Summary
I nanotubi a effetto tunnel (TNT) sono principalmente nanotubi di membrana F-actina aperti che collegano le cellule vicine, facilitando la comunicazione intercellulare. La caratteristica notevole che distingue i TNT da altre protrusioni cellulari è la natura sospesa dei nanotubi tra le cellule. Qui, caratterizziamo i TNT costruendo una vista del volume 3D di immagini z-stack confocali.
Abstract
Recenti scoperte hanno rivelato che le cellule eseguono un trasferimento intercellulare diretto, a lungo raggio, tramite condotti su nanometria, membrana di actina, vale a dire "nanotubi tunneling" (TNT). I TNT sono definiti come estensioni di membrana a doppio strato lipidico aperte che mediano la continuità tra cellule vicine di diametro compreso tra 50 nm e 1 μm. I TNT sono stati dimostrati inizialmente nelle cellule neuronali, ma studi successivi hanno rivelato l'esistenza di TNT in diversi tipi di cellule e malattie, come malattie neurodegenerative, infezioni virali e cancro. Diversi studi hanno fatto riferimento a nanostrutture di membrana chiuse e accoppiate elettricamente tra cellule vicine come TNT o strutture simili al TNT.
La spiegazione dell'ultrastruttura in termini di continuità della membrana all'endpoint è tecnicamente impegnativa. Inoltre, gli studi sulla comunicazione cellula-cellula sono impegnativi in termini di caratterizzazione dei TNT utilizzando metodi convenzionali a causa della mancanza di marcatori specifici. I TNT sono principalmente definiti come protrusioni di membrana aperte a base di F-actina. Tuttavia, una delle principali limitazioni è che la F-actina è presente in tutti i tipi di protrusioni, rendendo difficile differenziare i TNT da altre protrusioni. Una delle caratteristiche notevoli dei TNT a base di F-actina è che queste strutture si librano tra due cellule senza toccare il substrato. Pertanto, TNT distinti colorati con F-actina possono essere convenientemente distinti da altre sporgenze come filopodi e neuriti in base al loro librarsi tra le cellule.
Abbiamo recentemente dimostrato che l'internalizzazione dell'amiloide-β oligomerica1-42 (oAβ) attraverso l'endocitosi actina-dipendente stimola la chinasi-1 attivata da p21 attivata (PAK1), che media la formazione di TNT contenenti F-actina coespressi con fosfo-PAK1 tra cellule neuronali SH-SY5Y. Questo protocollo delinea un metodo di analisi del volume 3D per identificare e caratterizzare i TNT dalle immagini z-stack catturate di protrusioni di membrana immunocolorate con F-actina e fosfo-PAK1 in cellule neuronali trattate con oAβ. Inoltre, i TNT si distinguono dallo sviluppo di neuriti e escrescenze neuronali basate su condotti di membrana con tubazione tubulinica F-actina e β-III.
Introduction
I nanotubi a effetto tunnel (TNT) sono condotti di membrana basati su F-actina, principalmente aperti e svolgono un ruolo vitale nel trasferimento intercellulare di carichi e organelli1. La caratteristica unica dei TNT è che collegano le cellule vicine senza alcun contatto con il substrato; Sono lunghi oltre 10-300 μm e i loro diametri variano tra 50 nm e 1 μm 2,3. I TNT sono strutture transitorie e la loro durata dura da pochi minuti a diverse ore. I TNT sono stati dimostrati per la prima volta nelle cellule neuronali PC121; Successivamente, numerosi studi hanno dimostrato la loro esistenza in diversi tipi di cellule in vitro e in vivo 4,5. Diversi studi hanno rivelato il significato patologico dei TNT in vari modelli di malattia, come le malattie neurodegenerative, il cancro e le infezioni virali 6,7,8.
Le eterogeneità strutturali dei TNT sono state dimostrate da diversi studi in vari sistemi cellulari9. Le differenze si basano sulla composizione del citoscheletro, sul meccanismo di formazione e sui tipi di carico trasferiti10. In primo luogo, la continuità di membrana aperta, F-actina-positiva che si libra tra due cellule vicine e trasferisce organelli è considerata costituita da TNT11. Tuttavia, la mancanza di chiarezza o diversità osservata nella formazione dei TNT aumenta la difficoltà nello sviluppo di marcatori specifici per TNT. Pertanto, è difficile identificare le strutture TNT con metodi di rilevamento convenzionali e distinguere i nanotubi di membrana in termini di sporgenze aperte e chiuse12. Tuttavia, la caratteristica dei TNT di librarsi come sporgenze della membrana F-actina tra due cellule è relativamente più facile e più fattibile da identificare utilizzando le tecniche di imaging convenzionali. Altre protrusioni cellulari basate sull'actina come la filopodia e la filopodia dorsale non possono librarsi tra due cellule distanti, in particolare quando le cellule sono fisse. Da notare, i neuriti in via di sviluppo chiusi, accoppiati elettricamente, sono spesso definiti strutture simili a TNT13.
È noto che la F-actina svolge un ruolo importante nella formazione del TNT e diversi studi hanno dimostrato che l'inibitore della F-actina citocalasina D inibisce la formazione di TNT14,15. Al contrario, gli inibitori dei microtubuli non hanno alcun effetto sulla formazione di TNT16. Gli ultimi 2 decenni hanno visto diversi rapporti sul ruolo significativo che i TNT svolgono nella diffusione della patologia e della resistenza e terapia tumorale17. Pertanto, c'è una domanda infinita di tecniche migliori per la caratterizzazione del TNT.
La mancanza di marcatori specifici di TNT e la diversità nella morfologia e nella composizione citoscheletrica rendono difficile lo sviluppo di un metodo unico di caratterizzazione. Alcuni studi hanno utilizzato tecniche di rilevamento automatico delle immagini e quantificazione del TNT18,19. Tuttavia, ci sono diversi vantaggi dell'attuale metodo di analisi manuale del volume 3D rispetto all'analisi automatica delle immagini per il rilevamento e la quantificazione dei TNT. Spesso, gli occhi umani addestrati possono individuare queste nanostrutture sospese più facilmente di un metodo di rilevamento automatico delle immagini. Inoltre, i metodi di rilevamento automatico potrebbero essere difficili da implementare nei laboratori privi di esperienza algoritmica. Il presente metodo potrebbe essere ampiamente adottato dai ricercatori grazie alla sua precisione e riproducibilità.
In uno studio recente, abbiamo dimostrato che oAβ promuove la biogenesi del TNT nelle cellule neuronali attraverso un meccanismo di endocitosi mediato da PAK1, actina-dipendente,12. I TNT indotti da oAβ esprimono anche PAK1 attivato (o fosfo-PAK1). Abbiamo sviluppato un metodo di ricostruzione dell'immagine con vista del volume 3D per distinguere i TNT immunocolorati da oAβ, F-actina e fosfo-PAK1. I neuriti in via di sviluppo positivi alla tubulina β-III assomigliano spesso a strutture sospese simili a TNT20. Quindi, abbiamo ulteriormente distinto i TNT a base di F-actina dai neuriti positivi alla tubulina β-III e da altre sporgenze simili al TNT. Le immagini 3D della vista del volume sono state utilizzate per identificare i TNT sulla base delle loro caratteristiche di librarsi sopra il substrato e rimanere connessi tra due celle vicine. Questo articolo descrive l'identificazione e il rilevamento di condotti a membrana contenenti actina o TNT utilizzando immagini confocali z-stack e, infine, la quantificazione manuale delle strutture identificate da immagini di ricostruzione della vista del volume 3D. Il metodo presentato non è in grado di distinguere i TNT propri aperti dalle strutture simili al TNT chiuse; questo metodo aiuta a identificare i TNT in coltura cellulare 2D in vitro su un substrato piatto. Tuttavia, il metodo è facile da implementare e riprodurre e può essere ampiamente utilizzato per la quantificazione precisa dei soli TNT a base di actina e per distinguerli dai neuriti e dalle strutture simili al TNT positivo alla β-tubulina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Le cellule SH-SY5Y coltivate in terreni DMEM/F-12 sono state differenziate con acido retinoico 10 μM per 7 giorni e trattate con oligomeri oAβ da 1 μM per 2 ore a 37 °C (5% CO2). Dopo il trattamento, le cellule sono state fissate con la soluzione fissativa di Karnovsky e doppiamente immunocolorate con anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) e falloidina legante la F-actina. Successivamente, sono state scattate immagini confocali z-stack utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. I TNT sono stati quantificati mediante conteggio manuale e distinti da altri neuriti / protrusioni cellulari costruendo immagini di visualizzazione del volume 3D e identificando le strutture dalla loro caratteristica di librarsi tra due cellule senza toccare il substrato (Figura 1).
1. Coltura cellulare e differenziamento
- Coltura delle cellule neuronali SH-SY5Y in terreni DMEM/F12 (Ham) 1:1 con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di miscela penicillina-streptomicina-neomicina (PSN). Seminare le cellule in un piatto di imaging da 35 mm con un pozzetto da 14 mm costituito da un coprislip #1.5 al centro del piatto attaccato al fondo. Seminare le cellule sulla piastra di imaging ad una concentrazione di 12.000 cellule / cm2 ed eseguire gli esperimenti al 60% -70% di confluenza.
- Differenziare parzialmente le cellule con acido retinoico (RA) 10 μM da una soluzione madre da 100 mM (5 mg di RA in 15 ml di dimetilsolfossido [DMSO]). Quindi, incubare le cellule per 7 giorni a 37 °C (5% CO 2) per la differenziazione con cambio di terreno ogni2 giorni.
NOTA: Fare attenzione a mantenere la confluenza (60%-70%) delle cellule (sia cellule indifferenziate che parzialmente differenziate). La densità cellulare può influenzare la formazione di TNT tra le cellule.
2. Preparazione di oligomeri di amiloide-β1-42 (oAβ) per il trattamento delle cellule neuronali
- Sciogliere Aβ 1-42 (1 mg) in 200 μL di 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo e dividere la soluzione in 20 aliquote, ciascuna contenente 0,05 mg di peptidi. Liofilizzare e conservare le aliquote a -20 °C per un uso successivo.
- Preparare la soluzione madre (5 mM) dell'Aβ 1-42 liofilizzato in DMSO aggiungendo 2,2 μL di DMSO a 0,05 mg di peptide liofilizzato. Per sciogliere accuratamente i peptidi, vortice la soluzione e sonicare per 2 minuti in un sonicatore a bagnomaria.
- Diluire la soluzione madre ad una concentrazione di 100 μM in DMEM, pH 7,4, e vortice per convertire i peptidi in monomeri, seguita dall'incubazione a 4 °C per 24 ore per ottenere oligomeri di Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22.
- Caratterizzare oAβ prima degli esperimenti come riportato in precedenza21,22 mediante microscopia elettronica a trasmissione.
- Trattare le cellule SH-SY5Y parzialmente differenziate con 1 μM oAβ. Rimuovere il mezzo prima dei trattamenti e aggiungere DMEM fresco privo di FBS. Dopo la modifica del terreno, aggiungere oAβ (100 μM) precedentemente preparato al mezzo fino ad una concentrazione finale di 1 μM. Incubare le cellule con 1 μM oAβ per 2 ore a 37 °C (5% CO2). Includere un controllo negativo sotto forma di cellule non trattate.
3. Immunocolorazione di F-actina e PAK1 attivato per la caratterizzazione di TNT
- Eseguire l'immunocolorazione differenziale utilizzando l'anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) e la fallotossina falloidina legante la F-actina.
- Lavare le cellule di controllo e trattate con oAβ con 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per 2 x 2 minuti prima della fissazione. Preparare la soluzione fissativa di Karnovsky utilizzando il fissativo in formalina al 2% e glutaraldeide al 2,5% disciolto in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,2. Quindi, fissare le cellule nella parabola di imaging aggiungendo la soluzione fissativa di Karnovsky (quanto basta per coprire le cellule) per 45 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le celle fisse 2 x 2 min utilizzando il tampone di incubazione. Preparare il tampone di incubazione (20x) sciogliendo 0,1 g di saponina in 5 mL di FBS e diluire a 1x aggiungendo 95 mL di 1x PBS.
- Dopo la fissazione, aggiungere il primo anticorpo contro phopho-PAK1 ad una diluizione di 1:250 nel tampone di incubazione e incubare per una notte a 4 °C in una camera umida buia.
- Il giorno successivo, dopo 24 ore di incubazione, lavare le cellule 2 x 2 min con il tampone di incubazione; quindi, aggiungere l'anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor 488 (diluizione 1:1.000) e Phalloidin 555 (diluizione 1:1.000). Incubare le cellule nella camera umida buia per 1,5 ore a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione, lavare le cellule 2 x 2 minuti con tampone di incubazione. Colorare il nucleo aggiungendo 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in una diluizione 1:2.000 e incubare per 5 minuti a 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Preparare il mezzo di montaggio DABCO utilizzando 25 mg di DABCO in glicerolo al 90% e 10% 1x PBS. Per sciogliere correttamente, regolare il pH a 8,6 utilizzando il grado spettrofotometrico, diluire HCl (diluito 1:20 con acqua) e mantenere la soluzione su un bilanciere per la miscelazione.
- Come agente anti-sbiancamento, aggiungere il supporto di montaggio DABCO direttamente sulla piastra di imaging contenente il vetrino di copertura nella parte inferiore. Attendere almeno 1-2 ore e procedere direttamente all'esecuzione dell'imaging confocale.
NOTA: Non sono necessari adesivi per fissare i vetrini.
4. Immunocolorazione della tubulina F-actina e β-III per distinguere i TNT dai neuriti
- Eseguire l'immunocolorazione differenziale con l'anticorpo della tubulina β-III e la fallotossina falloidina legante la F-actina.
- Lavare le cellule trattate con oAβ 2x con 1x PBS prima di aggiungere la soluzione fissativa di Karnovsky. Incubare le cellule per 45 minuti a temperatura ambiente e lavare le celle 2 x 2 minuti con tampone di incubazione.
- Dopo la fissazione, aggiungere l'anticorpo contro la tubulina β-III (TUBb3) ad una diluizione di 1:250 nel tampone di incubazione e incubare a 4 °C per una notte nella camera umida buia.
- Il giorno successivo, lavare le cellule con tampone di incubazione (2 x 2 min) e aggiungere l'anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor 488 (diluizione 1:1.000) e Phalloidin 555 (diluizione 1:1.000) insieme allo stesso piatto. Quindi, incubare le cellule per 1,5 ore a temperatura ambiente nella camera umida buia.
- Lavare le celle 2 volte con tampone di incubazione e aggiungere DAPI a colorazione nucleare in una diluizione 1:2.000 per 5-10 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Aggiungere l'agente anti-sbiancante DABCO nel mezzo di montaggio come menzionato sopra e attendere 2 ore prima di eseguire l'imaging.
5. Imaging con microscopia confocale
- Per identificare i TNT, acquisire immagini z-stack di cellule immunocolorate utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Scatta le immagini utilizzando l'obiettivo DIC dell'olio 40x/1.40 con set di filtri DAPI, isotiocianato di fluoresceina (FITC) e tetrametilrodamina (TRITC).
- Innanzitutto, selezionare i canali facendo clic sui laser richiesti in sequenza nelle finestre Traccia 1, Traccia 2 e Traccia 3 nel software confocale. Fare clic sull'opzione T-PMT sotto la finestra Traccia 1 per acquisire le immagini DIC (Differential Interference Contrast) con canali di fluorescenza.
NOTA: le immagini DIC vengono acquisite da un rilevatore diverso etichettato come T-PMT. - Selezionare la scheda di acquisizione del software, fare clic sulla scheda Z-stack e attendere che si apra una finestra. Quindi, fai clic su Live Scan per mettere a fuoco le celle nella parte inferiore del piatto. Selezionare l'immagine focalizzata come prima pila. Quindi, concentrati verso l'alto per vedere la parte più in alto della cella e selezionala come ultima pila. Interrompere la scansione in tempo reale e fare clic sul numero accanto alla scheda ottimale per correggere la dimensione del passo delle pile. La dimensione del passo determina il numero di sezioni e gli intervalli in base allo spessore delle celle.
NOTA: la dimensione del passo verrà selezionata in base al campionamento di Nyquist per prendere abbastanza fette e garantire che non ci siano spazi vuoti tra le due pile. Il campionamento di Nyquist è determinato sulla base dell'obiettivo e delle lunghezze d'onda delle luci23. - Acquisisci immagini sequenziali di tre canali DAPI, FTICC e TRITC con laser a 405 nm, 488 nm e 561 nm e acquisisci con un tempo di permanenza dei pixel di 1,02 μs. Cattura immagini nel canale DIC con canali di fluorescenza per osservare il confine cellulare.
- Cattura una pila di immagini con le dimensioni di x: 224,92 μm e y: 224,92 μm, con ogni pixel di dimensioni 220 nm2 e scala z di 415 nm.
- Scatta immagini catturando diversi z-stack (15-22 stack) dal basso verso l'alto delle celle. Acquisire almeno 10 immagini dal campo casuale del piatto di coltura per ottenere un totale di ~ 200-300 cellule.
- Analizza le immagini acquisite offline per identificare i TNT mediante l'analisi della vista del volume 3D
6. Analisi di immagini confocali z-stack per identificare e quantificare TNT
- Aprire le immagini confocali salvate in formato dati .czi nel software Fiji per l'analisi.
- Selezionare l'opzione Hyperstack per visualizzare ogni z-stack e canale dell'immagine. Cercare gli hyperstack degli z-stack e dei canali, che si aprono in un'unica finestra, come illustrato nella Figura 2. Scorri le barre di scorrimento del canale (indicato da frecce rosse e verdi) e z-stack (indicato da frecce blu) per selezionare lo stack esatto di un particolare canale di interesse.
NOTA: Nelle celle fisse, poiché i TNT sospesi o i condotti della membrana rimangono sopra la superficie, le strutture non sono visibili nelle parti inferiori delle pile z. Tuttavia, nelle cellule fisse, i neuriti giacciono sulla superficie e sono rilevabili nelle parti inferiori delle z-stack (z = da 0 a 2). Vedere la Figura 2 per i passaggi di identificazione. - Come mostrato nella Figura 2, selezionare prima il canale colorato di F-actina (indicato da frecce rosse) scorrendo la barra del canale. Quindi, scorri manualmente le pile z (indicate da frecce blu) per vedere ogni pila una per una. Identificare le strutture colorate con F-actina che sembrano collegare le cellule, sono visibili nelle parti inferiori delle pile z e sono vicine alla superficie della parabola di imaging (z = 2) come neuriti (indicate da frecce bianche).
NOTA: La maggior parte dei neuriti sono facili da identificare in quanto appaiono come sporgenze estese (indicate da frecce rosa). - Identificare i TNT, i condotti cellula-cellula F-actina-positivi, scorrendo le pile z verso l'alto (da z = 4 nella Figura 2; indicato da frecce gialle). Cerca i neuriti vicino alle parti inferiori delle pile di z verso la superficie e osserva che iniziano a scomparire con lo scorrimento delle pile di z verso l'alto (a z = 6 nella Figura 2; i neuriti non sono chiaramente visibili).
- Identificare i TNT fosfo-PAK1-positivi in modo simile ai TNT F-actina-positivi analizzando la natura sospesa dei condotti dagli z-stack. Poiché la colorazione fosfo-PAK1 è più debole della colorazione F-actina, cerca TNT colorati con phopho-PAK1 a z = 4 (debolmente visibile) e a z = 6 (prominente).
- Inoltre, osservare le immagini DIC per verificare che le strutture TNT colorate con F-actina e fosfo-PAK1 siano condotti di membrana tra le cellule (Figura 3). Inoltre, unire i canali F-actina (rosso) e fosfo-PAK1 (verde) per verificare che i TNT identificati siano strutture co-colorate con F-actina e fosfo-PAK1 (Figura 3).
- Per quantificare i TNT, contare manualmente i numeri totali di celle e i TNT identificati e rappresentare i numeri come percentuali.
- Per distinguere i TNT F-actina-positivi e i condotti sospesi positivi alla tubulina β-III (TUBb3), simili al TNT, dalle immagini z-stack, unire i canali F-actina (rosso) e TUBb3 (verde) (Figura 4). Quindi, analizza gli z-stack delle immagini unite.
- Cerca esclusivamente TNT colorati con F-actina che sono debolmente visibili a z = 3 e prominenti a z = 6 e z = 9 (frecce gialle). Allo stesso modo, identificare F-actina e tubulina β-III (TUBb3) doppiamente positivi, condotti sospesi simili a TNT a z = 6 e z = 9 (frecce ciano). Identificare altre sporgenze non sospese colorate con tubulina F-actina e β-III dalle parti inferiori delle pile z (frecce bianche).
- Misurare il diametro dei TNT utilizzando lo strumento linea nelle Figi. Verificare la scala di misurazione facendo clic su Analizza | Impostare Scala in modo che la "distanza in pixel" venga impostata automaticamente dalle immagini .czi. Misurare i diametri dei TNT sul piano xy.
NOTA: la maggior parte dei diametri sono compresi tra 1 pixel e 4 pixel (cioè 220-880 nm); Ogni pixel è di 220 nm. Vedere la Figura 5 per un riepilogo del protocollo per l'analisi delle immagini confocali z-stack.
7.3D ricostruzione di immagini z-stack per caratterizzare TNT
- Utilizzare il plug-in del visualizzatore di volumi nelle Figi, che consente il reslicing 3D e la visualizzazione 3D abilitata alla soglia (Figura 6).
- Dividi le immagini z-stack in singoli canali. Quindi, ritagliate le immagini z-stack a canale singolo (canale F-actina) per utilizzare la vista di ricostruzione 3D per evidenziare uno o due TNT o neuriti alla volta. Abilita il plug-in di visualizzazione del volume per visualizzare le viste xy, yz e xz.
- Fissare un singolo TNT o neurite nel piano xy (le frecce bianche rappresentano i neuriti nella Figura 6A; le frecce gialle rappresentano i TNT nella Figura 6B) e contrassegnare le sezioni trasversali degli assi xz (rosso) e yz (verde). Osservare i neuriti nella parte inferiore del piano xz nei piani xz e yz (frecce bianche, Figura 6A) e i TNT nelle pile z superiori (frecce gialle, Figura 6B).
- Selezionare il singolo TNT o neurite per ricostruire la vista del volume 3D nel piano xz (Figura 6C, D). Nella ricostruzione 3D, osservare i neuriti nella parte inferiore del piano z (frecce bianche, Figura 6C) e i TNT che appaiono come strutture sospese che collegano due celle senza toccare il piano z inferiore (frecce gialle, Figura 6D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Qui, identifichiamo e caratterizziamo i TNT indotti da oAβ nelle cellule neuronali SH-SY5Y costruendo viste del volume 3D da immagini confocali z-stack (Figura 1). Le cellule sono state doppiamente immunocolorate con F-actina e fosfo-PAK1. Sono state analizzate immagini z-stack confocali di cellule immunocolorate per identificare i TNT (Figura 2). Inoltre, le immagini DIC sono state analizzate per verificare che le strutture TNT colorate con F-actina e fosfo-PAK1 fossero condotti di membrana tra le cellule (Figura 3). Inoltre, le cellule sono state doppiamente immunocolorate con F-actina e tubulina β-III (Figura 4). I condotti di membrana a doppio positivo della tubulina F-actina simile al TNT e della tubulina β-III sono stati distinti dai soli TNT F-actina-positivi (Figura 4). I TNT coespressi con fosfo-PAK1 (o PAK1 attivato) e F-actina sono stati distinti da altri neuriti/protrusioni cellulari costruendo immagini 3D basate sulla loro caratteristica di librarsi tra due cellule senza toccare il substrato (Figura 6). I TNT identificati sono stati individuati manualmente e la percentuale di TNT è stata calcolata con precisione dalle immagini di visualizzazione del volume 3D. Anche il diametro e la lunghezza dei TNT sono stati determinati analizzando i TNT identificati individualmente.
Figura 1: Diagramma schematico che rappresenta il riepilogo del protocollo del metodo di rilevamento dei TNT. Barra di scala = 100 μm per immagini al microscopio (in alto); 10 μm (viste del volume 3D). Abbreviazioni: oAβ = amiloide-oligomerica β1-42; PAK1 = chinasi-1 attivata da p21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Analisi di immagini confocali z-stack per identificare e quantificare i TNT. Le immagini confocali z-stack sono state analizzate nel software Fiji. Hyperstack di z-stack e canali aperti in un'unica finestra che mostra (A) F-actina e (B) fosfo-PAK1. Scorrendo le barre di scorrimento del canale (indicato da frecce rosse e verdi) e z-stack (indicato da frecce blu), sono stati analizzati i singoli stack di un particolare canale di interesse. (A) Le strutture colorate con F-actina che collegano le cellule, visibili nelle parti inferiori delle pile z, e considerate vicine alla superficie del piatto immagine (z = 2) sono state identificate come neuriti (indicate da frecce bianche). Al contrario, i condotti sospesi da cella a cellula visibili nelle parti più alte delle pile z sono stati identificati come TNT (indicati da frecce gialle). (B) Allo stesso modo, sono stati identificati neuriti e TNT colorati con fosfo-PAK1. Altre brevi sporgenze F-actina-positive che non sono collegate alle cellule vicine sono indicate da frecce rosa. Barre della scala = 10 μm. Abbreviazioni: TNT = tunneling nanotubes; PAK1 = chinasi-1 attivata da p21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Analisi delle immagini DIC per confermare i TNT. (A) Sono state osservate immagini DIC per verificare che i TNT colorati con F-actina e fosfo-PAK1 e le sporgenze dei neuriti fossero effettivamente condotti di membrana. (B) Inoltre, i canali F-actina (rosso) e fosfo-PAK1 (verde) sono stati fusi per verificare che i TNT identificati indotti da oAβ fossero strutture co-colorate con F-actina e fosfo-PAK1. Barre della scala = 10 μm. Abbreviazioni: TNT = tunneling nanotubes; DIC = contrasto di interferenza differenziale; PAK1 = chinasi-1 attivata da p21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Immagini confocali z-stack analizzate utilizzando il software delle Fiji per distinguere solo i TNT colorati con F-actina dalla tubulina β-III e dai condotti sospesi a doppia colorazione di F-actina simili al TNT. In primo luogo, i canali F-actina (rosso) e TUBb3 (verde) degli hyperstack sono stati uniti. Quindi, le immagini unite sono state aperte in un'unica finestra. Scorrendo le barre di scorrimento z-stack, sono stati identificati esclusivamente TNT colorati con F-actina; questi erano debolmente visibili a z = 3 e prominenti a z = 6 e z = 9 (frecce gialle, B). Allo stesso modo, F-actina e TUBb3 doppi positivi, condotti sospesi simili a TNT erano rilevabili a z = 6 e z = 9 (frecce ciano, A). Altre sporgenze di tubulina F-actina e β-III, non sospese, sono state identificate dalle parti inferiori delle pile z (frecce bianche). Barre della scala = 10 μm. Abbreviazioni: TNTs = tunneling nanotubes; TUBb3 = tubulina β-III. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Riepilogo schematico che rappresenta il protocollo dettagliato per l'analisi di immagini confocali z-stack. Abbreviazione: TNTs = tunneling nanotubes. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Vista di ricostruzione 3D per evidenziare uno o due TNT o neuriti alla volta. Il plugin "volume view" nelle Fiji viene utilizzato per visualizzare le viste xy, yz e xz. La ricostruzione 3D mostra il neurite che giace nella parte inferiore del piano z (frecce bianche nei pannelli A e C), mentre i TNT appaiono come strutture sospese che collegano due celle senza toccare il piano z inferiore (freccia gialla nei pannelli B e D). Barre della scala = 10 μm. Abbreviazione: TNTs = tunneling nanotubes. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diversi ricercatori negli ultimi 2 decenni hanno cercato di capire e caratterizzare la struttura dei TNT18. La mancanza di marcatori specifici ostacola il progresso e vi è una crescente domanda di un metodo conveniente e standardizzato che possa essere utilizzato per identificare, caratterizzare e quantificare i TNT. I TNT sono definiti come condotti di membrana a base di F-actina che si librano tra due cellule. Gli studi hanno dimostrato che i neuriti in via di sviluppo β-tubulina-positivi, vicini e in via di sviluppo si librano tra due cellule distanti e assomigliano a strutture simili a TNT12,13. Pertanto, i TNT sono identificati e distinti dai neuriti e da altre strutture simili al TNT in base alla loro positività per la sola actina e per essere condotti di membrana che si librano tra due cellule distanti. I ricercatori spesso trovano difficile ottenere strutture TNT intatte durante la fissazione prima di imaging24. Per superare questo problema, abbiamo usato una soluzione fissativa modificata con glutaraldeide al 2,5% (fissativo di Karnovsky) per fissare le cellule neuronali SH-SY5Y utilizzate in questo protocollo25.
Un passaggio critico di ogni esperimento di immunoistochimica / immunocitochimica è la fissazione del campione, che si basa sulla selezione dell'agente fissativo appropriato. Una fissazione imperfetta del campione può portare a una rapida degradazione proteolitica delle proteine bersaglio e ad una riduzione dell'immunoreattività specifica. La sovrafissazione causa il mascheramento dell'epitopo e l'incertezza nell'etichettatura specifica causata dallo sfondo non specifico. Anche il metodo, i tempi o la durata, la temperatura e il pH influenzano la corretta fissazione delle cellule26.
La paraformaldeide è ampiamente utilizzata come agente fissativo nell'immunocolorazione delle cellule. Gli svantaggi dell'uso della paraformaldeide come agente fissativo includono la perdita di antigenicità e cambiamenti nella morfologia. La glutaraldeide ha una pressione osmotica più bassa, è più stabile in soluzione e reticolazione facilmente, dando così risultati migliori27. Una combinazione di fissativo formaldeide-glutaraldeide (in tampone fosfato) si traduce in una fissazione eccezionale di una vasta gamma di campioni di tessuto / cellula. Questa combinazione consente una rapida stabilizzazione dell'ultrastruttura della cellula da parte della formaldeide, seguita da una fissazione permanente dall'azione penetrante più lenta della glutaraldeide28.
I TNT positivi per F-actina e fosfo-PAK1 si distinguono dai neuriti in base alla loro caratteristica di librarsi tra due cellule in coltura cellulare 2D in vitro su un substrato piatto. I TNT identificati sono stati individuati manualmente con l'analisi della vista del volume 3D e le percentuali di TNT formate sono state calcolate mediante conteggio manuale. Il metodo manuale rende difficile la quantificazione di grandi quantità di dati poiché richiede un'immensa manodopera19. Tuttavia, gli occhi allenati possono individuare i TNT in modo efficiente e distinguerli dai neuriti con una precisione migliore rispetto ai metodi di rilevamento automatico. I metodi di rilevamento automatico esistenti sono anche difficili da implementare in ogni laboratorio senza le competenze disponibili per sviluppare un algoritmo e / o modificare l'algoritmo esistente come richiesto per la configurazione sperimentale. Il metodo manuale di analisi della vista del volume 3D rende più facile identificare le strutture di membrana che si trovano tra le cellule nelle parti inferiori degli z-stack e quelle che si librano nelle parti centrali e superiori delle z-stack per distinguere chiaramente tra neuriti e TNT.
I TNT possono essere distinti da altre sporgenze di membrana come neuriti o microtubi tumorali. Tuttavia, è difficile distinguere tra tubi a membrana aperti e chiusi, di dimensioni nanometriche, il che solleva la seguente domanda: sono TNT o strutture simili al TNT? Dall'ultimo decennio, è stata accumulata un'enorme quantità di dati per mostrare l'inevitabile ruolo dei TNT nella diffusione della patologia, della resistenza al cancro e della terapia17. Pertanto, i ricercatori sono alla ricerca dello sviluppo di produttori specifici che cambieranno il campo della comunicazione intercellulare diretta e a lunga distanza. Fino ad allora, i metodi di caratterizzazione dell'imaging riproducibile sono molto richiesti per aprire la strada a continui progressi nel campo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.
Acknowledgments
D.K.V e A.R ringraziano la Manipal Academy of Higher Education per la borsa di studio TMA Pai. Ringraziamo il Science and Engineering Research Board of India per SERB-SRG (#SRG/2021/001315), nonché l'Indian Council of Medical Research of India (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) e il fondo intramurale della Manipal Academy of Higher Education, Manipal, India. Ringraziamo la struttura confocale del JNCASR (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, India) e B. Suma per la microscopia confocale in JNCASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
- Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
- Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
- Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
- Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
- Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
- Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
- Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
- Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
- Zurzolo, C.
- Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
- Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
- Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
- Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
- Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
- Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
- Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
- Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
- Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
- Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).
- Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
- Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
- Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
- Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).
