Summary
Het beperken van de timing van voedselinname is naar voren gekomen als een veelbelovende interventie om door voeding veroorzaakte metabole ziekten te verzachten. Dit manuscript beschrijft de bouw en het gebruik van een efficiënt systeem dat in eigen huis is gebouwd voor het meten en manipuleren van ritmische voedselinname bij muizen.
Abstract
Ritmische genexpressie is een kenmerk van het circadiane ritme en is essentieel voor het aansturen van de ritmiek van biologische functies op het juiste moment van de dag. Studies in de afgelopen decennia hebben aangetoond dat ritmische voedselinname (d.w.z. het tijdstip waarop organismen voedsel eten tijdens de 24-uursdag), aanzienlijk bijdraagt aan de ritmische regulatie van genexpressie in verschillende organen en weefsels door het hele lichaam. De effecten van ritmische voedselinname op gezondheid en fysiologie zijn sindsdien op grote schaal bestudeerd en hebben aangetoond dat het beperken van voedselinname gedurende 8 uur tijdens de actieve fase metabole ziekten verzwakt die voortvloeien uit een verscheidenheid aan obesogene diëten. Deze studies vereisen vaak het gebruik van gecontroleerde methoden voor het timen van de levering van voedsel aan dieren. Dit manuscript beschrijft het ontwerp en gebruik van een goedkoop en efficiënt systeem, intern gebouwd voor het meten van de dagelijkse voedselconsumptie en het manipuleren van ritmische voedselinname bij muizen. Dit systeem omvat het gebruik van betaalbare grondstoffen om kooien te bouwen die geschikt zijn voor voedselbezorging, volgens een gebruiksvriendelijke behandelingsprocedure. Dit systeem kan efficiënt worden gebruikt om muizen te voeden met verschillende voedingsregimes, zoals ad libitum, tijdsgebonden of aritmische schema's, en kan een vetrijk dieet bevatten om het effect ervan op gedrag, fysiologie en obesitas te bestuderen. Er wordt een beschrijving gegeven van hoe wild-type (WT) muizen zich aanpassen aan de verschillende voedingsregimes.
Introduction
De circadiane klok wordt alomtegenwoordig gevonden in verschillende soorten en biedt een tijdwaarnemingsmechanisme dat organismen helpt zich aan te passen aan hun ritmisch veranderende omgeving. De master circadiane pacemaker bevindt zich in de suprachiasmatische kern (SCN) van de hypothalamus. De SCN wordt voornamelijk meegevoerd door de omgevingslicht-donkercyclus en synchroniseert perifere klokken die aanwezig zijn in bijna elke cel van het lichaam via meerdere signalen, waaronder neuronale en hormonale signalen, voeding en lichaamstemperatuur 1,2,3,4,5,6,7,8 . Bij zoogdieren vertrouwt de moleculaire circadiane klok op de heterodimere transcriptiefactor CLOCK: BMAL1 9,10, die de expressie van de kernklokgenen genaamd Period (Per1, Per2 en Per3) en Cryptochrome (Cry1 en Cry2) regelt om een transcriptionele feedbacklus te initiëren die cruciaal is voor het genereren van circadiane ritmes 9,11,12 . De moleculaire klok reguleert ook de ritmische transcriptie van duizenden genen die de ritmiek van vrijwel elke biologische functie regelen13,14,15. Meer dan 50% van het genoom bij zoogdieren wordt ritmisch uitgedrukt in ten minste één weefseltype 16,17,18, en weefsels zoals de lever bij muizen hebben ongeveer 25%-30% van hun transcriptoom ritmisch uitgedrukt 18,19. Ritmische genexpressie is cruciaal om belangrijke biologische processen zoals celcycluscontrole20, glucosehomeostase 21 en aminozuurmetabolisme22 op het juiste moment van de dag te activeren om de fitheid van het organisme te vergroten.
In de afgelopen decennia is er steeds meer bewijs dat suggereert dat voedselinname kan fungeren als een krachtige synchroniserende cue voor het trainen van ritmes in genexpressie in meerdere weefsels, waaronder de lever23,24. Belangrijk is dat van voeding is aangetoond dat het ritmes in de lever meevoert, onafhankelijk van de SCN of van de licht-donkercyclus25, en ritmische voeding kan ritmische genexpressie stimuleren zonder de moleculaire klok 26,27,28,29,30,31 te betrekken. Voeding beperkt tot de inactieve periode van muizen (overdag) keert de fase van expressie van de kernklokgenen en van veel ritmische genenom 31. Time-restricted feeding (TRF), een voedingsinterventie waarbij de dagelijkse calorie-inname beperkt is tot een periode van 8-10 uur, heeft aangetoond dat het beschermt tegen obesitas, hyperinsulinemie, leversteatose en metabool syndroom32,33. Alle bovenstaande experimenten met manipulatie van voedselinname vereisen dat de experimentator gebruik maakt van effectieve methoden om voedsel op het juiste moment van de dag te leveren.
Er zijn verschillende methoden voor voedselbezorging ontwikkeld, met verschillende voor- en nadelen 29,34,35,36,37,38,39 (tabel 1). Sommige geautomatiseerde feeders zijn ontworpen om te werken op basis van een software die de hoeveelheid, duur en timing van voedselbeschikbaarheid regelt, terwijl het voeren en vrijwillige wielloopactiviteit bij muizenwordt geregistreerd 34. Een paar andere methoden houden in dat muizen in verschillende kooien worden geplaatst voor verschillende voedingsomstandigheden, waarbij de experimentator handmatig voedselpellets toevoegt op de vereiste tijd38,39. Een ander systeem maakt gebruik van een geautomatiseerd feedersysteem dat wordt bestuurd door een computer, waarbij een pneumatisch aangedreven afscherming de toegang tot voedsel voorkomt en dat kan worden geregeld door tijdsintervallen of massa voedsel35. Al deze methoden vereisen ofwel het gebruik en de installatie van een geautomatiseerde software die duur kan zijn en enige training vereist voor een goede werking van het instrument of arbeidsintensief zijn omdat de experimentator op specifieke tijden aanwezig moet zijn om de voedingsomstandigheden handmatig te wijzigen. Geautomatiseerde systemen komen ook met hun deel van de problemen, waaronder het slecht functioneren van hendels of deuren die het voedsel naar buiten laten, voedselpellets die vast komen te zitten in de stopcontacten en softwarestoringen. Bovendien vormt het geluid dat kan worden geproduceerd tijdens het openen van deuren of hendels het risico dat muizen worden geconditioneerd om deze te associëren met voedselbezorging, waardoor de interpretatie van effecten van voedselmanipulatie als strikt te wijten aan toegang tot voedsel of als gevolg van effecten op andere gedragsritmes zoals slaap / waakcyclus in gevaar komt. Het algemene doel van deze studie was om een betaalbaar en efficiënt systeem te ontwikkelen om de ritmische voedselinname op lange termijn te manipuleren die veel van deze bovengenoemde problemen zou helpen verlichten. Eerst en vooral kan het voedingsapparaat dat is ontwikkeld en hieronder wordt beschreven, worden gebouwd tegen zeer minimale kosten in vergelijking met de geautomatiseerde machines (tabel 2) en vereist het geen geavanceerde training voor hantering, bediening en onderhoud. Ten tweede produceert het voersysteem alleen een witte achtergrondruis en geen harde geluiden tijdens het bezorgen van voedsel, waardoor Pavlov-conditionering wordt voorkomen. Al met al is dit voedingssysteem economisch, toegankelijker en betrouwbaarder voor onderzoekers, terwijl het nog steeds efficiënt is in het manipuleren van ritmische voedselinname.
Protocol
Alle proefdieren worden gebruikt in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van Texas A &M University (AUP # 2022-0050). Zowel mannelijke als vrouwelijke C57BL/6 muizen tussen de 2-4 maanden oud worden hier gebruikt. De procedure voor het bouwen van het toevoersysteem wordt hieronder beschreven en de grondstoffen die nodig zijn om het apparaat te bouwen, worden vermeld in de materiaaltabel.
1. Constructie van het voersysteem
- Het construeren van een polyvinylchloride (PVC) basis
- Koop vier stukken 0,25-inch PVC-platen gesneden volgens de volgende afmetingen: 4,875 inch x 4,5 inch; 4,875 inch x 2,125 inch; 9,5 inch x 2,125 inch (twee stuks). Boor vier gaten in de 4,875-inch x 4,5-inch basis voor het bevestigen van een 24-uurs timer met behulp van de metingen in figuur 1A. Verlijm de vier stukken PVC om de basis te verkrijgen zoals in figuur 1A.
- De timer op de PVC-basis vastzetten
- Open de timer om de stekker te verwijderen. Maak een verbinding met een standaard verlengsnoer/elektrisch snoer (figuur 1B).
- Plaats de timer op de PVC-basis om deze uit te lijnen met de gaten die in stap 1.1.1 op de basis zijn geboord. Gebruik 1,5-inch schroeven om de timer op de PVC-basis te bevestigen. Zorg ervoor dat de timer plat ligt en stabiel op de PVC-basis staat.
- Boor vier gaten bovenop de timer en bevestig 0,75-inch schroeven om de voedselcontainer met acht compartimenten vast te houden (figuur 1B). De basis voor het systeem is compleet en ziet eruit als figuur 1C.
LET OP: Boor de gaten niet door de hele timer.
- Kooi instellen
- Snijd een 4-inch PVC-buis (externe diameter van 4,5 inch) op een hoogte van 3,125 inch. Boor een gat van ongeveer 0,5 inch aan de onderkant van de buis om de elektrische kabel door te laten.
- Schuur de bovenkant van de buis (bijvoorbeeld met een router of een roterend gereedschap) zodat de dop gemakkelijk kan worden verwijderd bij het vervangen van de voedselcontainer.
- Gebruik een muizenkooi met een breedte van meer dan 4,5 inch en snijd een gat van 4,5 inch aan de onderkant van de kooi met een gatenzaag.
OPMERKING: De locatie van het gat is afhankelijk van de opstelling van de kooi (bijv. Locatie van de bovenkant van de kooi en de waterfles, toevoeging van een loopwiel, enz.).
- Voerbak instellen
- Maak een voedseldispenser van een 4-inch sieradenorganisator met acht compartimenten, zoals weergegeven in figuur 1D. Snijd de rand van de container zo af dat deze goed in de buis past.
- Gebruik een 4-inch PVC-buisdop en snijd een gat dat overeenkomt met de grootte van een enkel dispensercompartiment (bijvoorbeeld met een roterend gereedschap) om een opening te maken die slechts één van de acht compartimenten tegelijk blootlegt. Terwijl de timer beweegt, legt de opening elke 3 uur een nieuw compartiment bloot. De componenten van het voersysteem zijn nu klaar voor gebruik. Zodra alle kooien zijn ingesteld, lijkt de uiteindelijke opstelling op die in figuur 1E.
- Het transport van veel voedselcontainers tegelijk kan omslachtig zijn. Om het transport te vergemakkelijken, neemt u drie stukken 0,25-inch PVC-buis. Boor een gat van 0,625 inch in het midden van twee stukken en lijm ze aan elkaar. Gebruik vervolgens een smalle 0,625-inch PVC-buis die in het gat en door het midden van de voedselbekers past om voedselbekers te stapelen om hun transport te vergemakkelijken, zoals weergegeven in figuur 1F.
- Test de timers voordat u de muizen introduceert door de installatie op stopcontacten aan te sluiten, een stuk nestje in één compartiment op een geregistreerd tijdstip te plaatsen en de positie van het nestje 12 uur later te controleren om ervoor te zorgen dat de timer snel draait.
2. Toepassing van het voersysteem
- Continue meting van voedselinname bij muizen
- Breng muizen over naar de experimentele kamer en laat ze acclimatiseren aan de licht-donker (LD) cyclus die gedurende ten minste 1 week in de kamer is ingesteld, en gedurende 2 weken als de licht-donkercyclus met meer dan 3 uur wordt verschoven. Voor dit experiment worden gegevens verzameld van mannelijke en vrouwelijke C57BL / 6-muizen tussen 2-4 maanden oud die zijn blootgesteld aan LD 12: 12 (n = 7 mannetjes en 4 vrouwtjes).
- Registreer het gewicht van muizen voordat ze individueel in de feederkooien werden ondergebracht (gewichten werden geregistreerd om 15.00 uur, d.w.z. op het moment dat voedselwissels werden uitgevoerd). Zorg ervoor dat muizen ad libitum toegang hebben tot water en voldoende beddengoed en nestjes.
- Voeg 1,5 g voedsel (routinematig gebruikte 45 mg stofloze precisiepellets) toe aan alle acht compartimenten van de feederbeker. Plaats de feederbeker op de timer. Plaats vervolgens het deksel op de feederbeker zodat slechts één compartiment wordt blootgesteld en noteer het tijdstip van voedselpresentatie. Vier compartimenten vertegenwoordigen nachtpunten en de andere vier vertegenwoordigen dagtijdpunten.
OPMERKING: Vanwege hamstergedrag waargenomen bij overmatige voedselpresentatie, werd 1,5 g geoptimaliseerd als het startgewicht van het voedsel. Muizen hebben de neiging om pellets te hamsteren bovenop de deksels van de voedselbeker of in het beddengoed in de kooi. Dit vertekent de gegevens, wat leidt tot een verkeerde interpretatie ervan. Mannelijke muizen hamsteren geen pellets wanneer ze worden gevoerd met 1,5 g of minder per compartiment. Vrouwtjes hebben de neiging om voedsel meer te hamsteren dan mannetjes, maar dit is muisspecifiek en kan worden verzwakt als ze 1 g pellet per compartiment leveren. - Verander voedsel elke dag op hetzelfde tijdstip en tel het aantal pellets dat in elk compartiment overblijft om de hoeveelheid geconsumeerd voedsel te berekenen. Controleer het voedingsprofiel gedurende een week om een basisvoedingsprofiel te krijgen van muizen die ad libitum krijgen.
- Bereken op basis van het voedsel dat in elk compartiment wordt geconsumeerd de gemiddelde dagelijkse voedselconsumptie voor elke muis (figuur 2).
- Vetrijk dieet (HFD) behandeling
OPMERKING: Dit voedingssysteem kan ook worden gebruikt om het effect van HFD op metabole ziekten te bestuderen en uiteindelijk worden gebruikt voor tijdgebonden voedingsschema's. HFD is niet in de handel verkrijgbaar als precieze grootte en gewicht pellets, en de pellets voor het voeren worden meestal verkregen als 0,5-inch pellets.- Plaats de HFD-pellets op een schoon oppervlak of transparante film en snijd ze in 6-7 kleinere stukjes van gelijke grootte met behulp van een scheermesje. Snijd de pellets klein genoeg zodat ze lijken op normale chow-pellets zoals gebruikt in punt 2.1 hierboven.
OPMERKING: Muizen hebben de neiging om grotere pellets in hun kooien te hamsteren, wat leidt tot een misrekening van het geconsumeerde voedsel. - Weeg 1,5 g gesneden HFD-stukken af en plaats ze in elk van de 8 voedselcompartimenten. Voor voedselwissel om de dag is 1,5 g HFD per compartiment voldoende.
- Verander het voedsel elke dag of om de andere dag volgens experimentele behoeften en noteer het gewicht van het voedsel dat overblijft.
- Bereken de hoeveelheid geconsumeerd voedsel door het resterende gewicht van voedsel af te trekken van de oorspronkelijke hoeveelheid voedsel die is gegeven. Herhaal dit proces gedurende een periode van 1 week om een basislijn van HFD-voedselinname te verkrijgen (figuur 2).
- Plaats de HFD-pellets op een schoon oppervlak of transparante film en snijd ze in 6-7 kleinere stukjes van gelijke grootte met behulp van een scheermesje. Snijd de pellets klein genoeg zodat ze lijken op normale chow-pellets zoals gebruikt in punt 2.1 hierboven.
- Acclimatiseren van mannelijke muizen aan een nachtbeperkt (NR) dieet
- Volg de stappen 2.1.1-2.1.4 om een basislijn van ad libitum-voeding te verkrijgen. Voor dit experiment worden gegevens verzameld van mannelijke C57BL / 6-muizen tussen 2-4 maanden oud die zijn blootgesteld aan LD 12: 12 (n = 18 mannetjes).
- Na 3-7 dagen ad libitum dieet, zet de muizen op een overgangsdieet door geleidelijk het aantal pellets in de dagcompartimenten te verminderen. Om dit te doen, heb vijf pellets per compartiment op dag 1 van de overgang (0,225 g per compartiment), 3 pellets op dag 2 (0,135 g per compartiment), 1 pellet op dag 3 (0,045 g per compartiment) en geen enkele daarna om de muizen volledig over te zetten op een nachtelijk beperkt dieet.
OPMERKING: Zorg ervoor dat muizen niet caloriebeperkt zijn. Gemiddelde van de dagelijkse voedselconsumptie van muizen per compartiment op basis van de ad libitum baseline en geef ze dezelfde hoeveelheid voedsel, waarbij het alleen over de compartimenten van vier nachten wordt verdeeld. - Blijf de voedselinname gedurende 2 weken volgen nadat de muizen zich hebben aangepast aan het nachtbeperkte regime. Pas tijdens deze periode de hoeveelheid voedsel die aan elke muis wordt gegeven aan om beter aan te sluiten bij de totale voedselconsumptie (figuur 3A). Voeg meestal voedselpellets toe (1 pellet voor elk van de vier nachtcompartimenten) wanneer muizen al hun voedsel gedurende twee opeenvolgende nachten opeten.
- Weeg de muizen aan het einde van de periode van 2 weken om eventuele gewichtsveranderingen als gevolg van het voedingsregime te controleren. Aan het einde van deze periode verdooft u de muizen met isofluraan en euthanaseert u ze door onthoofding. Verzamel weefsels en analyseer ze op dagelijkse veranderingen als gevolg van het voedingsparadigma.
- Mannelijke muizen laten wennen aan een aritmisch (AR) dieet
- Volg de stappen 2.1.1-2.1.4 om een basislijn van ad libitum-voeding te verkrijgen. Voor dit experiment worden gegevens verzameld van mannelijke C57BL / 6-muizen tussen 2-4 maanden oud die zijn blootgesteld aan LD 12: 12 (n = 18 mannetjes).
- Bereken na een week ad libitum dieet de gemiddelde voedselconsumptie per dag en deel dat aantal door 8 om de hoeveelheid voedsel te verkrijgen die in elk compartiment moet worden verstrekt. Bereik AR-voeding door ervoor te zorgen dat muizen gedurende de dag een gelijke hoeveelheid voedsel krijgen in alle acht compartimenten.
- Zet de muizen vervolgens op een overgangsdieet door geleidelijk, gedurende 3-5 dagen, de hoeveelheid voedsel die per compartiment wordt gegeven te verminderen om uiteindelijk elk ritme van voedselinname af te schaffen (zoals weergegeven in figuur 3B). Zorg er bij een AR-dieet voor dat de muizen toegang hebben tot 1/8 van hun dagelijkse voedselinname in elk van de acht compartimenten, en dus toegang tot voedsel om de 3 uur. Zorg ervoor dat muizen niet caloriebeperkt zijn.
- Houd de muizen op AR-dieet gedurende 2 weken of langer (figuur 3B).
- Pas tijdens het AR-dieet het voedsel elke dag aan om ervoor te zorgen dat muizen slechts een paar pellets achterlaten (meestal minder dan 5). Dit zorgt ervoor dat muizen precies de juiste hoeveelheid voedsel krijgen en niet caloriebeperkt zijn. Maak aanpassingen door pellets in alle acht compartimenten te verminderen of toe te voegen of door pellets in twee tegenovergestelde compartimenten te verminderen of toe te voegen, om geen ritmes van voedselinname op te wekken.
OPMERKING: Muizen die onder een AR-dieet worden gevoerd, laten voedsel bijna uitsluitend achter tussen ZT3 en ZT9 (tussen 3 uur en 9 uur nadat het licht is ingeschakeld), maar hebben 's nachts honger en bijten in de voedseldispenser om toegang te krijgen tot het volgende compartiment. Niettemin zijn AR-gevoede muizen niet caloriebeperkt en krijgen ze in feite meer gewicht dan NR-gevoede muizen in de loop van de tijd. - Weeg de muizen aan het einde van de periode van 2 weken om eventuele gewichtsveranderingen als gevolg van het voedingsregime te controleren. Aan het einde van deze periode verdooft u de muizen met isofluraan en euthanaseert u ze door onthoofding. Verzamel weefsels en analyseer ze op dagelijkse veranderingen als gevolg van het voedingsparadigma.
Representative Results
Het hierboven beschreven voedingssysteem kan worden gebruikt voor langdurige manipulatie van ritmische voedselinname bij muizen. Dit systeem stelt in wezen elke 3 uur een nieuw voedselcompartiment bloot aan de muis, waardoor de onderzoeker specifiek voedsel in elk compartiment kan manipuleren. Een toepassing was om het profiel van voedselinname over de periode van 24 uur te analyseren. De gegevens geven aan dat WT-muizen die normale chow ad libitum krijgen, 's nachts ongeveer 75% van hun voedsel eten (figuur 2A). Bovendien vindt het grootste deel van het voedsel dat overdag wordt gegeten plaats binnen de 3 uur voordat het licht uitgaat.
Muizen die HFD ad libitum kregen, aten meer voedsel op de eerste 2 dagen van blootstelling, waarschijnlijk vanwege de nieuwheid van HFD (figuur 2A). Na 2 dagen bleef de HFD-inname ritmisch, maar met een verminderde amplitude in vergelijking met bij normale chow ad libitum. Terwijl zowel mannelijke als vrouwelijke WT-muizen HFD kregen, bleek dat vrouwelijke muizen een grote hoeveelheid voedsel hamsterden op het deksel van het voerapparaat en in de kooi, terwijl mannetjes geen merkbaar hamsteren vertoonden. Zoals hierboven vermeld, kan het hamsteren van voedsel leiden tot een verkeerde berekening van de voedselconsumptie en tot verkeerde interpretatie van gegevens. Bovendien beten vrouwelijke muizen vaker in de plastic randen van de voedselbekers, vooral in de nachtcompartimenten. Mannelijke muizen vertoonden een significante gewichtstoename na 1 week ad libitum normale chow en na 1 week HFD (figuur 2E). Een vergelijkbare trend werd waargenomen bij vrouwelijke muizen, maar bereikte geen significante p-waarden, waarschijnlijk deels vanwege het lagere aantal vrouwtjes dat werd gebruikt in vergelijking met mannetjes.
Muizen die zijn overgestapt op een NR-dieet eten hun dagelijkse totale calorieën alleen 's nachts, zonder een significante afname van de calorie-inname gedurende de eerste 3-5 weken (figuur 3A). Langere blootstelling aan NR-schema vermindert de dagelijkse gemiddelde calorie-inname met 10% -15% in vergelijking met muizen die ad libitum krijgen, zoals elders beschreven34. Muizen die overgingen op een AR-dieet consumeerden hun dagelijkse totale calorieën in gelijke hoeveelheden gedurende de dag, wat leidde tot een dramatische demping van het dagelijkse ritme van voedselinname (figuur 3B). Wat het NR-voedingsschema betreft, wordt het dagelijkse gemiddelde van de calorie-inname niet beïnvloed door het AR-voedingsschema voor de eerste 3-5 weken van blootstelling, maar neemt het af bij langere blootstelling. Muizen vertoonden gewichtstoename na de NR (figuur 3C) en AR-schema's (figuur 3C).
Figuur 1: Ontwerp en constructie van het voedingsapparaatsysteem . (A) De afmetingen van de PVC-basis voor het toevoersysteem en een beschrijving van de plaats waar gaten moeten worden gemaakt voor het bevestigen van de timer. (B) Een 24-uurs timer voor en na het hergebruiken van de draad en het boren met schroeven voor het plaatsen van de voedselbeker. (C) De geassembleerde grijze basis en timer samen met een 4-inch PVC-buis. (D) De voedselbeker met acht compartimenten na het trimmen van de buitenranden. (E) De definitieve opstelling van kooien met de voedselbeker bedekt met een dop van 4 inch, zodat slechts één compartiment tegelijk toegankelijk is. (F) Het transport van meerdere voedselbekers tijdens een experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voedingsprofielen onder verschillende voedingsregimes . (A) Het voedingsprofiel van mannelijke WT-muizen die ad libitum kregen met normale chow (NC) gedurende 7 dagen en vetrijk dieet (HFD) gedurende nog eens 7 dagen. Gekleurde lijnen vertegenwoordigen individuele muisprofielen (n = 7) en de zwarte lijn geeft het gemiddelde ± SEM van zeven muizen aan. (B) Het vetrijke dieet voor en na het snijden. (C) Het dagelijkse gemiddelde van de voedselinname om de 3 uur ± SEM (n = 7). Het gemiddelde werd berekend over de laatste 5 dagen van het NC- of het HFD-voedingsschema. (D) Het gemiddelde (links) en het percentage (rechts) van de voedselinname gedurende de dag en nacht voor muizen die gevoed zijn met NC of HFD. De waarden vertegenwoordigen het gemiddelde van zeven muizen ± SEM en werden berekend met behulp van de voedselinnamegegevens over de laatste 5 dagen van NC- of HFD-voedingsschema's. * p < 0,05 tussen de twee groepen (gepaarde t-test). (E) Het gemiddelde lichaamsgewicht van muizen die in het experiment werden gebruikt na 1 week NC en 1 week HFD. De gegevens voor mannen (links) en vrouwtjes (rechts) worden weergegeven met * p < 0,05 tussen de twee groepen (gepaarde t-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Manipulatie van het dagelijkse ritme van voedselinname. (A) Het voedingsprofiel van mannelijke WT-muizen gevoed met normaal chow ad libitum gedurende 2 dagen, overgegaan op een nachtbeperkt (NR) voedingsregime gedurende 3 dagen en gedurende 8 nachten onder NR-voeding gehouden. De gekleurde lijnen vertegenwoordigen individuele muisprofielen (n = 18) en de zwarte lijn geeft de gemiddelde ± SEM van 18 muizen aan. Het grijze sterretje geeft aan dat de timer voor die muis niet goed functioneert op die ene dag waarop de timer stopte met draaien. (B) Voedingsprofiel van mannelijke WT-muizen gevoed met normale chow ad libitum gedurende 2 dagen, overgegaan naar een aritmisch (AR) voedingsregime gedurende 1 dag en gedurende 8 nachten onder AR-voeding gehouden. De gekleurde lijnen vertegenwoordigen individuele muisprofielen (n = 18) en de zwarte lijn geeft de gemiddelde ± SEM van de 18 muizen aan. (C) Het gemiddelde lichaamsgewicht van muizen die in het experiment werden gebruikt na 2 weken blootstelling aan NR- en AR-diëten. Gegevens worden weergegeven met * p < 0,05 tussen de twee groepen (gepaarde t-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Voor- en nadelen van de bestaande voersystemen. Een tabel met verschillende voedingssystemen die worden gebruikt voor manipulatie van voedselinname, met een korte beschrijving van de voor- en nadelen van elk systeem. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Kosten van materialen die nodig zijn om het voersysteem te bouwen. Een tabel met de kosten van items die nodig zijn voor de bouw van het voersysteem dat in dit document wordt beschreven, samen met een schatting van de bouwkosten per kooi. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
De afgelopen decennia is uitgebreid onderzoek gedaan naar de manipulatie van voedingsritmes en hun effect op de fysiologie. De constructie en het gebruik van het hier beschreven voedingssysteem kan worden gebruikt als een efficiënte methode voor het manipuleren van de voedselinname. Het protocol maakt gebruik van een gemeenschappelijke 24-uurs timer en een voedselbeker die is ontworpen als een organisator met acht compartimenten als belangrijke componenten van het systeem. De kooien kunnen eenvoudig worden gebouwd met slechts een paar gemakkelijk toegankelijke gereedschappen en de bediening van het systeem is gebruiksvriendelijk. Enkele van de belangrijkste aspecten van het protocol voor het aanpassen van het systeem om ritmische voedselinname te manipuleren, zijn het dagelijks wisselen van voedselbekers omdat de timer over een periode van 24 uur draait, handmatig tellen of wegen van resterende voedingsmiddelen en dagelijkse aanpassing van het aantal pellets voor AR-voeding. Meestal worden plastic spaanders gezien wanneer muizen honger hebben en niet voldoende voedsel krijgen. Dit probleem kan worden opgelost door nog een paar voedselpellets toe te voegen die zich aan het voedingsregime houden totdat er geen plastic spaanders worden gezien. In het geval van AR-voeding, waarbij de dagelijkse voeding moet worden aangepast, moet ervoor worden gezorgd dat het ritme van de voedselinname niet wordt geïnduceerd (figuur 3B). Daarom heeft het de voorkeur om pellets in tegenovergestelde compartimenten overal op te tellen of af te trekken om muizen aritmisch gevoed te houden.
Dit systeem kan verder worden verbeterd door de voedselbekers te bedekken met een laag epoxy om te voorkomen dat de muizen in het plastic bijten en zo de levensduur van de voedselbekers te verlengen. Het oppervlak van de timer voor de plaatsing van de voedselbeker kan ook worden aangepast om de voedselbeker plat en stabiel op de timer te laten zitten. Dit kan voorkomen dat de timer per ongeluk wordt gestopt door een ongelijk geplaatste timer. Een paar van de kooicomponenten, zoals voedselbekers, kunnen ook 3D-geprint worden om de kosten te verlagen en op maat gemaakt naar de wens van de onderzoeker. Dit kunnen voedselbekers met meer dan acht compartimenten zijn, die een betere tijdsresolutie kunnen geven dan het huidige 3-uursvenster.
Hoewel zeer efficiënt, heeft dit systeem enkele beperkingen, zoals arbeidsintensief, waarbij de onderzoeker nog steeds elke 24 uur voedselbekers moet vervangen en het resterende voedsel handmatig moet tellen / wegen. Bovendien moeten de timers van tijd tot tijd worden gecontroleerd om potentiële problemen te identificeren en / of als ze niet meer werken. Dit kan worden bereikt door het tellen van de voedselkorrels die overblijven na het voeren (bijvoorbeeld door te bepalen of sommige muizen voedsel slechts in een paar compartimenten aten en sommige compartimenten onaangeroerd lieten). Een andere beperking van dit systeem is dat het mogelijk niet zo goed werkt met vrouwelijke muizen, omdat de weinige experimenten die met vrouwtjes zijn uitgevoerd, hebben aangetoond dat ze de neiging hebben om voedsel te hamsteren en het plastic meer te kauwen dan mannelijke muizen.
Niettemin is dit voersysteem zeer effectief in het manipuleren van voedselinname, is het gemakkelijk te bouwen, te bedienen, te onderhouden en is het goedkoop in vergelijking met de dure geautomatiseerde feeders die op de markt bestaan. Het kan eenvoudig worden aangepast en aangepast aan de eisen van de onderzoeker en heeft geen speciale training nodig om het systeem te bedienen. Belangrijk is dat timers slechts een lage hoeveelheid constante witte ruis produceren, waardoor muizen geen geluid kunnen associëren met de beschikbaarheid van voedsel.
Samenvattend beschrijft dit artikel een innovatief voedingssysteem dat kan worden gebruikt om de dagelijkse voedselconsumptie bij muizen te volgen en kan worden aangepast om muizen te voeden met verschillende paradigma's, zoals tijdgebonden voeding, aritmische voeding en voeding met een vetrijk dieet. Dit systeem voegt toe aan de lijst met hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt om belangrijke vragen op het gebied van ritmische voedselinname en het effect ervan op de fysiologie aan te pakken.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door de subsidie R01DK128133 van NIH / NIDDK (aan J.S.M) en opstartfondsen van Texas A &M University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #6 x 0.75 inch Phillips Pan Head Stainless Steel Sheet Metal Screw (50-Pack) | Everbilt | #800172 | |
| #8 x 1.5 inch Phillips Pan Head Zinc Plated Sheet Metal Screw (100-Pack) | Everbilt | #801622 | |
| 0.25 inch gray PVC sheet (24 inch x 48 inch) | USPlastic | #45088 | |
| 4 inch PVC pipe (10 ft) | Home Depot | #531103 | |
| 45 mg dustless precision pellets | Bio-Serv | #F0165 | |
| 6 ft. Extension Cord | HDX | HD#145-017 | |
| Food container (eight-compartment jewelry organizer) | JewelrySupply | #PB8301 | |
| Indoor Basic Timer | General Electric | #15119 | |
| Oatey 4 inch ABS Pipe Test Cap with Knockout | Home Depot | #39103D | |
| Rodent Diet with 45 kcal% fat (with red dye) | Research Diets | #D12451 |
References
- Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of light and temperature in the regulation of circadian gene expression in Drosophila. PLoS Genetics. 3 (4), 0492-0507 (2007).
- Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
- Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
- Kawamoto, T., et al. Effects of fasting and re-feeding on the expression of Dec, Per1, and other clock-related genes. Journal of Biochemistry. 140 (3), 401-408 (2006).
- Lamia, K. A., Storch, K. F., Weitz, C. J. Physiological significance of a peripheral tissue circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (39), 15172-15177 (2008).
- Oosterman, J. E., Kalsbeek, A., La Fleur, S. E., Belsham, D. D. Impact of nutrients on circadian rhythmicity. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 308 (5), 337-350 (2015).
- Pitts, S. N., Perone, E., Silver, R. Food-entrained circadian rhythms are sustained in arrhythmic Clk/Clk mutant mice. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 285, 57-67 (2003).
- Sheward, W. J., et al. Entrainment to feeding but not to light: Circadian phenotype of VPAC 2 receptor-null mice. Journal of Neuroscience. 27 (16), 4351-4358 (2007).
- Gekakis, N., et al. Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism. Science. 280 (5369), 1564-1569 (1998).
- King, D. P., et al. Positional cloning of the mouse circadian Clock gene. Cell. 89 (4), 641-653 (1997).
- Kume, K., et al. mCRY1 and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop. Cell. 98 (2), 193-205 (1999).
- Shearman, L. P., et al. Interacting molecular loops in the mammalian circadian clock. Science. 288 (5468), 1013-1019 (2000).
- Beytebiere, J. R., et al. Tissue-specific BMAL1 cistromes reveal that rhythmic transcription is associated with rhythmic enhancer-enhancer interactions. Genes and Development. 33 (5-6), 294-309 (2019).
- Menet, J. S., Pescatore, S., Rosbash, M. CLOCK: BMAL1 is a pioneer- like transcription factor. Genes and Development. 28 (1), 8-13 (2014).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Mure, L. S., et al. Diurnal transcriptome atlas of a primate across major neural and peripheral tissues. Science. 359 (6381), (2018).
- Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Translational Medicine. 10 (458), 1-8 (2018).
- Zhang, R., Lahens, N. F., Ballance, H. I., Hughes, M. E., Hogenesch, J. B. A circadian gene expression atlas in mammals: Implications for biology and medicine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16219-16224 (2014).
- Menet, J. S., Rodriguez, J., Abruzzi, K. C., Rosbash, M. Nascent-Seq reveals novel features of mouse circadian transcriptional regulation. eLife. 2012 (1), 1-25 (2012).
- Miller, B. H., et al. Circadian and CLOCK-controlled regulation of the mouse transcriptome and cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3342-3347 (2007).
- Cailotto, C., et al. The suprachiasmatic nucleus controls the daily variation of plasma glucose via the autonomic output to the liver: Are the clock genes involved. European Journal of Neuroscience. 22 (10), 2531-2540 (2005).
- Eckel-Mahan, K. L., et al. Coordination of the transcriptome and metabolome by the circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5541-5546 (2012).
- Damiola, F., et al. Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes and Development. 14 (23), 2950-2961 (2000).
- Saini, C., et al. Real-time recording of circadian liver gene expression in freely moving mice reveals the phase-setting behavior of hepatocyte clocks. Genes and Development. 27 (13), 1526-1536 (2013).
- Stokkan, K. A., Yamazaki, S., Tei, H., Sakaki, Y., Menaker, M. Entrainment of the circadian clock in the liver by feeding. Science. 291 (5503), 490-493 (2001).
- Atger, F., et al. Circadian and feeding rhythms differentially affect rhythmic mRNA transcription and translation in mouse liver. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 6579-6588 (2015).
- Greenwell, B. J., et al. Rhythmic food intake drives rhythmic gene expression more potently than the hepatic circadian clock in mice. Cell Reports. 27 (3), 649-657 (2019).
- Izumo, M., et al. Differential effects of light and feeding on circadian organization of peripheral clocks in a forebrain Bmal1 mutant. eLife. 3, 04617 (2014).
- Mange, F., et al. Diurnal regulation of RNA polymerase III transcription is under the control of both the feeding-fasting response and the circadian clock. Genome Research. 27 (6), 973-984 (2017).
- Van Der Veen, D. R., et al. Impact of behavior on central and peripheral circadian clocks in the common vole Microtus arvalis, a mammal with ultradian rhythms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (9), 3393-3398 (2006).
- Vollmers, C., et al. Time of feeding and the intrinsic circadian clock drive rhythms in hepatic gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21453-21458 (2009).
- Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted feeding prevents obesity and metabolic syndrome in mice lacking a circadian clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
- Hatori, M., et al. Time-restricted feeding without reducing caloric intake prevents metabolic diseases in mice fed a high-fat diet. Cell Metabolism. 15 (6), 848-860 (2012).
- Acosta-Rodríguez, V. A., de Groot, M. H. M., Rijo-Ferreira, F., Green, C. B., Takahashi, J. S. Mice under caloric restriction self-impose a temporal restriction of food intake as revealed by an automated feeder system. Cell Metabolism. 26 (1), 267-277 (2017).
- Chung, H., et al. Time-restricted feeding improves insulin resistance and hepatic steatosis in a mouse model of postmenopausal obesity. Metabolism: Clinical and Experimental. 65 (12), 1743-1754 (2016).
- Sen, S., et al. Ultradian feeding in mice not only affects the peripheral clock in the liver, but also the master clock in the brain. Chronobiology International. 34 (1), 17-36 (2017).
- Xie, X., et al. Natural food intake patterns do not synchronize peripheral clocks. BMC Biology. 18 (160), 1-11 (2020).
- Swamy, S., et al. Circadian disruption of food availability significantly reduces reproductive success in mice. Hormones and Behavior. 105, 177-184 (2018).
- Xin, H., et al. Protocol for setup and circadian analysis of inverted feeding in mice. STAR Protocols. 2 (3), 100701 (2021).
