Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التلاعب في تناول الطعام الإيقاعي في الفئران باستخدام نظام تغذية مخصص

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64624
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Biology, Texas A&M University, 2Center for Biological Clocks Research, Texas A&M University, 3Interdisciplinary Program of Genetics, Texas A&M University

Summary

برز تقييد توقيت تناول الطعام كتدخل واعد لتخفيف الأمراض الأيضية التي يسببها النظام الغذائي. توضح هذه المخطوطة بالتفصيل بناء واستخدام نظام فعال تم بناؤه داخليا لقياس ومعالجة تناول الطعام الإيقاعي في الفئران.

Abstract

التعبير الجيني الإيقاعي هو السمة المميزة لإيقاع الساعة البيولوجية وهو ضروري لقيادة إيقاع الوظائف البيولوجية في الوقت المناسب من اليوم. أظهرت الدراسات التي أجريت على مدى العقود القليلة الماضية أن تناول الطعام الإيقاعي (أي الوقت الذي تأكل فيه الكائنات الحية الطعام خلال يوم 24 ساعة) ، يساهم بشكل كبير في التنظيم الإيقاعي للتعبير الجيني في مختلف الأعضاء والأنسجة في جميع أنحاء الجسم. تمت دراسة آثار تناول الطعام الإيقاعي على الصحة وعلم وظائف الأعضاء على نطاق واسع منذ ذلك الحين وكشفت أن تقييد تناول الطعام لمدة 8 ساعات خلال المرحلة النشطة يخفف من الأمراض الأيضية الناشئة عن مجموعة متنوعة من الأنظمة الغذائية المسببة للسمنة. غالبا ما تتطلب هذه الدراسات استخدام طرق خاضعة للرقابة لتوقيت تسليم الطعام للحيوانات. تصف هذه المخطوطة تصميم واستخدام نظام منخفض التكلفة وفعال ، تم بناؤه داخليا لقياس الاستهلاك اليومي للطعام بالإضافة إلى التلاعب بتناول الطعام الإيقاعي في الفئران. يستلزم هذا النظام استخدام مواد خام ميسورة التكلفة لبناء أقفاص مناسبة لتوصيل الطعام ، باتباع إجراء مناولة سهل الاستخدام. يمكن استخدام هذا النظام بكفاءة لإطعام الفئران على أنظمة تغذية مختلفة مثل الجداول الزمنية أو جداول عدم انتظام ضربات القلب ، ويمكن أن يتضمن نظاما غذائيا عالي الدهون لدراسة تأثيره على السلوك وعلم وظائف الأعضاء والسمنة. يتم تقديم وصف لكيفية تكيف الفئران من النوع البري (WT) مع أنظمة التغذية المختلفة.

Introduction

تم العثور على الساعة البيولوجية في كل مكان عبر الأنواع وتوفر آلية لحفظ الوقت تساعد الكائنات الحية على التكيف مع بيئتها المتغيرة إيقاعيا. يقع جهاز تنظيم ضربات القلب اليومي الرئيسي في النواة فوق التصالبية (SCN) في منطقة ما تحت المهاد. يتم تقييد SCN بشكل أساسي من خلال دورة الضوء والظلام البيئية ، ومزامنة الساعات الطرفية الموجودة في كل خلية من خلايا الجسم تقريبا عبر إشارات متعددة ، بما في ذلك الإشارات العصبية والهرمونية ، والتغذية ، ودرجة حرارة الجسم1،2،3،4،5،6،7،8 . في الثدييات ، تعتمد الساعة البيولوجية الجزيئية على عامل النسخ غير المتجانس CLOCK: BMAL1 9,10 ، والذي يتحكم في التعبير عن جينات الساعة الأساسية المسماة Period (Per1 و Per2 و Per3) و Cryptochrome (Cry1 و Cry2) لبدء حلقة تغذية مرتدة نسخية ضرورية لتوليد إيقاعات الساعة البيولوجية9،11،12 . تنظم الساعة الجزيئية أيضا النسخ الإيقاعي لآلاف الجينات التي تتحكم في إيقاع كل وظيفة بيولوجية تقريبا13،14،15. يتم التعبير عن أكثر من 50٪ من الجينوم في الثدييات بشكل إيقاعي في نوع نسيج واحد على الأقل16،17،18 ، والأنسجة مثل الكبد في الفئران لديها حوالي 25٪ -30٪ من نسختها المعبر عنها بشكل إيقاعي18،19. يعد التعبير الجيني الإيقاعي أمرا بالغ الأهمية لتنشيط العمليات البيولوجية المهمة مثل التحكم في دورة الخلية20 ، وتوازن الجلوكوز 21 ، واستقلاب الأحماض الأمينية22 في الوقت المناسب من اليوم من أجل زيادة لياقة الكائن الحي.

على مدى العقود القليلة الماضية ، كانت هناك أدلة متزايدة تشير إلى أن تناول الطعام يمكن أن يكون بمثابة إشارة متزامنة قوية لتقييد الإيقاعات في التعبير الجيني في أنسجة متعددة ، بما في ذلك الكبد23,24. الأهم من ذلك ، فقد ثبت أن التغذية تقيد الإيقاعات في الكبد بشكل مستقل عن SCN أو عن دورة الضوءوالظلام 25 ، ويمكن للتغذية الإيقاعية أن تدفع التعبير الجيني الإيقاعي دون إشراك الساعة الجزيئية 26،27،28،29،30،31. التغذية المقيدة بالفترة غير النشطة للفئران (النهار) تعكس مرحلة التعبير عن جينات الساعة الأساسية والعديد من الجينات الإيقاعية31. ثبت أن التغذية المقيدة بالوقت (TRF) ، وهي تدخل غذائي حيث يقتصر تناول السعرات الحرارية اليومية على فترة 8-10 ساعات ، تحمي من السمنة وفرط الأنسولين في الدم والتنكس الدهني الكبدي ومتلازمة التمثيل الغذائي32,33. تتطلب جميع التجارب المذكورة أعلاه التي تنطوي على التلاعب بتناول الطعام من المجرب الاستفادة من الأساليب الفعالة لتوصيل الطعام في الوقت المناسب من اليوم.

تم تطوير طرق مختلفة لتوصيل الطعام ، تحمل العديد من المزايا والعيوب29،34،35،36،37،38،39 (الجدول 1). تم تصميم بعض المغذيات الآلية للعمل بناء على برنامج يتحكم في كمية ومدة وتوقيت توافر الطعام أثناء تسجيل نشاط التغذية والجري الطوعي في الفئران34. تتضمن بعض الطرق الأخرى وضع الفئران في أقفاص مختلفة لظروف تغذية مختلفة, مع إضافة المجرب يدويا كريات الطعام في الوقت المحدد38,39. يستخدم نظام آخر نظام تغذية آلي يتم التحكم فيه بواسطة جهاز كمبيوتر حيث يمنع الدرع الهوائي الوصول إلى الطعام والذي يمكن التحكم فيه إما عن طريق فترات زمنية أو كتلة الطعام35. كل هذه الطرق إما تتطلب استخدام وإعداد برنامج محوسب يمكن أن يكون مكلفا ويتطلب بعض التدريب للتشغيل السليم للأداة أو كثيفة العمالة لأن المجرب يحتاج إلى أن يكون حاضرا في أوقات محددة لتغيير ظروف التغذية يدويا. تأتي الأنظمة المحوسبة أيضا مع نصيبها من المشكلات ، بما في ذلك خلل في الرافعات أو الأبواب التي تسمح للطعام بالخروج ، وتعلق كريات الطعام في المنافذ ، وتعطل البرامج. علاوة على ذلك ، فإن الصوت الذي قد ينتج أثناء فتح الأبواب أو الرافعات يمثل خطر تكييف الفئران لربطها بتوصيل الطعام ، مما يضر بتفسير آثار التلاعب بالطعام على أنها ناتجة تماما عن الوصول إلى الطعام أو بسبب التأثيرات على الإيقاعات السلوكية الأخرى مثل دورة النوم / الاستيقاظ. كان الهدف العام من هذه الدراسة هو تطوير نظام ميسور التكلفة وفعال للتعامل مع تناول الطعام الإيقاعي على المدى الطويل والذي من شأنه أن يساعد في التخفيف من العديد من هذه المشكلات المذكورة أعلاه. أولا وقبل كل شيء ، يمكن بناء جهاز التغذية الذي تم تطويره ووصفه أدناه بتكلفة قليلة جدا مقارنة بالآلات الآلية (الجدول 2) ولا يتطلب تدريبا متطورا للمناولة والتشغيل والصيانة. ثانيا ، ينتج نظام التغذية ضوضاء بيضاء في الخلفية فقط ولا توجد أصوات عالية أثناء توصيل الطعام ، وبالتالي يمنع تكييف بافلوفيان. إجمالا ، يعد نظام التغذية هذا اقتصاديا ، ويمكن الوصول إليه بسهولة وموثوقية للباحثين بينما لا يزال فعالا في التلاعب بتناول الطعام الإيقاعي.

Protocol

يتم استخدام جميع المواد الحيوانية وفقا للإرشادات التي وضعتها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان بجامعة تكساس إيه آند إم (AUP # 2022-0050). يتم استخدام كل من ذكور وإناث الفئران C57BL / 6 بين 2-4 أشهر من العمر هنا. يتم وصف إجراء بناء نظام التغذية أدناه ، ويتم الرجوع إلى المواد الخام المطلوبة لبناء الجهاز في جدول المواد.

1. بناء نظام التغذية

  1. بناء قاعدة بولي فينيل كلوريد (PVC)
    1. شراء أربع قطع من صفائح PVC مقاس 0.25 بوصة مقطوعة وفقا للأبعاد التالية: 4.875 بوصة × 4.5 بوصة ؛ 4.875 بوصة × 2.125 بوصة; 9.5 بوصة × 2.125 بوصة (قطعتين). احفر أربعة ثقوب في القاعدة مقاس 4.875 بوصة × 4.5 بوصة لتوصيل مؤقت 24 ساعة باستخدام القياسات الواردة في الشكل 1 أ. الصق القطع الأربع من PVC للحصول على القاعدة كما في الشكل 1 أ.
  2. تأمين المؤقت على قاعدة PVC
    1. افتح المؤقت لإزالة القابس. قم بإجراء اتصال باستخدام سلك تمديد / كهربائي قياسي (الشكل 1 ب).
    2. ضع المؤقت على قاعدة PVC لمواءمته مع الثقوب المحفورة على القاعدة في الخطوة 1.1.1. استخدم مسامير مقاس 1.5 بوصة لتثبيت المؤقت على قاعدة PVC. تأكد من أن المؤقت مسطح ومستقر على قاعدة PVC.
    3. احفر أربعة ثقوب أعلى المؤقت وقم بتثبيت مسامير مقاس 0.75 بوصة لتثبيت حاوية الطعام المكونة من ثماني حجرات (الشكل 1 ب). قاعدة النظام كاملة وتبدو مثل الشكل 1C.
      تنبيه: لا تقم بحفر الثقوب عبر المؤقت بأكمله.
  3. إعداد القفص
    1. قطع أنبوب PVC 4 بوصة (القطر الخارجي 4.5 بوصة) على ارتفاع 3.125 بوصة. احفر حفرة تبلغ حوالي 0.5 بوصة في الجزء السفلي من الأنبوب للسماح للكابل الكهربائي بالمرور.
    2. صنفر الجزء العلوي من الأنبوب (على سبيل المثال ، باستخدام جهاز توجيه أو أداة دوارة) للسماح بإزالة الغطاء بسهولة عند تغيير حاوية الطعام.
    3. استخدم قفص فأر بعرض أكبر من 4.5 بوصة واقطع فتحة مقاس 4.5 بوصة في أسفل القفص باستخدام منشار ثقب.
      ملاحظة: يعتمد موقع الفتحة على إعداد القفص (على سبيل المثال ، موقع الجزء العلوي من القفص وزجاجة الماء ، وإضافة عجلة الجري ، وما إلى ذلك).
  4. إعداد حاوية التغذية
    1. اصنع موزع طعام من منظم مجوهرات مقاس 4 بوصات مكون من ثماني حجرات كما هو موضح في الشكل 1 د. قطع حافة الحاوية بحيث تتناسب بشكل جيد مع الأنبوب.
    2. استخدم غطاء أنبوب PVC مقاس 4 بوصات وقم بقطع فتحة تتوافق مع حجم حجرة موزع واحدة (على سبيل المثال ، باستخدام أداة دوارة) لإنشاء فتحة تعرض واحدة فقط من المقصورات الثمانية في المرة الواحدة. مع تحرك المؤقت ، تكشف الفتحة عن حجرة جديدة كل 3 ساعات. مكونات نظام التغذية جاهزة الآن للاستخدام. بمجرد ضبط جميع الأقفاص ، يشبه الإعداد النهائي الإعداد الموضح في الشكل 1E.
    3. يمكن أن يكون نقل العديد من حاويات الطعام في وقت واحد مرهقا. لتسهيل النقل ، خذ ثلاث قطع من الأنابيب البلاستيكية مقاس 0.25 بوصة. احفر حفرة مقاس 0.625 بوصة في وسط قطعتين وألصقهما معا. بعد ذلك ، استخدم أنبوبا PVC ضيقا مقاس 0.625 بوصة يتناسب مع الفتحة ومن خلال وسط أكواب الطعام لتكديس أكواب الطعام لتسهيل نقلها ، كما هو موضح في الشكل 1F.
    4. اختبر المؤقتات قبل إدخال الفئران عن طريق توصيل الإعداد بمنافذ الطاقة ، ووضع قطعة من نستله في حجرة واحدة في وقت مسجل ، ومراقبة موضع نستله بعد 12 ساعة للتأكد من أن المؤقت يدور على الفور.

2. تطبيق نظام التغذية

  1. القياس المستمر لتناول الطعام في الفئران
    1. نقل الفئران إلى غرفة تجريبية وتأقلم مع دورة الضوء والظلام (LD) المحددة في الغرفة لمدة 1 أسبوع على الأقل ، ولمدة 2 أسابيع إذا تم تغيير دورة الضوء والظلام بأكثر من 3 ساعات. لهذه التجربة ، تم جمع البيانات من ذكور وإناث C57BL / 6 الفئران بين 2-4 أشهر من العمر المعرضة ل LD 12:12 (ن = 7 ذكور و 4 إناث).
    2. سجل وزن الفئران قبل إيوائها بشكل فردي في أقفاص التغذية (تم تسجيل الأوزان في الساعة 3:00 مساء ، أي في وقت إجراء تغييرات الطعام). تأكد من أن الفئران لديها إمكانية الوصول إلى الماء وما يكفي من الفراش و nestlets.
    3. أضف 1.5 جرام من الطعام (يستخدم بشكل روتيني 45 مجم من الكريات الدقيقة الخالية من الغبار) إلى جميع المقصورات الثمانية لكوب التغذية. ضع كوب التغذية على المؤقت. بعد ذلك ، ضع الغطاء على كوب التغذية بحيث يتم الكشف عن حجرة واحدة فقط ، ولاحظ وقت تقديم الطعام. تمثل أربع مقصورات نقاطا ليلية وتمثل الأربعة الأخرى نقاط وقت النهار.
      ملاحظة: نظرا لسلوك الاكتناز الذي لوحظ عند تقديم الطعام الزائد ، تم تحسين 1.5 جم كوزن طعام أولي. تميل الفئران إلى تخزين الكريات إما فوق أغطية أكواب الطعام أو في الفراش داخل القفص. هذا يشوه البيانات مما يؤدي إلى سوء تفسيرها. لا تخزن ذكور الفئران الكريات عند إطعامها ب 1.5 جم أو أقل لكل حجرة. تميل الإناث إلى تخزين الطعام أكثر من الذكور ، ولكن هذا خاص بالماوس ويمكن تخفيفه إذا كان يوفر 1 غرام من الحبيبات لكل مقصورة.
    4. قم بتغيير الطعام كل يوم في نفس الوقت واحسب عدد الكريات المتبقية في كل حجرة لحساب كمية الطعام المستهلكة. راقب ملف تعريف التغذية لمدة أسبوع للحصول على ملف تعريف تغذية أساسي للفئران التي تتغذى على libitum.
    5. بناء على الطعام المستهلك في كل حجرة ، احسب متوسط استهلاك الطعام اليومي لكل فأر (الشكل 2).
  2. علاج النظام الغذائي عالي الدهون (HFD)
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام نظام التغذية هذا لدراسة تأثير HFD على أمراض التمثيل الغذائي ويمكن استخدامه في النهاية لجداول التغذية المقيدة بالوقت. HFD غير متوفر تجاريا كحبيبات دقيقة الحجم والوزن, وعادة ما يتم شراء الكريات للتغذية على شكل كريات 0.5 بوصة.
    1. ضع كريات HFD على سطح نظيف أو فيلم شفاف وقطعها إلى 6-7 قطع أصغر من الحجم المتساوي باستخدام شفرة حلاقة. قطع الكريات صغيرة بما يكفي بحيث تشبه كريات تشاو العادية كما هو مستخدم في القسم 2.1 أعلاه.
      ملاحظة: تميل الفئران إلى تخزين كريات أكبر في أقفاصها ، مما يؤدي إلى سوء تقدير الطعام المستهلك.
    2. قم بوزن 1.5 جرام من قطع HFD المقطوعة وضعها في كل من مقصورات الطعام ال 8. لتغيير الطعام كل يوم ، يكفي 1.5 غرام من HFD لكل حجرة.
    3. قم بتغيير الطعام كل يوم أو كل يومين حسب الاحتياجات التجريبية وسجل وزن الطعام المتبقي.
    4. احسب كمية الطعام المستهلكة بطرح الوزن المتبقي للطعام من الكمية الأولية للطعام المعطاة. كرر هذه العملية على مدى أسبوع واحد للحصول على خط أساس لتناول الطعام HFD (الشكل 2).
  3. تأقلم ذكور الفئران مع نظام غذائي مقيد ليلا (NR)
    1. اتبع الخطوات من 2.1.1 إلى 2.1.4 للحصول على خط أساس للتغذية المخصصة . لهذه التجربة ، تم جمع البيانات من ذكور الفئران C57BL / 6 بين 2-4 أشهر من العمر المعرضة ل LD 12:12 (ن = 18 ذكرا).
    2. بعد 3-7 أيام من النظام الغذائي الإعلاني ، ضع الفئران على نظام غذائي انتقالي عن طريق تقليل عدد الكريات تدريجيا في مقصورات اليوم. للقيام بذلك ، احصل على خمس كريات لكل حجرة في اليوم الأول من الانتقال (0.225 جم لكل حجرة) ، 3 كريات في اليوم 2 (0.135 جم لكل حجرة) ، 1 بيليه في اليوم 3 (0.045 جم لكل حجرة) ، ولا شيء بعد ذلك لنقل الفئران تماما في نظام غذائي مقيد ليلا.
      ملاحظة: تأكد من أن الفئران ليست مقيدة بالسعرات الحرارية. متوسط الاستهلاك الغذائي اليومي للفئران لكل حجرة بناء على خط الأساس المخصص ومنحهم نفس الكمية من الطعام ، وتوزيعها فقط عبر المقصورات التي تستغرق أربع ليال.
    3. الحفاظ على مراقبة تناول الطعام لمدة 2 أسابيع بعد أن تكيفت الفئران مع نظام مقيد ليلا. خلال هذه الفترة ، اضبط كمية الطعام المعطاة لكل فأر لتناسب إجمالي استهلاكه الغذائي بشكل أفضل (الشكل 3 أ). عادة ما تضيف كريات الطعام (1 بيليه لكل من المقصورات الليلية الأربعة) عندما تأكل الفئران كل طعامها لمدة ليلتين متتاليتين.
    4. وزن الفئران في نهاية فترة 2 أسبوع لمراقبة أي تغيير في الوزن بسبب نظام التغذية. في نهاية هذه الفترة ، تخدير الفئران بالإيزوفلوران والقتل الرحيم لهم عن طريق قطع الرأس. جمع الأنسجة وتحليلها للتغييرات اليومية بسبب نموذج التغذية.
  4. تأقلم ذكور الفئران مع نظام غذائي غير منتظم (AR)
    1. اتبع الخطوات من 2.1.1 إلى 2.1.4 للحصول على خط أساس للتغذية المخصصة . لهذه التجربة ، تم جمع البيانات من ذكور الفئران C57BL / 6 بين 2-4 أشهر من العمر المعرضة ل LD 12:12 (ن = 18 ذكرا).
    2. بعد أسبوع من النظام الغذائي الإعلاني ، احسب متوسط استهلاك الطعام يوميا واقسم هذا الرقم على 8 للحصول على كمية الطعام التي سيتم توفيرها في كل حجرة. حقق تغذية AR من خلال ضمان حصول الفئران على كمية متساوية من الطعام في جميع المقصورات الثمانية على مدار اليوم.
    3. بعد ذلك ، ضع الفئران على نظام غذائي انتقالي عن طريق التقليل التدريجي ، على مدى 3-5 أيام ، من كمية الطعام المعطاة لكل حجرة لإلغاء أي إيقاع لتناول الطعام في النهاية (كما هو موضح في الشكل 3 ب). عند اتباع نظام غذائي AR ، تأكد من أن الفئران لديها إمكانية الوصول إلى 1/8 من استهلاكها الغذائي اليومي في كل من المقصورات الثمانية ، وبالتالي الوصول إلى الطعام في كل 3 ساعات. تأكد من أن الفئران ليست مقيدة بالسعرات الحرارية.
    4. الحفاظ على الفئران على النظام الغذائي AR لمدة 2 أسابيع أو أكثر (الشكل 3B).
    5. أثناء اتباع نظام غذائي AR ، اضبط الطعام كل يوم للتأكد من أن الفئران لا تترك سوى عدد قليل من الكريات (عادة أقل من 5). هذا يضمن أن الفئران تحصل على الكمية المناسبة من الطعام وليست مقيدة بالسعرات الحرارية. قم بإجراء التعديلات عن طريق تقليل أو إضافة الكريات في جميع المقصورات الثمانية أو عن طريق تقليل أو إضافة الكريات في جزأين متقابلين, لعدم إحداث أي إيقاعات لتناول الطعام.
      ملاحظة: الفئران التي تتغذى على نظام غذائي AR تترك الطعام بشكل حصري تقريبا بين ZT3 و ZT9 (بين 3 ساعات و 9 ساعات بعد الضوء) ومع ذلك فهي جائعة في الليل وتعض موزع الطعام للوصول إلى الحجرة التالية. ومع ذلك ، فإن الفئران التي تتغذى على AR ليست مقيدة بالسعرات الحرارية ، وفي الواقع تكتسب وزنا أكبر من الفئران التي تتغذى على NR بمرور الوقت.
    6. وزن الفئران في نهاية فترة 2 أسبوع لمراقبة أي تغيير في الوزن بسبب نظام التغذية. في نهاية هذه الفترة ، تخدير الفئران بالإيزوفلوران والقتل الرحيم لهم عن طريق قطع الرأس. جمع الأنسجة وتحليلها للتغييرات اليومية بسبب نموذج التغذية.

Representative Results

يمكن استخدام نظام التغذية الموصوف أعلاه للتلاعب على المدى الطويل بتناول الطعام الإيقاعي في الفئران. يعرض هذا النظام بشكل أساسي حجرة طعام جديدة للفأر كل 3 ساعات مما يمكن الباحث من معالجة الطعام على وجه التحديد في كل حجرة. كان أحد التطبيقات هو تحليل ملف تعريف تناول الطعام خلال فترة 24 ساعة. تشير البيانات إلى أن فئران WT التي تتغذى على الطعام العادي تأكل حوالي 75٪ من طعامها أثناء الليل (الشكل 2 أ). علاوة على ذلك ، فإن معظم الطعام الذي يتم تناوله خلال النهار يحدث في غضون 3 ساعات قبل إطفاء الضوء.

أكلت الفئران التي تغذت على HFD ad libitum المزيد من الطعام في أول يومين من التعرض ، على الأرجح بسبب حداثة HFD (الشكل 2 أ). بعد 2 أيام ، ظل تناول HFD إيقاعيا ، ولكن مع انخفاض السعة مقارنة بعند إطعامه العادي chow ad libitum. في حين تم تغذية كل من ذكور وإناث الفئران WT HFD ، فقد وجد أن إناث الفئران اكتنزت كمية كبيرة من الطعام على غطاء جهاز التغذية وفي القفص ، في حين أن الذكور لم يظهروا أي اكتناز ملحوظ. كما ذكر أعلاه ، يمكن أن يؤدي اكتناز الطعام إلى سوء تقدير استهلاك الغذاء ويؤدي إلى سوء تفسير البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، عضت إناث الفئران في الحافات البلاستيكية لأكواب الطعام بشكل متكرر ، خاصة في المقصورات الليلية. أظهرت الفئران الذكور زيادة كبيرة في الوزن بعد أسبوع واحد من الطعام العادي وبعد أسبوع واحد من HFD (الشكل 2E). لوحظ اتجاه مماثل مع إناث الفئران ولكنها لم تصل إلى قيم p كبيرة ، ويرجع ذلك جزئيا على الأرجح إلى انخفاض عدد الإناث المستخدمة مقارنة بالذكور.

الفئران التي انتقلت إلى نظام غذائي NR تأكل إجمالي السعرات الحرارية اليومية فقط في الليل ، دون انخفاض كبير في السعرات الحرارية لأول 3-5 أسابيع (الشكل 3A). يقلل التعرض الأطول لجدول NR من متوسط السعرات الحرارية اليومية بنسبة 10٪ -15٪ مقارنة بالفئران التي تتغذى على libitum ، كما هو موضح في مكان آخر34. استهلكت الفئران التي انتقلت إلى نظام غذائي AR إجمالي السعرات الحرارية اليومية بكميات متساوية على مدار اليوم ، مما أدى إلى تثبيط كبير في الإيقاع اليومي لتناول الطعام (الشكل 3 ب). أما بالنسبة لجدول التغذية NR ، فإن المتوسط اليومي لتناول السعرات الحرارية لا يتأثر بجدول تغذية AR لأول 3-5 أسابيع من التعرض ولكنه ينخفض مع التعرض لفترة أطول. أظهرت الفئران زيادة في الوزن بعد جداول NR (الشكل 3C) و AR (الشكل 3C).

Figure 1
الشكل 1: تصميم وبناء نظام جهاز التغذية. (أ) أبعاد قاعدة PVC لنظام التغذية ، ووصف المكان الذي يجب عمل ثقوب فيه لتثبيت المؤقت. (ب) مؤقت 24 ساعة قبل وبعد إعادة استخدام السلك والحفر بمسامير لوضع كوب الطعام. (ج) القاعدة الرمادية المجمعة والمؤقت جنبا إلى جنب مع أنبوب PVC مقاس 4 بوصات. (د) كوب الطعام المكون من ثماني حجرات بعد تقليم الحواف الخارجية. (ه) الإعداد النهائي للأقفاص مع كوب الطعام المغطى بغطاء 4 بوصات بحيث يمكن الوصول إلى حجرة واحدة فقط في كل مرة. (و) نقل أكواب طعام متعددة أثناء التجربة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: ملامح التغذية في ظل أنظمة غذائية مختلفة . (أ) ملف التغذية لذكور الفئران WT التي تتغذى على libitum مع الطعام العادي (NC) لمدة 7 أيام والنظام الغذائي عالي الدهون (HFD) لمدة 7 أيام إضافية. تمثل الخطوط الملونة ملفات تعريف الماوس الفردية (n = 7) ويشير الخط الأسود إلى متوسط ± SEM لسبعة فئران. ب: النظام الغذائي عالي الدهون قبل وبعد التقطيع. (ج) المتوسط اليومي لتناول الطعام كل 3 ساعات ± SEM (ن = 7). تم حساب المتوسط على مدار آخر 5 أيام من جدول تغذية NC أو HFD. (د) المتوسط (يسار) والنسبة المئوية (يمين) من تناول الطعام خلال النهار والليل للفئران التي تتغذى على NC أو HFD. تمثل القيم متوسط سبعة فئران ± SEM وتم حسابها باستخدام بيانات تناول الطعام على مدار آخر 5 أيام من جداول تغذية NC أو HFD. * p < 0.05 بين المجموعتين (اختبار t المزدوج). (ه) متوسط أوزان جسم الفئران المستخدمة في التجربة بعد أسبوع واحد من NC وأسبوع واحد من HFD. تظهر بيانات الذكور (يسار) والإناث (يمين) ب * p < 0.05 بين المجموعتين (اختبار t المقترن). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التلاعب بالإيقاع اليومي لتناول الطعام. (أ) ملف التغذية لذكور الفئران WT التي تغذت على chow ad libitum العادي لمدة 2 أيام ، وانتقلت إلى نظام تغذية مقيد ليلا (NR) لمدة 3 أيام ، وتم الحفاظ عليها تحت تغذية NR لمدة 8 ليال. تمثل الخطوط الملونة ملفات تعريف الماوس الفردية (n = 18) ويشير الخط الأسود إلى متوسط ± SEM ل 18 فأرا. تشير العلامة النجمية الرمادية إلى خلل في المؤقت لهذا الماوس في ذلك اليوم الوحيد حيث توقف المؤقت عن الدوران. (ب) ملف تغذية ذكور الفئران WT التي تغذت على chow ad libitum العادي لمدة 2 أيام ، وانتقلت إلى نظام تغذية عدم انتظام ضربات القلب (AR) لمدة 1 يوم ، وتم الحفاظ عليها تحت تغذية AR لمدة 8 ليال. تمثل الخطوط الملونة ملفات تعريف الماوس الفردية (n = 18) ويشير الخط الأسود إلى متوسط ± SEM للفأر ال 18. (ج) متوسط أوزان الجسم للفئران المستخدمة في التجربة بعد 2 أسابيع من التعرض لوجبات NR و AR. تظهر البيانات ب * p < 0.05 بين المجموعتين (اختبار t المزدوج). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مزايا وعيوب أنظمة التغذية الحالية. جدول يسلط الضوء على أنظمة التغذية المختلفة المستخدمة للتلاعب بتناول الطعام ، مع وصف موجز لإيجابيات وسلبيات كل نظام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: تكلفة المواد اللازمة لبناء نظام التغذية. جدول يسرد تكلفة العناصر المطلوبة لبناء نظام التغذية الموصوف في هذه الورقة جنبا إلى جنب مع تقدير تكلفة البناء لكل قفص. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

تم إجراء بحث مكثف على مدى العقود القليلة الماضية حول التلاعب بإيقاعات التغذية وتأثيرها على علم وظائف الأعضاء. يمكن استخدام بناء واستخدام نظام التغذية الموصوف هنا كطريقة فعالة لمعالجة تناول الطعام. يستخدم البروتوكول مؤقتا مشتركا لمدة 24 ساعة وكوب طعام مصمما كمنظم من ثماني حجرات كمكونات رئيسية للنظام. يمكن بناء الأقفاص بسهولة باستخدام عدد قليل من الأدوات التي يسهل الوصول إليها ، كما أن التعامل مع النظام سهل الاستخدام. تتضمن بعض الجوانب الرئيسية للبروتوكول الخاص بتكييف النظام للتلاعب باستهلاك الطعام الإيقاعي التغيير اليومي لأكواب الطعام نظرا لأن المؤقت يدور عبر فترة 24 ساعة ، والعد اليدوي أو وزن الطعام المتبقي ، والتعديل اليومي لعدد الكريات لتغذية AR. عادة ، تظهر نشارة البلاستيك عندما تكون الفئران جائعة ولا تحصل على طعام كاف. يمكن إصلاح هذه المشكلة عن طريق إضافة عدد قليل من كريات الطعام التي تلتزم بنظام التغذية حتى لا يتم رؤية نشارة بلاستيكية. في حالة التغذية بالواقع المعزز ، حيث يحتاج الطعام اليومي إلى التعديل ، يجب الحرص على عدم تحفيز إيقاع تناول الطعام (الشكل 3 ب). وبالتالي ، فمن الأفضل إما إضافة أو طرح الكريات في مقصورات متقابلة طوال الوقت للحفاظ على تغذية الفئران بشكل غير منتظم.

يمكن تحسين هذا النظام بشكل أكبر عن طريق طلاء أكواب الطعام بطبقة من الإيبوكسي لمنع الفئران من عض البلاستيك ، وبالتالي المساعدة في إطالة عمر أكواب الطعام. يمكن أيضا تعديل سطح المؤقت لوضع كوب الطعام لمساعدة كوب الطعام على الجلوس بشكل مسطح ومستقر على المؤقت. هذا يمكن أن يمنع التوقف العرضي للمؤقت الناجم عن مؤقت غير متساو. يمكن أيضا طباعة عدد قليل من مكونات القفص ، مثل أكواب الطعام ، بتقنية 3D لتقليل التكلفة وحسب الطلب حسب رغبة الباحث. يمكن أن يشمل ذلك أكواب الطعام التي تحتوي على أكثر من ثماني مقصورات ، والتي يمكن أن توفر دقة زمنية أفضل من نافذة 3 ساعات الحالية.

على الرغم من كفاءته العالية ، إلا أن هذا النظام له بعض القيود ، مثل كونه كثيف العمالة ، حيث لا يزال الباحث بحاجة إلى تغيير أكواب الطعام كل 24 ساعة ويطلب منهم عد / وزن الطعام المتبقي يدويا. بالإضافة إلى ذلك ، يجب مراقبة المؤقتات من وقت لآخر لتحديد المشكلات المحتملة و / أو إذا توقفت عن العمل. يمكن تحقيق ذلك أثناء حساب كريات الطعام المتبقية بعد التغذية (على سبيل المثال ، من خلال تحديد ما إذا كانت بعض الفئران قد أكلت الطعام فقط في بضع حجرات وتركت بعض المقصورات دون مساس). هناك قيد آخر لهذا النظام وهو أنه قد لا يعمل بشكل جيد مع إناث الفئران ، حيث أظهرت التجارب القليلة التي أجريت على الإناث أنها تميل إلى تخزين الطعام ومضغ البلاستيك أكثر من ذكور الفئران.

ومع ذلك ، فإن نظام التغذية هذا فعال للغاية في التعامل مع تناول الطعام ، وهو سهل البناء والتشغيل والصيانة وغير مكلف مقارنة بالمغذيات الآلية باهظة الثمن الموجودة في السوق. يمكن تكييفه وتعديله بسهولة ليناسب متطلبات الباحث ولا يحتاج إلى أي تدريب خاص لتشغيل النظام. الأهم من ذلك ، أن أجهزة ضبط الوقت تنتج فقط كمية منخفضة من الضوضاء البيضاء الثابتة ، مما يمنع الفئران من ربط أي صوت بتوافر الطعام.

باختصار ، تصف هذه الورقة نظام تغذية مبتكر يمكن استخدامه لمراقبة استهلاك الطعام اليومي في الفئران ويمكن تكييفه لإطعام الفئران على نماذج مختلفة مثل التغذية المقيدة بالوقت ، والتغذية غير المنتظمة ، والتغذية على نظام غذائي غني بالدهون. يضيف هذا النظام إلى قائمة الأدوات التي يمكن استخدامها لمعالجة الأسئلة المهمة في مجال تناول الطعام الإيقاعي وتأثيره على علم وظائف الأعضاء.

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل ماليا من خلال المنحة R01DK128133 من NIH / NIDDK (إلى JSM) وصناديق بدء التشغيل من جامعة تكساس إيه آند إم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#6 x 0.75 inch Phillips Pan Head Stainless Steel Sheet Metal Screw (50-Pack) Everbilt #800172
#8 x 1.5 inch Phillips Pan Head Zinc Plated Sheet Metal Screw (100-Pack) Everbilt  #801622
0.25 inch gray PVC sheet (24 inch x 48 inch) USPlastic #45088
4 inch PVC pipe (10 ft) Home Depot #531103
45 mg dustless precision pellets Bio-Serv #F0165
6 ft. Extension Cord HDX HD#145-017
Food container (eight-compartment jewelry organizer)  JewelrySupply #PB8301
Indoor Basic Timer General Electric #15119
Oatey 4 inch ABS Pipe Test Cap with Knockout Home Depot #39103D
Rodent Diet with 45 kcal% fat (with red dye) Research Diets #D12451

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of light and temperature in the regulation of circadian gene expression in Drosophila. PLoS Genetics. 3 (4), 0492-0507 (2007).
  2. Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
  3. Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
  4. Kawamoto, T., et al. Effects of fasting and re-feeding on the expression of Dec, Per1, and other clock-related genes. Journal of Biochemistry. 140 (3), 401-408 (2006).
  5. Lamia, K. A., Storch, K. F., Weitz, C. J. Physiological significance of a peripheral tissue circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (39), 15172-15177 (2008).
  6. Oosterman, J. E., Kalsbeek, A., La Fleur, S. E., Belsham, D. D. Impact of nutrients on circadian rhythmicity. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 308 (5), 337-350 (2015).
  7. Pitts, S. N., Perone, E., Silver, R. Food-entrained circadian rhythms are sustained in arrhythmic Clk/Clk mutant mice. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 285, 57-67 (2003).
  8. Sheward, W. J., et al. Entrainment to feeding but not to light: Circadian phenotype of VPAC 2 receptor-null mice. Journal of Neuroscience. 27 (16), 4351-4358 (2007).
  9. Gekakis, N., et al. Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism. Science. 280 (5369), 1564-1569 (1998).
  10. King, D. P., et al. Positional cloning of the mouse circadian Clock gene. Cell. 89 (4), 641-653 (1997).
  11. Kume, K., et al. mCRY1 and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop. Cell. 98 (2), 193-205 (1999).
  12. Shearman, L. P., et al. Interacting molecular loops in the mammalian circadian clock. Science. 288 (5468), 1013-1019 (2000).
  13. Beytebiere, J. R., et al. Tissue-specific BMAL1 cistromes reveal that rhythmic transcription is associated with rhythmic enhancer-enhancer interactions. Genes and Development. 33 (5-6), 294-309 (2019).
  14. Menet, J. S., Pescatore, S., Rosbash, M. CLOCK: BMAL1 is a pioneer- like transcription factor. Genes and Development. 28 (1), 8-13 (2014).
  15. Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
  16. Mure, L. S., et al. Diurnal transcriptome atlas of a primate across major neural and peripheral tissues. Science. 359 (6381), (2018).
  17. Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Translational Medicine. 10 (458), 1-8 (2018).
  18. Zhang, R., Lahens, N. F., Ballance, H. I., Hughes, M. E., Hogenesch, J. B. A circadian gene expression atlas in mammals: Implications for biology and medicine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16219-16224 (2014).
  19. Menet, J. S., Rodriguez, J., Abruzzi, K. C., Rosbash, M. Nascent-Seq reveals novel features of mouse circadian transcriptional regulation. eLife. 2012 (1), 1-25 (2012).
  20. Miller, B. H., et al. Circadian and CLOCK-controlled regulation of the mouse transcriptome and cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3342-3347 (2007).
  21. Cailotto, C., et al. The suprachiasmatic nucleus controls the daily variation of plasma glucose via the autonomic output to the liver: Are the clock genes involved. European Journal of Neuroscience. 22 (10), 2531-2540 (2005).
  22. Eckel-Mahan, K. L., et al. Coordination of the transcriptome and metabolome by the circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5541-5546 (2012).
  23. Damiola, F., et al. Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes and Development. 14 (23), 2950-2961 (2000).
  24. Saini, C., et al. Real-time recording of circadian liver gene expression in freely moving mice reveals the phase-setting behavior of hepatocyte clocks. Genes and Development. 27 (13), 1526-1536 (2013).
  25. Stokkan, K. A., Yamazaki, S., Tei, H., Sakaki, Y., Menaker, M. Entrainment of the circadian clock in the liver by feeding. Science. 291 (5503), 490-493 (2001).
  26. Atger, F., et al. Circadian and feeding rhythms differentially affect rhythmic mRNA transcription and translation in mouse liver. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 6579-6588 (2015).
  27. Greenwell, B. J., et al. Rhythmic food intake drives rhythmic gene expression more potently than the hepatic circadian clock in mice. Cell Reports. 27 (3), 649-657 (2019).
  28. Izumo, M., et al. Differential effects of light and feeding on circadian organization of peripheral clocks in a forebrain Bmal1 mutant. eLife. 3, 04617 (2014).
  29. Mange, F., et al. Diurnal regulation of RNA polymerase III transcription is under the control of both the feeding-fasting response and the circadian clock. Genome Research. 27 (6), 973-984 (2017).
  30. Van Der Veen, D. R., et al. Impact of behavior on central and peripheral circadian clocks in the common vole Microtus arvalis, a mammal with ultradian rhythms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (9), 3393-3398 (2006).
  31. Vollmers, C., et al. Time of feeding and the intrinsic circadian clock drive rhythms in hepatic gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21453-21458 (2009).
  32. Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted feeding prevents obesity and metabolic syndrome in mice lacking a circadian clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
  33. Hatori, M., et al. Time-restricted feeding without reducing caloric intake prevents metabolic diseases in mice fed a high-fat diet. Cell Metabolism. 15 (6), 848-860 (2012).
  34. Acosta-Rodríguez, V. A., de Groot, M. H. M., Rijo-Ferreira, F., Green, C. B., Takahashi, J. S. Mice under caloric restriction self-impose a temporal restriction of food intake as revealed by an automated feeder system. Cell Metabolism. 26 (1), 267-277 (2017).
  35. Chung, H., et al. Time-restricted feeding improves insulin resistance and hepatic steatosis in a mouse model of postmenopausal obesity. Metabolism: Clinical and Experimental. 65 (12), 1743-1754 (2016).
  36. Sen, S., et al. Ultradian feeding in mice not only affects the peripheral clock in the liver, but also the master clock in the brain. Chronobiology International. 34 (1), 17-36 (2017).
  37. Xie, X., et al. Natural food intake patterns do not synchronize peripheral clocks. BMC Biology. 18 (160), 1-11 (2020).
  38. Swamy, S., et al. Circadian disruption of food availability significantly reduces reproductive success in mice. Hormones and Behavior. 105, 177-184 (2018).
  39. Xin, H., et al. Protocol for setup and circadian analysis of inverted feeding in mice. STAR Protocols. 2 (3), 100701 (2021).

Tags

علم الأحياء، العدد 190،
التلاعب في تناول الطعام الإيقاعي في الفئران باستخدام نظام تغذية مخصص
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sahasrabudhe, A., Guy, C. R.,… More

Sahasrabudhe, A., Guy, C. R., Greenwell, B. J., Menet, J. S. Manipulation of Rhythmic Food Intake in Mice Using a Custom-Made Feeding System. J. Vis. Exp. (190), e64624, doi:10.3791/64624 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter