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Biology

कस्टम-मेड फीडिंग सिस्टम का उपयोग करके चूहों में लयबद्ध भोजन सेवन का हेरफेर

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64624
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Biology, Texas A&M University, 2Center for Biological Clocks Research, Texas A&M University, 3Interdisciplinary Program of Genetics, Texas A&M University

Summary

भोजन के सेवन के समय को सीमित करना आहार-प्रेरित चयापचय रोगों को कम करने के लिए एक आशाजनक हस्तक्षेप के रूप में उभरा है। यह पांडुलिपि चूहों में लयबद्ध भोजन सेवन को मापने और हेरफेर करने के लिए इन-हाउस निर्मित एक कुशल प्रणाली के निर्माण और उपयोग का विवरण देती है।

Abstract

लयबद्ध जीन अभिव्यक्ति सर्कैडियन लय की एक पहचान है और दिन के उचित समय पर जैविक कार्यों की लयबद्धता को चलाने के लिए आवश्यक है। पिछले कुछ दशकों में अध्ययनों से पता चला है कि लयबद्ध भोजन का सेवन (यानी, जिस समय जीव 24 घंटे के दिन के दौरान भोजन खाते हैं), पूरे शरीर में विभिन्न अंगों और ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति के लयबद्ध विनियमन में महत्वपूर्ण योगदान देता है। स्वास्थ्य और शरीर विज्ञान पर लयबद्ध भोजन के सेवन के प्रभावों का व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है और पता चला है कि सक्रिय चरण के दौरान 8 घंटे के लिए भोजन का सेवन प्रतिबंधित करने से विभिन्न प्रकार के ओबेसोजेनिक आहार से उत्पन्न चयापचय रोगों को कम किया जाता है। इन अध्ययनों में अक्सर जानवरों को भोजन के वितरण के समय के लिए नियंत्रित तरीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। यह पांडुलिपि कम लागत और कुशल प्रणाली के डिजाइन और उपयोग का वर्णन करती है, जो दैनिक भोजन की खपत को मापने के साथ-साथ चूहों में लयबद्ध भोजन सेवन में हेरफेर करने के लिए इन-हाउस बनाई गई है। यह प्रणाली उपयोगकर्ता के अनुकूल हैंडलिंग प्रक्रिया का पालन करते हुए, खाद्य वितरण के लिए अनुकूल पिंजरों का निर्माण करने के लिए सस्ती कच्चे माल का उपयोग करती है। इस प्रणाली का उपयोग चूहों को विभिन्न आहार आहारों जैसे एड लिबिटम, समय-प्रतिबंधित, या लयबद्ध कार्यक्रमों पर खिलाने के लिए कुशलतासे किया जा सकता है, और व्यवहार, शरीर विज्ञान और मोटापे पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उच्च वसा वाले आहार को शामिल कर सकता है। जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहे विभिन्न आहार आहारों के अनुकूल कैसे होते हैं, इसका विवरण प्रदान किया गया है।

Introduction

सर्कैडियन घड़ी प्रजातियों में सर्वव्यापी रूप से पाई जाती है और एक समय-पालन तंत्र प्रदान करती है जो जीवों को उनके लयबद्ध रूप से बदलते वातावरण के अनुकूल होने में मदद करती है। मास्टर सर्कैडियन पेसमेकर हाइपोथैलेमस के सुप्राचियास्मेटिक न्यूक्लियस (एससीएन) में स्थित है। एससीएन मुख्य रूप से पर्यावरणीय प्रकाश-अंधेरे चक्र से घिरा हुआ है, और न्यूरोनल और हार्मोनल संकेतों, भोजन और शरीर के तापमान 1,2,3,4,5,6,7,8 सहित कई संकेतों के माध्यम से शरीर की लगभग हर कोशिका में मौजूद परिधीय घड़ियों को सिंक्रनाइज़ करता है। . स्तनधारियों में, आणविक सर्कैडियन घड़ी हेटेरोडिमेरिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर क्लॉक: BMAL1 9,10 पर निर्भर करती है, जो एक ट्रांसक्रिप्शनल फीडबैक लूप शुरू करने के लिए पीरियड (Per1, Per2, और Per3) और क्रिप्टोक्रोम (Cry1 और Cry2) नामक कोर क्लॉक जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करती है जो सर्कैडियन लय 9,11,12 की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है . आणविक घड़ी हजारों जीनों के लयबद्ध प्रतिलेखन को भी नियंत्रित करती है जो लगभग हर जैविक कार्य 13,14,15 की लयबद्धता को नियंत्रित करते हैं। स्तनधारियों में जीनोम का 50% से अधिक कम से कम एक ऊतक प्रकार 16,17,18 में लयबद्ध रूप से व्यक्त किया जाता है, और चूहों में यकृत जैसे ऊतकों में उनके प्रतिलेख का लगभग 25% -30%लयबद्ध रूप से व्यक्त होता है। लयबद्ध जीन अभिव्यक्ति जीव फिटनेस बढ़ाने के लिए दिन के सही समय पर सेल चक्र नियंत्रण20, ग्लूकोज होमियोस्टेसिस21 और अमीनो एसिड चयापचय22 जैसी महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण है।

पिछले कुछ दशकों में, इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि भोजन का सेवन यकृत23,24 सहित कई ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति में लय को प्रशिक्षित करने के लिए एक शक्तिशाली सिंक्रनाइज़िंग क्यू के रूप में कार्य कर सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, फीडिंग को एससीएन या प्रकाश-अंधेरे चक्र25 से स्वतंत्र रूप से यकृत में लय को संलग्न करने के लिए दिखाया गया है, और लयबद्ध भोजन आणविक घड़ी 26,27,28,29,30,31 को शामिल किए बिना लयबद्ध जीन अभिव्यक्ति को चला सकता है। चूहों (दिन) की निष्क्रिय अवधि तक सीमित भोजन कोर क्लॉक जीन और कई लयबद्ध जीनों की अभिव्यक्ति के चरण को उलटदेता है। समय-प्रतिबंधित भोजन (टीआरएफ), जो एक पोषण संबंधी हस्तक्षेप है जहां दैनिक कैलोरी सेवन 8-10 घंटे की अवधि तक सीमित है, को मोटापे, हाइपरइन्सुलिनमिया, हेपेटिक स्टीटोसिस और चयापचय सिंड्रोम32,33 से बचाने के लिए दिखाया गया है। भोजन के सेवन में हेरफेर से जुड़े उपरोक्त सभी प्रयोगों के लिए प्रयोगकर्ता को दिन के सही समय पर भोजन वितरित करने के लिए प्रभावी तरीकों का उपयोग करने की आवश्यकता होती है।

खाद्य वितरण के विभिन्न तरीकों को विकसित किया गया है, जिसमें कई फायदे और नुकसानहैं 29,34,35,36,37,38,39 (तालिका 1)। कुछ स्वचालित फीडरों को एक सॉफ्टवेयर के आधार पर संचालित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो चूहों में भोजन और स्वैच्छिक व्हील-रनिंग गतिविधि को रिकॉर्ड करते समय भोजन की उपलब्धता की मात्रा, अवधि और समय को नियंत्रित करताहै। कुछ अन्य तरीकों में चूहों को अलग-अलग भोजन स्थितियों के लिए अलग-अलग पिंजरों में रखा जाता है, प्रयोगकर्ता मैन्युअल रूप से आवश्यक समय38,39 पर खाद्य छर्रों को जोड़ता है। एक अन्य प्रणाली एक कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित एक स्वचालित फीडर सिस्टम का उपयोग करती है जहां एक वायवीय-संचालित ढाल भोजन तक पहुंच को रोकता है और जिसे समय अंतराल या भोजन के द्रव्यमान द्वारा नियंत्रित किया जा सकताहै। इन सभी विधियों को या तो एक कम्प्यूटरीकृत सॉफ्टवेयर के उपयोग और सेटअप की आवश्यकता होती है जो महंगा हो सकता है और उपकरण के उचित संचालन के लिए कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है या श्रम गहन होते हैं क्योंकि प्रयोगकर्ता को भोजन की स्थिति को मैन्युअल रूप से बदलने के लिए विशिष्ट समय पर उपस्थित होने की आवश्यकता होती है। कम्प्यूटरीकृत सिस्टम भी अपने हिस्से के मुद्दों के साथ आते हैं, जिसमें लीवर या दरवाजों की खराबी शामिल है जो भोजन को बाहर निकलने देती है, खाद्य छर्रों को आउटलेट में फंसना और सॉफ्टवेयर टूटना शामिल है। इसके अलावा, दरवाजे या लीवर के उद्घाटन के दौरान उत्पन्न होने वाली ध्वनि चूहों को भोजन वितरण के साथ जोड़ने के लिए कंडीशनिंग चूहों का जोखिम प्रस्तुत करती है, जिससे भोजन की पहुंच के कारण या नींद / जागने के चक्र जैसे अन्य व्यवहार लय पर प्रभाव के कारण खाद्य हेरफेर के प्रभावों की व्याख्या से समझौता किया जाता है। इस अध्ययन का समग्र लक्ष्य दीर्घकालिक लयबद्ध भोजन सेवन में हेरफेर करने के लिए एक सस्ती और कुशल प्रणाली विकसित करना था जो इन उपरोक्त मुद्दों में से कई को कम करने में मदद करेगा। सबसे पहले और सबसे महत्वपूर्ण, फीडिंग उपकरण जो विकसित किया गया था और नीचे वर्णित है, स्वचालित मशीनों (तालिका 2) की तुलना में बहुत कम लागत पर बनाया जा सकता है और हैंडलिंग, संचालन और रखरखाव के लिए परिष्कृत प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है। दूसरे, फीडिंग सिस्टम केवल एक पृष्ठभूमि सफेद शोर पैदा करता है और खाद्य वितरण के दौरान कोई जोर की आवाज नहीं देता है, जिससे पावलोवियन कंडीशनिंग को रोका जा सकता है। कुल मिलाकर, यह भोजन प्रणाली शोधकर्ताओं के लिए आर्थिक, अधिक सुलभ और विश्वसनीय है, जबकि अभी भी लयबद्ध भोजन सेवन के हेरफेर में कुशल है।

Protocol

सभी पशु विषयों का उपयोग टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय (एयूपी # 2022-0050) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुसार किया जाता है। 2-4 महीने की उम्र के बीच नर और मादा दोनों सी 57बीएल /6 चूहों का उपयोग यहां किया जाता है। फीडिंग सिस्टम के निर्माण की प्रक्रिया नीचे वर्णित है, और उपकरण बनाने के लिए आवश्यक कच्चे माल को सामग्री की तालिका में संदर्भित किया गया है।

1. फीडिंग सिस्टम का निर्माण

  1. एक पॉली विनाइल क्लोराइड (पीवीसी) आधार का निर्माण
    1. निम्नलिखित आयामों के अनुसार काटे गए 0.25 इंच पीवीसी शीट के चार टुकड़े खरीदें: 4.875 इंच x 4.5 इंच; 4.875 इंच x 2.125 इंच; 9.5 इंच x 2.125 इंच (दो टुकड़े)। चित्रा 1 ए में प्रदान किए गए माप का उपयोग करके 24 घंटे के टाइमर को संलग्न करने के लिए 4.875-इंच x 4.5-इंच के आधार में चार छेद ड्रिल करें। चित्रा 1 ए में आधार प्राप्त करने के लिए पीवीसी के चार टुकड़ों को गोंद करें।
  2. पीवीसी बेस पर टाइमर को सुरक्षित करना
    1. प्लग निकालने के लिए टाइमर खोलें। एक मानक एक्सटेंशन / इलेक्ट्रिक कॉर्ड (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके कनेक्शन बनाएं।
    2. चरण 1.1.1 में आधार पर ड्रिल किए गए छेदों के साथ संरेखित करने के लिए पीवीसी बेस पर टाइमर रखें। पीवीसी बेस पर टाइमर को ठीक करने के लिए 1.5 इंच स्क्रू का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि टाइमर सपाट है और पीवीसी आधार पर स्थिर है।
    3. टाइमर के शीर्ष पर चार छेद ड्रिल करें और आठ-कम्पार्टमेंट फूड कंटेनर (चित्रा 1 बी) को पकड़ने के लिए 0.75 इंच के स्क्रू को ठीक करें। सिस्टम के लिए आधार पूरा है और चित्रा 1 सी की तरह दिखता है।
      सावधानी: पूरे टाइमर के माध्यम से छेद ड्रिल न करें।
  3. पिंजरे सेटअप
    1. 3.125 इंच की ऊंचाई पर 4 इंच पीवीसी ट्यूब (4.5 इंच का बाहरी व्यास) काटें। बिजली के केबल को गुजरने देने के लिए पाइप के तल पर लगभग 0.5 इंच का छेद ड्रिल करें।
    2. पाइप के शीर्ष को रेत दें (उदाहरण के लिए, राउटर या रोटरी टूल के साथ) ताकि खाद्य कंटेनर को बदलते समय टोपी को आसानी से हटाया जा सके।
    3. 4.5 इंच से अधिक चौड़ाई वाले माउस पिंजरे का उपयोग करें और छेद आरी का उपयोग करके पिंजरे के तल पर 4.5 इंच के छेद को काटें।
      नोट: छेद का स्थान पिंजरे सेटअप पर निर्भर करता है (उदाहरण के लिए, पिंजरे के शीर्ष और पानी की बोतल का स्थान, एक रनिंग व्हील के अतिरिक्त, आदि)।
  4. फीडिंग कंटेनर सेटअप
    1. चित्र 1 डी में दिखाए गए अनुसार 4 इंच के आठ-कम्पार्टमेंट गहने आयोजक से एक खाद्य डिस्पेंसर बनाएं। कंटेनर के रिम को इस तरह काटें कि यह पाइप में अच्छी तरह से फिट हो।
    2. एक 4-इंच पीवीसी पाइप कैप का उपयोग करें और एक एकल डिस्पेंसर डिब्बे (जैसे, रोटरी टूल के साथ) के आकार के अनुरूप एक छेद काटें ताकि एक उद्घाटन बनाया जा सके जो एक समय में आठ डिब्बों में से केवल एक को उजागर करता है। जैसे ही टाइमर चलता है, उद्घाटन हर 3 घंटे में एक नए डिब्बे को उजागर करता है। फीडिंग सिस्टम घटक अब उपयोग करने के लिए तैयार हैं। एक बार जब सभी पिंजरे सेट हो जाते हैं, तो अंतिम सेटअप चित्रा 1 ई में दिखाए गए जैसा दिखता है।
    3. एक समय में कई खाद्य कंटेनरों का परिवहन बोझिल हो सकता है। आसान परिवहन की सुविधा के लिए, 0.25 इंच पीवीसी पाइप के तीन टुकड़े लें। दो टुकड़ों के केंद्र में एक 0.625 इंच का छेद ड्रिल करें और उन्हें एक साथ गोंद करें। फिर, एक संकीर्ण 0.625 इंच पीवीसी पाइप का उपयोग करें जो छेद में फिट बैठता है और खाद्य कप के केंद्र के माध्यम से खाद्य कप को उनके परिवहन की सुविधा के लिए स्टैक करता है, जैसा कि चित्रा 1 एफ में दिखाया गया है।
    4. चूहों को पेश करने से पहले टाइमर का परीक्षण करें, सेटअप को पावर आउटलेट में प्लग करके, रिकॉर्ड किए गए समय पर एक डिब्बे में नेस्लेट का एक टुकड़ा रखकर, और 12 घंटे बाद नेस्टलेट की स्थिति की निगरानी करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि टाइमर तुरंत बदल जाता है।

2. फीडिंग सिस्टम का अनुप्रयोग

  1. चूहों में भोजन के सेवन का निरंतर माप
    1. चूहों को प्रयोगात्मक कमरे में स्थानांतरित करें और उन्हें कम से कम 1 सप्ताह के लिए कमरे में निर्धारित प्रकाश-अंधेरे (एलडी) चक्र में समायोजित करें, और 2 सप्ताह के लिए यदि प्रकाश-अंधेरे चक्र को 3 घंटे से अधिक स्थानांतरित किया जाता है। इस प्रयोग के लिए, एलडी 12: 12 (एन = 7 पुरुष और 4 महिलाएं) के संपर्क में आने वाले 2-4 महीने की उम्र के बीच नर और मादा सी 57बीएल / 6 चूहों से डेटा एकत्र किया जाता है।
    2. फीडर पिंजरों में व्यक्तिगत रूप से आवास देने से पहले चूहों के वजन को रिकॉर्ड करें (वजन 3:00 बजे दर्ज किया गया था, यानी, जिस समय भोजन परिवर्तन किए गए थे)। सुनिश्चित करें कि चूहों के पास पानी और पर्याप्त बिस्तर और घोंसले तक पहुंच है।
    3. फीडर कप के सभी आठ डिब्बों में 1.5 ग्राम भोजन (नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले 45 मिलीग्राम धूल रहित सटीक छर्रों का उपयोग किया जाता है) जोड़ें। फीडर कप को टाइमर पर रखें। फिर, फीडर कप पर ढक्कन रखें ताकि केवल एक डिब्बे को उजागर किया जाए, और भोजन प्रस्तुति के समय को नोट करें। चार डिब्बे रात के बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं और अन्य चार दिन के समय बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं।
      नोट: अतिरिक्त खाद्य प्रस्तुति पर देखे गए जमाखोरी व्यवहार के कारण, 1.5 ग्राम को शुरुआती खाद्य वजन के रूप में अनुकूलित किया गया था। चूहे या तो खाद्य कप ढक्कन के ऊपर या पिंजरे के भीतर बिस्तर में छर्रों को जमा करते हैं। यह डेटा को तिरछा कर देता है जिससे इसकी गलत व्याख्या होती है। नर चूहे प्रति डिब्बे 1.5 ग्राम या उससे कम के साथ खिलाए जाने पर छर्रों को जमा नहीं करते हैं। मादाएं पुरुषों की तुलना में भोजन की जमाखोरी करती हैं, लेकिन यह माउस-विशिष्ट है और प्रति डिब्बे 1 ग्राम गोली प्रदान करने पर क्षीण हो सकता है।
    4. एक ही समय में हर दिन भोजन बदलें और उपभोग किए गए भोजन की मात्रा की गणना करने के लिए प्रत्येक डिब्बे में शेष छर्रों की संख्या की गणना करें। एड लिबिटम खिलाए गए चूहों की बेसलाइन फीडिंग प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए एक सप्ताह के लिए फीडिंग प्रोफाइल की निगरानी करें।
    5. प्रत्येक डिब्बे में खाए गए भोजन के आधार पर, प्रत्येक माउस के लिए औसत दैनिक भोजन की खपत की गणना करें (चित्रा 2)।
  2. उच्च वसा आहार (HFD) उपचार
    नोट: इस फीडिंग सिस्टम का उपयोग चयापचय रोगों पर एचएफडी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है और अंततः समय-प्रतिबंधित भोजन कार्यक्रमों के लिए उपयोग किया जा सकता है। एचएफडी व्यावसायिक रूप से सटीक आकार और वजन के छर्रों के रूप में उपलब्ध नहीं है, और खिलाने के लिए छर्रों को आमतौर पर 0.5 इंच के छर्रों के रूप में खरीदा जाता है।
    1. एचएफडी छर्रों को एक साफ सतह या पारदर्शी फिल्म पर रखें और उन्हें रेजर ब्लेड का उपयोग करके समान आकार के 6-7 छोटे टुकड़ों में काट लें। छर्रों को इतना छोटा काट लें कि वे ऊपर अनुभाग 2.1 में उपयोग किए गए सामान्य चाउ छर्रों से मिलते-जुलते हों।
      नोट: चूहे अपने पिंजरों में बड़े छर्रों को जमा करते हैं, जिससे भोजन की गलत गणना होती है।
    2. कटे हुए एचएफडी टुकड़ों के 1.5 ग्राम वजन करें और 8 खाद्य डिब्बों में से प्रत्येक में रखें। हर दूसरे दिन भोजन बदलने के लिए, प्रति डिब्बे 1.5 ग्राम एचएफडी पर्याप्त है।
    3. प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार हर दिन या हर दूसरे दिन भोजन बदलें और जो भोजन बचता है उसके वजन को रिकॉर्ड करें।
    4. दिए गए भोजन की प्रारंभिक मात्रा से भोजन के शेष वजन को घटाकर उपभोग किए गए भोजन की मात्रा की गणना करें। एचएफडी भोजन सेवन की आधार रेखा प्राप्त करने के लिए 1 सप्ताह की अवधि में इस प्रक्रिया को दोहराएं (चित्रा 2)।
  3. नर चूहों को रात में प्रतिबंधित (एनआर) आहार के लिए अनुकूलित करना
    1. विज्ञापन लिबिटम फीडिंग की आधार रेखा प्राप्त करने के लिए चरण 2.1.1-2.1.4 का पालन करें। इस प्रयोग के लिए, एलडी 12: 12 (एन = 18 पुरुष) के संपर्क में आने वाले 2-4 महीने की उम्र के बीच नर सी 57बीएल / 6 चूहों से डेटा एकत्र किया जाता है।
    2. एड लिबिटम आहार के 3-7 दिनों के बाद, चूहों को दिन के डिब्बों में छर्रों की संख्या को धीरे-धीरे कम करके संक्रमण आहार पर रखा। ऐसा करने के लिए, संक्रमण के पहले दिन प्रति डिब्बे पांच छर्रों (0.225 ग्राम प्रति डिब्बे), दिन 2 पर 3 छर्रों (0.135 ग्राम प्रति डिब्बे), दिन 3 पर 1 गोली (0.045 ग्राम प्रति डिब्बे), और उसके बाद रात प्रतिबंधित आहार पर चूहों को पूरी तरह से संक्रमण करने के लिए कोई नहीं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि चूहे कैलोरी प्रतिबंधित नहीं हैं। एड लिबिटम बेसलाइन के आधार पर प्रति डिब्बे चूहों की दैनिक भोजन खपत का औसत निकालें और उन्हें समान मात्रा में भोजन दें, इसे केवल चार रात के डिब्बों में वितरित करें।
    3. चूहों को रात के प्रतिबंधित आहार के अनुकूल होने के बाद 2 सप्ताह तक भोजन के सेवन की निगरानी करते रहें। इस अवधि के दौरान, प्रत्येक माउस को दिए गए भोजन की मात्रा को उसकी कुल खाद्य खपत (चित्रा 3 ए) के अनुरूप समायोजित करें। आम तौर पर भोजन के छर्रों (चार रात के डिब्बों में से प्रत्येक के लिए 1 गोली) जोड़ें जब चूहे लगातार दो रातों के लिए अपना सारा भोजन खाते हैं।
    4. आहार आहार के कारण वजन के किसी भी बदलाव की निगरानी के लिए 2 सप्ताह की अवधि के अंत में चूहों का वजन करें। इस अवधि के अंत में, आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें और उन्हें डिकैपिटेशन द्वारा इच्छामृत्यु करें। ऊतकों को इकट्ठा करें और भोजन प्रतिमान के कारण दैनिक परिवर्तनों के लिए उनका विश्लेषण करें।
  4. नर चूहों को एक लयबद्ध (एआर) आहार के लिए अनुकूलित करना
    1. विज्ञापन लिबिटम फीडिंग की आधार रेखा प्राप्त करने के लिए चरण 2.1.1-2.1.4 का पालन करें। इस प्रयोग के लिए, एलडी 12: 12 (एन = 18 पुरुष) के संपर्क में आने वाले 2-4 महीने की उम्र के बीच नर सी 57बीएल / 6 चूहों से डेटा एकत्र किया जाता है।
    2. एड लिबिटम आहार के एक सप्ताह के बाद, प्रति दिन औसत भोजन की खपत की गणना करें और प्रत्येक डिब्बे में प्रदान किए जाने वाले भोजन की मात्रा प्राप्त करने के लिए उस संख्या को 8 से विभाजित करें। यह सुनिश्चित करके एआर फीडिंग प्राप्त करें कि चूहों को पूरे दिन सभी आठ डिब्बों में समान मात्रा में भोजन मिले।
    3. फिर, चूहों को धीरे-धीरे 3-5 दिनों में, प्रति डिब्बे दिए गए भोजन की मात्रा को कम करके संक्रमण आहार पर रखें ताकि अंततः भोजन सेवन की किसी भी लय को समाप्त किया जा सके (जैसा कि चित्र 3 बी में दिखाया गया है)। एआर आहार पर, सुनिश्चित करें कि चूहों को आठ डिब्बों में से प्रत्येक में उनके दैनिक भोजन सेवन का 1/8 तक पहुंच है, और इस प्रकार हर 3 घंटे में भोजन की पहुंच है। सुनिश्चित करें कि चूहे कैलोरी प्रतिबंधित नहीं हैं।
    4. चूहों को 2 सप्ताह या उससे अधिक समय तक एआर आहार पर बनाए रखें (चित्रा 3 बी)।
    5. एआर आहार के दौरान, यह सुनिश्चित करने के लिए हर दिन भोजन को समायोजित करें कि चूहे केवल कुछ छर्रों को पीछे छोड़ दें (आमतौर पर 5 से कम)। यह सुनिश्चित करता है कि चूहों को सही मात्रा में भोजन मिल रहा है और कैलोरी प्रतिबंधित नहीं है। भोजन के सेवन के किसी भी लय को प्रेरित न करने के लिए, सभी आठ डिब्बों में छर्रों को कम करके या जोड़कर या दो विपरीत डिब्बों में छर्रों को कम करके या जोड़कर समायोजन करें।
      नोट: एआर आहार के तहत खिलाए गए चूहे लगभग विशेष रूप से जेडटी 3 और जेडटी 9 (प्रकाश के बाद 3 घंटे और 9 घंटे के बीच) के बीच भोजन छोड़ देते हैं, फिर भी रात में भूखे होते हैं और अगले डिब्बे तक पहुंचने के लिए भोजन डिस्पेंसर को काटते हैं। फिर भी, एआर खिलाए गए चूहे कैलोरी प्रतिबंधित नहीं हैं, और वास्तव में समय के साथ एनआर खिलाए गए चूहों की तुलना में अधिक वजन प्राप्त करते हैं।
    6. आहार आहार के कारण वजन के किसी भी बदलाव की निगरानी के लिए 2 सप्ताह की अवधि के अंत में चूहों का वजन करें। इस अवधि के अंत में, आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें और उन्हें डिकैपिटेशन द्वारा इच्छामृत्यु करें। ऊतकों को इकट्ठा करें और भोजन प्रतिमान के कारण दैनिक परिवर्तनों के लिए उनका विश्लेषण करें।

Representative Results

ऊपर वर्णित फीडिंग सिस्टम का उपयोग चूहों में लयबद्ध भोजन सेवन के दीर्घकालिक हेरफेर के लिए किया जा सकता है। यह प्रणाली अनिवार्य रूप से हर 3 घंटे में माउस के लिए एक नए खाद्य डिब्बे को उजागर करती है जिससे शोधकर्ता को विशेष रूप से हर डिब्बे में भोजन में हेरफेर करने में मदद मिलती है। एक आवेदन 24 घंटे की अवधि में भोजन सेवन की प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करना था। डेटा से संकेत मिलता है कि डब्ल्यूटी चूहों को सामान्य चाउ एड लिबिटम खिलाया जाता है जो रात के दौरान अपने भोजन का लगभग 75% खाता है (चित्रा 2 ए)। इसके अलावा, दिन के दौरान खाया जाने वाला अधिकांश भोजन प्रकाश बंद होने से पहले 3 घंटे के भीतर होता है।

एचएफडी एड लिबिटम खिलाए गए चूहों ने एक्सपोजर के पहले 2 दिनों में अधिक भोजन खाया, संभवतः एचएफडी की नवीनता के कारण (चित्रा 2 ए)। 2 दिनों के बाद, एचएफडी का सेवन लयबद्ध रहा, फिर भी सामान्य चाउ एड लिबिटम खिलाए जाने की तुलना में कम आयाम के साथ। जबकि नर और मादा दोनों डब्ल्यूटी चूहों को एचएफडी खिलाया गया था, यह पाया गया कि मादा चूहों ने भोजन उपकरण के ढक्कन पर और पिंजरे में बड़ी मात्रा में भोजन जमा किया, जबकि पुरुषों ने कोई ध्यान देने योग्य जमाखोरी नहीं दिखाई। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, भोजन की जमाखोरी के परिणामस्वरूप भोजन की खपत की गलत गणना हो सकती है और डेटा गलत व्याख्या हो सकती है। इसके अलावा, मादा चूहों ने खाद्य कप के प्लास्टिक रिम में अधिक बार काटा, खासकर रात के डिब्बों में। नर चूहों ने एड लिबिटम सामान्य चाउ के 1 सप्ताह के बाद और एचएफडी के 1 सप्ताह के बाद महत्वपूर्ण वजन बढ़ाया (चित्रा 2 ई)। मादा चूहों के साथ एक समान प्रवृत्ति देखी गई थी, लेकिन महत्वपूर्ण पी-मूल्यों तक नहीं पहुंची, संभवतः पुरुषों की तुलना में उपयोग की जाने वाली महिलाओं की कम संख्या के कारण।

एनआर आहार में संक्रमण करने वाले चूहे केवल रात में अपने दैनिक कुल कैलोरी खाते हैं, पहले 3-5 हफ्तों के लिए कैलोरी सेवन में महत्वपूर्ण कमी के बिना (चित्रा 3 ए)। एनआर अनुसूची के लंबे समय तक संपर्क में रहने से एडी लिबिटम खिलाए गए चूहों की तुलना में दैनिक औसत कैलोरी सेवन 10% -15% कम हो जाता है, जैसा कि कहीं और वर्णितहै। एआर आहार में संक्रमण करने वाले चूहों ने दिन भर में समान मात्रा में अपनी दैनिक कुल कैलोरी का सेवन किया, जिससे भोजन सेवन की दैनिक लय में नाटकीय कमी आई (चित्रा 3 बी)। एनआर फीडिंग शेड्यूल के लिए, कैलोरी सेवन का दैनिक औसत एक्सपोजर के पहले 3-5 सप्ताह के लिए एआर फीडिंग शेड्यूल से प्रभावित नहीं होता है, लेकिन लंबे समय तक एक्सपोजर के साथ कम हो जाता है। चूहों ने एनआर (चित्रा 3 सी) और एआर शेड्यूल (चित्रा 3 सी) के बाद वजन बढ़ाया।

Figure 1
चित्र 1: फीडिंग उपकरण प्रणाली का डिजाइन और निर्माण। (ए) फीडिंग सिस्टम के लिए पीवीसी बेस के आयाम, और टाइमर को ठीक करने के लिए कहां छेद करने की आवश्यकता है, इसका विवरण। (बी) खाद्य कप के प्लेसमेंट के लिए तार को फिर से तैयार करने और स्क्रू के साथ ड्रिलिंग करने से पहले और बाद में 24 घंटे का टाइमर। (सी) 4 इंच पीवीसी पाइप के साथ इकट्ठे ग्रे बेस और टाइमर। (डी) बाहरी किनारों को ट्रिम करने के बाद आठ-कम्पार्टमेंट फूड कप। (ई) 4 इंच की टोपी के साथ कवर किए गए खाद्य कप के साथ पिंजरों का अंतिम सेटअप इस तरह से कि एक समय में केवल एक डिब्बे तक पहुंच योग्य हो। (एफ) एक प्रयोग के दौरान कई खाद्य कप का परिवहन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(ए) नर डब्ल्यूटी चूहों की फीडिंग प्रोफाइल को 7 दिनों के लिए सामान्य चाउ (एनसी) और अतिरिक्त 7 दिनों के लिए उच्च वसा वाले आहार (एचएफडी) के साथ एड लिबिटम खिलाया गया। रंगीन रेखाएं व्यक्तिगत माउस प्रोफाइल (एन = 7) का प्रतिनिधित्व करती हैं और काली रेखा सात चूहों के औसत ± एसईएम को इंगित करती है। (बी) स्लाइस करने से पहले और बाद में उच्च वसा वाला आहार। (C) हर 3 घंटे में भोजन सेवन का दैनिक औसत SEM (n = 7) ±। औसत की गणना एनसी या एचएफडी फीडिंग शेड्यूल के अंतिम 5 दिनों में की गई थी। (डी) एनसी या एचएफडी के साथ खिलाए गए चूहों के लिए दिन और रात के दौरान भोजन सेवन का औसत (बाएं) और प्रतिशत (दाएं)। मान एसईएम ± सात चूहों के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं और एनसी या एचएफडी फीडिंग शेड्यूल के पिछले 5 दिनों में भोजन सेवन डेटा का उपयोग करके गणना की गई थी। * पी < दो समूहों के बीच 0.05 (युग्मित टी-टेस्ट)। (ई) एनसी के 1 सप्ताह और एचएफडी के 1 सप्ताह के बाद प्रयोग में उपयोग किए गए चूहों के औसत शरीर का वजन। पुरुषों (बाएं) और महिलाओं (दाएं) के लिए डेटा को दो समूहों (युग्मित टी-टेस्ट) के बीच * पी < 0.05 के साथ दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: भोजन सेवन की दैनिक लय में हेरफेर। (A) नर WT चूहों की फीडिंग प्रोफाइल को 2 दिनों के लिए सामान्य चाउ एड लिबिटम के साथ खिलाया जाता है, 3 दिनों के लिए रात-प्रतिबंधित (NR) फीडिंग व्यवस्था में परिवर्तित किया जाता है, और 8 रातों के लिए NR फीडिंग के तहत बनाए रखा जाता है। रंगीन रेखाएं व्यक्तिगत माउस प्रोफाइल (एन = 18) का प्रतिनिधित्व करती हैं और काली रेखा 18 चूहों के औसत ± एसईएम को इंगित करती है। ग्रे तारांकन उस दिन उस माउस के लिए टाइमर की खराबी को इंगित करता है जहां टाइमर ने मुड़ना बंद कर दिया था। (बी) नर डब्ल्यूटी चूहों की फीडिंग प्रोफाइल को 2 दिनों के लिए सामान्य चाउ एड लिबिटम के साथ खिलाया गया, 1 दिन के लिए एक लयबद्ध (एआर) फीडिंग व्यवस्था में परिवर्तित किया गया, और 8 रातों के लिए एआर फीडिंग के तहत बनाए रखा गया। रंगीन रेखाएं व्यक्तिगत माउस प्रोफाइल (एन = 18) का प्रतिनिधित्व करती हैं और काली रेखा 18 चूहों के औसत ± एसईएम को इंगित करती है। (सी) एनआर और एआर आहार के संपर्क में आने के 2 सप्ताह के बाद प्रयोग में उपयोग किए गए चूहों के औसत शरीर के वजन। डेटा को दो समूहों (युग्मित टी-टेस्ट) के बीच * पी < 0.05 के साथ दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: मौजूदा फीडिंग सिस्टम के फायदे और नुकसान। भोजन सेवन के हेरफेर के लिए उपयोग की जाने वाली विभिन्न फीडिंग प्रणालियों को उजागर करने वाली एक तालिका, प्रत्येक प्रणाली के पेशेवरों और विपक्षों का संक्षिप्त विवरण के साथ। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: फीडिंग सिस्टम के निर्माण के लिए आवश्यक सामग्री की लागत। प्रति पिंजरे के निर्माण की लागत के अनुमान के साथ इस पेपर में वर्णित फीडिंग सिस्टम के निर्माण के लिए आवश्यक वस्तुओं की लागत को सूचीबद्ध करने वाली एक तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

पिछले कुछ दशकों में फीडिंग लय के हेरफेर और शरीर विज्ञान पर उनके प्रभाव पर व्यापक शोध किया गया है। यहां वर्णित फीडिंग सिस्टम के निर्माण और उपयोग का उपयोग भोजन सेवन में हेरफेर करने के लिए एक कुशल विधि के रूप में किया जा सकता है। प्रोटोकॉल सिस्टम के प्रमुख घटकों के रूप में एक सामान्य 24 घंटे टाइमर और आठ-कम्पार्टमेंट आयोजक के रूप में डिज़ाइन किए गए एक खाद्य कप का उपयोग करता है। पिंजरों का निर्माण कुछ आसानी से सुलभ उपकरणों का उपयोग करके आसानी से किया जा सकता है, और सिस्टम की हैंडलिंग उपयोगकर्ता के अनुकूल है। लयबद्ध भोजन सेवन में हेरफेर करने के लिए सिस्टम को अनुकूलित करने के लिए प्रोटोकॉल के कुछ प्रमुख पहलुओं में खाद्य कप का दैनिक परिवर्तन शामिल है क्योंकि टाइमर 24 घंटे की अवधि में बदल जाता है, शेष भोजन की मैन्युअल गिनती या वजन, और एआर फीडिंग के लिए छर्रों की संख्या का दैनिक समायोजन। आमतौर पर, प्लास्टिक शेविंग तब देखी जाती है जब चूहे भूखे होते हैं और उन्हें पर्याप्त भोजन नहीं मिलता है। इस समस्या को भोजन आहार का पालन करने वाले कुछ और खाद्य छर्रों को जोड़कर ठीक किया जा सकता है जब तक कि कोई प्लास्टिक शेविंग नहीं देखी जाती है। एआर फीडिंग के मामले में, जहां दैनिक भोजन को समायोजित करने की आवश्यकता होती है, भोजन के सेवन की लय को प्रेरित नहीं करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए (चित्रा 3 बी)। इसलिए, चूहों को अतालता से खिलाए रखने के लिए विपरीत डिब्बों में छर्रों को जोड़ना या घटाना बेहतर होता है।

चूहों को प्लास्टिक को काटने से रोकने के लिए एपॉक्सी की एक परत के साथ खाद्य कप को कोटिंग करके इस प्रणाली में और सुधार किया जा सकता है, और इस प्रकार खाद्य कप के जीवन को लंबा करने में मदद मिलती है। फूड कप प्लेसमेंट के लिए टाइमर की सतह को भी संशोधित किया जा सकता है ताकि फूड कप को टाइमर पर सपाट और स्थिर बैठने में मदद मिल सके। यह असमान रूप से रखे गए टाइमर के कारण टाइमर के आकस्मिक ठहराव को रोक सकता है। पिंजरे के कुछ घटक, जैसे कि खाद्य कप, लागत को कम करने के लिए 3 डी मुद्रित भी किए जा सकते हैं और शोधकर्ता की पसंद के अनुसार कस्टम-निर्मित किए जा सकते हैं। इसमें आठ से अधिक डिब्बों वाले खाद्य कप शामिल हो सकते हैं, जो वर्तमान 3 घंटे की विंडो की तुलना में बेहतर समय रिज़ॉल्यूशन दे सकते हैं।

यद्यपि बहुत कुशल, इस प्रणाली की कुछ सीमाएं हैं, जैसे कि श्रम गहन होना, शोधकर्ता को अभी भी हर 24 घंटे में खाद्य कप बदलने की आवश्यकता होती है और उन्हें शेष भोजन को मैन्युअल रूप से गिनने / तौलने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, संभावित मुद्दों की पहचान करने के लिए टाइमर की समय-समय पर निगरानी की जानी चाहिए और / या यदि उन्होंने काम करना बंद कर दिया है। यह खिलाने के बाद शेष खाद्य छर्रों की गिनती करते समय प्राप्त किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, यह निर्धारित करके कि क्या कुछ चूहों ने केवल कुछ डिब्बों में भोजन खाया और कुछ डिब्बों को अछूता छोड़ दिया)। इस प्रणाली की एक और सीमा यह है कि यह मादा चूहों के साथ भी काम नहीं कर सकता है, क्योंकि मादाओं के साथ किए गए कुछ प्रयोगों से पता चला है कि वे भोजन जमा करते हैं और पुरुष चूहों की तुलना में प्लास्टिक को अधिक चबाते हैं।

फिर भी, यह फीडिंग सिस्टम भोजन सेवन में हेरफेर करने में बहुत प्रभावी है, बाजार में मौजूद महंगे स्वचालित फीडरों की तुलना में निर्माण, संचालन, रखरखाव और सस्ती है। इसे शोधकर्ता की आवश्यकताओं के अनुरूप आसानी से अनुकूलित और संशोधित किया जा सकता है और सिस्टम को संचालित करने के लिए किसी विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है। महत्वपूर्ण रूप से, टाइमर केवल निरंतर सफेद शोर की कम मात्रा का उत्पादन करते हैं, जो चूहों को भोजन की उपलब्धता के साथ किसी भी ध्वनि को जोड़ने से रोकता है।

सारांश में, यह पेपर एक अभिनव भोजन प्रणाली का वर्णन करता है जिसका उपयोग चूहों में दैनिक भोजन की खपत की निगरानी के लिए किया जा सकता है और चूहों को विभिन्न प्रतिमानों जैसे समय-प्रतिबंधित भोजन, लयबद्ध भोजन और उच्च वसा वाले आहार पर खिलाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह प्रणाली उन उपकरणों की सूची में जोड़ती है जिनका उपयोग लयबद्ध भोजन के सेवन और शरीर विज्ञान पर इसके प्रभाव के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

सभी लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच /एनआईडीडीके (जेएसएम को) और टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय से स्टार्टअप फंड से अनुदान आर 01 डीके 128133 द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#6 x 0.75 inch Phillips Pan Head Stainless Steel Sheet Metal Screw (50-Pack) Everbilt #800172
#8 x 1.5 inch Phillips Pan Head Zinc Plated Sheet Metal Screw (100-Pack) Everbilt  #801622
0.25 inch gray PVC sheet (24 inch x 48 inch) USPlastic #45088
4 inch PVC pipe (10 ft) Home Depot #531103
45 mg dustless precision pellets Bio-Serv #F0165
6 ft. Extension Cord HDX HD#145-017
Food container (eight-compartment jewelry organizer)  JewelrySupply #PB8301
Indoor Basic Timer General Electric #15119
Oatey 4 inch ABS Pipe Test Cap with Knockout Home Depot #39103D
Rodent Diet with 45 kcal% fat (with red dye) Research Diets #D12451

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जीव विज्ञान अंक 190
कस्टम-मेड फीडिंग सिस्टम का उपयोग करके चूहों में लयबद्ध भोजन सेवन का हेरफेर
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Sahasrabudhe, A., Guy, C. R.,… More

Sahasrabudhe, A., Guy, C. R., Greenwell, B. J., Menet, J. S. Manipulation of Rhythmic Food Intake in Mice Using a Custom-Made Feeding System. J. Vis. Exp. (190), e64624, doi:10.3791/64624 (2022).

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