Summary
ヒト血漿中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)濃度に関する公表されたデータは一貫していません。.これらの不一致は、この神経ペプチドを定量するための標準化された検証済みの方法論の欠如が原因である可能性があります。ここでは、ヒト血漿中のCGRPを精製および定量するための検証済みの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)プロトコルについて説明します。
Abstract
カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、片頭痛の病態生理学において推定上の役割を果たす血管作動性神経ペプチドであり、バイオマーカー状態の候補となる可能性があります。CGRPは活性化時にニューロン線維から放出され、三叉神経支配を受ける血管系に無菌の神経原性炎症および動脈血管拡張を誘発する。末梢血管系におけるCGRPの存在は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などのプロテオミクスアッセイを使用して、ヒト血漿中のこの神経ペプチドを検出および定量するための研究に拍車をかけました。しかし、その半減期は6.9分であり、アッセイプロトコルの技術的詳細のばらつきは、しばしば完全には説明されていないため、文献では一貫性のないCGRP ELISAデータが得られています。ここでは、ヒト血漿中のCGRPの精製および定量のための修正ELISAプロトコルが提示されている。手順ステップには、サンプルの収集と調製、精製手段としての極性吸着剤を使用した抽出、非特異的結合をブロックするための追加ステップ、およびELISA による 定量が含まれます。さらに、このプロトコルは、希釈実験のスパイクと回収率および直線性で検証されています。この検証されたプロトコルは、理論的には、片頭痛だけでなく、CGRPが役割を果たす可能性のある他の疾患の個人の血漿中のCGRP濃度を定量化するために使用できます。
Introduction
カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、血管周囲局在を有する神経線維および非神経組織に存在する37アミノ酸神経ペプチドである。CGRPの2つの形態、α-とβ-CGRPは、90%以上の相同性を共有し、生理学的機能を共有しています。しかし、αCGRPは中枢神経系および末梢神経系に見られ、βCGRPは腸神経系に見られます1,2。侵害受容器の活性化およびカルシウム依存性エキソサイトーシスにより、CGRPはニューロンから放出され、動脈血管拡張および血漿タンパク質溢出を含む無菌性神経原性炎症を誘発する3、4、5、6、7。ここから、CGRPは毛細血管後血管に現れ、片頭痛などの求心性侵害受容活性化を引き起こす疾患のバイオマーカーとなる可能性があります8、9、10、11。注目すべきことに、CGRPは血管新生と免疫調節におけるその役割を通じてCOVID-19にも関与しており、好ましくない疾患の進化を予測する可能性があります12,13。したがって、ヒト血漿中のCGRPを正確に定量するためのプロトコルは、幅広い価値を持つ可能性があります。
おそらく片頭痛におけるCGRPの役割に最も注目されています。前臨床および臨床試験に基づいて、CGRPは片頭痛の可能性のあるバイオマーカーとして、また治療の標的として提示されています3,4,5,6,7,8,9,10。いくつかの研究では、対照参加者と比較して、一時的な片頭痛のあるコホートでCGRPの上昇が見られました10、14、15。片頭痛治療の臨床試験におけるCGRP阻害剤の成功は、片頭痛の原因因子としてCGRPの上昇を示唆しているようです。ただし、すべての研究者がこれらの結果を裏付けているわけではありません16、17、18、19。さらに、片頭痛の非頭痛症状におけるCGRPの役割はまだ解明されていません。現在の研究は、片頭痛の前庭症状におけるCGRPの役割を理解したいという願望によって動機付けられました。
文献中のCGRPイムノアッセイデータの不一致は、いくつかの理由による可能性があります。第一に、末梢血管系におけるCGRPの半減期は、セリンプロテアーゼ21、インスリン分解酵素および他のメタロプロテアーゼ22、中性エンドペプチダーゼ23、およびエンドセリン変換酵素-1 24の活性により、6.9分20である。第二に、CGRPを定量するために使用されるイムノアッセイの可変的な技術的詳細は、そのような研究では完全には説明されていません。最後に、イムノアッセイ方法論の標準化の欠如は、状況をさらに複雑にします。
この記事では、ヒト血漿中のαおよびβCGRPの精製と正確な定量を可能にする修正酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)プロトコルについて説明します。キットの抗体は、アミリン、カルシトニン、またはサブスタンスPと交差反応性がありません。このプロトコルは、スパイクと回復、希釈の直線性など、必要な検証実験を経ており、そのデータはここに示されています。検証を受けたこのようなCGRP ELISAプロトコルは、これまで文献に完全には記載されていない。このプロトコルは、片頭痛、心臓病学2,25、皮膚科26、産科27、リウマチ28,29、筋骨格30,31、内分泌32,33、およびCGRPが関与しているウイルス性疾患12,13の状況において、ヒト血漿中のCGRPを定量するために使用できます。
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Protocol
このプロトコルは、ジョンズホプキンス治験審査委員会(NA_00092491)の承認を得て、同意した個人からのヒト血漿サンプルを使用して開発されました。
1. サンプルの採取と調製
- 標準的な静脈穿刺法34を介して、肘前静脈から5 mLの全血を6 mLのバキュテイナーエチレンジアミン四酢酸(EDTA)収集チューブに収集します。
- 採取後、0.5 mLのアプロチニン(10,000 KIU/mL)競合セリンプロテアーゼ阻害剤をチューブに追加し、標的ペプチドの溶解をブロックします。チューブを10回反転させて、アプロチニンが血液と適切に混合できるようにします。その後、次のステップまでチューブを氷上に保管します。
- 採血から60分以内にチューブを604 x g で4°Cで4分間遠心分離します。
- 血漿画分をピペットで取り出し、2 mLの丸底滅菌クライオバイアルに移します。
- 直ちにクライオバイアルを-80°Cで最大2週間保存してください。
2.血漿サンプルの抽出
- 抽出カートリッジを15 mLの円錐形遠心分離管の中に置き、カートリッジの外側の隆起部をチューブの外側の隆起部で支えます。
- 最初に5 mLの100%メタノールを通過させ、次に10 mLの超純水をカートリッジに通して、カートリッジをアクティブにします。
- 流体が重力駆動の流れ を介して カートリッジを通過すると、流体はチューブに集まります。
- 液体がカートリッジを飲み込まないように、余分な液体が蓄積したら捨てます。
- 実験中にカートリッジが乾かないようにしてください。
- 250 μLの血漿を750 μLの4%酢酸で希釈します。
- 1 mLの血漿および酢酸溶液をカートリッジにゆっくりと通します。
注意: このステップは、通過するミリリットルごとに重力駆動の流れ を介して 約30秒かかるはずです。 - カートリッジを10 mLの4%酢酸で洗浄します。前と同じように、余分な液体が蓄積したら捨てて、液体がカートリッジを飲み込まないようにします。
- 最後の一滴の酢酸がカートリッジから放出されたら、カートリッジをチューブから取り出し、新しい15 mLの円錐形遠心チューブに入れます。
- 2.7 mLの4%酢酸と0.3 mLの100%メタノールを混合して、100%メタノールと4%酢酸の10:1溶液を調製します。これを使用して、この溶液を一度に1 mLずつカートリッジに通すことでCGRPを溶出します。通過した溶液の各ミリリットルの間に25分間休止する。溶離液を捨てないでください。
- チューブには、メタノールと酢酸溶液の最後のミリリットルが通過してから25分後に3mLの溶出液が含まれます。各1 mLの溶離液を1.7 mLの微量遠心チューブに入れます。
注意: これにより、各カートリッジから3つのマイクロ遠心チューブが生成されます。 - 各チューブをミニ遠心分離機に1秒間入れて、すべての溶離液が各チューブの底にあることを確認します。
- 4°Cの真空遠心分離ですべてのサンプルを乾燥させます(水溶液の場合は1,400 rpmで濃縮機能に設定、G力はチューブの位置によって異なるため、130〜250 x gの範囲です)。
注意: 真空遠心分離機がサンプルを乾燥させるのにかかる時間は、使用するマイクロ遠心チューブの種類によって異なります。 - アッセイ手順(ステップ4.1)に進む直前に、以前に乾燥したサンプルを酵素免疫測定(EIA)バッファー( 材料の表を参照)で再構成し、室温(RT)または20°Cに解凍します。
注:乾燥サンプルの再構成に使用されるEIAバッファーの容量は、元のサンプル容量、つまり250μLと等しくなければなりません。
3. ELISAプレートの調製 - 非特異的結合を制限するためのブロッキング
- 250 μLのトリス緩衝生理食塩水(TBS)/魚ゼラチンブロッキングバッファーをプレート上の各ウェルに加えます。
- プレートの上にカバーシートを置き、RTで2時間インキュベートします。
- カバーシートを取り外し、マルチチャンネルピペットを使用して反転または吸引してプレートを空にします。次に、ペーパータオルでプレートを拭き取り、液体の痕跡を捨てます。
- プレートを層流フードに10分間放置して、プレートを乾燥させます。
- プレートが目に見えて乾いたら、シリカゲル乾燥剤サシェ付きのグリップシールホイルポーチに入れ、ポーチを-20°Cで24時間保管します。
注:プレートはプレートインキュベーションから4週間以内に使用する必要があります。
4.アッセイ手順の前
- キットの指示に従って試薬(EIAバッファー、CGRP標準、CGRP品質管理、CGRPトレーサー、洗浄バッファー)を準備します。16〜20時間のインキュベーション期間が終了した後にのみエルマン試薬を調製してください。
- 残りのプロトコルを実行する前に、すべてのサンプルと試薬をRTに解凍してください。
5. アッセイ手順
- ブロックプレート内の各ウェルを、キット付属の洗浄バッファー(300 μL/ウェル)で5回すすぎます。すすぎごとに、洗浄バッファーをウェルに入れてから30秒休止し、マルチチャンネルピペットを使用して液体または吸引液を捨てます。
- 最後のすすぎの後、反転(プレートを反転させてウェル内の液体を排出する)またはマルチチャンネルピペットを使用した吸引によって、ウェルからすべてのバッファーを取り除きます。最後の一滴をペーパータオルの上に吸い取り、すべての液体がウェルから目に見えて除去されるまで逆さプレートを軽くたたきます。
- 試薬やバッファーを含まない少なくとも2つのウェルを「ブランク」ウェルとして確保します。次に、非特異的結合(NSB)のために少なくとも2つの他のウェルを確保します。
- 100 μLのEIAバッファーを各NSBウェルに分注します。
- 100 μLのCGRP標準物質を適切なウェルに二重に分注します。
- 100 μLのサンプル(EIAバッファーで再構成)と品質管理を適切なウェルに二重に分注します。
- NSB、CGRP標準物質、サンプル、および品質管理を含む各ウェルに100 μLのCGRPトレーサー(アセチルコリンエステラーゼに結合した抗CGRP抗体)を分注します。トレーサーを「ブランク」ウェルに分配しないでください。
- 透明なカバーシートを使用してプレートを覆い、各ウェル内のサンプルと試薬が大幅に蒸発しないように各ウェルを密封します。プレートを4°Cで16〜20時間インキュベートします。
- インキュベーションが完了したら、キットの指示に従ってエルマン試薬を再構成します。
- プレートを反転させて、すべての液体を取り除きます。各ウェルを(上記のように)300 μLの洗浄バッファーで3回すすぎます。
- 3回目のすすぎの後、プレートから液体を取り除き、プレートをシェーカープレートに置き、120rpmで2分間振とうします。
- プレートをさらに3回洗います。最後のすすぎの後、マルチチャンネルピペットを使用して反転または吸引によってウェルからすべてのバッファーを除去します。液体の最後の一滴をペーパータオルの上に吸い取り、すべての液体がウェルから目に見えて除去されるまで逆さプレートをタップします。
注意: ELISAマイクロプレートウォッシャーを使用している場合は、この手順で説明する追加の3回の洗浄は必要ない場合があります。 - 200 μLのエルマン試薬を各ウェルに分注します(「ブランク」ウェルは含まれません)。
- プレートを新しいカバーシートで覆い、光が当たらないようにアルミホイルで包みます。暗所でRTで1時間インキュベートします。
- プレートの裏側に、乾いたペーパータオルで裏側を拭いて、分光光度計の読み取り値を混乱させる可能性のある液体がないことを確認してください。
- プレートの405 nm(黄色)での吸光度を読み取ります。
6.データ分析
- 各「ブランク」、NSB、標準、品質管理、およびサンプルの平均吸光度を計算します。
- 標準、品質管理、およびサンプルの吸光度値からNSB平均吸光度値を差し引きます。
- Y軸に吸光度、X軸に濃度をプロットします。4パラメータのロジスティック回帰モデルを使用して検量線を作成します。
- 曲線が作成されたら、曲線の式を使用して、x軸で読み取ることができる品質管理とサンプルの補間濃度を決定します。
注:検量線は、品質管理のために計算された補間濃度が予想される濃度の25%以内である場合にのみ検証されます(通常は125 pg / mLですが、品質管理バイアルのラベルを参照してください)。
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Representative Results
プロトコルには、強調表示する必要があるいくつかの重要なステップがあります。まず、セリンプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニンを採取後すぐに全血サンプルに添加して、CGRPのさらなる酵素分解を防ぐ必要があります。セリンプロテアーゼはCGRP代謝に役割を果たすことが示されており、以前の研究では、ヒトのCGRPの定量にもアプロチニンが使用されていました21,35。プロテアーゼ阻害剤を使用せず、サンプル調製に60分以上かかる場合、ELISAを実行するとCGRPのレベルが低下することが予想されます。第二に、ELISA前の固相抽出により、CGRPが溶離液に濃縮され、血漿マトリックスから干渉する可能性のある分子が除去されます。この抽出ステップは、スパイクおよび回収実験におけるCGRPの収率を増加させる(次のセクションでさらに議論される)。抽出後の冷蔵室での真空遠心分離は、CGRPの損失をさらに制限します。第三に、ELISAの前に、マイクロタイタープレートはブロッキングバッファーを使用してブロックされなければならない。これにより、バッファー中の非特異的タンパク質をプレート内の残りの結合部位に受動的吸着できるため、バックグラウンドシグナルが減少します。ブロッキングは、非現実的に高いCGRPの収率を減らすのに役立ちます。
スパイクおよび回収実験では、CGRP検出が検量線希釈液(ここではEIAバッファー)と実験サンプルマトリックス(ここでは血漿)の差によって影響を受けるかどうかを判断します。血漿および/または血清には、CGRPへの抗体結合をブロックしたり、ペプチドを分解したりする分子が含まれている可能性があるため、CGRPの開始濃度を正確に検出および定量するアッセイの能力が妨げられます。この目的のために、血漿サンプルに既知量のCGRPを添加し(「スパイキング」ステップ)、抽出とELISA後にCGRPがどれだけ「回収」されたかを計算しました。CGRPストックはメーカーから入手し、使用するまで-20°Cの冷凍庫で保存しました。
希釈率試験では、サンプルを順次希釈し、希釈ごとにCGRPの濃度を計算します。希釈されたサンプルがCGRP濃度の適切な線形低下を示さない場合、これはEIAバッファーまたは血漿が一部の濃度でCGRPの検出を妨げるか、影響を受ける範囲で標準曲線が正確でないことを示しています。上記のスパイクおよび回収実験を行うにあたり、「スパイク」サンプルを順次希釈しました。血漿サンプルをスパイクして200 pg / mLのCGRP濃度を与え、その後サンプルを100 pg / mLに希釈し、次に50 pg / mLに希釈しました。
心血管、呼吸器、または最近の頭痛または神経学的症状の病歴のない3人の参加者からの血漿サンプルは、異なる濃度のCGRPでスパイクされました。プロトコルは、非添加対照サンプルに加えて、これらのサンプルに対して実行されました。 図1 は、スパイクおよび回収のためのプレートマップの例と希釈実験の直線性を示す。4パラメータのロジスティックフィットを実行して、線形範囲を超えるフィッティングを可能にする標準曲線を作成しました(表1 および 図2)。回収率は、添加された各サンプルについて計算され、許容範囲内であった(表2)。希釈の直線性は、添加サンプルで実証されました(図3)。 表3 は、製造業者の指示に従い、非特異的結合をブロックするための追加されたステップを含める前に実施された失敗したスパイクおよび回復実験から得られた結果を示す。これらのデータは、上限の125%を超える回収率を示しており、非特異的結合の存在を示す。ブロッキングバッファーを使用してプレートをブロックする手順をプロトコルに追加した後(ステップ3.1〜3.5)、この影響を減らし、許容可能な回収値を達成することができました(表2)。片頭痛や前庭症状のない3人の患者では、血漿中のCGRPの平均濃度は1.68±0.13 pg / mLであることがわかりました。今後の実験は、現在の方法論をより大きな対照患者に利用することを目指すべきである。
図1:プレートマップの例。 各プレートには、標準物質、サンプル、ブランク、およびNSBウェルがすべて重複または3重に含まれている必要があります。ブランクウェルには液体を含まず、NSBウェルには独自の酵素免疫測定バッファー、酵素結合二次抗体、およびエルマン試薬を含める必要があります。NSBウェルの平均吸光度値は、検量線を作成する前に、標準物質の吸光度値から差し引く必要があります。NSBウェルの平均吸光度値も、回収率を計算する前に、サンプルの吸光度値から差し引く必要があります。プレート位置の影響はありません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:4パラメータロジスティック(4PL)回帰標準曲線の例。 この検量線は、 表1に見られるものと同様の形式の式によって数学的に記述されます。4PL回帰曲線は、線形曲線と比較して生物学的システムに適合しています。この曲線と方程式は、標準が作成されたのと同じプレート上の品質管理とサンプルを補間するために使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:200 pg/mLで添加し、1:2および1:4に連続希釈したサンプルを示す希釈折れ線グラフ。 このデータは、広範囲の希釈液にわたって直線性を示しており、アッセイ方法が広範囲のCGRP濃度にわたって正確であることを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| パラメーター | 価値 |
| ×50 | 294.75 |
| 方程式 |  |
| 数式形式 |  |
表1:力価X50の4パラメータロジスティック(4PL)回帰標準曲線式の例。 4PL回帰曲線は、生物学的システムに見られる複雑さに対応しています。この曲線は、線形回帰よりも適しているため、ELISAの結果を分析するために使用されました。
| 吸光度(OD) | 補間濃度(pg/mL) | 利回り率 | |
| スパイクなしのコントロール | -0.0434 | 曲線上に落ちない(つまり、~0) | |
| 200 pg/mLでスパイク | 0.2712 | 214.7±23.4 | 107.40% |
| 100 pg/mLでスパイク | 0.0966 | 102.7 ± 2.35 | 102.70% |
| 50 pg/mLでスパイク | 0.0205 | 55.1±12.65 | 110.20% |
表2:固相抽出とプレートブロッキングの欠如による3人の対照参加者の成功したスパイクと回復実験の結果。 添加サンプルの収率はすべて理想的な100%収率の20%以内にあり、CGRP検出が血漿の実験サンプルマトリックスの影響を受けないことを示しています。
| 吸光度(OD) | 補間濃度(pg/mL) | 利回り率 | |
| スパイクなしのコントロール | -0.2087 | 曲線上に落ちない(つまり、~0) | |
| 200 pg/mLでスパイク | 2.371 | 264.2 ± 104 | 132.10% |
| 100 pg/mLでスパイク | 1.134 | 167.5±31.2 | 167.50% |
| 50 pg/mLでスパイク | 0.3218 | 80.55±4.54 | 161.10% |
表3:プレートブロッキングの欠如のために3人の対照参加者の失敗したスパイクおよび回復実験の結果。 添加サンプルの収率はすべて、収率の上限である120%をはるかに超えており、アッセイがNSBによって破損している可能性があることを示しています。これらの結果が得られた後、プロトコルにステップ3.1〜3.5を追加して、アッセイ前にプレート上のNSBをブロックしました。
| 吸光度(OD) | 補間濃度(pg/mL) | 利回り率 | |
| スパイクなしのコントロール | 0.0401 | 12.93 | |
| 100 pg/mLでスパイク | 0.0315 | 10.17±2.31 | 10.17% |
| 50 pg/mLでスパイク | 0.0152 | 4.895±15.4 | 9.79% |
| 25 pg/mL でスパイク | 0.0007 | 0.2177±6.43 | 0.87% |
表4:3人の対照参加者の失敗したスパイクおよび回復実験の結果。 添加サンプルの収率はすべて、80%の収率の下限を大幅に下回っており、起こりうる分解および競合する結合プロセスに対処するためにさらなる最適化が必要であることを示しています。これらの結果は、検出下限が2.23 pg/mL、アッセイ内cv < 10%、アッセイ間 cv が 12% の他社競合 ELISA アッセイ<結果です。
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Discussion
この記事では、ヒト血漿中のCGRPの検出と定量を可能にする検証済みのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、市販のCGRP ELISAキットがこの分子を正確に定量しないことが判明した後に合成されました。サンプル調製プロトコルと有効な標準曲線を確立した後、スパイクと回収率、および希釈実験の直線性は、回収率が予想よりもはるかに低いことを示しました。同様の結果が、異なる市販のCGRP ELISAキットを用いて見出された(表4)。参考までに、広く受け入れられている標準回収率は80〜120%36です。これらの結果は、CGRP21、22、23、24、CGRPに結合する他の分子を分解するプロテアーゼ活性の存在を示唆し、したがってプレートの抗体への結合、またはプレートへの非標的タンパク質の競合的結合のためのその利用可能性を制限する可能性がある。
これらの可能性のある交絡因子を制御するために、抽出プロトコルを最適化して、ELISAの前に独自の吸着剤による抽出を通じて血漿を精製しました。この吸着剤は、表面上はCGRPなどの極性分子を単離します。ELISA前の抽出の有効性を決定するために、ポジティブコントロールとして既知の濃度のCGRPを添加したヒト血漿サンプルを抽出および次いでELISAを受けた。これらの添加サンプルは、~50%-60%の回収率しか得られなかった。これらの結果は、外因的に添加されたCGRPが予想通り血漿中に検出されないことを示した。
プロトコルの他のさまざまなステップが最適化されました:分解を抑制するために遠心分離前に全血サンプルにセリンプロテアーゼ阻害剤を添加する21、抽出後の真空遠心分離の温度を下げる、遠心分離後の再懸濁方法を調整する。これらの変化後のスパイクおよび回復実験では、非現実的に高いCGRP濃度、120%を超える回収率が明らかになりました(表3)。心強いことに、Messlingerらによる同様のアッセイを使用した抽出後に、予想よりも高い値も最近報告されており37、これが依然として問題であることを示しています。Messlingerらは、血漿抽出後のアッセイが現実的なCGRP濃度を再現しないことを認めているが、この現象の理由を提供するものではない37。
非特異的結合を引き起こすELISAマイクロタイタープレート上の残留結合能が高い回収率の原因である可能性があると仮定しました。ELISAの前に、プレートをブロッキングバッファーであるTBS/魚ゼラチンバッファーと一緒にインキュベートして、この結合能力を低下させました。この追加のステップにより、より適切な回収率が得られました(表2)。したがって、ブロッキングバッファの使用を含む上で論じた修正および最適化は、プロトコルにおける重要なステップであり続ける。これらのステップにより、2 pg/mLと記載されている元のメーカーのキットと比較して、1.05 pg/mLの検出限界が低くなりました。
トラブルシューティングに関しては、ステップ2.10では溶離液を乾燥させるための真空遠心分離が必要です。このステップの長さは、サンプルが入っている微小遠心チューブの種類によって異なることが観察されています。 材料の表に記載されているマイクロ遠心チューブを使用すると、このステップは通常5時間続きます。ただし、大容量の代替マイクロ遠心チューブを使用する場合、このステップは最大11時間続く可能性があります。真空遠心分離に代わるものは、サンプルの凍結乾燥または凍結乾燥であり、抽出後にサンプルを凍結する必要があります。しかしながら、凍結乾燥は、このプロトコルの構築において試験されなかった。さらに、予想よりも体系的に低い濃度のCGRPが見つかった場合は、使用前にすべての試薬、特に抗体を室温まで解凍する必要があります。抗体やトレーサー溶液などの試薬の不安定性は、CGRPの結合における系統的エラーの一因となる可能性があります。収率が不十分な場合、CGRPへの抗体結合は、バッファーで再構成しても溶離液(メタノールおよび酢酸溶液)の相対酸性度の影響を受ける可能性があります。この場合、pH精留ステップは、緩衝液で再構成した後の論理的な追加になります。
このプロトコルの制限には、任意のELISA方法論、特に抗体不安定性に関連する制限が含まれる38。抗体試薬は、アッセイで使用する前に室温まで解凍する必要があります。ただし、長期間の温暖化は変性を引き起こし、その結果、CGRPの結合の有効性が低下する可能性があります。さらに、CGRPはさまざまな非セリンプロテアーゼによって分解され、偽陰性結果が増加する可能性があります。このプロトコルは、セリンプロテアーゼを添加し、サンプル処理時間を60分未満に制限することにより分解を制限しますが、分解が発生する可能性があります。別の制限は、テストされた凍結融解サイクルの欠如です。Leeら39 は、凍結融解サイクルが、タンパク質の感受性に応じて、血清および血漿タンパク質の量を増減できることを実証した。凍結融解サイクルに対するCGRPの感受性は文献で完全には検証されていないが、Messlingerらは、凍結融解の1サイクルでCGRPのレベルが低下することを指摘している37。さらに、このプロトコルの収量は、親水性表面で設計されたタンパク質LoBindチューブの使用から恩恵を受ける可能性があり、したがって、タンパク質回収率の向上につながります。
これらの検証実験は、ヒト血漿中のCGRPを定量化する最近の研究の著者によって実施されたようには見えないことに注意してください16,18,35,40,41。Messlinger et al.37によるELISA方法論のレビューは、そのようなコントロールの必要性を強調し、それらを使用していない研究に疑問を投げかけています。プロトコルの検証と標準化における私たちの作業は、将来のCGRP研究をより良い基盤に置くと信じています。このようなプロトコルの意味は多岐にわたり、理論的には、神経学的および非神経学的疾患プロセスにおけるCGRPのバイオマーカー状態の調査に拡張することができます2,25,26,27,28,29,30,31,32,33。
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Disclosures
著者は、追加するこれ以上の開示はありません。
Acknowledgments
このプロトコルに関して有益な議論をしてくれたRobert N. Cole、Lauren R. DeVine、Marcos Iglesiasに感謝します。これは、米国耳科学会(フェローシップグラント、PSK)、米国聴覚研究財団(90066548/90072266、JPC)、および国立衛生研究所(NIH)の構成要素である国立トランスレーショナルサイエンス推進センター(NCATS)、およびNIH医学研究ロードマップ(UL1 TR003098、NSF)からの資金提供によって部分的に支援されました。出版物の内容は著者の責任であり、必ずしもジョンズホプキンスICTR、NCATS、またはNIHの公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
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