Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الكشف عن الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) وقياسه في البلازما البشرية باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم المعدل

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/64775
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 4, 5, 1, 6, 1,3, 1
1Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Department of Oncology, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Michigan Medical School, 5Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, The Ohio State University College of Medicine, 6ICTR Clinical Research Core Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

البيانات المنشورة المتعلقة بتركيزات الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) في البلازما البشرية غير متسقة. قد تكون هذه التناقضات بسبب عدم وجود منهجية موحدة ومعتمدة لتحديد كمية هذا الببتيد العصبي. هنا ، نصف بروتوكول مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لتنقية وقياس CGRP في البلازما البشرية.

Abstract

الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) هو ببتيد عصبي نشط في الأوعية يلعب دورا مفترضا في الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي وقد يكون مرشحا لحالة العلامات الحيوية. يتم إطلاق CGRP من الألياف العصبية عند التنشيط ويحفز التهابا عصبيا معقما وتوسع الأوعية الشريانية في الأوعية الدموية التي تتلقى التعصيب الصادر ثلاثي التوائم. حفز وجود CGRP في الأوعية الدموية الطرفية التحقيقات للكشف عن هذا الببتيد العصبي وتحديده في البلازما البشرية باستخدام المقايسات البروتينية ، مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). ومع ذلك ، فإن عمر النصف البالغ 6.9 دقيقة والتباين في التفاصيل الفنية لبروتوكولات الفحص ، والتي غالبا ما لا يتم وصفها بالكامل ، قد أسفرت عن بيانات CGRP ELISA غير متسقة في الأدبيات. هنا ، يتم تقديم بروتوكول ELISA معدل لتنقية وقياس CGRP في البلازما البشرية. تتضمن الخطوات الإجرائية جمع العينات وإعدادها ، والاستخراج باستخدام مادة ماصة قطبية كوسيلة للتنقية ، وخطوات إضافية لمنع الربط غير المحدد ، والقياس الكمي عبر ELISA. علاوة على ذلك ، تم التحقق من صحة البروتوكول من خلال سبايك واستعادة وخطية لتجارب التخفيف. يمكن نظريا استخدام هذا البروتوكول الذي تم التحقق من صحته لتحديد تركيزات CGRP في بلازما الأفراد ليس فقط المصابين بالصداع النصفي ، ولكن أيضا مع الأمراض الأخرى التي قد يلعب فيها CGRP دورا.

Introduction

الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) هو ببتيد عصبي مكون من 37 حمضا أمينيا موجودا في الألياف العصبية مع توطين حول الأوعية الدموية وكذلك الأنسجة غير العصبية. يشترك شكلان من CGRP ، α- و β-CGRP ، في أكثر من 90٪ من التماثل ويتشاركان الوظائف الفسيولوجية. ومع ذلك ، تم العثور على αCGRP في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي ، بينما تم العثور على βCGRP في الجهاز العصبي المعوي 1,2. عند تنشيط مستقبلات الألم والإخراج الخلوي المعتمد على الكالسيوم ، يتم إطلاق CGRP من الخلايا العصبية ، مما يؤدي إلى التهاب عصبي معقم يتضمن توسع الأوعية الشريانية وتسرب بروتين البلازما3،4،5،6،7. من هنا ، يظهر CGRP في الأوعية بعد الشعيرات الدموية وقد يكون علامة حيوية للأمراض التي تسبب تنشيط مسبب للألم ، مثل الصداع النصفي8،9،10،11. وتجدر الإشارة إلى أن CGRP متورط أيضا في COVID-19 من خلال دوره في تكوين الأوعية الدموية والتعديل المناعي ، وقد يتنبأ بتطور المرض غير المواتي12,13. وبالتالي ، فإن بروتوكول القياس الكمي الدقيق ل CGRP في البلازما البشرية يمكن أن يكون له قيمة واسعة.

ربما تم إيلاء أكبر قدر من الاهتمام لدور CGRP في الصداع النصفي. استنادا إلى الدراسات قبل السريرية والسريرية ، تم طرح CGRP كمؤشر حيوي محتمل للصداع النصفي وكهدف للعلاج3،4،5،6،7،8،9،10. وجدت بعض الدراسات ارتفاعا في CGRP في الأفواج المصابة بالصداع النصفي العرضي بالنسبة للمشاركين فيالمجموعة 10،14،15. يبدو أن نجاح مثبطات CGRP في التجارب السريرية لعلاج الصداع النصفي ينطوي على ارتفاع CGRP كعامل مسبب للصداع النصفي. ومع ذلك ، لم يؤكد جميع المحققين هذه النتائج16،17،18،19. علاوة على ذلك ، لم يتم بعد توضيح دور CGRP في أعراض الصداع النصفي غير الصداع. كان الدافع وراء العمل الحالي هو الرغبة في فهم دور CGRP في الأعراض الدهليزية للصداع النصفي.

قد تكون بيانات المقايسة المناعية CGRP غير المتسقة في الأدبيات ناتجة عن عدة أسباب. أولا ، عمر النصف ل CGRP في الأوعية الدموية المحيطية هو 6.9 دقيقة 20 ، بسبب نشاط بروتياز سيرين 21 ، والإنزيمات المهينة للأنسولين وغيرها من الميتالوبروتياز 22 ، والإندوببتيداز المحايد 23 ، والإنزيم المحول للإندوثيلين -1 24. ثانيا ، لم يتم وصف التفاصيل الفنية المتغيرة للمقايسات المناعية المستخدمة لتحديد CGRP بشكل كامل في مثل هذه الدراسات. أخيرا ، يؤدي عدم توحيد منهجية المقايسة المناعية إلى تعقيد الصورة أكثر.

توضح هذه المقالة بروتوكول مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم المعدل (ELISA) الذي يسمح بالتنقية والقياس الكمي الدقيق ل α و βCGRP في البلازما البشرية. لا تتفاعل الأجسام المضادة للمجموعة مع الأميلين أو الكالسيتونين أو المادة P. خضع هذا البروتوكول لتجارب التحقق اللازمة ، مثل الارتفاع والاسترداد وخطية التخفيف ، والتي يتم تقديم البيانات الخاصة بها هنا. لم يتم وصف بروتوكول CGRP ELISA هذا الذي خضع للتحقق من الصحة بشكل كامل في الأدبيات. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد CGRP في البلازما البشرية في سياق الصداع النصفي وكذلك أمراض القلب 2,25 ، الأمراض الجلدية 26 ، التوليد 27 ، الروماتيزم28,29 ، الجهاز العضلي الهيكلي 30,31 ، الغدد الصماء 32,33 ، والأمراض الفيروسية 12,13 التي تورط فيها CGRP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام عينات البلازما البشرية من الأفراد المعتمدين بموافقة من مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة جونز هوبكنز (NA_00092491).

1. جمع العينات وإعدادها

  1. اجمع 5 مل من الدم الكامل من الوريد قبل التكعيبي عبر طرق بزل الوريد القياسية34 في أنبوب جمع 6 مل من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA).
  2. أضف 0.5 مل من مثبط الأنزيم البروتيني التنافسي للبروتين (10000 وحدة KIU / مل) إلى الأنبوب بعد الجمع لمنع تحلل الببتيد المستهدف. اقلب الأنبوب 10 مرات للسماح للأبروتينين بالاختلاط بشكل كاف مع الدم. بعد ذلك ، قم بتخزين الأنابيب على الثلج حتى الخطوة التالية.
  3. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 604 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية في غضون 60 دقيقة من جمع الدم.
  4. خلع جزء البلازما مع ماصة ونقل إلى 2 مل cryovials معقمة مستديرة القاع.
  5. قم بتخزين cryovials على الفور في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.

2. استخراج عينات البلازما

  1. ضع خرطوشة استخراج داخل أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل مع الحواف الخارجية للخرطوشة مدعومة بالحواف الخارجية للأنبوب.
  2. قم بتنشيط الخرطوشة عن طريق تمرير 5 مل من الميثانول بنسبة 100٪ أولا ثم 10 مل من الماء عالي النقاء عبر الخرطوشة.
    1. عندما يتم تمرير السائل عبر الخرطوشة عبر التدفق المدفوع بالجاذبية ، فإنه سيتجمع في الأنبوب.
    2. تخلص من السوائل الزائدة أثناء تراكمها للتأكد من أن السائل لا يبتلع الخرطوشة.
    3. تأكد من أن الخرطوشة لا تجف أثناء التجربة.
  3. تمييع 250 ميكرولتر من البلازما مع 750 ميكرولتر من حمض الخليك 4 ٪.
  4. مرر 1 مل من محلول البلازما وحمض الخليك ببطء عبر الخرطوشة.
    ملاحظة: يجب أن تستغرق هذه الخطوة حوالي 30 ثانية عبر التدفق المدفوع بالجاذبية لكل ملليلتر يتم تمريره.
  5. اغسل الخرطوشة ب 10 مل من حمض الخليك 4٪. كما حدث سابقا ، تخلص من السائل الزائد أثناء تراكمه للتأكد من أن السائل لا يبتلع الخرطوشة.
  6. بعد إطلاق آخر قطرة من حمض الأسيتيك من الخرطوشة ، أخرج الخرطوشة من الأنبوب وضعها في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 15 مل.
  7. تحضير محلول 10: 1 من الميثانول 100٪ وحمض الأسيتيك 4٪ عن طريق خلط 2.7 مل من حمض الأسيتيك 4٪ و 0.3 مل من الميثانول 100٪. استخدم هذا لإزالة CGRP عن طريق تمرير هذا الحل من خلال خرطوشة 1 مل في المرة الواحدة. توقف لمدة 25 دقيقة بين كل ملليلتر من المحلول الذي تم تمريره. لا تتخلص من الخفيف.
  8. سيحتوي الأنبوب على 3 mL من السائل المستخلص بعد 25 دقيقة من مرور آخر ملليلتر من محلول الميثانول وحمض الأسيتيك. ضع كل 1 مل من المحلول في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل.
    ملاحظة: يجب أن ينتج عن ذلك ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة من كل خرطوشة.
  9. ضع كل أنبوب في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 1 ثانية للتأكد من أن كل المحلول في أسفل كل أنبوب.
  10. قم بتجفيف جميع العينات عن طريق الطرد المركزي الفراغي عند 4 درجات مئوية (مضبوطة على وظيفة المكثف ، للمحاليل المائية ، عند 1400 دورة في الدقيقة ؛ تختلف قوة الجاذبية اعتمادا على موضع الأنابيب وبالتالي تتراوح من 130-250 × جم).
    ملاحظة: يعتمد الوقت المستغرق لجهاز الطرد المركزي الفراغي لتجفيف العينات على نوع أنبوب الطرد المركزي الدقيق المستخدم.
  11. مباشرة قبل الشروع في إجراء الفحص (الخطوة 4.1) ، أعد تكوين العينة المجففة مسبقا باستخدام محلول المقايسة المناعية للإنزيم (EIA) (انظر جدول المواد) المذاب إلى درجة حرارة الغرفة (RT) أو 20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم المخزن المؤقت EIA المستخدم لإعادة تكوين العينة المجففة مساويا لحجم العينة الأصلي ، أو 250 ميكرولتر.

3. تحضير لوحة ELISA - الحجب للحد من الارتباط غير المحدد

  1. أضف 250 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن (TBS) / حاجز مانع جيلاتين السمك إلى كل بئر على اللوحة.
  2. ضع ورقة غطاء فوق اللوحة واحتضانها لمدة 2 ساعة في RT.
  3. قم بإزالة ورقة الغطاء وأفرغ اللوحة عن طريق الانقلاب أو الشفط باستخدام ماصة متعددة القنوات. ثم ، لطخة لوحة على منشفة ورقية للتخلص من أي أثر للسائل.
  4. جفف اللوحة عن طريق ترك اللوحة في غطاء تدفق رقائقي لمدة 10 دقائق.
  5. بعد أن يجف الطبق بشكل واضح ، ضعه في كيس رقائق محكم الغلق مع كيس مجفف من هلام السيليكا وقم بتخزين الكيس عند -20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: يجب استخدام الألواح في غضون 4 أسابيع من حضانة اللوحة.

4. قبل إجراء الفحص

  1. قم بإعداد الكواشف (المخزن المؤقت لتقييم الأثر البيئي ، معيار CGRP ، مراقبة جودة CGRP ، متتبع CGRP ، المخزن المؤقت للغسيل) وفقا لتعليمات المجموعة. قم بإعداد كاشف Ellman فقط بعد انتهاء فترة الحضانة 16-20 ساعة.
  2. قم بإذابة جميع العينات والكواشف إلى RT قبل إجراء بقية البروتوكول.

5. إجراء الفحص

  1. اشطف كل بئر في اللوحة المسدودة خمس مرات باستخدام مخزن مؤقت للغسيل (300 ميكرولتر / بئر). لكل شطف ، توقف مؤقتا لمدة 30 ثانية بعد وضع المخزن المؤقت للغسيل في الآبار ، ثم تخلص من السائل أو نضح باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  2. بعد الشطف النهائي ، قم بإزالة كل المخزن المؤقت من الآبار عن طريق الانقلاب (قلب اللوحة لطرد السائل داخل الآبار) أو الشفط باستخدام ماصة متعددة القنوات. امسح آخر قطرات على منشفة ورقية واضغط على اللوحة المقلوبة حتى تتم إزالة كل السائل بشكل واضح من الآبار.
  3. خصص بئرين على الأقل بدون كواشف أو مخزن مؤقت ليعرف باسم الآبار "الفارغة". بعد ذلك ، خصص بئرين آخرين على الأقل للربط غير المحدد (NSB).
  4. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت EIA في كل بئر NSB.
  5. الاستغناء عن 100 ميكرولتر من معايير CGRP في نسختين في الآبار المناسبة.
  6. توزيع 100 ميكرولتر من العينات (المعاد تشكيلها في مخزن EIA العازل) ومراقبة الجودة في نسختين في الآبار المناسبة.
  7. الاستغناء عن 100 ميكرولتر من مقتفي CGRP (الجسم المضاد ل CGRP المرتبط بأستيل كولينستراز) لكل بئر يحتوي على معايير NSB و CGRP والعينات ومراقبة الجودة. لا تستغني عن التتبع إلى الآبار "الفارغة".
  8. قم بتغطية اللوحة باستخدام ورقة غطاء شفافة ، وختم كل بئر بحيث لا تتبخر العينات والكواشف في كل بئر بشكل كبير. احتضان اللوحة لمدة 16-20 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  9. بعد اكتمال الحضانة ، أعد تكوين كاشف Ellman وفقا لتعليمات المجموعة.
  10. اقلب اللوحة لإزالة كل السائل. شطف كل بئر (كما هو موضح أعلاه) ثلاث مرات مع 300 ميكرولتر من العازلة للغسيل.
  11. بعد الشطف الثالث ، قم بإزالة السائل من الألواح ، ضع اللوحة على لوحة شاكر ، ورجها عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
  12. اغسل الطبق ثلاث مرات إضافية. بعد الشطف النهائي ، قم بإزالة كل المخزن المؤقت من الآبار عن طريق الانقلاب أو الشفط باستخدام ماصة متعددة القنوات. امسح آخر قطرات من السائل على منشفة ورقية واضغط على اللوحة المقلوبة حتى تتم إزالة كل السائل بشكل واضح من الآبار.
    ملاحظة: قد لا تكون الغسلات الثلاث الإضافية الموضحة في هذه الخطوة ضرورية في حالة استخدام غسالة ELISA الدقيقة.
  13. توزيع 200 ميكرولتر من كاشف Ellman في كل بئر (لا يشمل الآبار "الفارغة").
  14. قم بتغطية اللوحة بورقة غلاف جديدة ولفها بورق الألمنيوم لمنع أي تعرض للضوء. احتضان في الظلام في RT لمدة 1 ساعة.
  15. تأكد من عدم وجود سائل على الجانب الخلفي من اللوحة قد يربك قراءة مقياس الطيف الضوئي عن طريق مسح المؤخر بمنشفة ورقية جافة.
  16. اقرأ اللوحة للامتصاص عند 405 نانومتر (اللون الأصفر).

6. تحليل البيانات

  1. احسب متوسط الامتصاص لكل "فارغ" ، NSB ، قياسي ، مراقبة الجودة ، والعينات.
  2. اطرح قيم امتصاص NSB المتوسطة من القيم القياسية ومراقبة الجودة وقيم امتصاص العينة.
  3. امتصاص المؤامرة على المحور ص والتركيز على المحور السيني. إنشاء منحنى قياسي باستخدام نموذج الانحدار اللوجستي رباعي المعلمات.
  4. بمجرد إنشاء المنحنى ، استخدم معادلة المنحنى لتحديد التركيزات المقحمة لمراقبة الجودة والعينات ، والتي يمكن قراءتها على المحور السيني.
    ملاحظة: يتم التحقق من صحة المنحنى القياسي فقط إذا كان التركيز المحسوب المحرف لمراقبة الجودة في حدود 25٪ من التركيز المتوقع (عادة 125 بيكوغرام / مل ، ولكن انظر ملصق قارورة مراقبة الجودة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هناك العديد من الخطوات الرئيسية في البروتوكول التي يجب تسليط الضوء عليها. أولا ، يجب إضافة الأبروتينين ، وهو مثبط لأنزيم البروتياز سيرين ، إلى عينات الدم الكاملة فور جمعها لمنع المزيد من التدهور الأنزيمي ل CGRP. وقد تبين أن بروتياز سيرين يلعب دورا في استقلاب CGRP ، وقد استخدمت دراسة سابقة أيضا الأبروتينين في قياس CGRP في البشر21,35. إذا لم يتم استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني ، واستغرق تحضير العينة أكثر من 60 دقيقة ، فيمكن للمرء أن يتوقع انخفاض مستويات CGRP عند إجراء ELISA. ثانيا ، استخراج الطور الصلب قبل ELISA يركز CGRP في eluent ويزيل الجزيئات التي يحتمل أن تتداخل من مصفوفة البلازما. تزيد خطوة الاستخراج هذه من إنتاجية CGRP في تجارب السنبلة والاسترداد (تمت مناقشتها بمزيد من التفصيل في القسم التالي). الطرد المركزي الفراغي في غرفة باردة بعد الاستخراج يحد من فقدان CGRP. ثالثا ، قبل ELISA ، يجب حظر ألواح العيار الدقيق باستخدام مخزن مؤقت للحظر. هذا يسمح بالامتزاز السلبي للبروتينات غير المحددة في المخزن المؤقت إلى مواقع الربط المتبقية في الألواح ، وبالتالي تقليل إشارة الخلفية. يساعد الحظر على تقليل الغلة العالية بشكل غير واقعي من CGRP.

تحدد تجارب الارتفاع والاسترداد ما إذا كان اكتشاف CGRP يتأثر بالاختلافات بين مخفف المنحنى القياسي (هنا ، المخزن المؤقت لتقييم الأثر البيئي) ومصفوفة العينة التجريبية (هنا ، البلازما). قد تحتوي البلازما و / أو المصل على جزيئات تمنع ارتباط الأجسام المضادة ب CGRP أو تحلل الببتيد ، وبالتالي تتداخل مع قدرة الفحص على اكتشاف وتحديد تركيز بدء CGRP بدقة. تحقيقا لهذه الغاية ، أضفنا كميات معروفة من CGRP إلى عينات البلازما - خطوة "الارتفاع" - وحسبنا مقدار CGRP الذي تم "استرداده" بعد الاستخراج و ELISA. تم الحصول على مخزون CGRP من الشركة المصنعة وتخزينه في فريزر -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

في اختبار خطي التخفيف ، يتم تخفيف العينة بشكل متسلسل ، ويتم حساب تركيزات CGRP لكل تخفيف. إذا لم تظهر العينات المخففة انخفاضات خطية مناسبة في تركيز CGRP ، فهذا يشير إلى أن المخزن المؤقت أو البلازما EIA يتداخل مع اكتشاف CGRP في بعض التركيزات أو أن المنحنى القياسي غير دقيق في النطاق المتأثر. عند إجراء تجربة الارتفاع والاسترداد الموصوفة أعلاه ، قمنا بتخفيف العينات "المسننة" بشكل متسلسل. قمنا برفع عينة بلازما لإعطاء تركيز CGRP قدره 200 بيكوغرام / مل ثم خففنا العينة إلى 100 بيكوغرام / مل ثم 50 بيكوغرام / مل.

تم رفع عينات البلازما من ثلاثة مشاركين ليس لديهم تاريخ من الصداع القلبي الوعائي أو التنفسي أو الصداع الحديث أو الأعراض العصبية بتركيزات مختلفة من CGRP. تم تشغيل البروتوكول لهذه العينات ، بالإضافة إلى عينات التحكم غير المسننة. يوضح الشكل 1 مثالا لخريطة لوحة للارتفاع والاسترداد والخطية لتجارب التخفيف. تم إجراء ملاءمة لوجستية رباعية المعلمات لإنشاء منحنى قياسي يسمح بالملاءمة خارج النطاق الخطي (الجدول 1 والشكل 2). تم حساب معدلات الاسترداد لكل عينة مسننة وكانت ضمن النطاق المقبول (الجدول 2). تم توضيح خطية التخفيف في العينات المسننة (الشكل 3). يوضح الجدول 3 النتائج التي تم الحصول عليها من تجربة ارتفاع واستعادة غير ناجحة أجريت باتباع تعليمات الشركة المصنعة وقبل إدراج الخطوات المضافة لمنع الربط غير المحدد. تظهر هذه البيانات معدلات استرداد تتجاوز الحد الأعلى البالغ 125٪ ، مما يشير إلى وجود ربط غير محدد. بعد إضافة الخطوات الواردة في البروتوكول لحظر اللوحة باستخدام مخزن مؤقت مانع (الخطوات 3.1-3.5) ، تمكنا من تقليل هذا التأثير وتحقيق قيم استرداد مقبولة (الجدول 2). في ثلاثة مرضى بدون أعراض الصداع النصفي أو الدهليزي ، وجدنا أن متوسط تركيز CGRP في البلازما كان 1.68 ± 0.13 بيكوغرام / مل. يجب أن تهدف التجارب المستقبلية إلى استخدام المنهجية الحالية على نطاق أوسع من مرضى التحكم.

Figure 1
الشكل 1: مثال على خريطة اللوحة. يجب أن تحتوي كل لوحة على معايير وعينات وفراغات وآبار NSB ، وكلها في نسختين أو ثلاث نسخ. يجب ألا تحتوي الآبار الفارغة على سائل ، ويجب أن تحتوي آبار NSB على محلول مقايسة مناعية إنزيمي خاص ، وجسم مضاد ثانوي مرتبط بالإنزيم ، وكاشف Ellman. يجب طرح متوسط قيم الامتصاص لآبار NSB من قيم الامتصاص للمعيار قبل إنشاء المنحنى القياسي. يجب أيضا طرح متوسط قيم الامتصاص لآبار NSB من قيم امتصاص العينات ، قبل حساب النسبة المئوية للاسترداد. لا يوجد أي تأثير لموقف لوحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مثال على منحنى قياسي للانحدار اللوجستي رباعي المعلمات (4PL). يتم وصف هذا المنحنى القياسي رياضيا بواسطة معادلة في شكل مشابه لتلك الموضحة في الجدول 1. منحنى الانحدار 4PL أكثر ملاءمة للأنظمة البيولوجية مقارنة بالمنحنيات الخطية. يتم استخدام هذا المنحنى والمعادلة لاستيفاء ضوابط الجودة والعينات على نفس اللوحة التي تم إنشاء المعيار عليها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: خطي مخطط خطي للتخفيف يظهر عينات ارتفعت عند 200 بيكوغرام / مل ، ثم مخففة بشكل متسلسل 1: 2 و 1: 4. توضح هذه البيانات الخطية على نطاق واسع من التخفيفات ، مما يشير إلى أن طريقة الفحص دقيقة عبر مجموعة واسعة من تركيزات CGRP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البارامتر قيمة
س50 294.75
معادلة Equation 1
شكل المعادلة Equation 2

الجدول 1: مثال على معادلة منحنى الانحدار القياسي اللوجستي رباعي المعلمات (4PL) مع التتر X50. يستوعب منحنى الانحدار 4PL التعقيد الذي يظهر في الأنظمة البيولوجية. تم استخدام هذا المنحنى لتحليل نتائج ELISA ، لأنه أكثر ملاءمة من الانحدار الخطي.

الامتصاص (OD) تركيز محرف (بيكوغرام / مل) العائد في المئة
تحكم غير مسنن -0.0434 لا يقع على المنحنى (أي ~ 0)
ارتفعت عند 200 بيكوغرام / مل 0.2712 214.7 ± 23.4 107.40%
ارتفعت عند 100 بيكوغرام / مل 0.0966 102.7 ± 2.35 102.70%
ارتفعت عند 50 بيكوغرام / مل 0.0205 55.1 ± 12.65 110.20%

الجدول 2: نتائج تجربة ناجحة للارتفاع والاسترداد لثلاثة مشاركين في المجموعة الضابطة بسبب نقص استخراج الطور الصلب وحجب الألواح. انخفضت النسبة المئوية للعائد للعينات المسننة في حدود 20٪ من العائد المثالي بنسبة 100٪ ، مما يشير إلى أن اكتشاف CGRP لا يتأثر بمصفوفة العينة التجريبية للبلازما.

الامتصاص (OD) تركيز محرف (بيكوغرام / مل) العائد في المئة
تحكم غير مسنن -0.2087 لا يقع على المنحنى (أي ~ 0)
ارتفعت عند 200 بيكوغرام / مل 2.371 264.2 ± 104 132.10%
ارتفعت عند 100 بيكوغرام / مل 1.134 167.5 ± 31.2 167.50%
ارتفعت عند 50 بيكوغرام / مل 0.3218 80.55 ± 4.54 161.10%

الجدول 3: نتائج تجربة ارتفاع واستعادة غير ناجحة لثلاثة مشاركين ضابطين بسبب نقص انسداد اللوحة. انخفضت النسبة المئوية للعائد للعينات المسننة أعلى بكثير من الحد الأعلى البالغ 120٪ ، مما يشير إلى أن الفحص قد يكون تالفا بواسطة NSB. بعد الحصول على هذه النتائج ، أضفنا الخطوات 3.1-3.5 في البروتوكول لحظر NSB على اللوحة قبل الفحص.

الامتصاص (OD) تركيز محرف (بيكوغرام / مل) العائد في المئة
تحكم غير مسنن 0.0401 12.93
ارتفعت عند 100 بيكوغرام / مل 0.0315 10.17±2.31 10.17%
ارتفعت عند 50 بيكوغرام / مل 0.0152 4.895±15.4 9.79%
ارتفعت عند 25 بيكوغرام / مل 0.0007 0.2177±6.43 0.87%

الجدول 4: نتائج تجربة ارتفاع واستعادة غير ناجحة لثلاثة مشاركين ضابطين. انخفضت النسبة المئوية للعائد للعينات المسننة إلى ما دون الحد الأدنى البالغ 80٪ ، مما يشير إلى أن هناك حاجة إلى مزيد من التحسين لمعالجة التدهور المحتمل وعمليات الربط التنافسية. هذه النتائج مأخوذة من اختبار ELISA التنافسي لمصنع آخر ، مع حد أدنى للكشف يبلغ 2.23 بيكوغرام / مل ، والسيرة الذاتية داخل الفحص < 10٪ والسيرة الذاتية بين المقايسة < 12٪.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توضح هذه المقالة بروتوكولا تم التحقق من صحته يسمح بالكشف عن CGRP وقياسه كميا في البلازما البشرية. تم تصنيع هذا البروتوكول بعد العثور على مجموعات CGRP ELISA التجارية لعدم تحديد هذا الجزيء بدقة. بعد إنشاء بروتوكول تحضير العينة ومنحنى قياسي صالح ، أظهرت تجارب الارتفاع والاسترداد والخطية للتخفيف أن النسبة المئوية للتعافي كانت أقل بكثير من المتوقع. تم العثور على نتائج مماثلة باستخدام مجموعة CGRP ELISA تجارية مختلفة (الجدول 4). كمرجع ، فإن الاسترداد القياسي المقبول على نطاق واسع هو 80-120٪ 36. قد تشير هذه النتائج إلى وجود نشاط الأنزيم البروتيني الذي يؤدي إلى تدهور CGRP21،22،23،24 ، والجزيئات الأخرى المرتبطة ب CGRP ، مما يحد من توافرها للارتباط بالأجسام المضادة للوحة ، أو الارتباط التنافسي للبروتينات غير المستهدفة بالأجسام المضادة للوحة.

للتحكم في هذه المربكات المحتملة ، تم تحسين بروتوكول الاستخراج لتنقية البلازما من خلال الاستخراج باستخدام مادة ماصة خاصة قبل ELISA. هذه المادة الماصة تعزل ظاهريا الجزيئات القطبية مثل CGRP. لتحديد فعالية الاستخراج قبل ELISA ، ارتفعت عينات البلازما البشرية بتركيزات معروفة من CGRP حيث خضعت الضوابط الإيجابية للاستخراج ثم ELISA. أسفرت هذه العينات المسننة فقط ~ 50٪ -60٪ استرداد. أشارت هذه النتائج إلى أن CGRP المضاف خارجيا لم يتم اكتشافه في البلازما ، كما يتوقع المرء.

تم تحسين العديد من الخطوات الأخرى للبروتوكول: إضافة مثبط الأنزيم البروتيني سيرين إلى عينات الدم الكاملة قبل الطرد المركزي لمنع التحلل21 ، وخفض درجة حرارة الطرد المركزي الفراغي بعد الاستخراج ، وتعديل طرق إعادة التعليق بعد الطرد المركزي. كشفت تجربة الارتفاع والاسترداد بعد هذه التغييرات عن تركيزات عالية بشكل غير واقعي من CGRP ، وهو استرداد أكبر من 120٪ (الجدول 3). ومما يبعث على الاطمئنان أنه تم الإبلاغ مؤخرا عن قيم أعلى من المتوقع بعد الاستخراج باستخدام مقايسة مماثلة من قبل Messlinger et al.37 ، مما يشير إلى أن هذا لا يزال يمثل مشكلة. يعترف Messlinger et al. بأن الفحص بعد استخراج البلازما لا يعيد إنتاج تركيزات CGRP واقعية ، دون تقديم سبب لهذه الظاهرة37.

افترضنا أن قدرة الربط المتبقية على ألواح المعايرة الدقيقة ELISA التي تسبب ارتباطا غير محدد قد تكون مسؤولة عن ارتفاع معدلات الاسترداد. قبل ELISA ، تم تحضين اللوحة بمخزن مؤقت مانع ، TBS / مخزن جيلاتين للأسماك ، لتقليل قدرة الربط هذه. وأسفرت هذه الخطوة الإضافية عن معدلات استرداد أكثر ملاءمة (الجدول 2). وبالتالي ، تظل التعديلات والتحسينات التي تمت مناقشتها أعلاه ، بما في ذلك استخدام المخزن المؤقت للحظر ، خطوات حاسمة في البروتوكول. سمحت هذه الخطوات بحد أدنى للكشف يبلغ 1.05 بيكوغرام / مل ، مقارنة بمجموعة أدوات الشركة المصنعة الأصلية المدرجة على أنها 2 بيكوغرام / مل.

فيما يتعلق باستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، تدعو الخطوة 2.10 إلى الطرد المركزي الفراغي لتجفيف المخفف. وقد لوحظ أن طول هذه الخطوة يختلف اعتمادا على نوع أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي توجد فيه العينات. باستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الموضحة في جدول المواد ، تستغرق هذه الخطوة عادة 5 ساعات. ومع ذلك ، عند استخدام أنابيب طرد مركزي دقيقة بديلة ذات أحجام أكبر ، يمكن أن تستمر هذه الخطوة حتى 11 ساعة. قد يكون البديل للطرد المركزي الفراغي هو التجفيد أو تجفيف العينات بالتجميد ، الأمر الذي يتطلب تجميد العينات بعد الاستخراج. ومع ذلك ، لم يتم اختبار التجفيد في بناء هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم العثور على تركيزات أقل بشكل منهجي من المتوقع من CGRP ، يجب على المرء التأكد من إذابة جميع الكواشف ، وخاصة الأجسام المضادة ، في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. يمكن أن يساهم عدم استقرار الكواشف ، مثل محاليل الأجسام المضادة والتتبع ، في حدوث خطأ منهجي في ربط CGRP. إذا استمر العائد غير كاف ، فقد يتأثر ارتباط الأجسام المضادة ب CGRP بالحموضة النسبية للمحلول (محلول الميثانول وحمض الخليك) ، على الرغم من إعادة التكوين باستخدام محلول مؤقت. في هذه الحالة ، ستكون خطوة تصحيح الأس الهيدروجيني إضافة منطقية بعد إعادة التكوين مع المخزن المؤقت.

تشمل قيود هذا البروتوكول القيود المرتبطة بأي منهجية ELISA ، وتحديدا عدم استقرار الأجسام المضادة38. يجب إذابة كواشف الأجسام المضادة إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها في الفحص ؛ ومع ذلك ، فإن الاحترار لفترة طويلة قد يسبب تمسخ وبالتالي انخفاض فعالية في CGRP الملزمة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتعرض CGRP للتدهور من قبل مجموعة متنوعة من البروتياز غير سيرين ، مما يؤدي إلى زيادة النتائج السلبية الخاطئة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يحد من التحلل عن طريق إضافة بروتياز سيرين والحد من وقت معالجة العينة إلى أقل من 60 دقيقة ، فقد يستمر حدوث التدهور. ومن القيود الأخرى عدم وجود دورات تجميد وذوبان تم اختبارها. أظهر Lee et al.39 أن دورات التجميد والذوبان يمكن أن تزيد أو تقلل من كميات بروتين المصل والبلازما ، اعتمادا على حساسية البروتين. لم يتم اختبار قابلية CGRP لدورات التجميد والذوبان بشكل كامل في الأدبيات ، على الرغم من أن Messlinger et al. لاحظوا أن مستويات CGRP تنخفض في دورة واحدة من التجميد والذوبان37. علاوة على ذلك ، قد يستفيد محصول هذا البروتوكول من استخدام أنابيب LoBind البروتينية ، المصممة بسطح محب للماء ، مما يؤدي إلى تحسين استعادة البروتين.

نلاحظ أن تجارب التحقق هذه لا يبدو أنها أجريت من قبل مؤلفي الدراسات الحديثة التي تحدد كمية CGRP في البلازما البشرية16،18،35،40،41. يؤكد استعراض منهجية ELISA بواسطة Messlinger et al.37 على الحاجة إلى مثل هذه الضوابط ويشكك في الدراسات التي لم تستخدمها. نعتقد أن عملنا في التحقق من صحة البروتوكول وتوحيده سيضع أبحاث CGRP المستقبلية على أساس أفضل. الآثار المترتبة على مثل هذا البروتوكول واسعة النطاق ، ويمكن نظريا أن تمتد إلى التحقيق في حالة العلامات الحيوية ل CGRP في عمليات الأمراض العصبية وغير العصبية2،25،26،27،28،29،30،31،32،33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين المزيد من الإفصاحات لإضافتها.

Acknowledgments

نود أن نشكر روبرت ن. كول ولورين ر. ديفين وماركوس إغليسياس على مناقشاتهم المفيدة بشأن هذا البروتوكول. تم دعم ذلك جزئيا بتمويل من الجمعية الأمريكية لطب الأذن (منحة الزمالة ، PSK) ، والمؤسسة الأمريكية لأبحاث السمع (90066548 / 90072266 ، JPC) ، والمركز الوطني لتطوير العلوم الانتقالية (NCATS) ، وهو أحد مكونات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، وخارطة طريق المعاهد الوطنية للصحة للبحوث الطبية (UL1 TR003098 ، NSF). محتويات المنشور هي مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية لمحكمة جونز هوبكنز الجنائية الدولية لرواندا أو NCATS أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube Sorenson Bioscience, Inc. 11510
99% methanol ThermoFisher Scientific L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube Falcon 14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials CRYO.S 122263
4% acetic acid ThermoFisher Scientific 035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube BD 367863
Allegra 64R benchtop centrifuge Beckman Coulter, Inc. 367586
Aprotinin VWR 76344-814
CGRP (human) ELISA kit Bertin Bioreagent A05481
CGRP stock Bertin Bioreagent
EIA Buffer Bertin Bioreagent A07000
Ellman's Reagent Bertin Bioreagent A09000_49+1
Multichannel pipettes ThermoFisher Scientific 4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges Waters WAT094226
Orbital Shaker Bellco 7744-01010
Precision micropipettes ThermoFisher Scientific F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader Molecular Devices Part Number M2
TBS/Fish Gelatin Bioworld, from Fischer Scientific 50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade Bertin Bioreagent A07001
Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator Eppendorf 22820109
Wash Buffer Bertin Bioreagent A17000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  2. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  3. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
  4. Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
  5. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  6. Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
  7. Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
  8. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
  9. Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
  10. Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
  11. Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
  12. Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
  13. Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
  14. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  15. Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
  16. Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
  17. Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
  18. Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
  19. Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
  20. Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
  21. Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
  22. Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
  23. Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
  24. Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
  25. Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
  26. Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
  27. Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
  28. Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
  29. Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
  30. Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
  31. Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
  32. Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
  33. Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
  34. World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
  35. Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
  36. Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
  37. Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
  38. Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
  39. Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
  40. Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
  41. Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 196 ،
الكشف عن الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) وقياسه في البلازما البشرية باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم المعدل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnan, P. S., Zamuner, F. T.,… More

Krishnan, P. S., Zamuner, F. T., Jenks, C. M., Xie, J. Y., Zhang, L., Lehar, M., Fedarko, N. S., Brait, M., Carey, J. P. Detection and Quantification of Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) in Human Plasma Using a Modified Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (196), e64775, doi:10.3791/64775 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter