Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En elektroporationsmetode til at omdanne Rickettsia spp. med en fluorescerende proteinekspressiv shuttlevektor i flåtcellelinjer

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64562
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Minnesota

Summary

Elektroporation er en hurtig, bredt vedtaget metode til at indføre eksogent DNA i slægten Rickettsia. Denne protokol giver en nyttig elektroporationsmetode til omdannelse af obligatoriske intracellulære bakterier i slægten Rickettsia.

Abstract

Rickettsioses er forårsaget af en bred vifte af obligatoriske intracellulære bakterier, der tilhører slægten Rickettsia , der kan overføres til hvirveldyrværter gennem bid af inficerede leddyrvektorer. Til dato er nye eller genopståede epidemiske rickettsioser fortsat en folkesundhedsrisiko på grund af vanskeligheden ved diagnosen, da diagnostiske metoder er begrænsede og ikke standardiserede eller universelt tilgængelige. Fejldiagnose som følge af manglende anerkendelse af tegn og symptomer kan resultere i forsinket antibiotikabehandling og dårlige sundhedsresultater. En omfattende forståelse af Rickettsia-egenskaber ville i sidste ende forbedre klinisk diagnose, vurdering og behandling med forbedret kontrol og forebyggelse af sygdommen.

Funktionelle undersøgelser af rickettsiale gener er afgørende for at forstå deres rolle i patogenese. Dette papir beskriver en procedure for elektroporation af Rickettsia parkeri-stammen Tate's Hell med shuttle-vektoren pRAM18dSFA og udvælgelsen af transformeret R. parkeri i flåtcellekultur med antibiotika (spectinomycin og streptomycin). En metode er også beskrevet til lokalisering af transformeret R. parkeri i flåtceller ved anvendelse af konfokal immunfluorescensmikroskopi, en nyttig teknik til kontrol af transformation i vektorcellelinjer. Lignende tilgange er også velegnede til omdannelse af andre rickettsiae.

Introduction

Rickettsioses er forårsaget af en bred vifte af obligatoriske intracellulære bakterier, der tilhører slægten Rickettsia (familie Rickettsiaceae, orden Rickettsiales). Slægten Rickettsia er klassificeret i fire hovedgrupper baseret på fylogenetiske egenskaber1,2: den plettede febergruppe (SFG), som indeholder de rickettsiae, der forårsager de mest alvorlige og dødelige flåtbårne rickettsioser (f.eks. Rickettsia rickettsii, det forårsagende middel til Rocky Mountain Spotted Fever), tyfusgruppen (TG, fx Rickettsia prowazekii, agent for epidemisk tyfus), overgangsgruppen (TRG, f.eks. Rickettsia felis, det forårsagende middel til loppebåren plettet feber) og forfædregruppen (AG, f.eks. Rickettsia bellii).

Blandt de ældste kendte vektorbårne sygdomme erhverves rickettsioser hovedsageligt efter overførsel af patogenerne gennem bid af inficerede leddyrvektorer, herunder flåter, lopper, lus og mider 3,4. Selvom opdagelsen af effektive antibiotika forbedrede behandlingsresultaterne, udfordrer nye og genopståede epidemiske rickettsioser fortsat traditionelle forebyggelses- og kontrolstrategier. Således ville en omfattende forståelse af rickettsia / vært / vektorinteraktioner i sidste ende etablere et stærkt fundament for at udvikle nye tilgange til forebyggelse og helbredelse af disse gamle sygdomme.

I naturen forekommer vandret genoverførsel (HGT) i bakterier gennem konjugation, transduktion og transformation5. In vitro bakteriel transformation udnytter disse HGT-begreber, selvom den intracellulære karakter af rickettsiae giver nogle udfordringer. De begrænsede vækstbetingelser og dårligt forstået konjugations- og transduktionssystemer i forskellige arter af rickettsiae har forhindret anvendelsen af konjugations- og transduktionsmetoder i rickettsiae 6,7,8. Sammenlignet med andre obligatoriske intracellulære bakterieslægter (f.eks. Chlamydia, Coxiella, Anaplasma og Ehrlichia) adskiller slægten Rickettsia sig med hensyn til vækst- og replikationsstrategier inden for cellecytoplasmaet, hvilket medfører specifikke udfordringer for den genetiske modifikation af rickettsiae på grund af deres unikke livsstilstræk9.

Den første forhindring, der skal overvindes, når man forsøger genetisk modifikation af rickettsiae, er at opnå en vellykket transformation. Således ville design af en gennemførlig tilgang med høj transformationseffektivitet være yderst værdifuld for udvikling af genetiske værktøjer til rickettsiae. Her fokuserer vi på elektroporation, en bredt anerkendt transformationsmetode, der er blevet brugt til at introducere eksogent DNA med succes i flere arter af rickettsiae, herunder Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii og Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.

Dette papir beskriver en procedure for elektroporation af R. parkeri-stammen Tate's Hell (tiltrædelse: GCA_000965145.1) med shuttlevektoren pRAM18dSFA afledt af Rickettsia amblyommatis-stammen AaR/SC-plasmid pRAM18, der er konstrueret til at kode mKATE, et langt rødt fluorescerende protein, og aadA, hvilket giver spectinomycin og streptomycinresistens13,15,20. Transformeret R. parkeri er levedygtige og stabilt vedligeholdt under antibiotikaudvælgelse i flåtcellelinjer. Derudover viser vi, at lokaliseringen af transformeret R. parkeri i levende flåtceller via konfokal mikroskopi kan bruges til at vurdere kvaliteten af transformationshastigheder i vektorcellelinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Formering og oprensning af R. parkeri fra flåtcellekultur

BEMÆRK: Alle cellekulturprocedurer skal udføres i et klasse II biosikkerhedsskab.

  1. Forberede R. parkeri-inficerede flåtceller
    1. Dyrk ISE6-celler i 25 cm 2-cellekulturkolber ved 34 ° C i 5 ml L15C300 medium17, suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 5% tryptosephosphat bouillon (TPB) og 0,1% lipoproteinkoncentrat (LPC).
      BEMÆRK: ISE6 (Ixodes scapularis embryo-derived cell line) er en flåtcellelinje, der i vid udstrækning anvendes i mange laboratorier og er således en vigtig model til at studere flåtpatogeninteraktioner17,18,19. Væksten i ISE6-celler er langsommere end for pattedyrceller med en befolkningsfordoblingstid på ≥72 timer. For eksempel vil ISE6-celler, der er underdyrket fra en 100% sammenflydende kultur i et forhold på 1: 5, tage 3-4 uger at genvinde 100% sammenløb. Sunde ISE6-celler vil generelt blive afrundet med adskillige klæbende filamenter17.
    2. Tæl ISE6-cellerne med et hæmocytometer under et lysmikroskop. Brug i en koncentration på ~ 106 celler / ml (100% sammenflydende).
      1. Skyl forsigtigt cellerne fra kolben med medium og disperger cellerne ved pipettering for at generere en homogen cellesuspension. Tilsæt 20 μL cellesuspension mellem hæmocytometeret og dækglasset for at tælle cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
    3. Tilføj værtscellefri vildtype R. parkeri 20 (gennemsnitligt antal: 5 × 10 7-10 × 107) til ISE6-cellekulturerne i 25 cm2-cellekulturkolber. Inkubere inficerede R. parkeri-cellekulturer ved 34 °C i 5 ml komplet medium bestående af L15C300-medium, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% natriumbicarbonat (NaHCO3) og 25 mM HEPES, indtil 90%-100% af cellerne er inficeret.
      BEMÆRK: Infektionshastigheden for R. parkeri i ISE6-celler bestemmes af Giemsa-farvning, og inkubationstiden for at nå 90% -100% infektion varierer fra 5 dage til 7 dage i gennemsnit.
    4. Bestem infektionshastigheden via Giemsa-farvning.
      1. I biosikkerhedsskabet resuspenderes de inficerede cellekulturer og overføres 50 μL af suspensionen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
      2. Suspensionen fortyndes med komplet medium (1:5 fortynding) og centrifuge 100 μL på glasmikroskopglas med en centrifuge ved 113 × g i 5 min. For at holde levende R. parkeri indesluttet skal du bruge en centrifuge med en forseglet rotor, der er designet til at blive fjernet fra centrifugen. Dette muliggør transport af den forseglede rotor ind og ud af emhætten.
        BEMÆRK: Da R. parkeri stadig er i live før centrifugering, skal prøven indeholdes, indtil rickettsia dræbes. Således skal centrifugen, der bruges til at dreje R. parkeri-kulturen på rutsjebanen, have en forseglet rotor, der er designet til at blive løftet ud af centrifugen. Med rotoren i den laminære strømningshætte indlæses prøverne i tragtmikroskopets glideenhed, genforsegles rotoren, og den forseglede rotor placeres tilbage i centrifugen. Tænd derefter centrifugen, og prøverne deponeres på mikroskopglassene. Når kørslen er færdig, skal du fjerne den forseglede rotor fra centrifugen og placere den i den laminære strømningshætte. Der skal du åbne rotorlåget og losse tragtmikroskopets glideenhed inde i emhætten. Når det er tørt, nedsænkes glasmikroskopet i absolut methanol, som dræber alle patogener. Tragterne og metalbærerne er nedsænket i fortyndet DMQ, som dræber R. parkeri.
      3. Lufttørring af diasene og fastgør i absolut methanol i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
      4. Plet rutsjebanerne med Giemsa-plet (4% i Sørensons buffer, pH 6,6) i 30 min ved 37 °C og skyl med vand i 5 s.
      5. Infektionsprocenten (antal celler inficeret med rickettsiae / 100 celler) bestemmes ved lysmikroskopi.
        BEMÆRK: Figur 1 viser typiske Giemsa-pletresultater.
  2. Forberedelse af cellefri R. parkeri
    BEMÆRK: Når 90% -100% af cellerne i kulturen er inficeret, skal rickettsiae isoleres fra ISE6-cellerne, og elektroporation skal udføres.
    1. Tilsæt sterilt 60-90 siliciumcarbidgrus til sterile 2 ml mikrocentrifugerør til et volumen på ca. 0,2 ml.
    2. 2 ml medium fjernes fra 100 % R. parkeri-inficerede kulturer (trin 1.1.3), og cellerne suspenderes i de resterende 3 ml medium.
    3. Der overføres lige store dele af denne suspension til rør fremstillet i trin 1.2.1.
    4. Vortex hvert rør med høj hastighed i 30 s og læg derefter rørene på is. Lad gruset sætte sig inden for få sekunder efter tyngdekraften.
    5. I et klasse II biosikkerhedsskab skal du have en steril 5 ml Luer-lock-sprøjte klar med stemplet forlænget og enden af stemplet fastgjort i en polystyrenbase til 15 ml koniske rør.
    6. Ved hjælp af en steril 1 ml barrierepipetspids monteret på en passende piptor skal du fjerne supernatanten af hvirvelcellelysat fra røret, idet du sørger for ikke at aspirere noget grus. Sæt pipetspidsen ind i åbningen af sprøjtens nav, og skub indholdet ud i sprøjten med et let tryk. Alternativt kan du bruge en steril, barriere 2 ml Pasteur pipette, der betjenes med en gummipære.
    7. Fastgør et steriliseret 2 μm porestørrelsesfilter på sprøjtenavet, og filtrer R. parkeri-kulturen fra trin 1.2.6 til sterile 1,5 ml rør.
    8. R. parkeri opsamles ved centrifugering ved 13.600 × g ved 4 °C i 5 min., og supernatanten kasseres.
    9. Pelleten genudsættes i 1,2 ml iskold 300 mM saccharose og centrifugeres igen ved 13.600 × g ved 4 °C i 5 min. Gentag resuspension og centrifugering i alt to saccharosevaske.
    10. Kombiner R. parkeri-pellets i et kølet, sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør i 50 μL iskold 300 mM saccharose pr. transformation. Da en 25 cm2 kolbe R. parkeri giver nok rickettsiae til to til tre transformationer, tilsættes 100-150 μL 300 mM kold saccharose.
      BEMÆRK: Hvis det ønskes, kan antallet af rickettsiae beregnes ved hjælp af et Petroff-Hausser tællekammer. Ved brug af en indledende podning på 5 × 10 7 -10 × 10 7 cellefri R. parkeri, vil det i gennemsnit tage 5-7 dage at nå 90% -100% infektion, hvilket giver ca. 5 × 107-10 × 1010 cellefri R. parkeri.
    11. Forsigtigt resuspender pelleten ved pipettering, indtil den er grundigt spredt. Prøven opdeles i 50 μL portioner i kølede, sterile 1,5 ml mikrocentrifugerør.
      BEMÆRK: Hvis det ønskes, kan rickettsial levedygtighed vurderes ved flowcytometri efter farvning med et fluorescerende farvestof 21.

2. Transformation af R. parkeri med pRAM18dSFA-plasmidet

  1. På is tilsættes 3 μg endotoksinfri pRAM18dSFA plasmid-DNA13,15,20 til hvert rør indeholdende 50 μL R. parkeri-suspension og omrør blandingen med pipetspidsen forsigtigt, men grundigt.
    BEMÆRK: Når du forbereder plasmid-DNA, skal du bruge et oprensningssæt, der inkluderer et trin til fjernelse af endotoksin for at give endotoksinfrit plasmid-DNA23. Vi fandt, at en række plasmidkoncentrationer på mellem 1 μg og 3 μg pr. 50 μL R. parkeri-suspension resulterede i vellykkede transformationer, mens forøgelse af mængden af plasmid til 10 μg hæmmede transformation.
  2. Overfør ovenstående blanding af DNA og R. parkeri til en kølet, steril 0,1 cm gap elektroporationskuvette (tryk forsigtigt på kuvetten, indtil blandingen er jævnt fordelt) og lad den sidde på is i 10-30 min.
  3. Substratet fjernes fra en 100 % sammenflydende ISE6-cellekultur, og cellelagene resuspenderes i 1,5 ml frisk substrat med NaHCO 3- og HEPES-buffer (beskrevet ovenfor i trin 1.1.3). Brug en kolbe med sammenflydende celler pr. Transformation.
  4. De resuspenderede celler overføres til et sterilt 2 ml mikrocentrifugerør (et rør pr. 25 cm2 kolbe ISE6-celler).
  5. Elektroporer R. parkeri / pRAM18dSFA-blandingen ved 1,8 KV, 200 ohm, 25 μF ved hjælp af en elektroporator.
  6. Ved hjælp af en steril, forlænget finspidset overførselspipet overføres en lille mængde af ISE6-cellesuspensionen (trin 2.4) til kuvetten og trækkes forsigtigt væsken op og ned for at vaske kuvetten ud. Blandingen overføres til 2 ml mikrocentrifugerøret, der indeholder resten af ISE6-cellesuspensionen, og omdannelsen blandes forsigtigt med cellerne.
  7. De transformerede prøver centrifugeres ved 700 × g i 2 minutter ved RT, og centrifugeringshastigheden øges derefter til 13.600 × g i 1 minut mere ved RT.
    BEMÆRK: De to centrifugeringshastigheder fremmer rickettsialbinding med og indtrængen i cellerne: 700 × g bruges til at trække ISE6-cellerne ned, mens 13.600 × g bruges til at trække rickettsiae ned.
  8. Lad prøverne sidde ved RT eller 34 °C i 15 minutter til 1 time.
  9. Resuspender transformanterne (to eller tre) i ISE6-celler med en steril 2 ml barrierepipetspids monteret på en pipettor og overføres til to eller tre 25 cm 2-cellekulturkolber indeholdende 3,5 ml frisk medium med NaHCO3- og HEPES-buffer. Alternativt kan du bruge en steril, barriere 2 ml Pasteur pipette, der betjenes med en gummipære.
  10. Fyldene beskæres for at fordele blandingen jævnt, og derefter inkuberes de ved 34 °C.
  11. Efter 16-24 timer tilsættes 10 μL spectinomycin (50 mg/ml) og 10 μL streptomycin (50 mg/ml) til hver kolbe i trin 2.10.

3. Observation af den transformerede R. parkeri

BEMÆRK: Brug et epifluorescensmikroskop med rhodamin/TRITC-filtre til at observere kolberne, der er fremstillet i trin 2.11 efter 3-7 dage. Når plaques er tydelige i kulturerne (5-14 dage), kan transformeret R. parkeri ses, der udtrykker det røde fluorescerende protein mKATE, kodet på pRAM18dSFA-plasmidet.

  1. Konfokal mikroskopi
    1. Cellekulturerne resuspenderes fra trin 2.11-kolberne, og 100 μL af disse cellekulturer blandes med 5 μL Hoechst 33342-opløsning i 10-30 minutter ved RT i mørke.
      BEMÆRK: Hoechst 33342 er en cellegennemtrængelig nuklear modfarve, der binder til levende flåtcelle-DNA og udsender blå fluorescens.
    2. Centrifuge 50 μL af blandingen på glasmikroskopglas ved hjælp af en centrifuge ved 5 × g i 3 min.
    3. Tilsæt 3 μL 1x PBS til stedet for celler deponeret på diaset, overlejr med en dækslip, og se med et konfokalmikroskop (60x mål). Brug følgende excitations- og emissionsparametre til fluorescerende billeddannelse: til 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), excitation ved 350 nm, emission ved 470 nm; for tetramethylrhodamin (TRITC), excitation ved 557 nm, emission ved 576 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfologien af R. parkeri i ISE6-celler under et lysmikroskop efter Giemsa-farvning er vist i figur 1. I figur 2 vises transformeret R. parkeri , der udtrykker rødt fluorescensprotein i ISE6-celler, ved hjælp af konfokal mikroskopi. Der er en betydelig stigning i infektionshastigheden af transformeret R. parkeri (rød) i ISE6-celler (blå, svarer til kernerne) fra (A) dag 7 til (B) dag 10 af inkubation.

Figure 1
Figur 1: Dias, der viser Giemsa-farvet Rickettsia parkeri i ISE6-celler. ISE6-celler inficeret med vildtype R. parkeri ved (A) lav infektion og (B) 90% -100% infektionsrater. Kernerne i ISE6-cellerne pletter til mørk lilla med Giemsa; R. parkeri fremstår som mørke lilla stænger. De røde felter viser intracellulær rickettsiae, og de røde stjerner angiver ekstracellulær rickettsiae. Alle billeder blev taget på et lysmikroskop med et 100x mål. Skalastænger = 50 μm. Forkortelse: N = kerner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Transformeret Rickettsia parkeri, der udtrykker rødt fluorescensprotein i ISE6-celler. pRAM18dSFA-transformeret R. parkeri (rød) i ISE6-celler (blå), farvet med Hoechst 33342 og påvist ved konfokal mikroskopi (A) 7 dage og (B) 10 dage efter transformation. Hoechst 33342 pletter kernerne, og dens excitations- og emissionsbølgelængder ligner DAPI. De flettede signaler er en kombination af DAPI- og TRITC-filterbilleder. Alle billeder blev taget på et konfokalmikroskop med et 60x mål. Skala søjler = 20 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; TRITC = tetramethylrhodamin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her demonstrerer vi en metode til at introducere eksogent DNA kodet på shuttleplasmidet pRAM18dSFA i rickettsiae ved hjælp af elektroporation. I denne procedure blev cellefri rickettsiae renset fra værtsceller, omdannet med en rickettsial shuttle-vektor og frigivet på flåtceller til infektion. Også beskrevet er en konfokal immunfluorescensprocedure til påvisning af rød fluorescensprotein-ekspressive R. parkeri i flåtceller. Lignende metoder kan anvendes på andre Rickettsia-arter og kan med yderligere ændringer tilpasses andre obligatoriske intracellulære bakterier, der er i stand til at opretholde et plasmid.

En vellykket transformation i denne protokol kræver tre komponenter: eksogent DNA, Rickettsia spp. bakterier og en passende type værtscelle22. Afhængigt af det specifikke forskningsmål kan disse komponenter ændres. Først blev det eksogene DNA introduceret via pRAM18dSFA-plasmidet, som indeholder spectinomycin- og streptomycin-valgbare markører og udtrykker mKATE (et langt rødt fluorescerende protein). Dette plasmid giver også ampicillinresistens til vækst i Escherichia coli. Som det fremgår af tidligere undersøgelser, er det muligt at erstatte antibiotikaresistensmarkører og generne for fluorescerende proteiner13. For det andet blev ISE6-celler udvalgt til at repræsentere transformerede cellelinjer, da denne cellelinje i vid udstrækning anvendes i mange laboratorier og er en væsentlig model til undersøgelse af vektorpatogeninteraktioner17,18,19. Andre arter af flåt16 eller pattedyrceller23,24 kan også bruges til at dyrke rickettsiae til transformation. Endelig blev der i denne protokol anvendt R. parkeri, som kan manipuleres i et biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) laboratorium ved hjælp af et klasse II biosikkerhedsskab med passende sikkerhedsforanstaltninger. Andre mere patogene Rickettsia spp. (fx R. rickettsii; R. prowazekii) kræver en BSL-3-indstilling til manipulation; Derfor skal der anvendes en strengere biosikkerhedsstandardprotokol, når man arbejder med sådanne midler.

Selvom denne protokol kan bruges som en standardprocedure for rickettsiae-transformation, kræver flere vigtige tekniske trin særlig opmærksomhed. For det første skal et vellykket rensningstrin sikre cellefri rickettsiae overlevelse og infektivitet9; Derfor er det mest kritiske aspekt af transformationsproceduren at isolere infektiøs, cellefri rickettsiae. Eventuelt resterende salt i den rensede rickettsiae vil resultere i buedannelse og transformationsfejl. Derfor er det nødvendigt at vaske den isolerede cellefri rickettsiae med saccharose for at fjerne alle salte. Den kolde saccharoseopløsning beskytter også den rickettsiale membranintegritet i den ekstracellulære tilstand.

Når 90%-100% af cellerne i en kultur er inficeret, skal rickettsiae isoleres fra ISE6-cellerne, og elektroporation skal udføres straks og uden afbrydelser, da rickettsiae er intracellulære organismer og ikke overlever godt uden for celler. Selvom rickettsiale kulturer kan opbevares ved 4 °C, bør denne type materiale ikke anvendes til elektroporation. En kultur, der er blevet opbevaret ved 4 ° C, kan bruges til at inokulere et nyt lag ISE6-celler, som derefter kan bruges til elektroporation, når infektionen har nået 90% -100%.

For det andet er elektroporationsindstillingerne, herunder spænding, modstand, kapacitans og tidskonstant, specifikke for forskellige rickettsiale arter. For eksempel er feltstyrken, der kræves under elektroporation, afhængig af størrelsen af rickettsiae og eksogent DNA7. Endelig er det vigtigt at opretholde den transformerede rickettsiae under antibiotikaudvælgelse for at forhindre tab af eksogene plasmider under flere passager i værtsceller9. Koncentrationen og typen af anvendt antibiotika er afhængig af, at Rickettsia-arten transformeres, som tidligere beskrevet 13,15,16,23, og det er vigtigt, at den valgte antibiotikamarkør ikke bør være en, der anvendes i kliniske behandlinger.

For at følge denne protokol skal både spectinomycin og streptomycin anvendes til selektion, indtil alle de resterende utransformerede rickettsiae er elimineret. Tilsammen dræber de to antibiotika både intracellulære og ekstracellulære rickettsiae og reducerer sandsynligheden for, at resistente vildtype rickettsiae dukker op. Derudover påvirker brugen af begge disse antibiotika ikke downstream-eksperimenter, såsom evnen til at bruge dem separat til at vælge to forskellige plasmider, da aadA-genet giver resistens over for både spectinomycin og streptomycin. De to antibiotika, der anvendes i denne protokol, giver ikke resistens over for antibiotika, der anvendes til klinisk behandling af rickettsial sygdom.

ISE6-krydscellelinjen, der anvendes i denne undersøgelse, har unikke fordele. Først blev ISE6-celler isoleret fra den sortbenede flåt Ixodes scapularis Say (Acari: Ixodidae), den vigtigste vektor for syv humane patogener i USA. For det andet er ISE6 en meget anvendt flåtcellelinje i mange laboratorier og er med succes blevet brugt til at genvinde mange flåtassocierede bakterier (Rickettsia, Anaplasma og Ehrlichia) efter elektroporation. For det tredje kan nogle patogene rickettsiae kun formeres i flåtceller, men ikke i pattedyrceller17,18,19,24. Flåtcellelinjer er imidlertid relativt skrøbelige sammenlignet med pattedyrceller og har mere intensive dyrkningskrav25,26,27,28. Derudover er væksten af ISE6-celler signifikant langsommere end for pattedyrcellelinjer, selvom den er podet med samme indledende densitet, selvom langsom replikation kan være fordelagtig, når de rickettsiale transformanter udviser reduceret vækst.

Denne protokol giver også en metode til at evaluere transformationseffektiviteten af rickettsiae i levende celler ved kritiske eksperimentelle trin, hvilket hjælper med at optimere elektroporationsindstillinger eller teste effektiviteten af forskellige cellelinjer til genopretning af transformanter. Ikke desto mindre har denne protokol begrænsninger, især for kvantificering af de opnåede transformanter. Transformationseffektivitet som indikator for en vellykket transformation kan påvises i en fremtidig undersøgelse. Rickettsial levedygtighed kunne vurderes ved hjælp af et passende farvningssæt og flowcytometri21 for at kvantificere de transformanter, der opnås. To parametre ville blive brugt til at bestemme transformationseffektivitet - antallet af levende rickettsiae, der bruges til transformation, og antallet af transformerede rickettsiae, der udtrykker mKATE.

Derudover kan billedanalyse med fluorescenssignaler bruges til at sammenligne transformationshastighederne for forskellige plasmider. Da den underliggende mekanisme for vedligeholdelse af rickettsial plasmid er dårligt forstået, kan velkarakteriserede transformationssystemer til introduktion af eksogene plasmider være værdifulde værktøjer til yderligere undersøgelse. Desuden vil den direkte visualisering af fluorescerende protein-ekspressive rickettsiae i celler eller væv forbedre vores forståelse af rickettsia / vært / vektorinteraktioner. Dette vil give information til udformning af strategier til kontrol og forebyggelse af rickettsioses.

Data tilgængelighed:
Alle data, der ligger til grund for resultaterne af denne undersøgelse, er offentligt tilgængelige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der erklæres ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Timothy J. Kurtti og Benjamin Cull for deres indsigtsfulde diskussioner og forslag. Denne undersøgelse blev økonomisk støttet af et tilskud til U.G.M. fra NIH (2R01AI049424) og et tilskud til U.G.M. fra Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette Bio-Rad 1652083
2 μm pore size filter  GE Healthcare Life Sciences Whatman 6783-2520
5 mL Luer-lock syringe  BD 309646
60-90 silicon carbide grit  LORTONE, inc  591-056
absolute methanol  Fisher Scientific A457-4
Bacto tryptose phosphate broth  BD 260300
Cytospin centrifuge Cytospin4 Thermo Fisher Scientific A78300003 The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) QIAGEN 12362 used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet  Perfector Scientific TP03-5301
fetal bovine serum  Gemini Bio 900-108 The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS Bio-Rad 165-2105 & 165-2110
hemocytometer Thermo Fisher Scientific 267110
HEPES Millipore-Sigma H4034
ImageJ Fiji National Institute of Health raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain  Gibco  2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium Gibco 41300039
lipoprotein concentrate  MP Biomedicals 191476
Nikon Diaphot Nikon epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent  Thermo Fisher Scientific R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope  Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber Hausser Scientific  Chamber 3900
sodium bicarbonate Millipore-Sigma S5761
Vortex Fisher Vortex Genie 2 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
  5. Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
  6. Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
  7. Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
  8. Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
  9. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
  10. Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
  11. Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
  12. Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
  13. Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
  14. Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
  15. Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
  16. Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
  17. Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
  18. Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
  19. Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
  20. Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
  21. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  22. Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
  23. Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
  24. Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
  25. Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
  26. Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
  27. Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
  28. Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).

Tags

Biologi udgave 188 Elektroporation Rickettsia immunfluorescens
En elektroporationsmetode til at omdanne <em>Rickettsia</em> spp. med en fluorescerende proteinekspressiv shuttlevektor i flåtcellelinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y.,… More

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y., Price, L. D., Munderloh, U. G. An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines. J. Vis. Exp. (188), e64562, doi:10.3791/64562 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter