Summary
음식 섭취 시기를 제한하는 것은 식이요법으로 인한 대사 질환을 약화시키기 위한 유망한 개입으로 부상했습니다. 이 원고는 생쥐의 리드미컬한 음식 섭취량을 측정하고 조작하기 위해 사내에 구축된 효율적인 시스템의 구축 및 사용에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
리드미컬한 유전자 발현은 일주기 리듬의 특징이며 하루 중 적절한 시간에 생물학적 기능의 리듬성을 유도하는 데 필수적입니다. 지난 수십 년 동안의 연구에 따르면 리드미컬한 음식 섭취(즉, 유기체가 하루 24시간 동안 음식을 먹는 시간)는 몸 전체의 다양한 기관과 조직에서 유전자 발현의 리드미컬한 조절에 크게 기여합니다. 리드미컬한 음식 섭취가 건강과 생리학에 미치는 영향은 그 이후로 널리 연구되어 왔으며 활동기 동안 8시간 동안 음식 섭취를 제한하면 다양한 비만 식단에서 발생하는 대사 질환이 약화되는 것으로 나타났습니다. 이러한 연구는 종종 동물에게 음식을 배달하는 타이밍을 맞추기 위해 통제 된 방법을 사용해야합니다. 이 원고는 생쥐의 리드미컬한 음식 섭취를 조작할 뿐만 아니라 일일 음식 소비량을 측정하기 위해 사내에 구축된 저렴하고 효율적인 시스템의 설계 및 사용에 대해 설명합니다. 이 시스템은 저렴한 원자재를 사용하여 사용자 친화적인 취급 절차에 따라 음식 배달에 적합한 케이지를 만드는 것을 수반합니다. 이 시스템은 임의, 시간 제한 또는 부정맥 일정과 같은 다양한 섭식 요법에 따라 생쥐에게 먹이를 주기 위해 효율적으로 사용할 수 있으며 고지방 식단을 통합하여 행동, 생리학 및 비만에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 야생형(WT) 마우스가 다양한 섭식 요법에 어떻게 적응하는지에 대한 설명이 제공됩니다.
Introduction
생체 시계는 여러 종에 걸쳐 어디에나 발견되며 유기체가 리드미컬하게 변화하는 환경에 적응하는 데 도움이 되는 시간 측정 메커니즘을 제공합니다. 마스터 일주기 심박 조율기는 시상 하부의 시상 핵 (SCN)에 있습니다. SCN은 주로 환경적 명암 주기에 의해 동반되며, 신경 및 호르몬 신호, 섭식 및 체온을 포함한 여러 신호를 통해 신체의 거의 모든 세포에 존재하는 주변 시계를 동기화합니다 1,2,3,4,5,6,7,8 . 포유류에서 분자 일주기 시계는 일주기 리듬 생성에 중요한 전사 피드백 루프를 시작하기 위해 Period(Per1, Per2 및 Per3) 및 Cryptochrome(Cry1 및 Cry2)이라는 핵심 시계 유전자의 발현을 제어하는 이종이합체 전사 인자 CLOCK: BMAL1 9,10에 의존합니다 . 분자 시계는 또한 거의 모든 생물학적 기능의 리듬을 제어하는 수천 개의 유전자의 리드미컬 한 전사를 조절합니다13,14,15. 포유류에서 게놈의 50% 이상은 적어도 하나의 조직 유형에서 리드미컬하게 발현된다 16,17,18, 그리고 마우스의 간과 같은 조직은 그들의 전사체의 약 25%-30%가 리드미컬하게 발현된다18,19. 리드미컬한 유전자 발현은 세포 주기 조절(cell cycle control)20, 포도당 항상성(glucose homeostasis)21, 아미노산 대사(amino acid metabolism)22와 같은 중요한 생물학적 과정을 하루 중 적절한 시간에 활성화시켜 유기체의 적합성을 증가시키는 데 결정적인 역할을 한다.
지난 수십 년 동안 음식 섭취가 간을 포함한 여러 조직에서 유전자 발현의 리듬을 동반하는 강력한 동기화 신호로 작용할 수 있음을 시사하는 증거가 증가하고 있습니다23,24. 중요하게도, 섭식은 SCN 또는 명암 주기와 독립적으로 간에서 리듬을 동반하는 것으로 나타났으며(25), 리드미컬한 섭식은 분자 시계 26,27,28,29,30,31을 포함하지 않고 리드미컬한 유전자 발현을 유도할 수 있습니다. 생쥐의 비활성 기간(주간)으로 제한된 섭식은 핵심 시계 유전자와 많은 리듬 유전자의 발현 단계를 역전시킨다31. 일일 칼로리 섭취량을 8-10시간으로 제한하는 영양 중재인 시간 제한 급식(TRF)은 비만, 고인슐린혈증, 간 지방증 및 대사 증후군을 예방하는 것으로 나타났습니다32,33. 음식 섭취 조작과 관련된 위의 모든 실험은 실험자가 하루 중 적절한 시간에 음식을 배달하는 효과적인 방법을 사용해야 합니다.
몇 가지 장점과 단점을 지닌 다양한 음식 배달 방법이 개발되었습니다 29,34,35,36,37,38,39 (표 1). 일부 자동 급식기는 마우스에서 섭식 및 자발적인 바퀴 달리기 활동을 기록하는 동안 식량 가용성의 양, 기간 및 타이밍을 제어하는 소프트웨어에 기초하여 작동하도록 설계되었다(34). 몇 가지 다른 방법은 마우스를 다른 섭식 조건에 대해 다른 케이지에 배치하는 것을 포함하며, 실험자는 전제 조건38,39에서 식품 펠릿을 수동으로 추가합니다. 또 다른 시스템은 컴퓨터에 의해 제어되는 자동 공급기 시스템을 사용하는데, 여기서 공압식 차폐물은 음식에 대한 접근을 방지하고 시간 간격 또는 음식의 질량(35)에 의해 제어될 수 있다. 이러한 모든 방법은 비용이 많이 들고 기기의 적절한 작동을 위해 약간의 교육이 필요하거나 공급 조건을 수동으로 변경하기 위해 특정 시간에 실험자가 있어야 하기 때문에 노동 집약적인 컴퓨터 소프트웨어의 활용 및 설정이 필요합니다. 컴퓨터 시스템에는 음식을 내보내는 레버나 문의 오작동, 음식물 알갱이가 콘센트에 끼는 것, 소프트웨어 고장 등 문제도 있습니다. 더욱이, 문이나 레버를 여는 동안 생성될 수 있는 소리는 쥐가 이를 음식 배달과 연관시키도록 컨디셔닝할 위험이 있으며, 따라서 음식 조작의 효과에 대한 해석을 엄격하게 음식 접근 때문이거나 수면/각성 주기와 같은 다른 행동 리듬에 대한 영향으로 인한 것으로 해석할 수 있습니다. 이 연구의 전반적인 목표는 앞서 언급한 많은 문제를 완화하는 데 도움이 되는 장기간의 리드미컬한 음식 섭취를 조작할 수 있는 저렴하고 효율적인 시스템을 개발하는 것이었습니다. 무엇보다도, 개발되어 후술되는 공급 장치는 자동화 기계(표 2)에 비해 매우 적은 비용으로 구성할 수 있으며 취급, 작동 및 유지 보수에 대한 정교한 교육이 필요하지 않습니다. 둘째, 급식 시스템은 배경 백색 소음만 발생하고 음식 배달 중에는 큰 소리가 나지 않아 파블로프 컨디셔닝을 방지합니다. 전체적으로, 이 사료 공급 시스템은 연구자들에게 경제적이고 접근하기 쉬우며 신뢰할 수 있는 동시에 리드미컬한 음식 섭취를 조작하는 데 효율적입니다.
Protocol
모든 동물 피험자는 텍사스 A&M 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(AUP #2022-0050)에서 정한 지침에 따라 사용됩니다. 생후 2-4개월 사이의 수컷과 암컷 C57BL/6 마우스가 모두 여기에 사용됩니다. 공급 시스템을 구축하는 절차는 아래에 설명되어 있으며 장치를 구축하는 데 필요한 원자재는 재료 표에 참조되어 있습니다.
1. 사료 공급 시스템 구축
- 폴리염화비닐(PVC) 베이스 구성
- 다음 치수에 따라 절단된 0.25인치 PVC 시트 4장을 조달합니다: 4.875인치 x 4.5인치; 4.875 인치 x 2.125 인치; 9.5인치 x 2.125인치(2개). 그림 4.875A에 제공된 측정값을 사용하여 4.5시간 타이머를 부착하기 위해 24인치 x 1인치 베이스에 4개의 구멍을 뚫습니다. 그림 1A와 같이 4개의 PVC 조각을 접착하여 베이스를 얻습니다.
- PVC 베이스에 타이머 고정
- 타이머를 열어 플러그를 뽑습니다. 표준 연장/전기 코드를 사용하여 연결합니다(그림 1B).
- 타이머를 PVC 베이스에 놓아 1.1.1단계에서 베이스에 뚫린 구멍에 맞춥니다. 1.5인치 나사를 사용하여 PVC 베이스에 타이머를 고정합니다. 타이머가 평평하게 놓여 있고 PVC 베이스에서 안정적인지 확인하십시오.
- 타이머 상단에 4개의 구멍을 뚫고 0.75인치 나사를 고정하여 8칸 식품 용기를 고정합니다(그림 1B). 시스템의 기반이 완성되었으며 그림 1C와 같습니다.
주의 : 전체 타이머에 구멍을 뚫지 마십시오.
- 케이지 설정
- 4인치 PVC 튜브(외경 4.5인치)를 3.125인치 높이로 자릅니다. 파이프 바닥에 약 0.5인치의 구멍을 뚫어 전기 케이블이 통과할 수 있도록 합니다.
- 식품 용기를 교체할 때 캡을 쉽게 제거할 수 있도록 파이프 상단을 샌딩(예: 라우터 또는 회전 도구로)합니다.
- 너비가 4.5인치보다 큰 마우스 케이지를 사용하고 구멍 톱을 사용하여 케이지 바닥에 4.5인치 구멍을 자릅니다.
알림: 구멍의 위치는 케이지 설정(예: 케이지 상단과 물병의 위치, 런닝 휠 추가 등)에 따라 다릅니다.
- 사료 용기 설정
- 그림 4D와 같이 1인치 8칸 보석 정리함으로 음식 디스펜서를 만듭니다. 파이프에 잘 맞도록 용기의 테두리를 자릅니다.
- 4인치 PVC 파이프 캡을 사용하고 단일 디스펜서 구획의 크기에 해당하는 구멍(예: 회전 도구 사용)을 절단하여 한 번에 8개의 구획 중 하나만 노출하는 개구부를 만듭니다. 타이머가 움직이면 3시간마다 새 구획이 열립니다. 이제 공급 시스템 구성 요소를 사용할 준비가 되었습니다. 모든 케이지가 설정되면 최종 설정은 그림 1E에 표시된 것과 유사합니다.
- 한 번에 많은 식품 용기를 운송하는 것은 번거로울 수 있습니다. 쉽게 운반 할 수 있도록 0.25 인치 PVC 파이프 3 개를 가져 가십시오. 두 조각의 중앙에 0.625인치 구멍을 뚫고 함께 붙입니다. 그런 다음 그림 0.625F와 같이 구멍과 음식 컵의 중앙을 통과하여 음식 컵을 쌓아 운반을 용이하게 하는 좁은 1인치 PVC 파이프를 사용합니다.
- 설정을 전원 콘센트에 꽂고, 기록된 시간에 한 구획에 네슬렛 조각을 놓고, 12시간 후에 네슬렛의 위치를 모니터링하여 타이머가 즉시 회전하는지 확인하여 마우스를 도입하기 전에 타이머를 테스트합니다.
2. 사료 공급 시스템의 적용
- 생쥐의 음식 섭취량을 지속적으로 측정
- 마우스를 실험실로 옮기고 최소 1주일 동안, 그리고 명암 주기가 3시간 이상 이동하면 2주 동안 실내에 설정된 명암(LD) 주기에 적응시킵니다. 이 실험을 위해 LD 12:12(n = 수컷 7마리 및 암컷 4마리)에 노출된 2-4개월령 사이의 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스에서 데이터를 수집합니다.
- 마우스를 피더 케이지에 개별적으로 수용하기 전에 마우스 체중을 기록합니다(무게는 오후 3:00, 즉 음식 교체가 수행될 때 기록됨). 생쥐가 물과 충분한 침구와 새끼를 자유롭게 이용할 수 있는지 확인하십시오.
- 1.5g의 식품(일상적으로 사용되는 먼지 없는 정밀 펠릿 45mg)을 피더 컵의 8개 구획 모두에 추가합니다. 타이머에 피더 컵을 놓습니다. 그런 다음 피더 컵에 뚜껑을 덮고 하나의 구획만 노출되도록 하고 음식 발표 시간을 기록하십시오. 4개의 구획은 야간 시점을 나타내고 나머지 4개는 주간 시점을 나타냅니다.
알림: 과도한 음식 제시 시 관찰된 비축 행동으로 인해 1.5g이 시작 식품 무게로 최적화되었습니다. 쥐는 음식 컵 뚜껑 위나 케이지 안의 침구에 알약을 쌓아두는 경향이 있습니다. 이로 인해 데이터가 왜곡되어 잘못 해석됩니다. 수컷 마우스는 구획당 1.5g 이하를 먹일 때 펠릿을 비축하지 않습니다. 암컷은 수컷보다 음식을 더 많이 비축하는 경향이 있지만 이것은 마우스에 따라 다르며 구획당 1g의 펠릿을 제공하면 약화될 수 있습니다. - 매일 같은 시간에 음식을 바꾸고 각 구획에 남아있는 알갱이의 수를 세어 소비되는 음식의 양을 계산하십시오. 일주일 동안 섭식 프로파일을 모니터링하여 임의로 먹이를 먹인 마우스 의 기준선 섭식 프로필을 얻습니다.
- 모든 구획에서 소비되는 음식을 기준으로 각 마우스의 평균 일일 음식 소비량을 계산합니다(그림 2).
- 고지방 식단(HFD) 치료
참고: 이 수유 시스템은 HFD가 대사 질환에 미치는 영향을 연구하는 데에도 사용할 수 있으며 결국 시간 제한 수유 일정에 사용할 수 있습니다. HFD는 정확한 크기 및 중량 펠릿으로 상업적으로 이용 가능하지 않습니다., 공급용 펠릿은 일반적으로 0.5인치 펠릿으로 조달됩니다.- HFD 펠릿을 깨끗한 표면이나 투명 필름에 놓고 면도날을 사용하여 6-7개의 작은 조각으로 자릅니다. 위의 섹션 2.1에서 사용된 일반 차우 펠릿과 유사하도록 펠릿을 충분히 작게 자릅니다.
참고: 쥐는 새장에 더 큰 알갱이를 쌓아두는 경향이 있어 소비된 음식을 잘못 계산할 수 있습니다. - 잘라낸 HFD 조각 1.5g의 무게를 측정하고 8개의 식품 칸 각각에 넣습니다. 격일로 음식을 교체하는 경우 구획당 1.5g의 HFD로 충분합니다.
- 실험의 필요에 따라 매일 또는 격일로 음식을 바꾸고 남은 음식의 무게를 기록하십시오.
- 주어진 음식의 초기 양에서 음식의 남은 무게를 빼서 소비하는 음식의 양을 계산하십시오. 이 과정을 1주일 동안 반복하여 HFD 식품 섭취 기준선을 얻습니다(그림 2).
- HFD 펠릿을 깨끗한 표면이나 투명 필름에 놓고 면도날을 사용하여 6-7개의 작은 조각으로 자릅니다. 위의 섹션 2.1에서 사용된 일반 차우 펠릿과 유사하도록 펠릿을 충분히 작게 자릅니다.
- 수컷 생쥐를 야간 제한(NR) 식단에 적응시키기
- 2.1.1-2.1.4 단계에 따라 임의 수유 기준선을 얻습니다. 이 실험을 위해, 데이터는 LD 12:12에 노출된 2-4개월 사이의 수컷 C57BL/6 마우스로부터 수집된다(n = 18마리 수컷).
- 3-7 일간의 임의식이 요법 후, 생쥐를 하루 구획의 펠릿 수를 점차적으로 줄임으로써 전환 식단에 넣습니다. 이를 위해 전환 1일차에 구획당 5개의 펠릿(구획당 0.225g), 2일차에 3개의 펠릿(구획당 0.135g), 3일차에 1개의 펠릿(구획당 0.045g)을 확보하고 그 이후에는 야간 제한 식단에서 마우스를 완전히 전환하지 않습니다.
알림: 마우스의 칼로리가 제한되지 않았는지 확인하십시오. 임의 기준선을 기준으로 구획당 생쥐 의 일일 음식 소비량을 평균화하고 동일한 양의 음식을 제공하여 4박 구획에만 분배합니다. - 생쥐가 야간 제한 요법에 적응한 후 2주 동안 음식 섭취량을 계속 모니터링하십시오. 이 기간 동안 총 음식 소비량에 더 잘 맞도록 각 마우스에게 제공되는 음식의 양을 조정하십시오(그림 3A). 일반적으로 음식 알갱이를 추가하십시오 (4 개의 밤 구획 각각에 대해 1 개의 펠릿) 쥐가 연속 2 박 동안 모든 음식을 먹을 때.
- 2주 기간이 끝날 때 마우스의 무게를 측정하여 섭식 요법으로 인한 체중 변화를 모니터링합니다. 이 기간이 끝나면 이소 플루 란으로 생쥐를 마취시키고 참수로 안락사시킵니다. 조직을 수집하고 섭식 패러다임으로 인한 일일 변화를 분석합니다.
- 수컷 생쥐를 부정맥(AR) 식단에 적응시키기
- 2.1.1-2.1.4 단계에 따라 임의 수유 기준선을 얻습니다. 이 실험을 위해, 데이터는 LD 12:12에 노출된 2-4개월 사이의 수컷 C57BL/6 마우스로부터 수집된다(n = 18마리 수컷).
- 일주일간의 임 의식이 요법 후 하루 평균 음식 소비량을 계산하고 그 숫자를 8로 나누어 각 구획에 제공 할 음식의 양을 구합니다. 쥐가 하루 종일 8개 구획 모두에서 동일한 양의 음식을 섭취하도록 하여 AR 먹이를 달성하십시오.
- 그런 다음 3-5일에 걸쳐 구획당 제공되는 음식의 양을 점진적으로 줄여 궁극적으로 음식 섭취의 리듬을 없애는 전환 식단에 마우스를 넣습니다( 그림 3B에 표시됨). AR 다이어트를 할 때 생쥐가 8 개의 구획 각각에서 일일 음식 섭취량의 1/8에 접근 할 수 있도록하여 3 시간마다 음식에 접근 할 수 있도록하십시오. 마우스의 칼로리가 제한되지 않았는지 확인하십시오.
- 마우스를 AR 식이요법으로 2주 이상 유지한다(도 3B).
- AR 다이어트 중에는 쥐가 몇 개의 알갱이(일반적으로 5개 미만)만 남기도록 매일 음식을 조절하십시오. 이렇게 하면 쥐가 적절한 양의 음식을 섭취하고 칼로리가 제한되지 않습니다. 8 개의 구획 모두에서 펠릿을 줄이거 나 추가하거나 두 개의 반대쪽 구획에서 펠릿을 줄이거 나 추가하여 조정하여 음식 섭취의 리듬을 유도하지 않도록하십시오.
참고: AR 식단으로 먹이를 먹은 쥐는 거의 독점적으로 ZT3와 ZT9 사이(불을 켠 후 3시간에서 9시간 사이)에 음식을 남겨두지만 밤에는 배가 고파서 음식 디스펜서를 깨물고 다음 구획에 접근합니다. 그럼에도 불구하고 AR 사료를 섭취한 마우스는 칼로리가 제한되지 않으며 실제로 시간이 지남에 따라 NR을 섭취한 마우스보다 더 많은 체중을 얻습니다. - 2주 기간이 끝날 때 마우스의 무게를 측정하여 섭식 요법으로 인한 체중 변화를 모니터링합니다. 이 기간이 끝나면 이소 플루 란으로 생쥐를 마취시키고 참수로 안락사시킵니다. 조직을 수집하고 섭식 패러다임으로 인한 일일 변화를 분석합니다.
Representative Results
위에서 설명한 사료 공급 시스템은 생쥐의 리드미컬 한 음식 섭취량을 장기간 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 기본적으로 3시간마다 새로운 음식 구획을 마우스에 노출시켜 연구원이 모든 구획에서 음식을 구체적으로 조작할 수 있도록 합니다. 한 가지 응용 프로그램은 24 시간 동안 음식 섭취 프로필을 분석하는 것이 었습니다. 데이터에 따르면 정상적인 차우 임의를 먹인 WT 마우스는 밤 동안 음식 의 약 75%를 먹습니다(그림 2A). 또한 낮에 먹는 대부분의 음식은 불이 꺼지기 전 3 시간 이내에 발생합니다.
HFD 를 임의 로 먹인 쥐는 노출 첫 2일 동안 더 많은 음식을 먹었는데, 이는 HFD의 참신함 때문일 수 있습니다(그림 2A). 2일 후, HFD 섭취량은 리드미컬하게 유지되었지만 정상적인 차우 를 임의로 먹였을 때에 비해 진폭이 감소했습니다. 수컷과 암컷 WT 마우스 모두 HFD를 먹인 반면, 암컷 마우스는 먹이 장치의 뚜껑과 케이지에 많은 양의 음식을 비축한 반면 수컷은 눈에 띄는 비축을 보이지 않는 것으로 나타났습니다. 위에서 언급했듯이 식품을 비축하면 식품 소비량을 잘못 계산하고 데이터를 잘못 해석할 수 있습니다. 또한 암컷 쥐는 특히 야간 구획에서 음식 컵의 플라스틱 테두리를 더 자주 물었습니다. 수컷 마우스는 임의 정상 차우 1주일 후와 HFD 1주 후 상당한 체중 증가를 보였다(그림 2E). 암컷 마우스에서도 유사한 경향이 관찰되었지만 유의미한 p-값에 도달하지 못했는데, 이는 부분적으로 수컷에 비해 사용된 암컷의 수가 적기 때문일 수 있습니다.
NR 식단으로 전환한 쥐는 처음 3-5주 동안 칼로리 섭취량이 크게 감소하지 않고 밤에만 일일 총 칼로리를 섭취합니다(그림 3A). NR 스케쥴에 더 오래 노출되면 다른 곳에서 설명한 바와 같이 임의로 먹인 마우스에 비해 일일 평균 칼로리 섭취량이 10%-15% 감소합니다(34). AR 식단으로 전환한 쥐는 하루 종일 동일한 양의 일일 총 칼로리를 섭취하여 음식 섭취의 일일 리듬을 극적으로 감소시켰습니다(그림 3B). NR 수유 일정의 경우 일일 평균 칼로리 섭취량은 노출 첫 3-5주 동안 AR 급여 일정의 영향을 받지 않지만 노출이 길어질수록 감소합니다. 마우스는 NR (도 3C) 및 AR 스케줄 (도 3C) 후에 체중 증가를 보였다.
그림 1: 공급 장치 시스템의 설계 및 구성 . (A) 공급 시스템용 PVC 베이스의 치수 및 타이머를 고정하기 위해 구멍을 뚫어야 하는 위치에 대한 설명. (B) 와이어의 용도를 변경하고 음식 컵을 배치하기 위해 나사로 드릴링하기 전후의 24시간 타이머. (C) 4인치 PVC 파이프와 함께 조립된 회색 베이스와 타이머. (D) 바깥쪽 가장자리를 다듬은 후의 8칸 음식 컵. (E) 한 번에 하나의 구획에만 접근할 수 있도록 식품 컵이 4인치 캡으로 덮인 케이지의 최종 설정. (F) 실험 중 여러 개의 식품 컵을 운송합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다양한 식이 요법 하에서의 섭식 프로필. (A) 7일 동안 정상 차우(NC)와 추가 7일 동안 고지방 식이(HFD)를 임의로 먹인 수컷 WT 마우스 의 섭식 프로필. 컬러 선은 개별 마우스 프로파일(n = 7)을 나타내고 검은색 선은 7개 마우스의 평균 ± SEM을 나타냅니다. (B) 슬라이스 전후의 고지방 식단. (C) 3시간마다 음식 섭취량의 일일 평균 ± SEM(n=7). 평균은 NC 또는 HFD 수유 일정의 지난 5일 동안 계산되었습니다. (D) NC 또는 HFD를 먹인 마우스의 낮과 밤 동안의 음식 섭취량의 평균(왼쪽) 및 백분율(오른쪽). 이 값은 SEM± 7마리의 마우스의 평균을 나타내며 NC 또는 HFD 급여 일정의 마지막 5일 동안의 음식 섭취 데이터를 사용하여 계산되었습니다. * p < 두 그룹 간 0.05(쌍체 t-검정). (E) NC의 1주일 및 HFD의 1주 후 실험에 사용된 마우스의 평균 체중. 남성(왼쪽)과 여성(오른쪽)에 대한 데이터는 두 그룹 사이에 * p < 0.05로 표시됩니다(쌍체 t-검정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 음식 섭취의 일일 리듬 조작. (A) 2일 동안 정상적인 차우 임의로 먹이를 먹인 수컷 WT 마우스의 섭식 프로파일, 3일 동안 야간 제한(NR) 섭식 요법으로 전환, 8일 동안 NR 섭식 하에 유지. 컬러 선은 개별 마우스 프로파일(n = 18)을 나타내고 검은색 선은 18개 마우스의 평균 ± SEM을 나타냅니다. 회색 별표는 타이머가 회전을 멈춘 날에 해당 마우스의 타이머가 오작동했음을 나타냅니다. (B) 2일 동안 정상적인 차우 임의로 먹이를 주고, 1일 동안 부정맥(AR) 먹이 체계로 전환하고, 8일 동안 AR 먹이를 유지한 수컷 WT 마우스의 섭식 프로필. 컬러 선은 개별 마우스 프로파일(n=18)을 나타내고 검은색 선은 18개 마우스의 평균 ± SEM을 나타냅니다. (C) NR 및 AR 식이에 2주 동안 노출된 후 실험에 사용된 마우스의 평균 체중. 데이터는 두 그룹 사이에 * p < 0.05로 표시됩니다(쌍체 t-검정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 기존 공급 시스템의 장점과 단점. 각 시스템의 장단점에 대한 간략한 설명과 함께 음식 섭취 조작에 사용되는 다양한 사료 공급 시스템을 강조하는 표입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 공급 시스템을 구성하는 데 필요한 재료 비용. 케이지 당 건설 비용 추정치와 함께이 백서에 설명 된 사료 공급 시스템 건설에 필요한 품목 비용을 나열한 표. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
지난 수십 년 동안 섭식 리듬의 조작과 생리학에 미치는 영향에 대한 광범위한 연구가 수행되었습니다. 여기에 설명된 사료 공급 시스템의 구축 및 활용은 음식 섭취를 조작하기 위한 효율적인 방법으로 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 일반적인 24시간 타이머와 8칸 오거나이저로 설계된 푸드 컵을 시스템의 핵심 구성 요소로 활용합니다. 케이지는 쉽게 접근할 수 있는 몇 가지 도구만 사용하여 쉽게 구성할 수 있으며 시스템 처리는 사용자 친화적입니다. 리드미컬한 음식 섭취를 조작하기 위해 시스템을 조정하기 위한 프로토콜의 주요 측면 중 일부는 타이머가 24시간 동안 회전하기 때문에 매일 음식 컵을 교체하고, 남은 음식을 수동으로 계산하거나 무게를 측정하고, AR 먹이를 위한 펠릿 수의 일일 조정을 포함합니다. 일반적으로 플라스틱 부스러기는 생쥐가 배고프고 적절한 음식을 섭취하지 못할 때 나타납니다. 이 문제는 플라스틱 부스러기가 보이지 않을 때까지 수유 요법을 준수하는 식품 알갱이를 몇 개 더 추가하여 해결할 수 있습니다. 매일 음식을 조절해야 하는 AR 급식의 경우 음식 섭취의 리듬을 유도하지 않도록 주의해야 합니다(그림 3B). 따라서 쥐에게 부정맥으로 먹이를 주기 위해 전체적으로 반대쪽 구획에 펠릿을 더하거나 빼는 것이 좋습니다.
이 시스템은 쥐가 플라스틱을 물지 않도록 식품 컵을 에폭시 층으로 코팅하여 식품 컵의 수명을 연장함으로써 더욱 개선될 수 있습니다. 음식 컵 배치를 위한 타이머의 표면은 음식 컵이 타이머에서 평평하고 안정적으로 놓일 수 있도록 수정할 수도 있습니다. 이렇게 하면 고르지 않게 배치된 타이머로 인해 타이머가 우발적으로 중지되는 것을 방지할 수 있습니다. 식품 컵과 같은 일부 케이지 구성 요소는 비용을 줄이기 위해 3D 프린팅이 가능하며 연구원의 취향에 맞게 맞춤 제작할 수도 있습니다. 여기에는 8개 이상의 구획이 있는 음식 컵이 포함될 수 있으며, 이는 현재 3시간 창보다 더 나은 시간 해상도를 제공할 수 있습니다.
매우 효율적이지만 이 시스템은 노동 집약적인 것과 같은 몇 가지 제한 사항이 있으며 연구원은 여전히 24시간마다 음식 컵을 교체해야 하고 남은 음식을 수동으로 계산/무게를 측정해야 합니다. 또한 타이머를 수시로 모니터링하여 잠재적인 문제 및/또는 작동이 중지되었는지 확인해야 합니다. 이것은 먹이 후 남아있는 음식 알갱이를 세는 동안 달성 할 수 있습니다 (예 : 일부 마우스가 몇 구획에서만 음식을 먹고 일부 구획을 그대로 두었는지 여부를 결정함으로써). 이 시스템의 또 다른 한계는 암컷을 대상으로 한 몇 가지 실험에서 수컷 쥐보다 음식을 비축하고 플라스틱을 더 많이 씹는 경향이 있음을 보여주었기 때문에 암컷 쥐에게는 잘 작동하지 않을 수 있다는 것입니다.
그럼에도 불구하고 이 사료 공급 시스템은 식품 섭취를 조작하는 데 매우 효과적이며 구성, 작동, 유지 관리가 용이하며 시장에 존재하는 고가의 자동 공급 장치에 비해 저렴합니다. 연구원의 요구 사항에 맞게 쉽게 조정 및 수정할 수 있으며 시스템을 작동하기 위해 특별한 교육이 필요하지 않습니다. 중요한 것은 타이머가 적은 양의 일정한 백색 소음만 생성하므로 쥐가 소리를 음식 가용성과 연관시키는 것을 방지할 수 있다는 것입니다.
요약하면, 이 논문은 생쥐의 일일 음식 섭취량을 모니터링하는 데 사용할 수 있고 시간 제한 급식, 부정맥 급식, 고지방 사료 급식과 같은 다양한 패러다임에서 생쥐에게 먹이를 주기 위해 적용할 수 있는 혁신적인 섭식 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 리드미컬한 음식 섭취 및 생리학에 미치는 영향 분야에서 중요한 질문을 해결하는 데 사용할 수 있는 도구 목록에 추가됩니다.
Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH/NIDDK의 R01DK128133 보조금(JSM까지)과 Texas A&M University의 스타트업 펀드로 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #6 x 0.75 inch Phillips Pan Head Stainless Steel Sheet Metal Screw (50-Pack) | Everbilt | #800172 | |
| #8 x 1.5 inch Phillips Pan Head Zinc Plated Sheet Metal Screw (100-Pack) | Everbilt | #801622 | |
| 0.25 inch gray PVC sheet (24 inch x 48 inch) | USPlastic | #45088 | |
| 4 inch PVC pipe (10 ft) | Home Depot | #531103 | |
| 45 mg dustless precision pellets | Bio-Serv | #F0165 | |
| 6 ft. Extension Cord | HDX | HD#145-017 | |
| Food container (eight-compartment jewelry organizer) | JewelrySupply | #PB8301 | |
| Indoor Basic Timer | General Electric | #15119 | |
| Oatey 4 inch ABS Pipe Test Cap with Knockout | Home Depot | #39103D | |
| Rodent Diet with 45 kcal% fat (with red dye) | Research Diets | #D12451 |
References
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