Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שיטת אלקטרופורציה להפיכת ריקטסיה spp. עם וקטור מעבורת המבטא חלבון פלואורסצנטי בקווי תאי קרציות

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64562
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Minnesota

Summary

אלקטרופורציה היא שיטה מהירה שאומצה באופן נרחב להחדרת דנ"א אקסוגני לסוג ריקטסיה. פרוטוקול זה מספק שיטת אלקטרופורציה שימושית לטרנספורמציה של חיידקים תוך תאיים מהסוג Rickettsia.

Abstract

Rickettsioses נגרמים על ידי מגוון רחב של חיידקים תוך תאיים חובה השייכים לסוג Rickettsia שיכולים להיות מועברים למארחים בעלי חוליות באמצעות נשיכה של וקטורים פרוקי רגליים נגועים. נכון להיום, מגפות מתעוררות או מתעוררות מחדש נותרו סיכון לבריאות הציבור בשל הקושי באבחון, שכן שיטות האבחון מוגבלות ואינן סטנדרטיות או נגישות אוניברסלית. אבחנה שגויה הנובעת מחוסר הכרה של הסימנים והתסמינים עלולה לגרום לעיכוב בטיפול האנטיביוטי ולתוצאות בריאותיות לקויות. הבנה מקיפה של מאפייני ריקטסיה תשפר בסופו של דבר את האבחון, ההערכה והטיפול הקליניים עם שליטה ומניעה משופרות של המחלה.

מחקרים פונקציונליים של גנים ריקטסיאליים חיוניים להבנת תפקידם בפתוגנזה. מאמר זה מתאר הליך לאלקטרופורציה של זן ריקטסיה פארקרי טייט'ס גיהנום עם וקטור המעבורת pRAM18dSFA ובחירת R. parkeri מותמר בתרבית תאי קרציות עם אנטיביוטיקה (ספקטינומיצין וסטרפטומיצין). שיטה מתוארת גם ללוקליזציה של R. parkeri מותמר בתאי קרציות באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית, טכניקה שימושית לבדיקת טרנספורמציה בקווי תאים וקטוריים. גישות דומות מתאימות גם לטרנספורמציה של ריקטסיות אחרות.

Introduction

ריקטסיוזות נגרמות על ידי מגוון רחב של חיידקים תוך-תאיים השייכים לסוג Rickettsia (משפחה Rickettsiaceae, סדר Rickettsiales). הסוג Rickettsia מסווג לארבע קבוצות עיקריות בהתבסס על מאפיינים פילוגנטיים1,2: קבוצת קדחת מנומרת (SFG), המכילה את הריקטזיה הגורמת לריקטזיוזות החמורות והקטלניות ביותר (למשל, Rickettsia rickettsii, הסוכן הסיבתי של קדחת הרוקי מאונטיין), קבוצת הטיפוס (TG, למשל, Rickettsia prowazekii, הסוכן של טיפוס מגיפה), קבוצת המעבר (TRG, למשל, Rickettsia felis, הגורם הסיבתי של קדחת מנומרת המועברת על ידי פרעושים), וקבוצת האבות (AG, למשל, Rickettsia bellii).

בין המחלות העתיקות ביותר הידועות המועברות על ידי וקטורים, ריקטסיוזים נרכשים בעיקר בעקבות העברת הפתוגנים דרך עקיצות של וקטורים של פרוקי רגליים נגועים, כולל קרציות, פרעושים, כינים וקרדיות 3,4. אף על פי שהגילוי של אנטיביוטיקה יעילה שיפר את תוצאות הטיפול, ריקטסיוזים של מגפות מתעוררות ומתעוררות מחדש ממשיכים לאתגר את אסטרטגיות המניעה והבקרה המסורתיות. לפיכך, הבנה מקיפה של אינטראקציות ריקטסיה/מארח/וקטור תיצור בסופו של דבר בסיס איתן לפיתוח גישות חדשות למניעה ולריפוי של מחלות עתיקות אלה.

בטבע, העברת גנים אופקית (HGT) בחיידקים מתרחשת באמצעות הצמדה, התמרה וטרנספורמציה5. טרנספורמציה של חיידקים במבחנה משתמשת במושגי HGT אלה, אם כי האופי התוך-תאי של ריקטסיה מציב כמה אתגרים. תנאי הגידול המוגבלים ומערכות ההצמדה וההתמרות שלא הובנו כהלכה במינים שונים של ריקטסיה מנעו את היישום של שיטות הצמדה והתמרות ב-rickettsiae 6,7,8. בהשוואה לסוגים אחרים של חיידקים תוך-תאיים (למשל, כלמידיה, קוקסיאלה, אנאפלזמה וארליכיה), הסוג ריקטסיה שונה בכל הנוגע לאסטרטגיות הגדילה והשכפול בתוך הציטופלסמה התאית, מה שמטיל אתגרים ספציפיים לשינוי הגנטי של ריקטסיה בשל תכונות אורח החיים הייחודיות שלהם9.

המכשול הראשוני שיש להתגבר עליו כאשר מנסים לבצע את השינוי הגנטי של rickettsiae הוא להשיג טרנספורמציה מוצלחת. לפיכך, תכנון גישה ישימה עם יעילות טרנספורמציה גבוהה יהיה בעל ערך רב לפיתוח כלים גנטיים עבור rickettsiae. כאן אנו מתמקדים באלקטרופורציה, שיטת טרנספורמציה מוכרת באופן נרחב ששימשה להחדרת דנ"א אקסוגני בהצלחה למספר מינים של ריקטסיה, כולל ריקטסיה פרוואזקי, ריקטסיה טיפי, ריקטסיה קונורי, ריקטסיה פרקרי, ריקטסיה מונטננסיס, ריקטסיה בלי, ריקטסיה טווסי, וריקטסיה בוכנרי10,11,12 ,13,14,15,16.

מאמר זה מתאר הליך לאלקטרופורציה של זן R. parkeri Tate's Hell (הצטרפות: GCA_000965145.1) עם וקטור המעבורת pRAM18dSFA שמקורו בזן Rickettsia amblyommatis AaR/SC פלסמיד pRAM18 שתוכנן לקודד mKATE, חלבון פלואורסצנטי אדום רחוק, ו- aadA, המקנה עמידות לספקטינומיצין וסטרפטומיצין 13,15,20. R. parkeri שעברו טרנספורמציה הם ברי קיימא ומתוחזקים ביציבות תחת ברירה אנטיביוטית בקווי תאי הקרציות. בנוסף, אנו מראים כי לוקליזציה של R. parkeri מותמר בתאי קרציות חיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית יכולה לשמש להערכת איכות קצבי הטרנספורמציה בקווי תאים וקטוריים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התפשטות וטיהור של R. parkeri מתרבית תאי קרציות

הערה: כל הליכי תרבית התאים יבוצעו בארון בטיחות ביולוגית מדרגה II.

  1. הכנת R. parkeri-תאי קרציות נגועים
    1. לגדל תאי ISE6 בבקבוקי תרבית תאיםבגודל 25 ס"מ בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס ב-5 מ"ל של L15C300 בינוני17, בתוספת 5% סרום בקר עוברי (FBS), 5% מרק טריפטוז פוספט (TPB) ו-0.1% תרכיז ליפופרוטאין (LPC).
      הערה: ISE6 (Ixodes scapularis קו תאים שמקורו בעובר) הוא קו תאי קרציות הנמצא בשימוש נרחב במעבדות רבות והוא, לפיכך, מודל חיוני לחקר אינטראקציות בין קרציות לפתוגן 17,18,19. קצב הגדילה של תאי ISE6 איטי יותר מזה של תאי יונקים, עם זמן הכפלת אוכלוסייה של ≥72 שעות. לדוגמה, לתאי ISE6 שעברו תת-תרבות מתרבית של 100% מפגש ביחס של 1:5 ייקח 3-4 שבועות להחזיר 100% מפגש. תאי ISE6 בריאים יהיו בדרך כלל מעוגלים עם חוטים נצמדים רבים17.
    2. ספרו את תאי ISE6 בעזרת המוציטומטר תחת מיקרוסקופ אור. יש להשתמש בריכוז של ~106 תאים/מ"ל (100% מפגש).
      1. שטפו בעדינות את התאים מהבקבוקון עם מדיום ופזרו את התאים על ידי פיפטינג ליצירת תרחיף תאים הומוגני. הוסף 20 μL של תרחיף התא בין ההמוציטומטר לזכוכית כיסוי כדי לספור את התאים באמצעות המוציטומטר.
    3. הוסף צלוחיות מסוג R. parkeri 20 ללא תאים מארחים (מספר ממוצע: 5 × 10 7-10 × 10 7) לתרביות התאים ISE6 בבקבוקונים של 25 ס"מ 2 תרביות תאים. דגירה נגועה R. parkeri תרביות תאים ב 34 מעלות צלזיוס ב 5 מ"ל של מדיום שלם המורכב L15C300 בינוני, 10% FBS, 5% TPB, 0.1% LPC, 0.25% סודיום ביקרבונט (NaHCO3), ו 25 mM HEPES עד 90%-100% של תאים נגועים.
      הערה: שיעור ההדבקה של R. parkeri בתאי ISE6 נקבע על ידי צביעת Giemsa, וזמן הדגירה להגיע לזיהום של 90%-100% נע בין 5 ימים ל-7 ימים בממוצע.
    4. לקבוע את שיעור ההדבקה באמצעות צביעת גימסה.
      1. בארון הבטיחות הביולוגית, יש להשעות את תרביות התאים הנגועים ולהעביר 50 מיקרו-ליטר מהמתלים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
      2. לדלל את המתלים עם מדיום שלם (דילול 1:5) וצנטריפוגה 100 μL על מיקרוסקופ זכוכית שקופיות באמצעות צנטריפוגה ב 113 × גרם במשך 5 דקות. כדי לשמור על R. parkeri חי, השתמש בצנטריפוגה עם רוטור אטום המיועד להסרה מהצנטריפוגה. זה מאפשר את הובלת הרוטור האטום פנימה והחוצה ממכסה המנוע.
        הערה: מכיוון שה-R. parkeri עדיין בחיים לפני הצנטריפוגה, יש להכיל את הדגימה עד להריגת הריקטזיה. לפיכך, הצנטריפוגה המשמשת לסיבוב תרבות R. parkeri על המגלשה חייבת להיות בעלת רוטור אטום המיועד להרמה מתוך הצנטריפוגה. עם הרוטור במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, טען את הדגימות למכלול שקופיות המשפך-מיקרוסקופ, אטם מחדש את הרוטור והנח את הרוטור האטום בחזרה לצנטריפוגה. לאחר מכן, הפעל את הצנטריפוגה, והדגימות מופקדות על שקופיות המיקרוסקופ. לאחר סיום הריצה, הסר את הרוטור האטום מהצנטריפוגה והנח אותו במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. שם, פתחו את מכסה הרוטור, ופרקו את מכלול השקופיות של המשפך-מיקרוסקופ בתוך מכסה המנוע. לאחר התייבשות, לטבול את מיקרוסקופ הזכוכית מחליק מתנול מוחלט, אשר הורג את כל הפתוגנים. המשפכים ונושאי המתכת שקועים ב- DMQ מדולל, שהורג את ר 'פארקרי.
      3. אוויר לייבש את המגלשות לתקן מתנול מוחלט במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      4. הכתימו את המגלשות בכתם Giemsa (4% בחיץ של Sørenson, pH 6.6) למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ושטפו במים במשך 5 שניות.
      5. קבע את אחוז ההדבקה (מספר התאים הנגועים בריקטזיה/100 תאים) על ידי מיקרוסקופיית אור.
        הערה: איור 1 מציג תוצאות אופייניות של כתמי Giemsa.
  2. הכנת ר. פרקרי ללא תאים
    הערה: כאשר 90%-100% מהתאים בתרבית נגועים, יש לבודד את הריקטזיה מתאי ISE6 ולבצע אלקטרופורציה.
    1. הוסף חצץ סיליקון קרביד סטרילי 60-90 לצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים של 2 מ"ל לנפח של כ-0.2 מ"ל.
    2. הסר 2 מ"ל של בינוני מתרביות נגועות ב- 100% R. parkeri (שלב 1.1.3) והושיע מחדש את התאים ב- 3 מ"ל הנותרים של המדיום.
    3. העבר חלקים שווים של מתלה זה לצינורות שהוכנו בשלב 1.2.1.
    4. מערבבים כל צינור במהירות גבוהה במשך 30 שניות ואז מניחים את הצינורות על קרח. תנו לחצץ לשקוע תוך שניות על ידי כוח הכבידה.
    5. בארון בטיחות ביולוגית מדרגה II, יש מזרק Luer-lock סטרילי של 5 מ"ל מוכן עם הבוכנה מורחבת וקצה הבוכנה מאובטח בבסיס פוליסטירן עבור צינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
    6. באמצעות קצה פיפט מחסום סטרילי, 1 מ"ל המותאם לפיפטטור מתאים, הסר את הסופר-נטנט של התא המערבולת ליזאט מהצינור, תוך הקפדה שלא לשאוף לשום חצץ. הכנס את קצה הפיפט לפתח רכזת המזרק והוצא את התוכן לתוך המזרק בלחץ עדין. לחלופין, השתמש בפיפטה סטרילית, מחסום 2 מ"ל פסטר המופעל עם נורת גומי.
    7. חברו מסנן מעוקר בגודל נקבוביות של 2 מיקרומטר לרכזת המזרק וסננו את תרבית R. parkeri משלב 1.2.6 לצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל.
    8. לאסוף את R. parkeri על ידי צנטריפוגה ב 13,600 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, ולהשליך את supernatant.
    9. השהה את הכדור ב-1.2 מ"ל של סוכרוז קר כקרח 300 מ"מ וצנטריפוגה שוב ב-13,600 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חזור על החידוש והצנטריפוגה בסך הכל שתי שטיפות סוכרוז.
    10. שלבו את כדורי R. parkeri לצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר וסטרילי אחד בגודל 1.5 מ"ל ב-50 מיקרו-ליטר של סוכרוז קר כקרח של 300 מ"ל לכל טרנספורמציה. מכיוון שבקבוקון אחד בגודל25 ס"מ 2 של R. parkeri מספק מספיק ריקטסיה לשתיים עד שלוש טרנספורמציות, הוסף 100-150 מיקרון של סוכרוז קר של 300 mM.
      הערה: אם תרצה, ניתן לחשב את מספר הריקטזיה באמצעות תא ספירה של פטרוף-האוזר. כאשר משתמשים בחיסון ראשוני של 5 × 107 -10 × 10 7 R. parkeri ללא תאים, ייקח 5-7 ימים בממוצע להגיע לזיהום של 90%-100%, מה שמניב בערך 5 × 107-10 × 10 10 R. parkeri ללא תאים.
    11. יש למרוח בעדינות את הכדור על ידי פיפטינג עד לפיזור יסודי. חלקו את הדגימה לחלקים של 50 μL בצינורות מיקרוצנטריפוגה מקוררים וסטריליים של 1.5 מ"ל.
      הערה: אם תרצה, ניתן להעריך את הכדאיות הריקטסיאלית על ידי ציטומטריה של זרימה לאחר צביעה בצבע פלואורסצנטי 21.

2. טרנספורמציה של R. parkeri עם פלסמיד pRAM18dSFA

  1. על הקרח, הוסיפו 3 מיקרוגרם של pRAM18dSFA DNA פלסמיד נטול אנדוטוקסין13,15,20 לכל צינור המכיל 50 μL של תרחיף R. parkeri וערבבו את התערובת עם קצה הפיפט בעדינות אך ביסודיות.
    הערה: בעת הכנת דנ"א פלסמיד, השתמש בערכת טיהור הכוללת שלב להסרת אנדוטוקסין כדי להפיק DNA פלסמיד23 נטול אנדוטוקסין. מצאנו כי טווח של ריכוזי פלסמידים של בין 1 מיקרוגרם ל-3 מיקרוגרם לכל 50 μL של מתלה R. parkeri הביא לשינויים מוצלחים, בעוד שהגדלת כמות הפלסמיד ל-10 מיקרוגרם עיכבה את הטרנספורמציה.
  2. מעבירים את התערובת הנ"ל של דנ"א ו-R. parkeri לתוך קובט אלקטרופורציה מקורר וסטרילי בגודל 0.1 ס"מ (מקישים בעדינות על הקובט עד שהתערובת מפוזרת באופן שווה) ומניחים לה לשבת על הקרח למשך 10-30 דקות.
  3. הסר את המדיום מתרבית 100% קונפלואנטית של תאי ISE6 והשהה מחדש את שכבות התאים ב-1.5 מ"ל של מדיום טרי עם NaHCO 3 וחיץ HEPES (שתואר לעיל בשלב 1.1.3). השתמש בבקבוקון אחד של תאים מתמזגים לכל טרנספורמציה.
  4. מעבירים את התאים המחיים לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 2 מ"ל (צינור אחד לכל 25ס" מ 2 בקבוקון של תאי ISE6).
  5. אלקטרופוראט תערובת R. parkeri/pRAM18dSFA ב-1.8 KV, 200 אוהם, 25 μF באמצעות אלקטרופורטור.
  6. באמצעות פיפט סטרילי בעל קצה עדין מורחב, מעבירים כמות קטנה מתלייה של תאי ISE6 (שלב 2.4) לתוך הקובט ומושכים בעדינות את הנוזל למעלה ולמטה כדי לשטוף את הקובט. מעבירים את התערובת לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל את שארית מתלה תאי ISE6 ומערבבים בעדינות את תערובת הטרנספורמציה עם התאים.
  7. צנטריפוגה את הדגימות שעברו טרנספורמציה ב-700 × גרם למשך 2 דקות ב-RT, ולאחר מכן הגדל את מהירות הצנטריפוגה ל-13,600 × גרם למשך דקה אחת נוספת ב-RT.
    הערה: שתי מהירויות הצנטריפוגה מקדמות קשירה ריקטסיאלית עם התאים וכניסה אליהם: 700 × גרם משמשים למשיכת תאי ISE6, בעוד 13,600 × גרם משמשים למשיכת הריקטזיה.
  8. תנו לדגימות לשבת ב-RT או ב-34°C למשך 15 דקות עד שעה.
  9. השהה את הטרנספורמטורים (שניים או שלושה) בתאי ISE6 עם קצה פיפט מחסום סטרילי של 2 מ"ל המותאם לפיפטור והעבר לשניים או שלושה צלוחיות תרבית תאים בגודל 25 ס"מהמכילות 3.5 מ"ל של מדיום טרי עם NaHCO3 וחיץ HEPES. לחלופין, השתמש בפיפטה סטרילית, מחסום 2 מ"ל פסטר המופעל עם נורת גומי.
  10. נדנדנדו את הצלוחיות כדי לפזר את התערובת באופן שווה ולאחר מכן דגירה ב 34 מעלות צלזיוס.
  11. לאחר 16-24 שעות, יש להוסיף 10 μL של ספקטינומיצין (50 מ"ג/מ"ל) ו-10 μL של סטרפטומיצין (50 מ"ג/מ"ל) לכל בקבוק בשלב 2.10.

3. תצפית על ר' פרקרי שעבר טרנספורמציה

הערה: השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מסנני רודמין/TRITC כדי לצפות בצלוחיות שהוכנו בשלב 2.11 לאחר 3-7 ימים. ברגע שהפלאקים ניכרים בתרביות (5-14 ימים), ניתן לראות את R. parkeri שעבר טרנספורמציה המבטאת את החלבון הפלואורסצנטי האדום mKATE, המקודד על פלסמיד pRAM18dSFA.

  1. מיקרוסקופיה קונפוקלית
    1. השהה את תרביות התאים משלב 2.11 צלוחיות וערבב 100 μL של תרביות תאים אלה עם 5 μL של תמיסת Hoechst 33342 למשך 10-30 דקות ב- RT בחושך.
      הערה: Hoechst 33342 הוא כתם נגדי גרעיני חדיר לתאים שנקשר לדנ"א של תאי קרציות חיים ופולט פלואורסצנטיות כחולה.
    2. צנטריפוגה 50 μL של התערובת על מיקרוסקופ זכוכית מחליק באמצעות צנטריפוגה ב 5 × גרם במשך 3 דקות.
    3. הוסף 3 μL של 1x PBS לנקודה של תאים שהופקדו על המגלשה, כיסוי עם כיסוי להחליק, וצפה עם מיקרוסקופ confocal (60x מטרה). השתמש בפרמטרים הבאים של עירור ופליטה להדמיית פלואורסצנט: עבור 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), עירור ב-350 ננומטר, פליטה ב-470 ננומטר; עבור טטרה-מתילרודאמין (TRITC), עירור ב-557 ננומטר, פליטה ב-576 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המורפולוגיה של R. parkeri בתאי ISE6 תחת מיקרוסקופ אור לאחר צביעת גימסה מוצגת באיור 1. באיור 2, R. parkeri שעבר טרנספורמציה המבטא חלבון פלואורסצנטי אדום בתאי ISE6 מוצג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. ישנה עלייה משמעותית בשיעור ההדבקה של R. parkeri (אדום) מותמר בתאי ISE6 (כחול, מתאים לגרעינים) מ (A) יום 7 עד (B) יום 10 של הדגירה.

Figure 1
איור 1: שקופיות המציגות ריקטסיה פארקרי מוכתמת בגימסה בתאי ISE6. תאי ISE6 נגועים ב-R. parkeri מסוג בר ב-(A) זיהום נמוך ו-(B) שיעורי הדבקה של 90%-100%. הגרעינים של תאי ISE6 מוכתמים בסגול כהה עם גימסה; ה- R. parkeri מופיעים כמוטות סגולים כהים. התיבות האדומות מציגות ריקטזיה תוך-תאית, והכוכביות האדומות מציינות ריקטזיה חוץ-תאית. כל התמונות צולמו במיקרוסקופ אור עם מטרה של פי 100. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצור: N = גרעינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ריקטסיה פארקרי שעברה טרנספורמציה המבטאת חלבון פלואורסצנטי אדום בתאי ISE6. pRAM18dSFA-מותמר R. parkeri (אדום) בתאי ISE6 (כחול), מוכתם ב- Hoechst 33342 וזוהה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (A) 7 ימים ו- (B) 10 ימים לאחר הטרנספורמציה. Hoechst 33342 מכתים את הגרעינים, ואורכי הגל של העירור והפליטה שלו דומים ל-DAPI. האותות הממוזגים הם שילוב של תמונות מסנן DAPI ו- TRITC. כל התמונות צולמו במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של פי 60. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; TRITC = טטרה-מתיל-רודמין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מדגימים שיטה להחדרת דנ"א אקסוגני המקודד על פלסמיד pRAM18dSFA לתוך ריקטסיה באמצעות אלקטרופורציה. בהליך זה, ריקטסיה נטולת תאים טוהרה מתאים מארחים, הומרה עם וקטור מעבורת ריקטסיאלית, ושוחררה לתאי קרציות לצורך זיהום. כמו כן מתואר הליך אימונופלואורסצנטי קונפוקלי לאיתור חלבון פלואורסצנטי אדום המבטא R. parkeri בתאי קרציות. שיטות דומות ישימות למינים אחרים של Rickettsia ועם שינויים נוספים עשויות להיות ניתנות להתאמה לחיידקים תוך-תאיים אחרים המסוגלים לשמור על פלסמיד.

טרנספורמציה מוצלחת בפרוטוקול זה דורשת שלושה מרכיבים: דנ"א אקסוגני, חיידקי Rickettsia spp. וסוג מתאים של תא מארח22. בהתאם למטרת המחקר הספציפית, ניתן לשנות רכיבים אלה. ראשית, הדנ"א האקסוגני הוכנס דרך פלסמיד pRAM18dSFA, המכיל סמנים הניתנים לבחירה בספקטינומיצין וסטרפטומיצין ומבטא mKATE (חלבון פלואורסצנטי אדום רחוק). פלסמיד זה גם מקנה עמידות לאמפיצילין לצמיחה ב-Escherichia coli. כפי שהוכח במחקרים קודמים, ניתן להחליף סמנים עמידים לאנטיביוטיקה ואת הגנים לחלבונים פלואורסצנטיים13. שנית, תאי ISE6 נבחרו לייצג קווי תאים מותמרים מכיוון שקו תאים זה נמצא בשימוש נרחב במעבדות רבות והוא מודל חיוני לחקר אינטראקציות וקטוריות-פתוגנים17,18,19. מינים אחרים של קרציות16 או תאי יונקים23,24 יכולים לשמש גם לגידול ריקטסיה לצורך טרנספורמציה. לבסוף, בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב- R. parkeri, אשר ניתן לתמרן במעבדה ברמה 2 (BSL-2) באמצעות ארון בטיחות ביולוגית מסוג II עם אמצעי בטיחות נאותים. ריקטסיה פתוגנית יותר (למשל, R. rickettsii; R. prowazekii) דורשים הגדרת BSL-3 למניפולציה; לכן, יש להשתמש בפרוטוקול סטנדרטי מחמיר יותר של בטיחות ביולוגית בעת עבודה עם סוכנים כאלה.

למרות שפרוטוקול זה יכול לשמש כהליך סטנדרטי לטרנספורמציה של ריקטסיה, מספר שלבים טכניים מרכזיים דורשים תשומת לב מיוחדת. ראשית, שלב טיהור מוצלח חייב להבטיח הישרדות ריקטסיה ללא תאיםוהדבקה 9; לפיכך, ההיבט הקריטי ביותר של הליך הטרנספורמציה הוא לבודד ריקטסיה מדבקת ונטולת תאים. כל מלח שיורי בריקטסיה המטוהרת יגרום לכשל בקשת וטרנספורמציה. לכן, שטיפת rickettsiae ללא תאים מבודדים עם סוכרוז נדרש כדי להסיר את כל המלחים. תמיסת סוכרוז קר גם מגנה על שלמות הממברנה הריקטסיאלית במצב החוץ-תאי.

כאשר 90%-100% מהתאים בתרבית נגועים, יש לבודד את הריקטסיה מתאי ISE6, ולבצע אלקטרופורציה ללא דיחוי וללא הפרעות, שכן ריקטסיה הם אורגניזמים תוך תאיים ואינם שורדים היטב מחוץ לתאים. למרות תרביות rickettsial ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס, זה סוג של חומר לא צריך לשמש עבור electroporation. תרבית שאוחסנה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס יכולה לשמש לחיסון שכבה חדשה של תאי ISE6, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם עבור electroporation לאחר זיהום הגיע 90%-100%.

שנית, הגדרות האלקטרופורציה, כולל מתח, התנגדות, קיבוליות וקבוע זמן, הן ספציפיות למינים שונים של ריקטסיאלים. לדוגמה, חוזק השדה הנדרש במהלך אלקטרופורציה תלוי בגודל הריקטזיה והדנ"אהאקסוגני 7. לבסוף, חשוב לשמור על ריקטסיה שעברה טרנספורמציה תחת בחירת אנטיביוטיקה כדי למנוע אובדן של פלסמידים אקסוגניים במהלך מעברים מרובים בתאים מארחים9. הריכוז והסוג של אנטיביוטיקה בשימוש תלויים בהפיכת מיני הריקטסיה, כפי שתואר קודם לכן 13,15,16,23, וחשוב שהסמן האנטיביוטי שנבחר לא יהיה כזה שמיושם בטיפולים קליניים.

כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, יש להשתמש הן בספקטינומיצין והן בסטרפטומיצין לבחירה עד שכל שאריות הריקטזיה שאינן טרנספורמציה יבוטלו. יחד, שתי האנטיביוטיקות הורגות הן ריקטסיה תוך-תאית והן את הרקטזיה החוץ-תאית ומפחיתות את ההסתברות להופעת ריקטסיה עמידה מסוג בר. בנוסף, השימוש בשתי האנטיביוטיקות הללו אינו משפיע על ניסויים במורד הזרם, כגון היכולת להשתמש בהן בנפרד כדי לבחור שני פלסמידים שונים, שכן הגן aadA מקנה עמידות הן לספקטינומיצין והן לסטרפטומיצין. שתי האנטיביוטיקות המשמשות בפרוטוקול זה אינן מעניקות עמידות לאנטיביוטיקה המשמשת לטיפול הקליני במחלת ריקטסיאל.

לקו תאי הסימון ISE6 ששימש במחקר זה יש יתרונות ייחודיים. ראשית, תאי ISE6 בודדו מהקרצייה שחורת הרגליים Ixodes scapularis Say (Acari: Ixodidae), הווקטור העיקרי לשבעה פתוגנים אנושיים בארצות הברית. שנית, ISE6 הוא קו תאי קרציות שנמצא בשימוש נרחב במעבדות רבות, ונעשה בו שימוש מוצלח לשחזור חיידקים רבים הקשורים לקרציות (ריקטסיה, אנאפלזמה וארליכיה) לאחר אלקטרופורציה. שלישית, חלק מהריקטסיאה הפתוגנית יכולה להיות מופצת רק בתאי קרציות אך לא בתאי יונקים17,18,19,24. עם זאת, קווי תאי הקרציות שבריריים יחסית בהשוואה לתאי יונקים ויש להם דרישות תרבית אינטנסיביות יותר25,26,27,28. בנוסף, קצב הגדילה של תאי ISE6 איטי משמעותית מזה של קווי תאים של יונקים, גם אם הם נזרעים באותה צפיפות ראשונית, אם כי שכפול איטי יכול להיות יתרון כאשר הטרנספורמטורים הרקטזיאליים מפגינים צמיחה מופחתת.

פרוטוקול זה מספק גם שיטה להערכת יעילות הטרנספורמציה של ריקטסיה בתאים חיים בשלבים ניסיוניים קריטיים, המסייעת לייעל את הגדרות האלקטרופורציה או בבדיקת היעילות של קווי תאים שונים לשחזור טרנספורמציות. עם זאת, לפרוטוקול זה יש מגבלות, במיוחד לכימות הטרנספורמטורים המתקבלים. יעילות הטרנספורמציה כאינדיקטור לטרנספורמציה מוצלחת יכולה להיות מודגמת במחקר עתידי. ניתן להעריך את הכדאיות של Rickettsial באמצעות ערכת צביעה מתאימה וציטומטריה של זרימה21 כדי לכמת את הטרנספורמטורים המתקבלים. שני פרמטרים ישמשו לקביעת יעילות הטרנספורמציה - מספר הריקטסיה החיה המשמשת לטרנספורמציה ומספר הריקטסיה המותמרת המבטאת mKATE.

בנוסף, ניתוח תמונה עם אותות פלואורסצנטיים יכול לשמש להשוואת שיעורי הטרנספורמציה של פלסמידים שונים. מכיוון שהמנגנון הבסיסי של תחזוקת פלסמיד ריקטסיאלי אינו מובן היטב, מערכות טרנספורמציה מאופיינות היטב להחדרת פלסמידים אקסוגניים יכולות להיות כלים חשובים לחקירה נוספת. יתר על כן, ההדמיה הישירה של ריקטסיה המבטאת חלבון פלואורסצנטי בתאים או ברקמות תשפר את הבנתנו את האינטראקציות בין ריקטסיה/מארח/וקטור. זה יספק מידע לתכנון אסטרטגיות לשליטה ומניעה של ריקטסיוזים.

זמינות נתונים:
כל הנתונים העומדים בבסיס תוצאות מחקר זה זמינים לציבור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא מוצהרים ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לטימותי ג'יי קורטי ובנג'מין קול על הדיונים וההצעות התובנות שלהם. מחקר זה נתמך כספית על ידי מענק ל- U.G.M. מה- NIH (2R01AI049424) ומענק ל- U.G.M. מתחנת הניסויים החקלאיים של מינסוטה (MIN-17-078).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette Bio-Rad 1652083
2 μm pore size filter  GE Healthcare Life Sciences Whatman 6783-2520
5 mL Luer-lock syringe  BD 309646
60-90 silicon carbide grit  LORTONE, inc  591-056
absolute methanol  Fisher Scientific A457-4
Bacto tryptose phosphate broth  BD 260300
Cytospin centrifuge Cytospin4 Thermo Fisher Scientific A78300003 The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) QIAGEN 12362 used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet  Perfector Scientific TP03-5301
fetal bovine serum  Gemini Bio 900-108 The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS Bio-Rad 165-2105 & 165-2110
hemocytometer Thermo Fisher Scientific 267110
HEPES Millipore-Sigma H4034
ImageJ Fiji National Institute of Health raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain  Gibco  2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium Gibco 41300039
lipoprotein concentrate  MP Biomedicals 191476
Nikon Diaphot Nikon epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent  Thermo Fisher Scientific R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope  Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber Hausser Scientific  Chamber 3900
sodium bicarbonate Millipore-Sigma S5761
Vortex Fisher Vortex Genie 2 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
  5. Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
  6. Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
  7. Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
  8. Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
  9. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
  10. Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
  11. Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
  12. Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
  13. Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
  14. Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
  15. Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
  16. Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
  17. Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
  18. Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
  19. Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
  20. Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
  21. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  22. Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
  23. Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
  24. Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
  25. Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
  26. Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
  27. Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
  28. Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).

Tags

ביולוגיה גיליון 188 אלקטרופורציה ריקטסיה אימונופלואורסצנציה
שיטת אלקטרופורציה להפיכת <em>ריקטסיה</em> spp. עם וקטור מעבורת המבטא חלבון פלואורסצנטי בקווי תאי קרציות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y.,… More

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y., Price, L. D., Munderloh, U. G. An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines. J. Vis. Exp. (188), e64562, doi:10.3791/64562 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter