Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En elektroporationsmetod för att omvandla Rickettsia spp.

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64562
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Minnesota

Summary

Elektroporering är en snabb, allmänt antagen metod för att införa exogent DNA i släktet Rickettsia. Detta protokoll ger en användbar elektroporationsmetod för omvandling av obligatoriska intracellulära bakterier i släktet Rickettsia.

Abstract

Rickettsioses orsakas av ett brett spektrum av obligatoriska intracellulära bakterier som tillhör släktet Rickettsia som kan överföras till ryggradsdjursvärdar genom bett av infekterade leddjursvektorer. Hittills är nya eller återuppkommande epidemiska rickettsioses fortfarande en folkhälsorisk på grund av svårigheten att diagnostisera, eftersom diagnostiska metoder är begränsade och inte standardiserade eller allmänt tillgängliga. Feldiagnos till följd av bristande erkännande av tecken och symtom kan leda till försenad antibiotikabehandling och dåliga hälsoutfall. En omfattande förståelse av Rickettsia-egenskaper skulle i slutändan förbättra klinisk diagnos, bedömning och behandling med förbättrad kontroll och förebyggande av sjukdomen.

Funktionella studier av rickettsialgener är avgörande för att förstå deras roll i patogenesen. Detta dokument beskriver ett förfarande för elektroporering av Rickettsia parkeri-stammen Tate's Hell med skyttelvektorn pRAM18dSFA och valet av transformerad R. parkeri i fästcellsodling med antibiotika (spektinomycin och streptomycin). En metod beskrivs också för lokalisering av transformerad R. parkeri i fästingceller med hjälp av konfokal immunofluorescensmikroskopi, en användbar teknik för att kontrollera transformation i vektorcellinjer. Liknande tillvägagångssätt är också lämpliga för omvandling av andra rickettsiae.

Introduction

Rickettsioses orsakas av ett brett spektrum av obligatoriska intracellulära bakterier som tillhör släktet Rickettsia (familj Rickettsiaceae, ordning Rickettsiales). Släktet Rickettsia klassificeras i fyra huvudgrupper baserat på fylogenetiska egenskaper1,2: den fläckiga febergruppen (SFG), som innehåller de rickettsiae som orsakar de allvarligaste och dödligaste fästingburna rickettsioserna (t.ex. Rickettsia rickettsii, orsaksmedlet för Rocky Mountain Spotted Fever), tyfusgruppen (TG, t.ex. Rickettsia prowazekii, agenten för epidemisk tyfus), övergångsgruppen (TRG, t.ex. Rickettsia felis, orsaksmedlet för loppburen fläckig feber) och förfädersgruppen (AG, t.ex. Rickettsia bellii).

Bland de äldsta kända vektorburna sjukdomarna förvärvas rickettsioses huvudsakligen efter överföring av patogenerna genom bett av infekterade leddjursvektorer, inklusive fästingar, loppor, löss och kvalster 3,4. Även om upptäckten av effektiva antibiotika förbättrade behandlingsresultaten, fortsätter nya och återuppkommande epidemiska rickettsioses att utmana traditionella förebyggande och kontrollstrategier. Således skulle en omfattande förståelse av rickettsia / värd / vektorinteraktioner i slutändan skapa en stark grund för att utveckla nya metoder för att förebygga och bota dessa gamla sjukdomar.

I naturen sker horisontell genöverföring (HGT) i bakterier genom konjugering, transduktion och transformation5. In vitro bakteriell transformation använder dessa HGT-koncept, även om rickettsiaes intracellulära natur innebär vissa utmaningar. De begränsade tillväxtförhållandena och dåligt förstådda konjugerings- och transduktionssystemen hos olika arter av rickettsiae har förhindrat tillämpningen av konjugerings- och transduktionsmetoder i rickettsiae 6,7,8. Jämfört med andra obligatoriska intracellulära bakteriesläkten (t.ex. klamydia, Coxiella, Anaplasma och Ehrlichia) skiljer sig släktet Rickettsia med avseende på tillväxt- och replikationsstrategierna inom cellcytoplasman, vilket innebär specifika utmaningar för den genetiska modifieringen av rickettsiae på grund av deras unika livsstilsegenskaper9.

Det första hindret att övervinna när man försöker genetisk modifiering av rickettsiae är att uppnå framgångsrik omvandling. Således skulle utformningen av ett genomförbart tillvägagångssätt med hög transformationseffektivitet vara extremt värdefullt för att utveckla genetiska verktyg för rickettsiae. Här fokuserar vi på elektroporation, en allmänt erkänd transformationsmetod som har använts för att framgångsrikt introducera exogent DNA i flera arter av rickettsiae, inklusive Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii och Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.

Detta dokument beskriver ett förfarande för elektroporering av R. parkeri-stammen Tate's Hell (anslutning: GCA_000965145.1) med skyttelvektorn pRAM18dSFA härledd från Rickettsia amblyommatis-stammen AaR / SC-plasmid pRAM18 konstruerad för att koda mKATE, ett långt rött fluorescerande protein, och aadA, vilket ger spektinomycin och streptomycinresistens13,15,20. Transformerade R. parkeri är livskraftiga och stabilt underhållna under antibiotikaval i fästingcellinjer. Dessutom visar vi att lokaliseringen av transformerade R. parkeri i levande fästingceller via konfokalmikroskopi kan användas för att bedöma kvaliteten på transformationshastigheter i vektorcellinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förökning och rening av R. parkeri från fästingcellsodling

OBS: Alla cellodlingsprocedurer ska utföras i ett klass II-biosäkerhetsskåp.

  1. Förbereda R. parkeri-infekterade fästingceller
    1. Odla ISE6-celler i 25 cm2-celliga odlingskolvar vid 34 °C i 5 ml L15C300 medium17, kompletterat med 5% fetalt bovint serum (FBS), 5% tryptosfosfatbuljong (TPB) och 0,1% lipoproteinkoncentrat (LPC).
      OBS: ISE6 (Ixodes scapularis embryo-derived cell line) är en fästingcellinje som används i stor utsträckning i många laboratorier och är därför en viktig modell för att studera fästing-patogeninteraktioner17,18,19. Tillväxthastigheten för ISE6-celler är långsammare än för däggdjursceller, med en populationsfördubblingstid på ≥72 timmar. Till exempel kommer ISE6-celler subodlade från en 100% sammanflytande kultur i förhållandet 1: 5 att ta 3-4 veckor att återfå 100% sammanflöde. Friska ISE6-celler kommer i allmänhet att avrundas med många vidhäftande filament17.
    2. Räkna ISE6-cellerna med en hemocytometer under ett ljusmikroskop. Använd i en koncentration av ~ 106 celler / ml (100% sammanflöde).
      1. Skölj försiktigt cellerna från kolven med medium och sprid cellerna genom pipettering för att generera en homogen cellsuspension. Tillsätt 20 μL cellsuspension mellan hemocytometern och täckglaset för att räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
    3. Lägg till värdcellfri vildtyp R. parkeri 20 (genomsnittligt antal: 5 × 10 7-10 × 107) till ISE6-cellkulturerna i 25 cm2 cellodlingskolvar. Inkubera infekterade R. parkeri-cellkulturer vid 34 °C i 5 ml komplett medium bestående av L15C300-medium, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% natriumbikarbonat (NaHCO3) och 25 mM HEPES tills 90% -100% av cellerna är infekterade.
      OBS: Infektionshastigheten för R. parkeri i ISE6-celler bestäms av Giemsa-färgning, och inkubationstiden för att nå 90% -100% infektion varierar från 5 dagar till 7 dagar i genomsnitt.
    4. Bestäm infektionshastigheten via Giemsa-färgning.
      1. I biosäkerhetsskåpet återsuspenderar du de infekterade cellkulturerna och överför 50 μL av suspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
      2. Späd suspensionen med fullständigt medium (1:5 spädning) och centrifugera 100 μl på glasmånsglas med hjälp av en centrifug på 113 × g i 5 minuter. För att hålla levande R. parkeri innesluten, använd en centrifug med en förseglad rotor som är konstruerad för att tas bort från centrifugen. Detta möjliggör transport av den förseglade rotorn in och ut ur huven.
        OBS: Eftersom R. parkeri fortfarande lever före centrifugering måste provet innehålla tills rickettsia dödas. Således måste centrifugen som används för att snurra R. parkeri-kulturen på bilden ha en förseglad rotor som är konstruerad för att lyftas ut ur centrifugen. Med rotorn i den laminära flödeshuven, ladda proverna i trattmikroskopets glidaggregat, återförslut rotorn och placera den förseglade rotorn tillbaka i centrifugen. Slå sedan på centrifugen och proverna deponeras på mikroskopglasen. När körningen är klar, ta bort den förseglade rotorn från centrifugen och placera den i den laminära flödeshuven. Där öppnar du rotorlocket och lossar trattmikroskopets glidaggregat inuti huven. När det är torrt, fördjupa glasmikroskopet i absolut metanol, vilket dödar alla patogener. Trattarna och metallbärarna är nedsänkta i utspädd DMQ, vilket dödar R. parkeri.
      3. Lufttorka objektglasen och fixera i absolut metanol i 5 min vid rumstemperatur (RT).
      4. Färga rutschkanorna med Giemsa-fläck (4% i Sørensons buffert, pH 6,6) i 30 min vid 37 °C och skölj med vatten i 5 s.
      5. Bestäm infektionsprocenten (antal celler infekterade med rickettsiae/100 celler) med ljusmikroskopi.
        OBS: Figur 1 visar typiska Giemsa-fläckresultat.
  2. Förbereda cellfri R. parkeri
    OBS: När 90%-100% av cellerna i kulturen är infekterade, bör rickettsiae isoleras från ISE6-cellerna och elektroporering bör utföras.
    1. Tillsätt sterilt 60-90 kiselkarbidkorn till sterila 2 ml mikrocentrifugrör till en volym av cirka 0,2 ml.
    2. Ta bort 2 ml medium från 100 % R. parkeri-infekterade kulturer (steg 1.1.3) och återsuspendera cellerna i de återstående 3 ml mediet.
    3. Överför lika delar av denna suspension till rör som beretts i steg 1.2.1.
    4. Vörda varje rör med hög hastighet i 30 s och placera sedan rören på is. Låt gruset sätta sig inom några sekunder av tyngdkraften.
    5. I ett klass II biosäkerhetsskåp, ha en steril 5 ml Luer-lock-spruta redo med kolven utsträckt och kolvens ände säkrad i en polystyrenbas för 15 ml koniska rör.
    6. Använd en steril, 1 ml barriärpipettspets monterad på en lämplig pipettor, ta bort supernatanten på det virvlade celllysatet från röret, var noga med att inte aspirera något grus. För in pipettspetsen i sprutnavets öppning och mata ut innehållet i sprutan med försiktigt tryck. Alternativt kan du använda en steril barriär 2 ml Pasteur-pipett som drivs med en gummilampa.
    7. Fäst ett steriliserat filter med en porstorlek på 2 μm på sprutnavet och filtrera R. parkeri-kulturen från steg 1.2.6 till sterila 1,5 ml rör.
    8. Samla upp R. parkeri genom centrifugering vid 13 600 × g vid 4 °C i 5 minuter och kassera supernatanten.
    9. Återsuspendera pelleten i 1,2 ml iskall 300 mM sackaros och centrifugera igen vid 13 600 × g vid 4 °C i 5 minuter. Upprepa resuspensionen och centrifugeringen i totalt två sackarostvättar.
    10. Kombinera R. parkeri-pellets till ett kylt, sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör i 50 μl iskall 300 mM sackaros per transformation. Eftersom en 25 cm2 kolv av R. parkeri ger tillräckligt med rickettsiae för två till tre transformationer, tillsätt 100-150 μL 300 mM kall sackaros.
      OBS: Om så önskas kan antalet rickettsiae beräknas med hjälp av en Petroff-Hausser räknekammare. Vid användning av en initial inokulering av 5 × 10 7-10 × 10 7 cellfri R. parkeri tar det i genomsnitt 5-7 dagar att nå 90%-100% infektion, vilket ger cirka 5 × 107-10 × 1010 cellfri R. parkeri.
    11. Återsuspendera försiktigt pelleten genom pipettering tills den är ordentligt dispergerad. Dela provet i 50 μl portioner i kylda, sterila 1,5 ml mikrocentrifugrör.
      OBS: Om så önskas kan rickettsial viabilitet bedömas genom flödescytometri efter färgning med ett fluorescerande färgämne 21.

2. Transformation av R. parkeri med pRAM18dSFA-plasmiden

  1. Tillsätt 3 μg endotoxinfritt pRAM18dSFA-plasmid-DNA13,15,20 på is till varje rör som innehåller 50 μl R. parkeri-suspension och rör om blandningen med pipettspetsen försiktigt men noggrant.
    OBS: När du förbereder plasmid-DNA, använd ett reningssats som innehåller ett endotoxinavlägsnande steg för att ge endotoxinfritt plasmid-DNA23. Vi fann att ett intervall av plasmidkoncentrationer på mellan 1 μg och 3 μg per 50 μL R. parkeri-suspension resulterade i framgångsrika transformationer, medan ökning av mängden plasmid till 10 μg hämmade transformationen.
  2. Överför ovanstående blandning av DNA och R. parkeri till en kyld, steril 0,1 cm gapelektroporationskyvett (knacka försiktigt på kyvetten tills blandningen är jämnt fördelad) och låt den sitta på is i 10-30 min.
  3. Ta bort mediet från en 100% sammanflytande odling av ISE6-celler och återsuspendera cellskikten i 1,5 ml färskt medium med NaHCO 3 och HEPES-buffert (beskrivs ovan i steg 1.1.3). Använd en kolv med konfluenta celler per transformation.
  4. Överför de återsuspenderade cellerna till ett sterilt 2 ml mikrocentrifugrör (ett rör per 25 cm2 kolv med ISE6-celler).
  5. Elektropolera R. parkeri/pRAM18dSFA-blandningen vid 1,8 KV, 200 ohm, 25 μF med hjälp av en elektroporator.
  6. Använd en steril, förlängd finspetsöverföringspipett och överför en liten mängd av ISE6-cellsuspensionen (steg 2.4) till kyvetten och dra försiktigt vätskan upp och ner för att tvätta ut kyvetten. Överför blandningen till 2 ml mikrocentrifugrör som innehåller resten av ISE6-cellsuspensionen och blanda försiktigt transformationsblandningen med cellerna.
  7. Centrifugera de transformerade proverna vid 700 × g i 2 minuter vid rt och öka sedan centrifugeringshastigheten till 13 600 × g i ytterligare 1 min vid RT.
    OBS: De två centrifugeringshastigheterna främjar rickettsial bindning med och inträde i cellerna: 700 × g används för att dra ner ISE6-cellerna, medan 13 600 × g används för att dra ner rickettsiae.
  8. Låt proverna sitta vid RT eller 34 °C i 15 min till 1 timme.
  9. Återsuspendera transformanterna (två eller tre) i ISE6-celler med en steril 2 ml barriärpipettspets monterad på en pipettor och överför till två eller tre 25 cm2-celliga odlingskolvar som innehåller 3,5 ml färskt medium med NaHCO3 - och HEPES-buffert. Alternativt kan du använda en steril barriär 2 ml Pasteur-pipett som drivs med en gummilampa.
  10. Häll kolvarna så att blandningen sprids jämnt och inkubera sedan vid 34 °C.
  11. Efter 16–24 timmar, tillsätt 10 μl spektinomycin (50 mg/ml) och 10 μl streptomycin (50 mg/ml) till varje kolv i steg 2.10.

3. Observation av den förvandlade R. parkeri

OBS: Använd ett epifluorescensmikroskop med rhodamin/ TRITC-filter för att observera kolvarna som beretts i steg 2.11 efter 3-7 dagar. När plack är uppenbara i kulturerna (5-14 dagar) kan transformerad R. parkeri ses som uttrycker det röda fluorescerande proteinet mKATE, kodat på pRAM18dSFA-plasmiden.

  1. Konfokalmikroskopi
    1. Återsuspendera cellkulturerna från steg 2.11-kolvarna och blanda 100 μl av dessa cellkulturer med 5 μl Hoechst 33342-lösning i 10-30 min vid RT i mörker.
      OBS: Hoechst 33342 är en cellgenomsläpplig kärnmotfärg som binder till levande fästingcells-DNA och avger blå fluorescens.
    2. Centrifugera 50 μl av blandningen på glasmikroskopglas med en centrifug på 5 × g i 3 minuter.
    3. Lägg till 3 μL 1x PBS till platsen för celler som deponeras på bilden, överlägg med en täckglidning och visa med ett konfokalmikroskop (60x mål). Använd följande excitations- och emissionsparametrar för fluorescerande avbildning: för 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), excitation vid 350 nm, emission vid 470 nm; för tetrametylrhodamin (TRITC), excitation vid 557 nm, utsläpp vid 576 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfologin hos R. parkeri i ISE6-celler under ett ljusmikroskop efter Giemsa-färgning visas i figur 1. I figur 2 visas transformerat R. parkeri som uttrycker rött fluorescensprotein i ISE6-celler med konfokalmikroskopi. Det finns en betydande ökning av infektionshastigheten för transformerad R. parkeri (röd) i ISE6-celler (blå, motsvarar kärnorna) från (A) dag 7 till (B) dag 10 av inkubation.

Figure 1
Bild 1: Bilder som visar Giemsa-färgade Rickettsia parkeri i ISE6-celler. ISE6-celler infekterade med vildtyp R. parkeri vid (A) låg infektion och (B) 90% -100% infektionshastigheter. Kärnorna i ISE6-cellerna fläckar till mörklila med Giemsa; R. parkeri framträder som mörklila stavar. De röda rutorna visar intracellulär rickettsiae, och de röda asteriskerna indikerar extracellulär rickettsiae. Alla bilder togs på ett ljusmikroskop med ett 100x mål. Skalstänger = 50 μm. Förkortning: N = kärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Transformerad Rickettsia parkeri som uttrycker rött fluorescensprotein i ISE6-celler. pRAM18dSFA-transformerad R. parkeri (röd) i ISE6-celler (blå), färgad med Hoechst 33342 och detekterad med konfokalmikroskopi (A) 7 dagar och (B) 10 dagar efter transformation. Hoechst 33342 fläckar kärnorna, och dess excitations- och emissionsvåglängder liknar DAPI. De sammanslagna signalerna är en kombination av DAPI- och TRITC-filterbilder. Alla bilder togs på ett konfokalmikroskop med ett 60x mål. Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TRITC = tetrametylrhodamin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här demonstrerar vi en metod för att införa exogent DNA kodat på skyttelplasmiden pRAM18dSFA i rickettsiae med hjälp av elektroporation. I denna procedur renades cellfri rickettsiae från värdceller, transformerades med en rickettsial shuttlevektor och släpptes ut på fästceller för infektion. Dessutom beskrivs ett konfokalt immunofluorescensförfarande för att detektera röd fluorescensproteinuttryckande R. parkeri i fästingceller. Liknande metoder är tillämpliga på andra Rickettsia-arter och kan med ytterligare modifieringar vara anpassningsbara till andra obligatoriska intracellulära bakterier som kan upprätthålla en plasmid.

En framgångsrik omvandling i detta protokoll kräver tre komponenter: exogent DNA, Rickettsia spp.-bakterier och en lämplig typ av värdcell22. Beroende på det specifika forskningsmålet kan dessa komponenter ändras. Först introducerades det exogena DNA:t via pRAM18dSFA-plasmiden, som innehåller spektinomycin- och streptomycinvalbara markörer och uttrycker mKATE (ett långt rött fluorescerande protein). Denna plasmid ger också ampicillinresistens för tillväxt i Escherichia coli. Som visats i tidigare studier är det möjligt att ersätta antibiotikaresistensmarkörer och generna för fluorescerande proteiner13. För det andra valdes ISE6-celler för att representera transformerade cellinjer eftersom denna cellinje används i stor utsträckning i många laboratorier och är en viktig modell för studier av vektor-patogeninteraktioner17,18,19. Andra arter av fästing16 eller däggdjursceller23,24 kan också användas för att odla rickettsiae för transformation. Slutligen användes i detta protokoll R. parkeri, som kan manipuleras i ett laboratorium för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) med hjälp av ett klass II-biosäkerhetsskåp med lämpliga säkerhetsåtgärder. Andra mer patogena Rickettsia spp. (t.ex. R. rickettsii; R. prowazekii) kräva en BSL-3-inställning för manipulation; Därför måste ett strängare biosäkerhetsstandardprotokoll användas vid arbete med sådana medel.

Även om detta protokoll kan användas som ett standardförfarande för rickettsiae-transformation, kräver flera viktiga tekniska steg särskild uppmärksamhet. För det första måste ett framgångsrikt reningssteg säkerställa cellfri rickettsiae överlevnad och smittsamhet9; Därför är den mest kritiska aspekten av transformationsförfarandet att isolera smittsamma, cellfria rickettsiae. Eventuellt kvarvarande salt i den renade rickettsiae kommer att resultera i båg- och transformationsfel. Därför krävs tvättning av den isolerade cellfria rickettsiae med sackaros för att avlägsna alla salter. Den kalla sackaroslösningen skyddar också rickettsialmembranets integritet i det extracellulära tillståndet.

När 90%-100% av cellerna i en kultur är infekterade, bör rickettsiae isoleras från ISE6-cellerna, och elektroporering bör utföras utan dröjsmål och utan avbrott, eftersom rickettsiae är intracellulära organismer och inte överlever långt utanför cellerna. Även om rickettsialkulturer kan lagras vid 4 °C, bör denna typ av material inte användas för elektroporering. En kultur som har lagrats vid 4 °C kan användas för att inokulera ett nytt lager av ISE6-celler, som sedan kan användas för elektroporering när infektionen har nått 90%-100%.

För det andra är elektroporationsinställningarna, inklusive spänning, motstånd, kapacitans och tidskonstant, specifika för olika rickettsialarter. Till exempel är fältstyrkan som krävs vid elektroporering beroende av storleken på rickettsiae och exogent DNA7. Slutligen är det viktigt att upprätthålla den transformerade rickettsiae under antibiotikaselektion för att förhindra förlust av exogena plasmider under flera passager i värdceller9. Koncentrationen och typen av antibiotika som används är beroende av att Rickettsia-arten transformeras, som tidigare beskrivits 13,15,16,23, och det är viktigt att den valda antibiotikamarkören inte är en som tillämpas i kliniska behandlingar.

För att följa detta protokoll bör både spektinomycin och streptomycin användas för selektion tills alla återstående otransformerade rickettsiae har eliminerats. Tillsammans dödar de två antibiotika både intracellulära och extracellulära rickettsiae och minskar sannolikheten för att resistent vildtyp rickettsiae dyker upp. Dessutom påverkar användningen av båda dessa antibiotika inte nedströms experiment, såsom förmågan att använda dem separat för att välja för två olika plasmider, eftersom aadA-genen ger resistens mot både spektinomycin och streptomycin. De två antibiotika som används i detta protokoll ger inte resistens mot antibiotika som används vid klinisk behandling av rickettsial sjukdom.

ISE6-fästingcellinjen som används i denna studie har unika fördelar. Först isolerades ISE6-celler från den svartbenta fästingen Ixodes scapularis Say (Acari: Ixodidae), huvudvektorn för sju mänskliga patogener i USA. För det andra är ISE6 en omfattande fästingcellinje i många laboratorier och har framgångsrikt använts för att återställa många fästingassocierade bakterier (Rickettsia, Anaplasma och Ehrlichia) efter elektroporering. För det tredje kan vissa patogena rickettsiae endast förökas i fästingceller men inte i däggdjursceller17,18,19,24. Fästingcellinjer är dock relativt ömtåliga jämfört med däggdjursceller och har mer intensiva odlingskrav25,26,27,28. Dessutom är tillväxthastigheten för ISE6-celler signifikant långsammare än för däggdjurscellinjer, även om de är sådda med samma initiala densitet, även om långsam replikation kan vara fördelaktig när rickettsialtransformanterna uppvisar minskad tillväxt.

Detta protokoll tillhandahåller också en metod för att utvärdera transformationseffektiviteten hos rickettsiae i levande celler vid kritiska experimentella steg, vilket hjälper till att optimera elektroporationsinställningar eller testa effektiviteten hos olika cellinjer för att återställa transformanter. Icke desto mindre har detta protokoll begränsningar, särskilt för kvantifieringen av de erhållna transformanterna. Transformationseffektivitet som en indikator på en framgångsrik omvandling kan demonstreras i en framtida studie. Rickettsial viabilitet kan bedömas med hjälp av en lämplig färgningssats och flödescytometri21 för att kvantifiera de transformanter som erhålls. Två parametrar skulle användas för att bestämma transformationseffektivitet - antalet levande rickettsiae som används för transformation och antalet transformerade rickettsiae som uttrycker mKATE.

Dessutom kan bildanalys med fluorescenssignaler användas för att jämföra transformationshastigheterna för olika plasmider. Eftersom den underliggande mekanismen för rickettsial plasmidunderhåll är dåligt förstådd kan väl karakteriserade transformationssystem för införande av exogena plasmider vara värdefulla verktyg för vidare undersökning. Dessutom kommer den direkta visualiseringen av fluorescerande proteinuttryckande rickettsiae i celler eller vävnader att förbättra vår förståelse av rickettsia / värd / vektorinteraktioner. Detta kommer att ge information för att utforma strategier för att kontrollera och förebygga rickettsioses.

Data tillgänglighet:
Alla data som ligger till grund för resultaten av denna studie är offentligt tillgängliga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar Timothy J. Kurtti och Benjamin Cull för deras insiktsfulla diskussioner och förslag. Denna studie stöddes ekonomiskt av ett bidrag till U.G.M. från NIH (2R01AI049424) och ett bidrag till U.G.M. från Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette Bio-Rad 1652083
2 μm pore size filter  GE Healthcare Life Sciences Whatman 6783-2520
5 mL Luer-lock syringe  BD 309646
60-90 silicon carbide grit  LORTONE, inc  591-056
absolute methanol  Fisher Scientific A457-4
Bacto tryptose phosphate broth  BD 260300
Cytospin centrifuge Cytospin4 Thermo Fisher Scientific A78300003 The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) QIAGEN 12362 used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet  Perfector Scientific TP03-5301
fetal bovine serum  Gemini Bio 900-108 The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS Bio-Rad 165-2105 & 165-2110
hemocytometer Thermo Fisher Scientific 267110
HEPES Millipore-Sigma H4034
ImageJ Fiji National Institute of Health raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain  Gibco  2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium Gibco 41300039
lipoprotein concentrate  MP Biomedicals 191476
Nikon Diaphot Nikon epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent  Thermo Fisher Scientific R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope  Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber Hausser Scientific  Chamber 3900
sodium bicarbonate Millipore-Sigma S5761
Vortex Fisher Vortex Genie 2 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
  5. Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
  6. Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
  7. Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
  8. Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
  9. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
  10. Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
  11. Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
  12. Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
  13. Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
  14. Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
  15. Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
  16. Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
  17. Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
  18. Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
  19. Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
  20. Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
  21. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  22. Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
  23. Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
  24. Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
  25. Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
  26. Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
  27. Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
  28. Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).

Tags

Biologi Utgåva 188 Elektroporering Rickettsia immunofluorescens
En elektroporationsmetod för att omvandla <em>Rickettsia</em> spp.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y.,… More

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y., Price, L. D., Munderloh, U. G. An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines. J. Vis. Exp. (188), e64562, doi:10.3791/64562 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter