- pH משפיעים גם על קיבוע תקין של התאים26.
Paraformaldehyde נמצא בשימוש נרחב כסוכן מקבע ב immunostaining של תאים. החסרונות של שימוש paraformaldehyde כסוכן מקבע כוללים את אובדן antigenicity ושינויים במורפולוגיה. Glutaraldehyde יש לחץ אוסמוטי נמוך יותר, הוא יציב יותר בתמיסה, crosslinks בקלות, ובכך נותן תוצאות טובות יותר27. שילוב של פורמלדהיד-גלוטרלדהיד (בחיץ פוספט) מקובע גורם לקיבוע יוצא דופן של מגוון רחב של דגימות רקמה/תאים. שילוב זה מאפשר ייצוב מהיר של מבנה האולטרה של התא על ידי פורמלדהיד, ולאחר מכן קיבוע קבוע על ידי פעולת החדירה האיטית יותר של גלוטרלדהיד28.
TNTs חיוביים ל-F-אקטין ופוספו-PAK1 נבדלים מנויריטים על סמך המאפיין שלהם של ריחוף בין שני תאים בתרבית תאים דו-ממדית במבחנה על מצע שטוח. ה- TNTs שזוהו זוהו באופן ידני באמצעות ניתוח תצוגת נפח תלת-ממדית, ואחוזי ה- TNTs שנוצרו חושבו על ידי ספירה ידנית. השיטה הידנית מקשה על כימות כמויות גדולות של נתונים מכיוון שהיא דורשת כוח אדם עצום19. עם זאת, עיניים מאומנות יכולות לזהות TNTs ביעילות ולהבדיל אותם מנויריטים בדיוק רב יותר מאשר שיטות זיהוי אוטומטיות. גם שיטות האיתור האוטומטיות הקיימות קשות ליישום בכל מעבדה ללא המומחיות הזמינה לפיתוח אלגוריתם ו/או שינוי האלגוריתם הקיים כנדרש לצורך מערך הניסוי. שיטת ניתוח תצוגת הנפח התלת-ממדית הידנית מקלה על זיהוי מבני הממברנה הנמצאים בין תאים בחלקים התחתונים של ערימות z לבין אלה המרחפים בחלקים האמצעיים והגבוהים יותר של ערימות z כדי להבחין בבירור בין נויריטים ל-TNTs.
TNTs ניתן להבחין בין בליטות ממברנה אחרות כגון neurites או microtubes הגידול. עם זאת, קשה להבחין בין צינורות פתוחים וקרובים, בגודל ננו, בקוטר ממברנה, מה שמעלה את השאלה הבאה: האם הם מבנים דמויי TNT או TNT? מאז העשור האחרון, כמות עצומה של נתונים נצברו כדי להראות את התפקיד הבלתי נמנע של TNTs בהתפשטות הפתולוגיה, עמידות לסרטן, וטיפול17. לכן, חוקרים מחפשים פיתוח של יצרנים ספציפיים שישנו את תחום התקשורת הבין-תאית הישירה למרחקים ארוכים. עד אז, יש ביקוש רב לשיטות אפיון הדמיה הניתנות לשחזור כדי לסלול את הדרך להתקדמות מתמשכת בתחום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.
Acknowledgments
D.K.V ו- A.R מודים לאקדמיה להשכלה גבוהה של מניפל על מלגת TMA Pai. אנו מודים למועצת המחקר המדעית וההנדסית של הודו עבור SERB-SRG (#SRG/2021/001315), כמו גם למועצה ההודית למחקר רפואי של הודו (#5/4-5/אד-הוק/נוירו/216/2020-NCD-I) ולקרן התוך-מורלית של האקדמיה להשכלה גבוהה של מניפל, מניפל, הודו. אנו מודים למתקן הקונפוקלי של JNCASR (מרכז ג'ווהרלל נהרו למחקר מדעי מתקדם, הודו) ול- B. Suma על המיקרוסקופיה הקונפוקלית ב- JNCASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
- Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
- Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
- Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
- Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
- Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
- Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
- Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
- Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
- Zurzolo, C.
- Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
- Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
- Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
- Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
- Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
- Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
- Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
- Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
- Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
- Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).
- Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
- Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
- Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
- Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).
