Summary
Elektroporering er en rask, bredt vedtatt metode for å introdusere eksogent DNA i slekten Rickettsia. Denne protokollen gir en nyttig elektroporeringsmetode for transformasjon av obligatoriske intracellulære bakterier i slekten Rickettsia.
Abstract
Rickettsioses er forårsaket av et bredt spekter av obligatoriske intracellulære bakterier som tilhører slekten Rickettsia som kan overføres til vertebrate verter gjennom bitt av infiserte leddyrvektorer. Til dags dato forblir nye eller gjenoppståtte epidemiske rickettsioser en folkehelserisiko på grunn av vanskeligheten med diagnosen, da diagnostiske metoder er begrensede og ikke standardiserte eller universelt tilgjengelige. Feildiagnostisering som følge av manglende gjenkjennelse av tegn og symptomer kan føre til forsinket antibiotikabehandling og dårlige helseutfall. En omfattende forståelse av Rickettsia-egenskaper vil til slutt forbedre klinisk diagnose, vurdering og behandling med forbedret kontroll og forebygging av sykdommen.
Funksjonelle studier av rickettsiale gener er avgjørende for å forstå deres rolle i patogenesen. Dette papiret beskriver en prosedyre for elektroporering av Rickettsia parkeri-stammen Tate's Hell med skyttelvektoren pRAM18dSFA og valg av transformert R. parkeri i krysscellekultur med antibiotika (spektinomycin og streptomycin). En metode er også beskrevet for lokalisering av transformert R. parkeri i kryssceller ved bruk av konfokal immunfluorescensmikroskopi, en nyttig teknikk for å kontrollere transformasjon i vektorcellelinjer. Lignende tilnærminger er også egnet for transformasjon av andre rickettsiae.
Introduction
Rickettsioses er forårsaket av et bredt spekter av obligatoriske intracellulære bakterier som tilhører slekten Rickettsia (familie Rickettsiaceae, orden Rickettsiales). Slekten Rickettsia er klassifisert i fire hovedgrupper basert på fylogenetiske egenskaper1,2: flekkfebergruppen (SFG), som inneholder de rickettsiae som forårsaker de mest alvorlige og dødelige flåttbårne rickettsiosene (f.eks. Rickettsia rickettsii, årsaksmidlet til Rocky Mountain Spotted Fever), tyfusgruppen (TG, f.eks. Rickettsia prowazekii, agenten for epidemisk tyfus), overgangsgruppen (TRG, f.eks. Rickettsia felis, det forårsakende middelet til loppebåren flekkfeber), og forfedregruppen (AG, f.eks. Rickettsia bellii).
Blant de eldste kjente vektorbårne sykdommene er rickettsioser hovedsakelig anskaffet etter overføring av patogenene gjennom biter av infiserte leddyrvektorer, inkludert flått, lopper, lus og midd 3,4. Selv om oppdagelsen av effektive antibiotika forbedret behandlingsresultatene, fortsetter nye og gjenoppståtte epidemiske rickettsioses å utfordre tradisjonelle forebyggings- og kontrollstrategier. Dermed vil en omfattende forståelse av rickettsia / vert / vektorinteraksjoner til slutt etablere et sterkt fundament for å utvikle nye tilnærminger for å forebygge og kurere disse gamle sykdommene.
I naturen skjer horisontal genoverføring (HGT) i bakterier gjennom konjugering, transduksjon og transformasjon5. In vitro bakteriell transformasjon benytter disse HGT-konseptene, selv om den intracellulære naturen til rickettsiae gir noen utfordringer. De begrensede vekstforholdene og dårlig forstått konjugerings- og transduksjonssystemer i forskjellige arter av rickettsiae har forhindret anvendelse av konjugerings- og transduksjonsmetoder i rickettsiae 6,7,8. Sammenlignet med andre obligatoriske intracellulære bakterielle slekter (f.eks. Chlamydia, Coxiella, Anaplasma og Ehrlichia), er slekten Rickettsia forskjellig med hensyn til vekst- og replikasjonsstrategiene i cellecytoplasma, noe som pålegger spesifikke utfordringer for genetisk modifisering av rickettsiae på grunn av deres unike livsstilsegenskaper9.
Den første hindringen å overvinne når man forsøker genetisk modifisering av rickettsiae er å oppnå vellykket transformasjon. Dermed vil utforming av en gjennomførbar tilnærming med høy transformasjonseffektivitet være ekstremt verdifull for å utvikle genetiske verktøy for rickettsiae. Her fokuserer vi på elektroporering, en bredt anerkjent transformasjonsmetode som har blitt brukt til å introdusere eksogent DNA med suksess i flere arter av rickettsiae, inkludert Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii og Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Dette papiret beskriver en prosedyre for elektroporering av R. parkeri-stammen Tate's Hell (tiltredelse: GCA_000965145.1) med skyttelvektoren pRAM18dSFA avledet fra Rickettsia amblyommatis-stammen AaR / SC plasmid pRAM18 konstruert for å kode mKATE, et langt rødt fluorescerende protein, og aadA, som gir spektinomycin og streptomycinresistens13,15,20. Transformert R. parkeri er levedyktig og stabilt opprettholdt under antibiotikavalg i krysscellelinjer. I tillegg viser vi at lokalisering av transformert R. parkeri i levende flåttceller via konfokalmikroskopi kan brukes til å vurdere kvaliteten på transformasjonshastigheter i vektorcellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forplantning og rensing av R. parkeri fra krysscellekultur
MERK: Alle cellekulturprosedyrer skal utføres i et klasse II biosikkerhetsskap.
- Forbereder R. parkeri-infiserte flåttceller
- Dyrk ISE6-celler i 25 cm2 cellekulturflasker ved 34 °C i 5 ml L15C300 medium17, supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 5% tryptosefosfatbuljong (TPB) og 0,1% lipoproteinkonsentrat (LPC).
MERK: ISE6 (Ixodes scapularis embryo-avledet cellelinje) er en krysscellelinje som er mye brukt i mange laboratorier og er dermed en viktig modell for å studere krysspatogeninteraksjoner17,18,19. Vekstraten til ISE6-celler er langsommere enn for pattedyrceller, med en befolkningsdoblingstid på ≥72 timer. For eksempel vil ISE6-celler subcultivated fra en 100% sammenflytende kultur i forholdet 1: 5 ta 3-4 uker å gjenvinne 100% sammenløp. Sunne ISE6-celler vil generelt bli avrundet med mange vedheftende filamenter17. - Tell ISE6-cellene med et hemocytometer under et lysmikroskop. Bruk i en konsentrasjon på ~ 106 celler / ml (100% sammenløpende).
- Skyll cellene forsiktig fra kolben med medium og disperg cellene ved pipettering for å generere en homogen cellesuspensjon. Tilsett 20 μL cellesuspensjon mellom hemocytometeret og dekkglasset for å telle cellene ved hjelp av et hemocytometer.
- Legg til vertscellefri villtype R. parkeri 20 (gjennomsnittlig antall: 5 × 10 7-10 × 107) til ISE6-cellekulturer i 25 cm2 cellekulturflasker. Inkuber infiserte R. parkeri-cellekulturer ved 34 °C i 5 ml komplett medium bestående av L15C300-medium, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% natriumbikarbonat (NaHCO3) og 25 mM HEPES til 90% -100% av cellene er infisert.
MERK: Infeksjonshastigheten til R. parkeri i ISE6-celler bestemmes av Giemsa-farging, og inkubasjonstiden for å nå 90% -100% infeksjon varierer fra 5 dager til 7 dager i gjennomsnitt. - Bestem infeksjonsraten via Giemsa-farging.
- I biosikkerhetsskapet, resuspend de infiserte cellekulturene og overfør 50 μL av suspensjonen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Fortynn suspensjonen med komplett medium (1:5 fortynning) og sentrifuge 100 μL på glassmikroskopglass ved bruk av en sentrifuge ved 113 × g i 5 minutter. For å holde levende R. parkeri inneholdt, bruk en sentrifuge med en forseglet rotor som er designet for å fjernes fra sentrifugen. Dette muliggjør transport av den forseglede rotoren inn og ut av panseret.
MERK: Siden R. parkeri fortsatt er i live før sentrifugering, må prøven holdes inne til rickettsiaen blir drept. Dermed må sentrifugen som brukes til å spinne R. parkeri-kulturen på lysbildet, ha en forseglet rotor som er designet for å løftes ut av sentrifugen. Med rotoren i den laminære strømningshetten, legg prøvene inn i traktmikroskopets lysbildemontering, forsegle rotoren og plasser den forseglede rotoren tilbake i sentrifugen. Slå deretter på sentrifugen, og prøvene blir avsatt på mikroskopglassene. Etter at løpeturen er ferdig, fjern den forseglede rotoren fra sentrifugen og legg den i den laminære strømningshetten. Der åpner du rotorlokket og laster ut traktmikroskopets glideenhet inne i hetten. Når det er tørt, senk glassmikroskopet i absolutt metanol, som dreper alle patogener. Traktene og metallbærerne er nedsenket i fortynnet DMQ, noe som dreper R. parkeri. - Lufttørk lysbildene og fest i absolutt metanol i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
- Legg lysbildene med Giemsa-flekk (4 % i Sørensons buffer, pH 6,6) i 30 minutter ved 37 °C og skyll med vann i 5 s.
- Bestem infeksjonsprosenten (antall celler infisert med rickettsiae/100 celler) ved lysmikroskopi.
MERK: Figur 1 viser typiske Giemsa-flekkresultater.
- Dyrk ISE6-celler i 25 cm2 cellekulturflasker ved 34 °C i 5 ml L15C300 medium17, supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 5% tryptosefosfatbuljong (TPB) og 0,1% lipoproteinkonsentrat (LPC).
- Forbereder cellefri R. parkeri
MERK: Når 90% -100% av cellene i kulturen er infisert, bør rickettsiae isoleres fra ISE6-cellene og elektroporering skal utføres.- Tilsett sterilt 60-90 silisiumkarbidkorn til sterile 2 ml mikrosentrifugerør til et volum på ca. 0,2 ml.
- Fjern 2 ml medium fra 100% R. parkeri-infiserte kulturer (trinn 1.1.3) og resuspend cellene i de resterende 3 ml medium.
- Overfør like deler av denne suspensjonen til rør fremstilt i trinn 1.2.1.
- Vortex hvert rør med høy hastighet i 30 s og legg deretter rørene på is. La grusen slå seg ned i løpet av sekunder etter tyngdekraften.
- I et biosikkerhetsskap i klasse II har du en steril 5 ml Luer-låssprøyte klar med stempelet forlenget og enden av stempelet festet i en polystyrenbase for 15 ml koniske rør.
- Bruk en steril 1 ml barrierepipetspiss montert på en egnet pipetor til å fjerne supernatanten fra det virvelformede cellelysatet fra slangen, og pass på at du ikke aspirerer korn. Sett pipespissen inn i åpningen av sprøytenavet og stikk innholdet inn i sprøyten med forsiktig trykk. Alternativt kan du bruke en steril, barriere 2 ml Pasteur-pipette som drives med en gummipære.
- Fest et sterilisert 2 μm porestørrelsesfilter på sprøytenavet og filtrer R. parkeri-kulturen fra trinn 1.2.6 til sterile 1,5 ml rør.
- Samle R. parkeri ved sentrifugering ved 13 600 × g ved 4 ° C i 5 minutter, og kast supernatanten.
- Resuspend pelleten i 1,2 ml iskald 300 mM sukrose og sentrifuge igjen ved 13 600 × g ved 4 °C i 5 minutter. Gjenta resuspendering og sentrifugering for totalt to sukrosevasker.
- Kombiner R. parkeri-pellets i ett kjølt, sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør i 50 μL iskaldt 300 mM sukrose per transformasjon. Som en 25 cm2 kolbe av R. parkeri gir nok rickettsiae for to til tre transformasjoner, tilsett 100-150 μL 300 mM kald sukrose.
MERK: Om ønskelig kan antall rickettsiae beregnes ved hjelp av et Petroff-Hausser tellekammer. Ved bruk av en innledende inokulasjon på 5 × 10 7 -10 × 10 7 cellefri R. parkeri, vil det ta 5-7 dager i gjennomsnitt å nå 90% -100% infeksjon, noe som gir ca. 5 × 107-10 × 10 10 cellefri R. parkeri. - Rør pelleten forsiktig om ved pipettering til den er grundig dispergert. Del prøven i 50 μL porsjoner i kjølte, sterile 1,5 ml mikrosentrifugerør.
MERK: Om ønskelig kan rickettsial levedyktighet vurderes ved flowcytometri etter farging med fluorescerende fargestoff 21.
2. Transformasjon av R. parkeri med pRAM18dSFA-plasmidet
- På is, tilsett 3 μg endotoksinfritt pRAM18dSFA plasmid-DNA13,15,20 til hvert rør som inneholder 50 μL R. parkeri-suspensjon og rør blandingen med pipetspissen forsiktig, men grundig.
MERK: Når du forbereder plasmid-DNA, bruk et rensesett som inkluderer et endotoksinfjerningstrinn for å gi endotoksinfritt plasmid-DNA23. Vi fant at en rekke plasmidkonsentrasjoner på mellom 1 μg og 3 μg per 50 μL R. parkeri-suspensjon resulterte i vellykkede transformasjoner, mens økning av mengden plasmid til 10 μg hemmet transformasjon. - Overfør ovennevnte blanding av DNA og R. parkeri til en kjølt, steril 0,1 cm gap elektroporasjonskuvette (bank forsiktig på kyvetten til blandingen er jevnt fordelt) og la den sitte på is i 10-30 minutter.
- Fjern mediet fra en 100 % konfluent kultur av ISE6-celler og resuspend cellelagene i 1,5 ml friskt medium med NaHCO 3 og HEPES-buffer (beskrevet ovenfor i trinn 1.1.3). Bruk en kolbe med sammenflytende celler per transformasjon.
- Overfør de resuspenderte cellene til et sterilt 2 ml mikrosentrifugerør (ett rør per 25 cm2 kolbe ISE6-celler).
- Elektroporate R. parkeri / pRAM18dSFA-blandingen ved 1,8 KV, 200 ohm, 25 μF ved bruk av en elektroporator.
- Bruk en steril, forlenget finspissoverføringspiplett, og overfør en liten mengde ISE6-cellesuspensjon (trinn 2.4) inn i kyvetten og trekk væsken forsiktig opp og ned for å vaske ut kyvetten. Overfør blandingen til 2 ml mikrosentrifugerør som inneholder resten av ISE6-cellesuspensjonen og bland forsiktig transformasjonsblandingen med cellene.
- Sentrifuger de transformerte prøvene ved 700 × g i 2 minutter ved RT, og øk deretter sentrifugeringshastigheten til 13 600 × g i 1 min mer ved RT.
MERK: De to sentrifugeringshastighetene fremmer rickettsial binding med og inntreden i cellene: 700 × g brukes til å trekke ned ISE6-cellene, mens 13.600 × g brukes til å trekke ned rickettsiae. - La prøvene sitte ved RT eller 34 °C i 15 minutter til 1 time.
- Resuspendere transformantene (to eller tre) i ISE6-celler med en steril 2 ml barrierepipetspiss montert på en pipetor og overføres til to eller tre 25 cm 2-cellekulturflasker som inneholder 3,5 ml friskt medium med NaHCO3 og HEPES-buffer. Alternativt kan du bruke en steril, barriere 2 ml Pasteur-pipette som drives med en gummipære.
- Rock kolbene for å spre blandingen jevnt og deretter inkubere ved 34 ° C.
- Etter 16-24 timer tilsettes 10 μL spektrinomycin (50 mg/ml) og 10 μL streptomycin (50 mg/ml) til hver kolbe i trinn 2.10.
3. Observasjon av den transformerte R. parkeri
MERK: Bruk et epifluorescensmikroskop med rhodamin / TRITC-filtre for å observere kolber tilberedt i trinn 2.11 etter 3-7 dager. Når plakkene er tydelige i kulturene (5-14 dager), kan transformert R. parkeri ses som uttrykker det røde fluorescerende proteinet mKATE, kodet på pRAM18dSFA-plasmidet.
- Konfokal mikroskopi
- Resuspend cellekulturer fra trinn 2.11 kolber og bland 100 μL av disse cellekulturer med 5 μL Hoechst 33342 løsning i 10-30 min ved RT i mørket.
MERK: Hoechst 33342 er en cellegjennomtrengelig kjernefysisk motvekt som binder seg til levende flåttcelle-DNA og avgir blå fluorescens. - Sentrifuge 50 μL av blandingen på glassmikroskopglass ved hjelp av en sentrifuge ved 5 × g i 3 minutter.
- Legg 3 μL 1x PBS til stedet av celler avsatt på lysbildet, overlegg med en dekselglid, og vis med et konfokalt mikroskop (60x objektiv). Bruk følgende eksitasjons- og utslippsparametere for fluorescerende avbildning: for 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), eksitasjon ved 350 nm, utslipp ved 470 nm; for tetrametylrhodamin (TRITC), eksitasjon ved 557 nm, utslipp ved 576 nm.
- Resuspend cellekulturer fra trinn 2.11 kolber og bland 100 μL av disse cellekulturer med 5 μL Hoechst 33342 løsning i 10-30 min ved RT i mørket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Morfologien til R. parkeri i ISE6-celler under et lysmikroskop etter Giemsa-farging er vist i figur 1. I figur 2 er transformert R. parkeri som uttrykker rødt fluorescensprotein i ISE6-celler vist ved hjelp av konfokalmikroskopi. Det er en betydelig økning i infeksjonshastigheten av transformert R. parkeri (rød) i ISE6-celler (blå, tilsvarer kjernene) fra (A) dag 7 til (B) dag 10 av inkubasjon.
Figur 1: Lysbilder som viser Giemsa-farget Rickettsia parkeri i ISE6-celler. ISE6-celler infisert med villtype R. parkeri ved (A) lav infeksjon og (B) 90% -100% infeksjonsrater. Kjernene til ISE6-cellene flekker til mørk lilla med Giemsa; R. parkeri vises som mørk lilla stenger. De røde boksene viser intracellulær rickettsiae, og de røde stjernene indikerer ekstracellulær rickettsiae. Alle bildene ble tatt på et lysmikroskop med et 100x mål. Skalastenger = 50 μm. Forkortelse: N = kjerner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Transformert Rickettsia parkeri som uttrykker rødt fluorescensprotein i ISE6-celler. pRAM18dSFA-transformert R. parkeri (rød) i ISE6-celler (blå), farget med Hoechst 33342 og påvist ved konfokalmikroskopi (A) 7 dager og (B) 10 dager etter transformasjon. Hoechst 33342 flekker kjernene, og dens eksitasjons- og emisjonsbølgelengder ligner på DAPI. De sammenslåtte signalene er en kombinasjon av DAPI- og TRITC-filterbilder. Alle bildene ble tatt på et konfokalt mikroskop med et 60x mål. Skala barer = 20 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TRITC = tetrametylrhodamin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her demonstrerer vi en metode for å introdusere eksogent DNA kodet på skyttelplasmidet pRAM18dSFA i rickettsiae ved hjelp av elektroporering. I denne prosedyren ble cellefri rickettsiae renset fra vertsceller, transformert med en rickettsial shuttle vektor, og frigjort på flåttceller for infeksjon. Også beskrevet er en konfokal immunfluorescensprosedyre for å oppdage rød fluorescensprotein-uttrykkende R. parkeri i kryssceller. Lignende metoder gjelder for andre Rickettsia-arter , og med ytterligere modifikasjoner kan de tilpasses andre obligatoriske intracellulære bakterier som er i stand til å opprettholde et plasmid.
En vellykket transformasjon i denne protokollen krever tre komponenter: eksogent DNA, Rickettsia spp. bakterier og en egnet type vertscelle22. Avhengig av det spesifikke forskningsmålet, kan disse komponentene endres. Først ble det eksogene DNA introdusert via pRAM18dSFA-plasmidet, som inneholder spektromycin- og streptomycin-valgbare markører og uttrykker mKATE (et langt rødt fluorescerende protein). Dette plasmidet gir også ampicillinresistens for vekst i Escherichia coli. Som vist i tidligere studier er det mulig å erstatte antibiotikaresistensmarkører og genene for fluorescerende proteiner13. For det andre ble ISE6-celler valgt for å representere transformerte cellelinjer, da denne cellelinjen er mye brukt i mange laboratorier og er en viktig modell for studiet av vektorpatogeninteraksjoner17,18,19. Andre arter av tick16 eller pattedyrceller23,24 kan også brukes til å vokse rickettsiae for transformasjon. Til slutt, i denne protokollen, ble R. parkeri brukt, som kan manipuleres i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) laboratorium ved hjelp av et klasse II biosikkerhetsskap med riktige sikkerhetstiltak. Andre mer patogene Rickettsia spp. (f.eks. R. rickettsii; R. prowazekii) krever en BSL-3-innstilling for manipulering; Derfor må en strengere biosikkerhetsstandardprotokoll brukes ved arbeid med slike midler.
Selv om denne protokollen kan brukes som en standardprosedyre for rickettsiae-transformasjon, krever flere viktige tekniske trinn spesiell oppmerksomhet. For det første må et vellykket rensetrinn sikre cellefri rickettsiaeoverlevelse og smittsomhet9; Derfor er det mest kritiske aspektet ved transformasjonsprosedyren å isolere smittsom, cellefri rickettsiae. Eventuelt restsalt i den rensede rickettsiaen vil resultere i bue- og transformasjonssvikt. Derfor er det nødvendig å vaske den isolerte cellefrie rickettsiaen med sukrose for å fjerne alle salter. Den kalde sukroseløsningen beskytter også rickettsial membranintegritet i ekstracellulær tilstand.
Når 90% -100% av cellene i en kultur er infisert, bør rickettsiae isoleres fra ISE6-cellene, og elektroporering skal utføres uten forsinkelse og uten avbrudd, da rickettsiae er intracellulære organismer og ikke overlever godt utenfor celler. Selv om rickettsialkulturer kan lagres ved 4 °C, bør denne typen materiale ikke brukes til elektroporering. En kultur som har blitt lagret ved 4 ° C, kan brukes til å inokulere et nytt lag av ISE6-celler, som deretter kan brukes til elektroporering når infeksjonen har nådd 90% -100%.
For det andre er elektroporeringsinnstillingene, inkludert spenning, motstand, kapasitans og tidskonstant, spesifikke for forskjellige rickettsiale arter. For eksempel er feltstyrken som kreves under elektroporering avhengig av størrelsen på rickettsiae og eksogent DNA7. Til slutt er det viktig å opprettholde den transformerte rickettsiae under antibiotikavalg for å forhindre tap av eksogene plasmider under flere passasjer i vertsceller9. Konsentrasjonen og typen antibiotika som brukes er avhengig av at Rickettsia-artene blir transformert, som tidligere beskrevet 13,15,16,23, og det er viktig at antibiotikamarkøren som velges ikke skal være en som brukes i kliniske behandlinger.
For å følge denne protokollen bør både spektinomycin og streptomycin brukes til seleksjon inntil all gjenværende utransformert rickettsiae er eliminert. Kombinert dreper de to antibiotika både intracellulær og ekstracellulær rickettsiae og reduserer sannsynligheten for at resistent villtype rickettsiae dukker opp. I tillegg påvirker bruk av begge disse antibiotika ikke nedstrømseksperimenter, for eksempel evnen til å bruke dem separat for å velge for to forskjellige plasmider, siden aadA-genet gir motstand mot både spektinomycin og streptomycin. De to antibiotika som brukes i denne protokollen gir ikke resistens mot antibiotika som brukes i klinisk behandling av rickettsial sykdom.
ISE6-krysscellelinjen som ble brukt i denne studien har unike fordeler. Først ble ISE6-celler isolert fra den svartbente flåtten Ixodes scapularis Say (Acari: Ixodidae), hovedvektoren for syv humane patogener i USA. For det andre er ISE6 en mye brukt krysscellelinje i mange laboratorier og har blitt brukt til å gjenopprette mange flåttassosierte bakterier (Rickettsia, Anaplasma og Ehrlichia) etter elektroporering. For det tredje kan noen patogene rickettsiae bare forplantes i flåttceller, men ikke i pattedyrceller17,18,19,24. Imidlertid er krysscellelinjer relativt skjøre sammenlignet med pattedyrceller og har mer intensive kulturkrav25,26,27,28. I tillegg er vekstraten til ISE6-celler betydelig langsommere enn for pattedyrcellelinjer, selv om den er sådd med samme innledende tetthet, selv om langsom replikasjon kan være fordelaktig når rickettsiale transformanter utviser redusert vekst.
Denne protokollen gir også en metode for å evaluere transformasjonseffektiviteten til rickettsiae i levende celler ved kritiske eksperimentelle trinn, noe som bidrar til å optimalisere elektroporeringsinnstillinger eller ved å teste effektiviteten til forskjellige cellelinjer for å gjenopprette transformanter. Likevel har denne protokollen begrensninger, spesielt for kvantifisering av transformantene som er oppnådd. Transformasjonseffektivitet som en indikator på en vellykket transformasjon kan demonstreres i en fremtidig studie. Rickettsial levedyktighet kan vurderes ved hjelp av et egnet fargesett og flowcytometri21 for å kvantifisere transformantene som oppnås. To parametere vil bli brukt til å bestemme transformasjonseffektivitet - antall levende rickettsiae som brukes til transformasjon og antall transformerte rickettsiae som uttrykker mKATE.
I tillegg kan bildeanalyse med fluorescenssignaler brukes til å sammenligne transformasjonshastighetene til forskjellige plasmider. Siden den underliggende mekanismen for vedlikehold av rickettsial plasmid er dårlig forstått, kan godt karakteriserte transformasjonssystemer for innføring av eksogene plasmider være verdifulle verktøy for videre undersøkelse. Videre vil direkte visualisering av fluorescerende protein-uttrykkende rickettsiae i celler eller vev forbedre vår forståelse av rickettsia / vert / vektor interaksjoner. Dette vil gi informasjon for å utforme strategier for å kontrollere og forebygge rickettsioses.
Datatilgjengelighet:
Alle data som ligger til grunn for resultatene fra denne studien er offentlig tilgjengelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter oppgis.
Acknowledgments
Vi takker Timothy J. Kurtti og Benjamin Cull for deres innsiktsfulle diskusjoner og forslag. Denne studien ble økonomisk støttet av et tilskudd til U.G.M. fra NIH (2R01AI049424) og et tilskudd til U.G.M. fra Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
References
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
- Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
- Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
- Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
- Winkler, H. H.
- Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
- Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E.
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
- Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
- Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
- Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
- Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
- Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
- Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
- Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
- Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
- Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
- Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
- Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
- Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
- Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
- Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
- Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
- Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
- Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).
