Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Обнаружение и количественная оценка туннельных нанотрубок с использованием изображений 3D Volume View

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/63992
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, India
* These authors contributed equally

Summary

Туннельные нанотрубки (TNT) представляют собой в основном открытые F-актиновые мембранные нанотрубки, которые соединяют соседние клетки, облегчая межклеточную связь. Примечательной характеристикой, которая отличает ТНТ от других клеточных выступов, является парящая природа нанотрубок между клетками. Здесь мы характеризуем TNT, создавая 3D-объемное представление конфокальных изображений z-стека.

Abstract

Недавние открытия показали, что клетки выполняют прямой, дальний, межклеточный перенос через наноразмерные, актин-мембранные каналы, а именно «туннельные нанотрубки» (TNT). ТНТ определяются как открытые, липидные двухслойные мембранные расширения, которые опосредуют непрерывность между соседними клетками диаметром от 50 нм до 1 мкм. ТНТ были продемонстрированы первоначально в нейрональных клетках, но последовательные исследования выявили существование ТНТ в нескольких типах клеток и заболеваниях, таких как нейродегенеративные заболевания, вирусные инфекции и рак. В нескольких исследованиях упоминались близкие, электрически связанные мембранные наноструктуры между соседними клетками как TNT или TNT-подобные структуры.

Выяснение ультраструктуры с точки зрения непрерывности мембраны в конечной точке является технически сложной задачей. Кроме того, исследования клеточно-клеточной коммуникации являются сложными с точки зрения характеристики ТНТ с использованием обычных методов из-за отсутствия специфических маркеров. ТНТ в первую очередь определяются как открытые мембранные протрузии на основе F-актина. Однако одним из основных ограничений является то, что F-актин присутствует во всех типах выступов, что затрудняет дифференциацию ТНТ от других выступов. Одной из примечательных характеристик ТНТ на основе F-актина является то, что эти структуры парят между двумя клетками, не касаясь субстрата. Таким образом, различные F-актин-окрашенные ТНТ можно удобно отличить от других выступов, таких как филоподии и нейриты, на основе их парения между клетками.

Недавно мы показали, что интернализация олигомерного амилоид-β1-42 (oAβ) через актин-зависимый эндоцитоз стимулирует активированную р21-активированную киназу-1 (PAK1), которая опосредует образование F-актин-содержащих ТНТ, совместно экспрессируемых с фосфо-PAK1 между нейрональными клетками SH-SY5Y. Этот протокол описывает метод 3D-объемного анализа для идентификации и характеристики ТНТ по захваченным z-стековым изображениям F-актин- и фосфо-PAK1-иммуноокрашенных мембранных протрузий в нейронных клетках, обработанных oAβ. Кроме того, ТНТ отличаются от развивающихся нейритов и нейрональных выростов на основе F-актин- и β-III тубулин-иммуноокрашенных мембранных каналов.

Introduction

Туннельные нанотрубки (ТНТ) основаны на F-актинах, в первую очередь на открытых мембранных каналах и играют жизненно важную роль в межклеточном переносе груза и органелл1. Уникальной характеристикой ТНТ является то, что они соединяют соседние клетки без какого-либо контакта с субстратом; они имеют длину более 10-300 мкм, а их диаметр колеблется от 50 нм до 1 мкм 2,3. ТНТ являются переходными структурами, и их срок службы длится от нескольких минут до нескольких часов. ТНТ были впервые продемонстрированы в нейронных клетках PC121; позже многочисленные исследования показали их существование в нескольких типах клеток in vitro и in vivo 4,5. Несколько исследований выявили патологическое значение ТНТ в различных моделях заболеваний, таких как нейродегенеративные заболевания, рак и вирусные инфекции 6,7,8.

Структурные неоднородности ТНТ были продемонстрированы несколькими исследованиями в различных клеточных системах9. Различия основаны на составе цитоскелета, механизме образования и10 передаваемых типах грузов. Прежде всего, открытая, F-актин-положительная мембранная непрерывность, которая парит между двумя соседними клетками и переносит органеллы, считается состоящей из TNT11. Однако отсутствие ясности или разнообразия, наблюдаемое при формировании ТНТ, усугубляет трудности в разработке маркеров, специфичных для тротила. Таким образом, трудно идентифицировать тротиловые структуры обычными методами обнаружения и различать мембранные нанотрубки с точки зрения открытых и закрытых выступов12. Тем не менее, характеристику ТНТ для парения в виде протрузий F-актиновой мембраны между двумя клетками относительно легче и более осуществимо идентифицировать с помощью обычных методов визуализации. Другие клеточные протрузии на основе актина, такие как филоподия и дорсальная филоподия, не могут парить между двумя отдаленными клетками, особенно когда клетки фиксированы. Следует отметить, что закрытые, электрически связанные, развивающиеся нейриты часто называют тротилоподобными структурами13.

Известно, что F-актин играет важную роль в образовании тротила, и несколько исследований показали, что ингибитор F-актина цитохалазин D ингибирует образование ТНТ14,15. Напротив, ингибиторы микротрубочек не оказывают никакого влияния на образование тротила16. За последние 2 десятилетия было несколько сообщений о значительной роли, которую ТНТ играют в распространении патологии и резистентности опухолей и терапии17. Поэтому существует бесконечный спрос на более совершенные методы характеристики тротила.

Отсутствие специфических маркеров ТНТ и разнообразие морфологии и состава цитоскелета затрудняют разработку уникального метода характеризации. В некоторых исследованиях использовались автоматизированные методы обнаружения изображений и количественной оценки тротила18,19. Тем не менее, есть несколько преимуществ нынешнего метода ручного анализа объема 3D перед автоматическим анализом изображений для обнаружения и количественной оценки ТНТ. Часто обученные человеческие глаза могут обнаружить эти парящие наноструктуры легче, чем автоматизированный метод обнаружения изображений. Кроме того, автоматические методы обнаружения может быть трудно реализовать в лабораториях, не имеющих опыта работы с алгоритмами. Настоящий метод может быть широко принят исследователями из-за его точности и воспроизводимости.

В недавнем исследовании мы показали, что oAβ способствует биогенезу ТНТ в нейронных клетках через PAK1-опосредованный, актин-зависимый, эндоцитозный механизм12. oAβ-индуцированные ТНТ также экспрессируют активированный PAK1 (или фосфо-PAK1). Мы разработали метод реконструкции изображения 3D-объемного вида для различения oAβ-индуцированных, F-актин- и фосфо-PAK1-иммуноокрашенных TNT. β-III тубулин-положительные, развивающиеся нейриты часто напоминают ТНТ-подобные парящие структуры20. Следовательно, мы дополнительно различали ТНТ на основе F-актина от β-III тубулин-положительных нейритов и других ТНТ-подобных протрузий. 3D-изображения с объемным видом были использованы для идентификации ТНТ на основе их характеристик зависания над субстратом и поддержания связи между двумя соседними ячейками. В данной работе описывается идентификация и обнаружение актинсодержащих мембранных трубопроводов или ТНТ с использованием конфокальных изображений z-стека и, наконец, ручная количественная оценка идентифицированных структур из 3D-изображений реконструкции объемного вида. Представленный метод не может отличить открытые собственные ТНТ от закрытых тротилоподобных структур; этот метод помогает идентифицировать ТНТ в 2D-культуре клеток in vitro на плоском субстрате. Однако метод прост в реализации и воспроизведении и может широко использоваться для точной количественной оценки только ТНТ на основе актина и для их отличия от нейритов и β-тубулин-положительных тротилоподобных структур.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки SH-SY5Y, культивируемые в средах DMEM/F-12, дифференцировали 10 мкМ ретиноевой кислоты в течение 7 дней и обрабатывали 1 мкМ oAβ олигомерами в течение 2 ч при 37 °C (5% CO2). После лечения клетки фиксировали фиксирующим раствором Карновского и двойным иммуноокрашиванием фосфо-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) антителом и F-актин-связывающим фаллоидином. Позже конфокальные изображения z-стека были сделаны с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа. TNT были количественно определены методом ручного подсчета и отличались от других нейритов / протрузий клеток путем построения 3D-изображений объемного вида и идентификации структур по их характеристике парения между двумя клетками, не касаясь субстрата (рисунок 1).

1. Клеточная культура и дифференцировка

  1. Культивируйте нейрональные клетки SH-SY5Y в среде DMEM/F12 (Ham's) 1:1 с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% смесью пенициллин-стрептомицин-неомицин (PSN). Засейте клетки в 35-миллиметровую тарелку для визуализации с 14 мм, хорошо состоящей из крышки No 1,5 в центре тарелки, прикрепленной к дну. Посейте клетки на тарелке для визуализации в концентрации 12 000 клеток/см2 и проведите эксперименты при слиянии 60%-70%.
  2. Частично дифференцируют клетки с 10 мкМ ретиноевой кислоты (РА) из стокового раствора 100 мМ (5 мг РА в 15 мл диметилсульфоксида [DMSO]). Затем инкубируют клетки в течение 7 дней при 37 °C (5% CO2) для дифференцировки с изменением среды каждые 2 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с поддержанием слияния (60%-70%) клеток (как недифференцированных, так и частично дифференцированных клеток). Плотность клеток может влиять на образование ТНТ между клетками.

2. Получение олигомеров амилоид-β1-42 (oAβ) для лечения нейрональных клеток

  1. Растворить Aβ 1-42 (1 мг) в 200 мкл 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанола и разделить раствор на 20 аликвот, каждая из которых содержит 0,05 мг пептидов. Лиофилизируйте и храните аликвоты при −20 °C для последующего использования.
  2. Готовят исходный раствор (5 мМ) лиофилизированного Aβ 1-42 в ДМСО путем добавления 2,2 мкл ДМСО к 0,05 мг лиофилизированного пептида. Чтобы тщательно растворить пептиды, вихрьте раствор и протрите ультразвуком в течение 2 мин на водяной бане.
  3. Разбавляют стоковый раствор до концентрации 100 мкМ в ДМЭМ, рН 7,4 и вихря для превращения пептидов в мономеры с последующей инкубацией при 4°С в течение 24 ч для получения олигомеров Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22.
  4. Охарактеризовали oAβ до экспериментов, как сообщалось ранее21,22 с помощью просвечивающей электронной микроскопии визуализации.
  5. Обрабатывайте частично дифференцированные клетки SH-SY5Y 1 мкМ oAβ. Удалите среду перед процедурами и добавьте свежий DMEM без FBS. После изменения среды добавляют ранее приготовленный oAβ (100 мкМ) в среду до конечной концентрации 1 мкМ. Инкубируют клетки с 1 мкМ oAβ в течение 2 ч при 37 °C (5% CO2). Включите отрицательный контроль в виде необработанных клеток.

3. Иммуноокрашивание F-актина и активированного PAK1 для характеристики ТНТ

  1. Выполняют дифференциальное иммуноокрашивание с использованием антител фосфо-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) и F-актин-связывающего фаллотоксина фаллотоксина.
  2. Промывайте контрольные и обработанные oAβ клетки 1x фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS) в течение 2 x 2 мин перед фиксацией. Готовят фиксаторный раствор Карновского с использованием 2% формалинового фиксатора и 2,5% глутаральдегида, растворенного в 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,2. Затем зафиксируйте клетки в тарелке для визуализации, добавив фиксирующий раствор Карновского (достаточно, чтобы покрыть клетки) в течение 45 мин при комнатной температуре.
  3. Промыть неподвижные клетки 2 х 2 мин с помощью инкубационного буфера. Готовят инкубационный буфер (20x), растворяя 0,1 г сапонина в 5 мл FBS и разбавляя до 1x, добавляя 95 мл 1x PBS.
  4. После фиксации добавляют первое антитело против phopho-PAK1 в разведении 1:250 в инкубационном буфере и инкубируют на ночь при 4 °C в темной влажной камере.
  5. На следующий день, после 24 ч инкубации промыть клетки 2 х 2 мин с инкубационным буфером; затем добавляют вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (разведение 1:1000) и фаллоидином 555 (разведение 1:1000). Инкубируют клетки в темной влажной камере в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
  6. После инкубации промыть клетки 2 х 2 мин инкубационным буфером. Окрашивают ядро добавлением 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в разведении 1:2000 и инкубируют в течение 5 мин до 10 мин при комнатной температуре в темноте.
  7. Приготовьте монтажную среду DABCO, используя 25 мг DABCO в 90% глицерине и 10% в 1x PBS. Чтобы раствориться должным образом, отрегулируйте рН до 8,6 с помощью спектрофотометрического класса, разбавьте HCl (разбавленное 1:20 водой) и держите раствор на коромысле для смешивания.
  8. В качестве антиотбеливающего агента добавьте монтажную среду DABCO непосредственно на тарелку для визуализации, содержащую крышку внизу. Подождите не менее 1-2 ч и непосредственно приступайте к выполнению конфокальной визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксации обшивки не требуется никаких клеев.

4. Иммуноокрашивание F-актина и тубулина β-III для отличия ТНТ от нейритов

  1. Выполняют дифференциальное иммуноокрашивание антителом к тубулину β-III и F-актин-связывающим фаллотоксином фаллотоксином фаллоидином.
  2. Промыть обработанные oAβ клетки в 2 раза 1x PBS перед добавлением фиксаторного раствора Карновского. Инкубировать клетки в течение 45 мин при комнатной температуре и промыть клетки 2 х 2 мин с инкубационным буфером.
  3. После фиксации добавляют антитело против тубулина β-III (TUBb3) в разведении 1:250 в инкубационном буфере и инкубируют при 4 °C на ночь в темной влажной камере.
  4. На следующий день промыть клетки инкубационным буфером (2 х 2 мин) и добавить вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (разведение 1:1000) и фаллоидином 555 (разведение 1:1000) вместе в одну и ту же посуду. Затем инкубируют клетки в течение 1,5 ч при комнатной температуре в темной влажной камере.
  5. Промыть клетки 2 раза инкубационным буфером и добавить ядерный окрашивающий DAPI в разведении 1:2000 в течение 5-10 мин при комнатной температуре в темноте.
  6. Добавьте антиотбеливающее средство DABCO в монтажную среду, как упоминалось выше, и подождите 2 часа перед визуализацией.

5. Визуализация с помощью конфокальной микроскопии

  1. Чтобы идентифицировать ТНТ, захватите z-стековые изображения иммуноокрашенных клеток с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Делайте снимки с помощью объектива 40x/1.40 Oil DIC с фильтрами DAPI, флуоресцеина изотиоцианата (FITC) и тетраметилродамина (TRITC).
  2. Сначала выберите каналы, последовательно щелкнув необходимые лазеры в окнах Track 1, Track 2 и Track 3 в конфокальном программном обеспечении. Щелкните опцию T-PMT под окном Track 1, чтобы получить изображения дифференциального интерференционного контраста (DIC) с флуоресцентными каналами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения DIC захватываются другим детектором, помеченным как T-PMT.
  3. Выберите вкладку приобретения программного обеспечения, нажмите на вкладку Z-stack и дождитесь открытия окна. Затем щелкните динамическое сканирование , чтобы сфокусировать ячейки в нижней части тарелки. Выберите это сфокусированное изображение в качестве первого стека. Затем сфокусируйтесь вверх, чтобы увидеть самую верхнюю часть ячейки, и выберите ее в качестве последнего стека. Остановите сканирование в реальном времени и щелкните число рядом с оптимальной вкладкой, чтобы зафиксировать размер шага стеков. Размер шага определяет количество фрагментов и интервалы в зависимости от толщины ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер шага будет выбран на основе выборки Найквиста, чтобы взять достаточное количество срезов и убедиться, что между двумя стеками нет зазоров. Выборка Найквиста определяется на основе объектива и длин волн огней23.
  4. Делайте последовательные изображения трех каналов DAPI, FITC и TRITC с помощью лазеров 405 нм, 488 нм и 561 нм и делайте снимки со временем выдержки пикселя 1,02 мкс. Захват изображений в DIC-канале с флуоресцентными каналами для наблюдения за границей ячейки.
  5. Захват стопки изображений с размерами x: 224,92 мкм и y: 224,92 мкм, с каждым пикселем размером 220 нм2 и z-масштабированием 415 нм.
  6. Делайте снимки, захватывая несколько z-стеков (15-22 стека) снизу вверх ячеек. Получите не менее 10 изображений из случайного поля чашки культуры, чтобы получить в общей сложности ~200-300 клеток.
  7. Анализ захваченных изображений в автономном режиме для идентификации ТНТ с помощью анализа 3D-представления объема

6. Анализ конфокальных изображений z-стека для идентификации и количественной оценки ТНТ

  1. Откройте для анализа конфокальные изображения, сохраненные в формате данных .czi в программном обеспечении Фиджи.
  2. Выберите параметр Hyperstack , чтобы просмотреть каждый z-стек и канал изображения. Найдите гиперстеки z-стеков и каналов, которые открываются в одном окне, как показано на рисунке 2. Прокрутите полосы прокрутки канала (обозначены красными и зелеными стрелками) и z-стека (обозначены синими стрелками), чтобы выбрать точный стек конкретного интересующего канала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В неподвижных ячейках, поскольку парящие ТНТ или мембранные каналы остаются над поверхностью, структуры не видны в нижних частях z-стеков. Однако в фиксированных клетках нейриты лежат на поверхности и обнаруживаются в нижних частях z-стеков (z = от 0 до 2). Шаги идентификации см. на рисунке 2 .
  3. Как показано на рисунке 2, сначала выберите канал, окрашенный F-актином (обозначенный красными стрелками), прокрутив полосу канала. Затем вручную прокрутите z-стеки (обозначенные синими стрелками), чтобы увидеть каждый стек по одному. Идентифицируйте структуры, окрашенные F-актином, которые, по-видимому, соединяют клетки, видны в нижних частях z-стеков и находятся близко к поверхности тарелки для визуализации (z = 2) как нейриты (обозначенные белыми стрелками).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство нейритов легко идентифицировать, поскольку они выглядят как расширенные выступы (обозначенные розовыми стрелками).
  4. Идентифицируйте TNT, F-актин-положительные, парящие межклеточные каналы, прокручивая z-стеки вверх (от z = 4 на рисунке 2; обозначены желтыми стрелками). Ищите нейриты вблизи нижних частей z-стеков к поверхности и наблюдайте, что они начинают исчезать с прокруткой z-стеков к вершине (при z = 6 на рисунке 2; нейриты не видны четко).
  5. Идентифицировать фосфо-PAK1-положительные ТНТ аналогично F-актин-положительным ТНТ путем анализа парящей природы каналов из z-стеков. Поскольку окрашивание фосфо-PAK1 слабее, чем окрашивание F-актином, ищите окрашенные phopho-PAK1 TNT при z = 4 (слабо видимые) и при z = 6 (заметные).
  6. Кроме того, наблюдайте изображения ДВС-синдрома, чтобы убедиться, что окрашенные F-актин- и фосфо-PAK1-окрашенные тротиловые структуры являются мембранными проводниками между клетками (рисунок 3). Кроме того, объединяют F-актиновые (красные) и фосфо-ПАК1 (зеленые) каналы, чтобы убедиться, что идентифицированные ТНТ являются структурами F-актина и фосфо-ПАК1 (рисунок 3).
  7. Чтобы количественно оценить ТНТ, подсчитайте общее число ячеек и идентифицированные ТНТ вручную и представьте числа в процентах.
  8. Чтобы отличить F-актин-положительные ТНТ и β-III тубулин(TUBb3)-положительные, ТНТ-подобные парящие каналы от z-стековых изображений, объединяют F-актиновые (красный) и TUBb3 (зеленый) каналы (рисунок 4). Затем проанализируйте z-стеки объединенных изображений.
    1. Ищите исключительно окрашенные F-актином TNT, которые слабо видны при z = 3 и заметны при z = 6 и z = 9 (желтые стрелки). Аналогичным образом, идентифицируйте F-актин и β-III тубулин (TUBb3) двойные положительные, тротилоподобные парящие каналы при z = 6 и z = 9 (голубые стрелки). Идентификация других F-актин- и β-III тубулиновых, ненависающих выступов из нижних частей z-стеков (белые стрелки).
  9. Измерьте диаметр ТНТ с помощью линейного инструмента на Фиджи. Проверьте масштаб измерения, щелкнув Анализировать | Установите масштаб таким образом, чтобы «расстояние в пикселях» автоматически устанавливалось из изображений .czi. Измерьте диаметры ТНТ в xy-плоскости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство диаметров составляют от 1 до 4 пикселей (т.е. 220-880 нм); каждый пиксель равен 220 нм. См. рисунок 5 для краткого описания протокола для анализа конфокальных изображений z-стека.

7.3D реконструкция изображений z-стека для характеристики ТНТ

  1. Используйте плагин для просмотра томов на Фиджи, который позволяет выполнять 3D-перерисовку и 3D-визуализацию с пороговой поддержкой (рисунок 6).
  2. Разделите изображения z-стека на отдельные каналы. Затем обрежьте одноканальные (F-актиновый канал) изображения z-стека, чтобы использовать 3D-режим реконструкции для выделения одного или двух ТНТ или нейритов одновременно. Включите подключаемый модуль представления громкости для визуализации представлений xy, yz и xz.
  3. Закрепите один тротил или нейрит в плоскости xy (белые стрелки представляют нейриты на рисунке 6A; желтые стрелки представляют TNT на рисунке 6B) и отметьте поперечные сечения осей xz (красный) и yz (зеленый). Наблюдайте за нейритами в нижней части плоскости xz в плоскостях xz и yz (белые стрелки, рисунок 6A) и TNT в верхних z-стеках (желтые стрелки, рисунок 6B).
  4. Выберите отдельный тротил или нейрит, чтобы реконструировать 3D-вид объема в плоскости xz (рисунок 6C, D). В 3D-реконструкции наблюдайте нейриты в нижней части z-плоскости (белые стрелки, рисунок 6C) и ТНТ, появляющиеся в виде парящих структур, соединяющих две ячейки, не касаясь нижней z-плоскости (желтые стрелки, рисунок 6D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы идентифицируем и характеризуем oAβ-индуцированные TNT в нейронных клетках SH-SY5Y путем построения 3D-объемных представлений из конфокальных изображений z-стека (рисунок 1). Клетки были дважды иммуноизолированы F-актином и фосфо-PAK1. Конфокальные изображения z-стека иммуноокрашенных клеток были проанализированы для идентификации ТНТ (рисунок 2). Кроме того, изображения ДВС-синдрома были проанализированы, чтобы убедиться, что F-актин- и фосфо-PAK1-окрашенные тротиловые структуры были мембранными проводниками между клетками (рисунок 3). Кроме того, клетки были дважды иммуноизолированы F-актином и тубулином β-III (рисунок 4). Тротилоподобные F-актин и β-III тубулиновые двойные положительные мембранные каналы отличались только от F-актин-положительных ТНТ (рисунок 4). ТНТ, совместно экспрессированные с фосфо-PAK1 (или активированным PAK1) и F-актином, отличались от других нейритов/клеточных выступов путем построения 3D-изображений объемного вида на основе их характеристики зависания между двумя клетками без прикосновения к субстрату (рисунок 6). Идентифицированные ТНТ были обнаружены вручную, а процент ТНТ был рассчитан точно по изображениям 3D-объема. Диаметр и длина ТНТ также определялись путем анализа индивидуально идентифицированных ТНТ.

Figure 1
Рисунок 1: Принципиальная схема, представляющая сводку протокола метода обнаружения TNT. Шкала = 100 мкм для микроскопических изображений (вверху); 10 мкм (3D объемные виды). Сокращения: oAβ = олигомерный амилоид-β1-42; PAK1 = p21-активированная киназа-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Анализ конфокальных изображений z-стека для идентификации и количественной оценки ТНТ. Конфокальные изображения z-stack были проанализированы в программном обеспечении Fiji. Гиперстеки z-стеков и каналов открываются в одном окне, показывая (A) F-актин и (B) фосфо-PAK1. Путем прокрутки полос прокрутки канала (обозначенного красными и зелеными стрелками) и z-стека (обозначенного синими стрелками) были проанализированы отдельные стеки конкретного интересующего канала. (A) Окрашенные F-актином структуры, соединяющие ячейки, видимые в нижних частях z-стеков и считающиеся близкими к поверхности изображения тарелки (z = 2), были идентифицированы как нейриты (обозначенные белыми стрелками). Напротив, парящие каналы, связанные между ячейками, видимые в более высоких частях z-стеков, были идентифицированы как ТНТ (обозначенные желтыми стрелками). (B) Аналогичным образом были идентифицированы фосфо-PAK1-окрашенные нейриты и ТНТ. Другие F-актин-положительные короткие выступы, которые не связаны с соседними клетками, обозначены розовыми стрелками. Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: TNT = туннельные нанотрубки; PAK1 = p21-активированная киназа-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Анализ изображений ДВС-синдрома для подтверждения ТНТ. (A) Изображения ДВС-синдрома были замечены для проверки того, что окрашенные F-актин- и фосфо-PAK1 ТНТ и нейритовые выступы действительно были мембранными проводниками. (B) Кроме того, каналы F-актина (красный) и фосфо-ПАК1 (зеленый) были объединены для проверки того, что идентифицированные ТНТ, индуцированные oAβ, представляли собой структуры, окрашенные F-актином и фосфо-ПАК1. Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: TNT = туннельные нанотрубки; DIC = дифференциальный интерференционный контраст; PAK1 = p21-активированная киназа-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Конфокальные изображения z-стека, проанализированные с использованием программного обеспечения Фиджи, чтобы отличить только окрашенные F-актином ТНТ от тубулина β-III и F-актина с двойным окрашиванием, похожими на ТНТ парящими проводниками. Во-первых, были объединены F-актин (красный) и TUBb3 (зеленый) каналы гиперстеков. Затем объединенные изображения были открыты в одном окне. Путем прокрутки полос прокрутки z-стека были идентифицированы исключительно ТНТ, окрашенные F-актином; они были слабо видны при z = 3 и заметны при z = 6 и z = 9 (желтые стрелки, B). Аналогичным образом, F-актин и TUBb3 двойные положительные, тротилоподобные парящие каналы были обнаружены при z = 6 и z = 9 (голубые стрелки, A). Другие F-актин- и β-III тубулиновые, ненависающие выступы были идентифицированы из нижних частей z-стеков (белые стрелки). Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: ТНТ = туннельные нанотрубки; TUBb3 = тубулин β-III. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Схематическое резюме, представляющее подробный протокол анализа конфокальных изображений z-стека. Аббревиатура: TNT = туннельные нанотрубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: 3D-вид реконструкции для выделения одного или двух ТНТ или нейритов одновременно. Плагин "volume view" на Фиджи используется для визуализации представлений xy, yz и xz. 3D-реконструкция показывает нейрит, лежащий в нижней части z-плоскости (белые стрелки в панелях A и C), в то время как TNT выглядят как парящие структуры, которые соединяют две ячейки, не касаясь нижней z-плоскости (желтая стрелка в панелях B и D). Шкала стержней = 10 мкм. Аббревиатура: TNT = туннельные нанотрубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несколько исследователей в течение последних 2 десятилетий пытались понять и охарактеризовать структуру TNT18. Отсутствие специфических маркеров препятствует прогрессу, и существует растущий спрос на удобный, стандартизированный метод, который можно использовать для идентификации, характеристики и количественной оценки ТНТ. ТНТ определяются как мембранные каналы на основе F-актина, которые парят между двумя клетками. Исследования показали, что β-тубулин-положительные, близкие, развивающиеся нейриты парят между двумя отдаленными клетками и напоминают тротилоподобные структуры12,13. Таким образом, ТНТ идентифицируются и отличаются от нейритов и других тротилоподобных структур на основе их позитивности только для актина и для мембранных каналов, которые парят между двумя отдаленными клетками. Исследователям часто бывает сложно получить неповрежденные тротиловые структуры во время фиксации перед визуализацией24. Чтобы преодолеть эту проблему, мы использовали модифицированный фиксирующий раствор с 2,5% глутаральдегидом (фиксатор Карновского) для фиксации нейронных клеток SH-SY5Y, используемых в этомпротоколе 25.

Критическим этапом каждого эксперимента по иммуногистохимии / иммуноцитохимии является фиксация образца, которая зависит от выбора соответствующего фиксирующего агента. Несовершенная фиксация образца может привести к быстрой протеолитической деградации белков-мишеней и снижению специфической иммунореактивности. Гиперфиксация вызывает маскировку эпитопа и неопределенность в специфической маркировке, вызванную неспецифическим фоном. Способ, сроки или продолжительность, температура и рН также влияют на правильную фиксацию клеток26.

Параформальдегид широко используется в качестве фиксирующего агента при иммуноокрашивании клеток. К недостаткам использования параформальдегида в качестве фиксирующего средства можно отнести потерю антигенности и изменение морфологии. Глутаральдегид имеет более низкое осмотическое давление, более стабилен в растворе и легко сшивается, что дает лучшие результаты27. Комбинация формальдегид-глутаральдегид (в фосфатном буфере) фиксатора приводит к исключительной фиксации широкого спектра образцов тканей/клеток. Эта комбинация обеспечивает быструю стабилизацию ультраструктуры клетки формальдегидом с последующей постоянной фиксацией более медленным проникающим действием глутаральдегида28.

ТНТ, которые являются положительными для F-актина и фосфо-ПАК1, отличаются от нейритов на основе их характеристики парения между двумя клетками в 2D-культуре клеток in vitro на плоском субстрате. Идентифицированные ТНТ были обнаружены вручную с помощью 3D-анализа объема, а процентное содержание сформированных ТНТ было рассчитано методом ручного подсчета. Ручной метод затрудняет количественную оценку больших объемов данных, поскольку для этого требуется огромная рабочаясила19. Тем не менее, обученные глаза могут эффективно обнаруживать ТНТ и отличать их от нейритов с большей точностью, чем автоматические методы обнаружения. Существующие методы автоматического обнаружения также трудно реализовать в каждой лаборатории без имеющихся знаний для разработки алгоритма и / или изменения существующего алгоритма в соответствии с требованиями экспериментальной установки. Ручной метод анализа объема 3D облегчает идентификацию мембранных структур, лежащих между ячейками в нижних частях z-стеков и теми, которые парят в средней и верхней частях z-стеков, чтобы четко различать нейриты и ТНТ.

ТНТ можно отличить от других мембранных протрузий, таких как нейриты или опухолевые микротрубки. Однако трудно провести различие между открытыми и закрытыми наноразмерными мембранными трубками, что вызывает следующий вопрос: являются ли они ТНТ или тротилоподобными структурами? За последнее десятилетие было накоплено огромное количество данных, чтобы показать неизбежную роль ТНТ в распространении патологии, устойчивости к раку и терапии17. Поэтому исследователи ищут разработку конкретных производителей, которые изменят область прямой, междугородной межклеточной связи. До тех пор воспроизводимые методы визуализации характеризуются большим спросом, чтобы проложить путь к непрерывному прогрессу в этой области.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

D.K.V и A.R благодарят Академию высшего образования Манипал за стипендию TMA Pai. Мы благодарим Совет по научным и инженерным исследованиям Индии за SERB-SRG (#SRG/2021/001315), а также Индийский совет медицинских исследований Индии (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) и Очный фонд Академии высшего образования Манипал, Манипал, Индия. Мы благодарим конфокальный центр JNCASR (Центр перспективных научных исследований Джавахарлала Неру, Индия) и Б. Суму за конфокальную микроскопию в JNCASR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip Cellvis D35-14-1.5-N Imaging dish used to seed cells for staining experiments
Aβ (1-42) 1 mg AnaSpec #64129 Oligomers of amyloid beta to treat the cells
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11070 Secondary antibody for phospho-PAK1
Biological Safety Cabinet Thermo Scientific (MSC Advantage) 51025411 Provide aspetic conditions duirng cell culture
CO2 Incubator Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) 51026556 For growing cells at or near body temperature
Confocal Laser Scanning Microscope ZEISS (Carl Zeiss) LSM 880 Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] Merck 8034560100 Anti-bleaching reagent
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542-1MG Neuclear stainer
DMEM media Gibco 11965092 Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42)
 DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) Gibco 12500062 Culture media for SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade Cryopur CP-100 Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade Himedia MB058 Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42)
Fetal Bovine Serum Gibco 16000044  Major supplement for Culture media (US origin)
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) Sigma Aldrich HT5014-120ML Component in the Karnovsky's fixative solution
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) Sigma G5882 Component in the Karnovsky's fixative solution
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution TCI H024 Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) National Institute of Health (NIH) Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer".
Lyophilizer Christ, Alpha 2.4 LDplus 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only
Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture Thermo fisher Scientific 15640055 Antibiotic mixture
Phalloidin-iFlor 555 Abcam ab176756 F-actin binding stain
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] CST #2601 Primary antibody
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) Cloud clone PAE711Hu01 Primary antibody
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Differentiating reagent
Saponin Merck 8047-15-2 Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) Ultrasonic Cleaner 3.0 L/3.2 Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42)
ZEN Microscopy software ZEISS (Carl Zeiss) Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  2. Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
  3. Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
  4. Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
  5. Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
  6. Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
  7. Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
  8. Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
  9. Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
  10. Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
  11. Zurzolo, C. Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity. Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).
  12. Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
  13. Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
  14. Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
  15. Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
  16. Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
  17. Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
  18. Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
  19. Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
  20. Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
  21. Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
  22. Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
  23. Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).
  24. Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
  25. Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
  26. Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
  27. Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
  28. Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).

Tags

Биология Выпуск 186 Межклеточный перенос наноструктуры амилоидно-β р21-активированная киназа конфокальные z-стеки объемное 3D-изображение иммуноокрашивание туннельные нанотрубки F-актин
Обнаружение и количественная оценка туннельных нанотрубок с использованием изображений 3D Volume View
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Valappil, D. K., Raghavan, A., Nath, … More

Valappil, D. K., Raghavan, A., Nath, S. Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images. J. Vis. Exp. (186), e63992, doi:10.3791/63992 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter