Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

זיהוי וכימות של פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) בפלזמה אנושית באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים שונה

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/64775
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 4, 5, 1, 6, 1,3, 1
1Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Department of Oncology, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Michigan Medical School, 5Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, The Ohio State University College of Medicine, 6ICTR Clinical Research Core Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

נתונים שפורסמו בנוגע לריכוזי פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) בפלזמה אנושית אינם עקביים. חוסר עקביות זה עשוי לנבוע מהיעדר מתודולוגיה מתוקננת ומתוקפת לכימות נוירופפטיד זה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מאומת של בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) לטיהור וכימות CGRP בפלזמה אנושית.

Abstract

פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) הוא נוירופפטיד וזואקטיבי הממלא תפקיד משוער בפתופיזיולוגיה של מיגרנות, ועשוי להיות מועמד למצב של סמן ביולוגי. CGRP משתחרר מסיבים עצביים עם הפעלתו וגורם לדלקת נוירוגנית סטרילית ולהרחבת כלי דם עורקיים בכלי הדם המקבלים עצבוב טריגמינלי תוסס. נוכחותו של CGRP בכלי הדם ההיקפיים דרבנה חקירות לזהות ולכמת נוירופפטיד זה בפלזמה אנושית באמצעות בדיקות פרוטאומיות, כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA). עם זאת, זמן מחצית החיים של 6.9 דקות והשונות בפרטים הטכניים של פרוטוקולי הבדיקה, שלעתים קרובות אינם מתוארים במלואם, הניבו נתוני CGRP ELISA לא עקביים בספרות. כאן מוצג פרוטוקול ELISA שונה לטיהור וכימות CGRP בפלזמה אנושית. השלבים הפרוצדורליים כוללים איסוף והכנת דגימות, חילוץ באמצעות סורבנט קוטבי כאמצעי לטיהור, צעדים נוספים לחסימת קשירה לא ספציפית, וכימות באמצעות ELISA. יתר על כן, הפרוטוקול אומת עם ספייק והתאוששות ולינאריות של ניסויי דילול. פרוטוקול מאומת זה יכול לשמש באופן תיאורטי לכימות ריכוזי CGRP בפלזמה של אנשים לא רק עם מיגרנה, אלא גם עם מחלות אחרות שבהן CGRP עשוי לשחק תפקיד.

Introduction

פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) הוא נוירופפטיד של 37 חומצות אמינו שנמצא בסיבים עצביים עם לוקליזציה פריווסקולרית, כמו גם ברקמות שאינן עצביות. שתי הצורות של CGRP, α ו-β-CGRP, חולקות יותר מ-90% הומולוגיה וחולקות תפקודים פיזיולוגיים; עם זאת, αCGRP נמצא במערכת העצבים המרכזית וההיקפית, בעוד βCGRP נמצא במערכת העצבים האנטרית 1,2. עם הפעלת nociceptor ואקסוציטוזה תלוית סידן, CGRP משתחרר מנוירונים, וגורם לדלקת נוירוגנית סטרילית המערבת הרחבת כלי דם עורקיים ואקסטרווזיה של חלבון פלזמה 3,4,5,6,7. מכאן, CGRP מופיע בכלי הדם שלאחר הנימים ועשוי להיות סמן ביולוגי למחלות הגורמות להפעלה נוסיספטיבית afferent, כגון מיגרנה 8,9,10,11. יש לציין כי CGRP היה מעורב גם ב- COVID-19 באמצעות תפקידו באנגיוגנזה ובאפנון חיסוני, ועשוי לחזות אבולוציה שלילית של מחלות12,13. לפיכך, פרוטוקול לכימות מדויק של CGRP בפלזמה אנושית יכול להיות בעל ערך רחב.

תשומת הלב הרבה ביותר הוקדשה אולי לתפקיד של CGRP במיגרנה. בהתבסס על מחקרים פרה-קליניים וקליניים, CGRP הוצג כסמן ביולוגי אפשרי למיגרנה וכיעד לטיפול 3,4,5,6,7,8,9,10. מחקרים מסוימים מצאו עלייה של CGRP בקבוצות עם מיגרנה אפיזודית ביחס למשתתפי הביקורת10,14,15. נראה כי ההצלחה של מעכבי CGRP בניסויים קליניים לטיפול במיגרנה מרמזת על CGRP מוגבר כגורם סיבתי למיגרנות. עם זאת, לא כל החוקרים אישרו תוצאות אלה16,17,18,19. יתר על כן, תפקידו של CGRP בסימפטומים שאינם כאבי ראש של מיגרנה טרם הובהר; העבודה הנוכחית הונעה על ידי הרצון להבין את התפקיד של CGRP בסימפטומים שיווי המשקל של מיגרנה.

נתוני בדיקת CGRP לא עקביים בספרות יכולים לנבוע מכמה סיבות. ראשית, זמן מחצית החיים של CGRP בכלי הדם ההיקפיים הוא 6.9 דקות 20, בשל הפעילות של פרוטאזות סרין 21, אנזימים מפרקים אינסולין ומטלופרוטאזות אחרות 22, אנדופפטידאזות ניטרליות 23, ואנזים ממיר אנדותלין-1 24. שנית, הפרטים הטכניים המשתנים של הבדיקות החיסוניות המשמשות לכימות CGRP אינם מתוארים במלואם במחקרים כאלה. לבסוף, חוסר הסטנדרטיזציה של מתודולוגיית החיסון מסבך את התמונה עוד יותר.

מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה של בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) המאפשר טיהור וכימות מדויק של α ו- βCGRP בפלזמה אנושית. הנוגדנים של הערכה אינם צולבים עם עמילין, קלציטונין או חומר P. פרוטוקול זה עבר את ניסויי התיקוף הנדרשים, כגון ספייק ושחזור ולינאריות של דילול, שהנתונים עבורם מוצגים כאן. פרוטוקול CGRP ELISA כזה שעבר אימות לא תואר בעבר במלואו בספרות. פרוטוקול זה יכול לשמש לכימות CGRP בפלזמה אנושית בהקשר של מיגרנה, כמו גם קרדיולוגית2,25, דרמטולוגית 26, מיילדותית 27, ראומטולוגית28,29, שרירים ושלד 30,31, אנדוקרינית 32,33, ומחלות ויראליות12,13 שבהן CGRP היה מעורב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה פותח באמצעות דגימות פלזמה אנושיות מאנשים מוסכמים באישור מועצת הביקורת המוסדית של ג'ונס הופקינס (NA_00092491).

1. איסוף דוגמאות והכנתן

  1. לאסוף 5 מ"ל של דם שלם מן הווריד antecubital באמצעות שיטות venipuncture סטנדרטיות34 לתוך 6 מ"ל vacutainer ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) צינור איסוף.
  2. הוסף 0.5 מ"ל של מעכב פרוטאז סרין תחרותי (10,000 KIU/mL) לצינור לאחר האיסוף כדי לחסום את הליזה של פפטיד המטרה. הפוך את הצינור 10 פעמים כדי לאפשר לאפרוטנין להתערבב כראוי עם הדם. לאחר מכן, אחסנו את הצינורות על קרח עד לשלב הבא.
  3. צנטריפוגה את הצינור ב 604 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C בתוך 60 דקות של איסוף הדם.
  4. מורידים את חלק הפלזמה עם פיפטה ומעבירים ל 2 מ"ל קריובלים סטריליים עגולים למטה.
  5. מיד לאחסן את cryovials ב -80 ° C למשך עד שבועיים.

2. מיצוי דגימות הפלזמה

  1. מניחים מחסנית חילוץ בתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל כאשר הרכסים החיצוניים של המחסנית נתמכים על ידי הרכסים החיצוניים של הצינור.
  2. הפעל את המחסנית על ידי העברת 5 מ"ל תחילה של 100% מתנול ולאחר מכן 10 מ"ל של מים טהורים במיוחד דרך המחסנית.
    1. כאשר נוזל מועבר דרך המחסנית באמצעות זרימה מונעת כוח הכבידה, הוא ייאסף בצינור.
    2. יש לזרוק את עודפי הנוזל כשהם מצטברים כדי להבטיח שהנוזל לא יבלע את המחסנית.
    3. ודא שהמחסנית אינה מתייבשת במהלך הניסוי.
  3. לדלל 250 μL של פלזמה עם 750 μL של 4% חומצה אצטית.
  4. העבר את 1 מ"ל של פלזמה ותמיסת חומצה אצטית באיטיות דרך המחסנית.
    הערה: שלב זה אמור להימשך כ-30 שניות באמצעות זרימה מונעת כבידה עבור כל מיליליטר שעובר.
  5. שטוף את המחסנית עם 10 מ"ל של 4% חומצה אצטית. כפי שנעשה בעבר, לזרוק את הנוזל העודף כפי שהוא מצטבר כדי להבטיח כי הנוזל לא לבלוע את המחסנית.
  6. לאחר שהטיפה האחרונה של חומצה אצטית משתחררת מהמחסנית, הסר את המחסנית מהצינור והנח אותה בצינור צנטריפוגה חרוטי חדש של 15 מ"ל.
  7. הכינו תמיסה ביחס 10:1 של 100% מתנול ו-4% חומצה אצטית על ידי ערבוב של 2.7 מ"ל של 4% חומצה אצטית ו-0.3 מ"ל של 100% מתנול. השתמש באפשרות זו כדי להפתיע את ה- CGRP על-ידי העברת פתרון זה דרך המחסנית 1 מ"ל בכל פעם. הפסקה של 25 דקות בין כל מיליליטר של תמיסה עבר. אל תזרקו את ה-eluent.
  8. הצינור יכיל 3 מ"ל של הנוזל המדולל 25 דקות לאחר שהמיליליטר האחרון של תמיסת המתנול והחומצה האצטית עבר. מניחים כל 1 מ"ל של המוציא לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל.
    הערה: פעולה זו אמורה להניב שלושה צינורות מיקרו-צנטריפוגות מכל מחסנית.
  9. מקם כל צינור בצנטריפוגה קטנה למשך שנייה אחת כדי להבטיח שכל הנוזל נמצא בתחתית כל צינור.
  10. יבש את כל הדגימות על ידי צנטריפוגת ואקום ב 4 ° C (מוגדר לפעולת רכז, עבור תמיסות מימיות, ב 1,400 סל"ד; כוח G משתנה בהתאם למיקום של צינורות ולכן נע בין 130-250 x גרם).
    הערה: הזמן שייקח לצנטריפוגת הוואקום לייבש את הדגימות יהיה תלוי בסוג צינור המיקרוצנטריפוגה שבו נעשה שימוש.
  11. מיד לפני שתמשיך להליך הבדיקה (שלב 4.1), צור מחדש את הדגימה שיובשה בעבר עם מאגר אנזים חיסוני (EIA) (ראה טבלת חומרים) מופשר לטמפרטורת החדר (RT) או 20 ° C.
    הערה: נפח מאגר EIA המשמש לבנייה מחדש של הדגימה המיובשת צריך להיות שווה לנפח הדגימה המקורי, או 250 μL.

3. הכנת צלחת ELISA - חסימה להגבלת קשירה לא ספציפית

  1. הוסיפו 250 μL של חיץ חוסם מלח חוצץ טריס (TBS)/ג'לטין דגים לכל באר בצלחת.
  2. מניחים יריעת כיסוי מעל הצלחת ודגרים במשך שעתיים ב-RT.
  3. הסר את דף השער ורוקן את הצלחת על ידי היפוך או שאיפה באמצעות פיפטה רב ערוצית. לאחר מכן, כתם את הצלחת על מגבת נייר כדי להשליך כל זכר של נוזל.
  4. יבש את הצלחת על ידי השארת הצלחת במכסה מנוע זרימה למינרית למשך 10 דקות.
  5. לאחר שהצלחת יבשה באופן ניכר, הניחו אותה בשקיק רדיד אלומיניום אטום עם שקיק מייבש ג'ל סיליקה ואחסנו את השקית בטמפרטורה של -20°C למשך 24 שעות.
    הערה: יש להשתמש בצלחות תוך 4 שבועות מרגע הדגירה.

4. לפני הליך הבדיקה

  1. הכן ריאגנטים (מאגר EIA, תקן CGRP, בקרת איכות CGRP, עוקב CGRP, מאגר שטיפה) בהתאם להוראות הערכה. הכינו את המגיב של אלמן רק לאחר סיום תקופת הדגירה של 16-20 שעות.
  2. הפשיר את כל הדגימות והריאגנטים ל- RT לפני ביצוע שאר הפרוטוקול.

5. הליך הבדיקה

  1. יש לשטוף כל באר בצלחת החסומה חמש פעמים באמצעות חיץ כביסה שסופק על ידי הערכה (300 מיקרוליטר/באר). עבור כל שטיפה, יש להשהות 30 שניות לאחר הנחת חיץ השטיפה בבארות, ולאחר מכן לזרוק את הנוזל או לשאוף באמצעות פיפטה רב ערוצית.
  2. לאחר השטיפה הסופית, הסר את כל החיץ מהבארות על ידי היפוך (היפוך הצלחת כדי להוציא את הנוזל בתוך בארות) או שאיפה באמצעות פיפטה רב ערוצית. כתם את הטיפות האחרונות על מגבת נייר והקש על הצלחת ההפוכה עד שכל הנוזלים יוסרו באופן גלוי מהבארות.
  3. הקצו לפחות שתי בארות ללא ריאגנטים או חיץ כדי להיקרא בארות "ריקות". לאחר מכן, הקצו לפחות שתי בארות אחרות לכריכה לא ספציפית (NSB).
  4. יש לפזר 100 μL של חיץ EIA לכל באר NSB.
  5. יש להוציא 100 μL של תקני CGRP בשכפול לבארות מתאימות.
  6. יש להוציא 100 μL של דגימות (שהורכבו מחדש במאגר EIA) ובקרת איכות בשכפול לבארות מתאימות.
  7. יש להוציא 100 מיקרוליטר של נותב CGRP (נוגדן אנטי-CGRP המחובר לאצטילכולין אסטראז) לכל באר המכילה NSB, תקני CGRP, דגימות ובקרת איכות. אל תחלק נותב לבארות "ריק".
  8. מכסים את הצלחת באמצעות יריעת כיסוי שקופה, אוטמים כל באר כך שהדגימות והריאגנטים בכל באר לא יתאדו באופן משמעותי. לדגור על הצלחת במשך 16-20 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. לאחר השלמת הדגירה, יש להרכיב מחדש את מגיב אלמן בהתאם להוראות הערכה.
  10. הפוך את הצלחת כדי להסיר את כל הנוזלים. יש לשטוף כל באר (כמתואר לעיל) שלוש פעמים עם 300 μL של חיץ כביסה.
  11. לאחר השטיפה השלישית מוציאים את הנוזל מהצלחות, מניחים את הצלחת על צלחת שייקר ומנערים במהירות 120 סל"ד למשך 2 דקות.
  12. שוטפים את הצלחת שלוש פעמים נוספות. לאחר השטיפה הסופית, הסר את כל החיץ מהבארות על ידי היפוך או שאיפה באמצעות פיפטה רב ערוצית. כתם את טיפות הנוזל האחרונות על מגבת נייר והקש על הצלחת ההפוכה עד שכל הנוזל יוסר באופן גלוי מהבארות.
    הערה: ייתכן שלא יהיה צורך בשלוש הכביסות הנוספות המתוארות בשלב זה אם משתמשים במכונת כביסה מיקרו-צלחות של ELISA.
  13. יש לפזר 200 מיקרוליטר של מגיב אלמן לכל באר (לא כולל בארות "ריק").
  14. כסו את הצלחת ביריעת כיסוי חדשה ועטפו אותה ברדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. לדגור בחושך ב RT במשך 1 שעה.
  15. ודא שאין נוזל בצד האחורי של הצלחת שעלול לבלבל את קריאת הספקטרופוטומטר על ידי ניגוב החלק האחורי במגבת נייר יבשה.
  16. קרא את הלוח לספיגה של 405 ננומטר (צבע צהוב).

6. ניתוח נתונים

  1. חשב את הספיגה הממוצעת עבור כל "ריק", NSB, תקן, בקרת איכות, ואת הדגימות.
  2. הפחת את ערכי הספיגה הממוצעת של NSB מערכי התקן, בקרת האיכות וספיגת הדגימה.
  3. ספיגת העלילה על ציר ה-y והריכוז על ציר ה-x. בניית עקומה סטנדרטית באמצעות מודל רגרסיה לוגיסטית בן ארבעה פרמטרים.
  4. לאחר בניית העקומה, השתמש במשוואת העקומה כדי לקבוע את ריכוזי האינטרפולציה עבור בקרת איכות ודגימות, שניתן לקרוא על ציר x.
    הערה: העקומה הסטנדרטית מאומתת רק אם ריכוז האינטרפולציה המחושב עבור בקרת האיכות הוא בטווח של 25% מהריכוז הצפוי (בדרך כלל 125 pg/mL, אך ראה את התווית של בקבוקון בקרת האיכות).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ישנם מספר שלבים מרכזיים בפרוטוקול שיש להדגיש. ראשית, יש להוסיף אפרוטינין, מעכב פרוטאז סרין, לדגימות דם שלמות מיד עם איסופו כדי למנוע פירוק אנזימטי נוסף של CGRP. הודגם כי פרוטאזות סרין ממלאות תפקיד במטבוליזם של CGRP, ומחקר קודם השתמש גם באפרוטינין לכימות CGRP בבני אדם21,35. אם לא נעשה שימוש במעכבי פרוטאזות, והכנת הדגימה אורכת יותר מ-60 דקות, ניתן לצפות לירידה ברמות CGRP בעת ביצוע ELISA. שנית, מיצוי פאזה מוצקה לפני ELISA מרכז CGRP ב eluent ומבטל מולקולות שעלולות להפריע ממטריצת הפלזמה. שלב מיצוי זה מגדיל את התשואה של CGRP בניסויי ספייק והתאוששות (נדון בהמשך המסור). צנטריפוגת ואקום בחדר קר לאחר השאיבה מגבילה עוד יותר את אובדן CGRP. שלישית, לפני ELISA, לוחות microtiter חייב להיות חסום באמצעות מאגר חוסם. זה מאפשר ספיחה פסיבית של חלבונים לא ספציפיים בחיץ לאתרי הקישור הנותרים בלוחות, ובכך להפחית את אות הרקע. חסימה מסייעת להפחית תפוקות גבוהות באופן לא מציאותי של CGRP.

ניסויי ספייק ושחזור קובעים אם זיהוי CGRP מושפע מההבדלים בין מדלל העקומה הסטנדרטי (כאן, מאגר EIA) ומטריצת דגימה ניסיונית (כאן, פלזמה). פלזמה ו/או סרום עשויים להכיל מולקולות החוסמות את קשירת הנוגדנים ל-CGRP או פוגעות בפפטיד, ובכך מפריעות ליכולתו של הנבדק לזהות ולכמת את הריכוז ההתחלתי של CGRP באופן מדויק. לשם כך, הוספנו כמויות ידועות של CGRP לדגימות פלזמה – שלב ה"ספייקינג" – וחישבנו כמה CGRP "שוחזר" לאחר מיצוי ו-ELISA. מלאי CGRP התקבל מהיצרן ואוחסן במקפיא של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

בבדיקת דילול ליניארי, דגימה מדוללת סדרתית, וריכוזי CGRP מחושבים עבור כל דילול. אם הדגימות המדוללות אינן מציגות ירידה ליניארית מתאימה בריכוז CGRP, הדבר מצביע על כך שמאגר ה- EIA או הפלזמה מפריעים לזיהוי CGRP בריכוזים מסוימים או שעקומת התקן אינה מדויקת בטווח המושפע. בביצוע ניסוי הספייק והשחזור שתואר לעיל, דיללנו באופן סדרתי את הדגימות ה"קוצניות"; ביצענו ספייק של דגימת פלזמה כדי לתת ריכוז של CGRP של 200 pg/mL ולאחר מכן דיללנו את הדגימה ל-100 pg/mL ולאחר מכן ל-50 pg/mL.

דגימות פלזמה משלושה משתתפים ללא היסטוריה של לב וכלי דם, נשימה, או כאבי ראש או תסמינים נוירולוגיים לאחרונה היו עם ריכוזים שונים של CGRP. הפרוטוקול הופעל עבור דגימות אלה, בנוסף לדגימות בקרה שאינן ספייק. איור 1 מראה דוגמה של מפת לוחות עבור ספייק ושחזור ולינאריות של ניסויי דילול. התאמה לוגיסטית של ארבעה פרמטרים בוצעה כדי ליצור עקומה סטנדרטית שאפשרה התאמה מעבר לטווח הליניארי (טבלה 1 ואיור 2). שיעורי ההחלמה חושבו עבור כל דגימה שקוצצה והיו בטווח המקובל (טבלה 2). הלינאריות של הדילול הודגמה בדגימות הקוצניות (איור 3). טבלה 3 מציגה תוצאות שהתקבלו מניסוי ספייק ושחזור כושל שנערך בהתאם להוראות היצרן ולפני הכללת השלבים שנוספו לחסימת קשירה לא ספציפית. נתונים אלה מראים שיעורי התאוששות העולים על הגבול העליון של 125%, דבר המצביע על נוכחות של כריכה לא ספציפית. לאחר הוספת השלבים בפרוטוקול לחסימת הלוח באמצעות מאגר חוסם (שלבים 3.1-3.5), הצלחנו להפחית השפעה זו ולהשיג ערכי שחזור מקובלים (טבלה 2). בשלושה מטופלים ללא מיגרנה או תסמינים וסטיבולריים, מצאנו כי הריכוז הממוצע של CGRP בפלזמה היה 1.68 ± 0.13 pg/mL. ניסויים עתידיים צריכים לשאוף להשתמש במתודולוגיה הנוכחית בקנה מידה גדול יותר של חולי ביקורת.

Figure 1
איור 1: מפת לוחות לדוגמה. כל צלחת צריכה להכיל תקנים, דגימות, ריקים ובארות NSB, והכל בשכפול או משולש. בארות ריקות לא צריכות להכיל נוזלים, ובארות NSB צריכות להכיל מאגר חיסוני אנזימי קנייני, נוגדן משני הקשור לאנזים ומגיב של אלמן. יש להפחית את ערכי הספיגה הממוצעים של בארות NSB מערכי הספיגה של התקן לפני יצירת העקומה הסטנדרטית. יש להפחית גם את ערכי הספיגה הממוצעים של בארות NSB מערכי הספיגה של הדגימות, לפני חישוב אחוז ההתאוששות. אין השפעה של מיקום הצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דוגמה לעקומת תקן רגרסיה לוגיסטית (4PL) בעלת ארבעה פרמטרים. עקומה סטנדרטית זו מתוארת מתמטית על ידי משוואה בצורה דומה לזו הנראית בטבלה 1. עקומת רגרסיה 4PL מתאימה יותר למערכות ביולוגיות בהשוואה לעקומות ליניאריות. עקומה ומשוואה אלה משמשות לאינטרפולציה של בקרות איכות ודגימות על אותו לוח שעליו נוצר התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תרשים ליניאריות של קווי דילול המציג דגימות שזינקו במהירות של 200 pg/mL, ולאחר מכן דוללו סדרתית ביחס של 1:2 ו-1:4. נתונים אלה מראים ליניאריות על פני מגוון רחב של דילולים, מה שמצביע על כך ששיטת הבדיקה מדויקת בטווח רחב של ריכוזי CGRP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרמטר ערך
X50 294.75
משוואה Equation 1
צורת משוואה Equation 2

טבלה 1: דוגמה למשוואת עקומה סטנדרטית של רגרסיה לוגיסטית (4PL) עם טיטרים X50. עקומת רגרסיה 4PL מתאימה למורכבות הנראית במערכות ביולוגיות. עקומה זו שימשה לניתוח התוצאות של ELISA, שכן היא מתאימה יותר מאשר רגרסיה ליניארית.

ספיגה (OD) ריכוז אינטרפולציה (pg/mL) אחוז תשואה
שליטה ללא קוצים -0.0434 אינו נופל על עקומה (כלומר, ~0)
זינק ב-200 עמ'/מ"ל 0.2712 214.7 ± 23.4 107.40%
זינוק ב-100 עמ'/מ"ל 0.0966 102.7 ± 2.35 102.70%
זינק ב-50 עמ'/מ"ל 0.0205 58.7 ± 12.65 110.20%

טבלה 2: תוצאות ניסוי ספייק ושחזור מוצלח של שלושה משתתפי ביקורת עקב היעדר מיצוי פאזה מוצקה וחסימת לוחות. אחוז התשואה עבור דגימות ספייק נפל כולו בתוך 20% מהתשואה האידיאלית של 100%, מה שמצביע על כך שזיהוי CGRP אינו מושפע ממטריצת הדגימה הניסיונית של פלזמה.

ספיגה (OD) ריכוז אינטרפולציה (pg/mL) אחוז תשואה
שליטה ללא קוצים -0.2087 אינו נופל על עקומה (כלומר, ~0)
זינק ב-200 עמ'/מ"ל 2.371 264.2 ± 104 132.10%
זינוק ב-100 עמ'/מ"ל 1.134 169.5 ± 31.2 167.50%
זינק ב-50 עמ'/מ"ל 0.3218 80.55 ± 4.54 161.10%

טבלה 3: תוצאות ניסוי ספייק והתאוששות לא מוצלח של שלושה משתתפי ביקורת עקב היעדר חסימת לוחות. אחוז התשואה עבור דגימות ספייק ירד הרבה מעל הגבול העליון של 120% תשואה, מה שמצביע על כך שהבדיקה עשויה להיות פגומה על ידי NSB. לאחר קבלת תוצאות אלה, הוספנו שלבים 3.1-3.5 בפרוטוקול כדי לחסום NSB על הצלחת לפני הבדיקה.

ספיגה (OD) ריכוז אינטרפולציה (pg/mL) אחוז תשואה
שליטה ללא קוצים 0.0401 12.93
זינוק ב-100 עמ'/מ"ל 0.0315 10.17±2.31 10.17%
זינק ב-50 עמ'/מ"ל 0.0152 4.895±15.4 9.79%
ספייק ב-25 עמ'/מ"ל 0.0007 0.2177±6.43 0.87%

טבלה 4: תוצאות ניסוי ספייק והתאוששות כושל של שלושה משתתפי ביקורת. אחוז התשואה עבור דגימות ספייק ירד הרבה מתחת לגבול התחתון של 80% תשואה, מה שמצביע על כך שהיה צורך באופטימיזציה נוספת כדי להתמודד עם השפלה אפשרית ותהליכי קשירה תחרותיים. תוצאות אלה הן מבדיקת ELISA תחרותית של יצרן אחר, עם גבול זיהוי נמוך יותר של 2.23 pg/mL, וקורות חיים תוך בדיקה < 10% ו- CV בין בדיקות < 12%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול מאומת המאפשר זיהוי וכימות של CGRP בפלזמה אנושית. פרוטוקול זה סונתז לאחר שנמצא כי ערכות CGRP ELISA מסחריות אינן מכמתות במדויק מולקולה זו. לאחר קביעת פרוטוקול הכנת דגימה ועקומה סטנדרטית תקפה, ספייק והתאוששות ולינאריות של ניסויי דילול הראו כי אחוז המחלימים היה נמוך בהרבה מהצפוי. תוצאות דומות נמצאו בערכת CGRP ELISA מסחרית אחרת (טבלה 4). לשם השוואה, ההתאוששות הסטנדרטית המקובלת היא 80-120%36. תוצאות אלה עשויות להצביע על נוכחות של פעילות פרוטאז המשפילה CGRP21,22,23,24, מולקולות אחרות שנקשרות ל-CGRP, ובכך מגבילות את זמינותו להיקשרות לנוגדנים של הצלחת, או קשירה תחרותית של חלבונים שאינם מטרה לנוגדני הצלחת.

כדי לשלוט בגורמים מבלבלים אפשריים אלה, פרוטוקול מיצוי הותאם לטיהור פלזמה באמצעות מיצוי עם חומר סופג קנייני לפני ELISA. חומר סורבנט זה מבודד לכאורה מולקולות קוטביות כגון CGRP. כדי לקבוע את יעילות המיצוי לפני ELISA, דגימות פלזמה אנושיות זינקו עם ריכוזים ידועים של CGRP כאשר בקרות חיוביות עברו מיצוי ולאחר מכן ELISA. דגימות קוצניות אלה הניבו רק ~ 50%-60% התאוששות. תוצאות אלה הצביעו על כך שתוספת אקסוגנית של CGRP אינה מזוהה בפלזמה, כפי שניתן היה לצפות.

מספר שלבים נוספים של הפרוטוקול עברו אופטימיזציה: הוספת מעכב פרוטאז סרין לדגימות דם שלמות לפני הצנטריפוגה כדי לעכב השפלה21, הורדת הטמפרטורה של צנטריפוגת ואקום לאחר החילוץ, והתאמת שיטות השעיה לאחר הצנטריפוגה. ניסוי ספייק והתאוששות לאחר שינויים אלה גילה ריכוזי CGRP גבוהים באופן לא מציאותי, יותר מ-120% התאוששות (טבלה 3). באופן מרגיע, ערכים גבוהים מהצפוי דווחו לאחרונה גם לאחר חילוץ באמצעות בדיקה דומה על ידי Messlinger et al.37, מה שמצביע על כך שזו נותרה בעיה. מסלינגר ועמיתיו מודים כי הבדיקה לאחר מיצוי פלזמה אינה משחזרת ריכוזי CGRP מציאותיים, מבלי לספק סיבה לתופעה זו37.

שיערנו כי יכולת הקשירה השיורית על לוחות המיקרוטיטר של ELISA הגורמת לקשירה לא ספציפית עשויה להיות אחראית לשיעורי ההתאוששות הגבוהים. לפני ELISA, הצלחת הודגרה עם חיץ חוסם, TBS/חיץ ג'לטין דגים, כדי להפחית את יכולת הקשירה הזו. צעד נוסף זה הביא לשיעורי התאוששות מתאימים יותר (טבלה 2). לפיכך, השינויים והאופטימיזציות שנדונו לעיל, כולל השימוש במאגר החסימה, נותרו שלבים קריטיים בפרוטוקול. שלבים אלה אפשרו גבול זיהוי נמוך יותר של 1.05 pg/mL, בהשוואה לזה של ערכת היצרן המקורית הרשומה כ- 2 pg/mL.

לגבי פתרון בעיות, שלב 2.10 דורש צנטריפוגה ואקום כדי לייבש את eluent. אורכו של שלב זה נצפה משתנה בהתאם לסוג צינור המיקרוצנטריפוגות שבו הדגימות נמצאות. באמצעות צינורות מיקרוצנטריפוגות המתוארים בטבלת החומרים, שלב זה נמשך בדרך כלל 5 שעות. עם זאת, כאשר צינורות מיקרוצנטריפוגות חלופיים של נפחים גדולים יותר משמשים, שלב זה יכול להימשך עד 11 שעות. חלופה לצנטריפוגת ואקום עשויה להיות ליופיליזציה או ייבוש בהקפאה של הדגימות, מה שיחייב את הדגימות להיות מוקפאות לאחר השאיבה. עם זאת, ליופיליזציה לא נבדקה בבניית פרוטוקול זה. בנוסף, אם נמצאו ריכוזים נמוכים מהצפוי של CGRP באופן שיטתי, יש לוודא שכל הריאגנטים, במיוחד הנוגדנים, מופשרים לטמפרטורת החדר לפני השימוש. חוסר היציבות של ריאגנטים, כגון תמיסות נוגדנים ונותבים, עלול לתרום לשגיאה שיטתית בקישור CGRP. אם היבול ממשיך להיות בלתי מספק, קשירת נוגדנים ל-CGRP עלולה להיות מושפעת מהחומציות היחסית של האלואנט (מתנול ותמיסת חומצה אצטית), למרות בנייה מחדש עם חיץ. במקרה זה, שלב תיקון pH יהיה תוספת הגיונית לאחר הרכבה מחדש עם חיץ.

המגבלות של פרוטוקול זה כוללות את המגבלות הקשורות לכל מתודולוגיית ELISA, במיוחד חוסר יציבות נוגדנים38. ריאגנטים נוגדנים חייב להיות מופשר לטמפרטורת החדר לפני השימוש בבדיקה; עם זאת, התחממות לתקופה ממושכת עלולה לגרום לדנטורציה וכתוצאה מכך לירידה ביעילות בקישור CGRP. נוסף על כך, CGRP עלול לעבור פירוק על-ידי מגוון פרוטאזות שאינן סרין, מה שמוביל לעלייה בתוצאות שליליות כוזבות. למרות שפרוטוקול זה מגביל את ההתפרקות על ידי הוספת פרוטאז סרין ומגביל את זמן עיבוד הדגימה לפחות מ-60 דקות, השפלה עדיין עלולה להתרחש. מגבלה נוספת היא היעדר מחזורי הקפאה-הפשרה שנבדקו. Lee et al.39 הדגימו כי מחזורי הקפאה-הפשרה יכולים להגדיל או להקטין את כמויות החלבון בסרום ובפלזמה, בהתאם לרגישות החלבון. הרגישות של CGRP למחזורי הקפאה-הפשרה לא נבדקה במלואה בספרות, אם כי מסלינגר ועמיתיו ציינו כי רמות ה-CGRP יורדות במחזור אחד של הקפאה והפשרה37. יתר על כן, התשואה של פרוטוקול זה עשויה להפיק תועלת משימוש בצינורות LoBind חלבוניים, המתוכננים עם משטח הידרופילי, ובכך להוביל לשיפור התאוששות החלבון.

נציין כי נראה כי ניסויי אימות אלה לא בוצעו על ידי מחברי מחקרים אחרונים המכמתים CGRP בפלזמה אנושית 16,18,35,40,41. סקירה של מתודולוגיית ELISA על ידי Messlinger et al.37 מדגישה את הצורך בבקרות כאלה ומעמידה בספק מחקרים שלא השתמשו בהם. אנו מאמינים שעבודתנו באימות וסטנדרטיזציה של פרוטוקול תציב את מחקר CGRP העתידי על בסיס טוב יותר. ההשלכות של פרוטוקול כזה הן רחבות היקף, וניתן להרחיב אותן תיאורטית לחקר מצב הסמן הביולוגי של CGRP בתהליכי מחלה נוירולוגיים ולא נוירולוגיים 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין גילויים נוספים להוסיף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לרוברט נ' קול, לורן ר' דוויין ומרקוס איגלסיאס על הדיונים המועילים שלהם בנוגע לפרוטוקול זה. זה נתמך בחלקו על ידי מימון מהאגודה האמריקאית לאף אוטולוגיה (מענק מלגה, PSK), הקרן האמריקאית לחקר השמיעה (90066548/90072266, JPC), והמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NCATS), מרכיב של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), ומפת הדרכים של NIH למחקר רפואי (UL1 TR003098, NSF). תוכן הפרסום הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפה הרשמית של ICTR ג'ונס הופקינס, NCATS או NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube Sorenson Bioscience, Inc. 11510
99% methanol ThermoFisher Scientific L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube Falcon 14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials CRYO.S 122263
4% acetic acid ThermoFisher Scientific 035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube BD 367863
Allegra 64R benchtop centrifuge Beckman Coulter, Inc. 367586
Aprotinin VWR 76344-814
CGRP (human) ELISA kit Bertin Bioreagent A05481
CGRP stock Bertin Bioreagent
EIA Buffer Bertin Bioreagent A07000
Ellman's Reagent Bertin Bioreagent A09000_49+1
Multichannel pipettes ThermoFisher Scientific 4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges Waters WAT094226
Orbital Shaker Bellco 7744-01010
Precision micropipettes ThermoFisher Scientific F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader Molecular Devices Part Number M2
TBS/Fish Gelatin Bioworld, from Fischer Scientific 50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade Bertin Bioreagent A07001
Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator Eppendorf 22820109
Wash Buffer Bertin Bioreagent A17000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  2. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  3. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
  4. Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
  5. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  6. Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
  7. Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
  8. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
  9. Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
  10. Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
  11. Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
  12. Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
  13. Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
  14. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  15. Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
  16. Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
  17. Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
  18. Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
  19. Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
  20. Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
  21. Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
  22. Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
  23. Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
  24. Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
  25. Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
  26. Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
  27. Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
  28. Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
  29. Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
  30. Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
  31. Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
  32. Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
  33. Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
  34. World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
  35. Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
  36. Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
  37. Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
  38. Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
  39. Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
  40. Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
  41. Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 196
זיהוי וכימות של פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) בפלזמה אנושית באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים שונה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnan, P. S., Zamuner, F. T.,… More

Krishnan, P. S., Zamuner, F. T., Jenks, C. M., Xie, J. Y., Zhang, L., Lehar, M., Fedarko, N. S., Brait, M., Carey, J. P. Detection and Quantification of Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) in Human Plasma Using a Modified Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (196), e64775, doi:10.3791/64775 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter